阅读说明：本技术 茄子SmBIC2基因及蛋白的用途 (Eggplant SmBIC2 gene and application of protein ) 是由 陈火英 何永军 刘杨 张信童 于 2020-07-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,特别是涉及茄子SmBIC2基因及蛋白在抑制植物花青素合成或调控植物光形态建成中的用途。本发明中将SmBIC2基因在野生型拟南芥和茄子中过表达,可以促进拟南芥和茄子下胚轴的伸长,同时抑制了花青素合成。本发明针对目前茄子研究基础薄弱的现状,克隆光信号通路中的关键基因SmBIC2,为今后利用基因工程技术改良植物品质,获得具有高抗氧化性的药物或食物提供理论依据,具有很大的应用价值。(The invention relates to the technical field of biology, in particular to application of eggplant SmBIC2 gene and protein in inhibiting plant anthocyanin synthesis or regulating plant photomorphogenesis. According to the invention, the SmBIC2 gene is overexpressed in wild arabidopsis thaliana and eggplants, so that the elongation of hypocotyls of the arabidopsis thaliana and the eggplants can be promoted, and the synthesis of anthocyanin is inhibited. Aiming at the current situation that the research foundation of eggplants is weak at present, the key gene SmBIC2 in an optical signal path is cloned, so that a theoretical basis is provided for improving the plant quality by utilizing a genetic engineering technology and obtaining a medicine or food with high oxidation resistance in the future, and the method has great application value.)

茄子SmBIC2基因及蛋白的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及茄子SmBIC2基因及蛋白的用途。

背景技术

BIC2在植物中是一种隐花色素蓝光抑制因子，它可以和蓝光受体CRY1和CRY2互作调控植物的光形态建成。研究发现，在黑暗条件下，CRYs以无活性的单体存在，光照使CRYs转变为活跃的二聚体，从而触发一系列光形态发生，然而BIC2蛋白会通过抑制CRYs的二聚化，来维持细胞的光敏性，从而参与调控植物的光形态建成。

BIC2可以调控植物光形态建成的转录因子，比如，HY5、TT8、MYB1、LZF1、HFR1和CO等。BIC2通过抑制HY5、LZF1和HFR1来调控拟南芥幼苗下胚轴的伸长，通过调控CO的蛋白稳定性来调控拟南芥的光周期开花。

BIC2调控了植物的光形态建成，那么光又是如何调控BIC2的呢？研究发现，BIC2的转录不只是受蓝光调控，红光和远红光同样可以促进BIC2的表达，同时红光、远红光受体以及蓝光受体都能通过COP调控HY5的表达，因此推测光是通过HY5调控BIC2的转录。

目前，只在拟南芥中克隆得到BIC2基因，并仅对其植物的光形态建成进行了功能分析。但茄子中BIC2基因的相关研究相对比较滞后，目前未有任何与茄子SmBIC2基因及其编码蛋白的相关文献报道。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供茄子SmBIC2基因及蛋白的用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种茄子SmBIC2基因及蛋白的用途。

优选地，所述茄子SmBIC2基因的核苷酸序列为以下序列中的一种：

1)如SEQ ID NO.1第1～579位所示的核苷酸序列；

2)与SEQ ID NO.1所示第1～579位所示的核苷酸序列具有至少70％的同源性的核苷酸序列；

3)能与SEQ ID NO.1所示第1～579位所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

所述茄子SmBIC2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

如上所述，本发明的茄子SmBIC2基因及蛋白的用途，具有以下有益效果：

1、将SmBIC2基因在野生型拟南芥和茄子中过表达，可以促进拟南芥和茄子下胚轴的伸长，同时抑制了花青素合成。

2、本发明针对目前茄子研究基础薄弱的现状，克隆光信号通路中的关键基因SmBIC2，为今后利用基因工程技术改良植物品质，获得具有高抗氧化性的药物或食物提供理论依据，具有很大的应用价值。

附图说明

图1为本发明的茄子SmBIC2蛋白与拟南芥AtBIC2蛋白的氨基酸序列比较(FASTA)结果，其中，相同的氨基酸在两个序列之间用深色标出，CID结构域为与蓝光受体CRY互作的部分；

图2为本发明的茄子SmBIC2基因在不同组织的表达情况；

图3为转SmBIC2基因拟南芥植株的RT-PCR检测；

图4为转SmBIC2基因的野生型拟南芥幼苗表型变化情况，其中最左侧的一株是WT放大后的图；

图5为转SmBIC2基因的野生型拟南芥幼苗下胚轴变化情况；

图6为转SmBIC2基因的野生型拟南芥幼苗花青素合成变化情况；

图7为转SmBIC2基因的茄子幼苗表型变化情况(每组三株)；

图8为转SmBIC2基因的茄子幼苗下胚轴变化情况；

图9为转SmBIC2基因的茄子幼苗花青素合成变化情况；

图10为转SmBIC2基因的茄子幼苗花青素合成主要结构基因的变化情况。

以上附图中，BIC2-OE1\BIC2-OE2\BIC2-OE3或SmBIC2-OE1\SmBIC2-OE2\SmBIC2-OE3为BIC2转基因的三个生物学重复；图中116代表野生型。

具体实施方式

本发明第一方面提供茄子SmBIC2基因或蛋白在抑制植物花青素合成或调控植物光形态建成中的用途。

所述茄子SmBIC2基因的核苷酸序列为以下序列中的一种：

1)如SEQ ID NO.1第1～579位所示的核苷酸序列；

2)与SEQ ID NO.1所示第1～579位所示的核苷酸序列具有至少70％的同源性的核苷酸序列；

3)能与SEQ ID NO.1所示第1～579位所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

具体的，所述至少70％的同源性可以为至少80％的同源性、至少90％的同源性、至少95％的同源性、至少98％的同源性或至少99％的同源性。

所述茄子SmBIC2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。茄子SmBIC2蛋白共192个氨基酸残基，分子量为22.25KDa，理论等电点(pI)为9.853。

在一种实施方式中，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

所述植物光形态建成是植物依赖光来控制细胞的分化、结构和功能的改变，最终汇集成组织和器官的建成，即以光控制植物发育的过程，称为光形态建成。

所述调控植物光形态建成包括促进植物下胚轴的伸长。

在一种实施方式中，所述植物为拟南芥和茄子。茄子是广泛种植的蔬菜作物，紫色茄子的果皮含有丰富的花青素，紫色茄子的抗氧化保健作用在常见蔬菜作物中是最好的。

在一种实施方式中，所述用途还包括茄子SmBIC2基因或蛋白在制备抑制植物花青素合成产品或调控植物光形态建成产品中的用途。

所述产品中的有效物质为茄子SmBIC2基因和/或蛋白。

所述产品选自药品或试剂。

在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，本发明提供的茄子SmBIC2核苷酸序列和氨基酸序列还可以用于筛选茄子SmBIC2相关同源基因或同源蛋白。

根据本发明的茄子SmBIC2基因，还可以用于得到与茄子SmBIC2相关基因的点阵。可以用³²P对茄子SmBIC2相关的全部或部分做放射活性标记而得的DNA探针筛选茄子cDNA文库。适合于筛选的cDNA文库是来自茄子的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech,Stratagene,Palo Alto,Cal.。这种筛选方法可以识别与茄子SmBIC2相关的基因家族的核苷酸序列。

本发明提供的一种抑制植物花青素合成或调控植物光形态建成的方法，所述方法包括以下步骤：

获取茄子SmBIC2基因，构建茄子SmBIC2转化载体，将所述茄子SmBIC2转化载体侵染目标植株或其组织、器官。

具体的，所述方法还包括侵染后进行抗生素筛选或连续自交。

所述转化载体选自35S启动子驱动的过表达载体。在一种实施方式中，所述转化载体选自PHB。

在一种实施方式中，所述目标植株为茄子或拟南芥。

所述茄子SmBIC2基因的核苷酸序列为以下序列中的一种：

1)如SEQ ID NO.1第1～579位所示的核苷酸序列；

2)与SEQ ID NO.1所示第1～579位所示的核苷酸序列具有至少70％的同源性的核苷酸序列；

3)能与SEQ ID NO.1所示第1～579位所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

具体的，所述至少70％的同源性可以为至少80％的同源性、至少90％的同源性、至少95％的同源性、至少98％的同源性或至少99％的同源性。

茄子SmBIC2核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法制备的cDNA库作为模板，扩增而得。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。然后用重组法来大批量地获得有关序列，这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

在一种实施方式中，所述茄子SmBIC2基因通过PCR扩增获取。用于PCR扩增茄子SmBIC2基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

可用实时荧光定量PCR的方法分析茄子SmBIC2基因产物的表达模式，即分析茄子SmBIC2基因的mRNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

在一种实施方式中，用于荧光定量PCR分析的茄子SmBIC2基因产物的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1茄子SmBIC2基因的克隆

1.植物材料的获得

本实验所用的植物材料为茄子优良种质资源‘蓝山禾线茄’。实验材料栽培于上海市闵行区浦江镇航天育种基地的人工塑料大棚中。在自然条件下育苗，生长并结实。采集茄子的叶片用于提取RNA。

2.RNA的提取

采用TRIzol法提取总RNA(TRIzol购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。用甲醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光光度计(Thermo Scientific NANODROP1000Spectrophotometer)上测定RNA的纯度及浓度。

3.基因的全长克隆

基于茄子基因组数据库(http://eggplant.kazusa.or.jp/)，利用拟南芥AtBIC2基因的序列，比对找到SmBIC2的同源序列并设计特异引物。将提取的RNA进行反转录(PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit：宝生物工程(大连)有限公司)，以第一链cDNA为模板，利用引物

F1：5′-ATGAAGAACTTCGAATCTTTGTCA-3′(SEQ ID NO.3)

R1：5′-CTATCTACTTCTGATTTCGAATATTCT-3′(SEQ ID NO.4)

进行PCR，扩增得到预期长度后回收并连接到Blunt Simple Vector(北京全式金生物技术有限公司)载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR筛选阳性克隆，送至上海生工生物有限公司进行测序，得cDNA序列SEQ ID NO.1。

实施例2茄子SmBIC2基因的序列信息

本发明新的茄子SmBIC2基因全长CDS开放读框序列为579bp，详细序列见SEQ IDNO.1。根据CDS开放读码框序列推导出茄子SmBIC2的氨基酸序列，共192个氨基酸残基，分子量为22.25KDa，理论等电点(pI)为9.853，详细序列见SEQ ID NO.2所示序列。

比对茄子SmBIC2编码蛋白的氨基酸序列与拟南芥AtBIC2蛋白的氨基酸序列，发现茄子SmBIC2和拟南芥AtBIC2一样，也具有与蓝光受体CRY互作的CID domain，如图1所示(SmBIC2：茄子的氨基酸序列；AtBIC2：拟南芥AtBIC2的氨基酸序列；CID domain：与CRY互作的结构域)。由此可见，茄子SmBIC2基因与拟南芥AtBIC2基因具有相似的结构域。

实施例3茄子SmBIC2基因在不同组织中的表达

1.植物材料的获得

在果实成熟期分别采集茄子根、茎、叶、花、萼片、果皮、果肉，将样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用。

2.RNA的提取

采用TRIzol法提取总RNA(TRIzol购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。用普通琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1.2％；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15min)检测完整性。电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示rRNA样品的降解。纯度较好的RNA，A260/A280以及A260/A230约为2.0左右。用分光光度计测定OD值并计算RNA含量。

3.cDNA的获得

以500ng的总RNA为模板，按照宝生物公司TaKaRa PrimeScriptTM RT reagentKit Perfect Real Time试剂盒操作说明进行反转录获得cDNA备用。

4.设计特异性引物以进行实时荧光定量PCR分析基因在不同组织中的表达量。根据已经获得的茄子SmBIC2基因序列，利用引物设计软件设计用于Real-time PCR中SmBIC2基因定量分析的特异性引物

SmBIC2-F：5′-ATTTTTTCGACTCCACGAAGAAAGA-3′(SEQ ID NO.5)

SmBIC2-R：5′-ACTTCTCACGCCCCGATAATCCTAA-3′(SEQ ID NO.6)

内参基因为Actin(GU984779.1)，其引物为

SmACTIN-F(SEQ ID NO.7)：5′-GTCGGAATGGGACAGAAGGATG-3′

SmACTIN-R(SEQ ID NO.8)：5′-GTGCCTCAGTCAGGAGAACAGGGT-3′

5.制作目的基因及内参基因的标准曲线。用EASY Dilution(试剂盒提供)将标准品cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内参基因的特异性引物进行Real-time PCR扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线。分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单一的PCR扩增产物。通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数。

6.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析。以合成的cDNA第一条链为模板，分别用目的基因与内参基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Real-time PCR反应在FTC-3000实时定量仪上进行，反应体系为20μL。反应采用三步法，95℃变性1min，接着40个循环：95℃30s；58℃30s；72℃45s。每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物是否为特异产生。

7.采用2^-△△Ct法作相对定量分析。结果表明SmBIC2基因在茄子的根、茎、叶、花、萼片、果皮、果肉中都有表达，其中在花中的表达量最高，其次是叶，而在果肉中的表达量较低，说明SmBIC2基因在合成花青素的部位表达量较高(图2)。

实施例4茄子SmBIC2基因转拟南芥的功能验证

所用转化载体为PHB，拟南芥材料为野生型(哥伦比亚)植株。将含有SmBIC2-PHB的农杆菌培养至OD 0.8～2.0，6000rpm离心5min，弃上清，菌体沉淀用MS液重悬，调整OD600为0.8～1.2，侵染拟南芥花序10～60sec，暗培养12h后正常培养，收集成熟的种子。

收集的T0代转基因种子，铺在含有50mg/L潮霉素抗性1/2MS平板上，4℃春化3d，光照培养箱培养6-10d，选取根长的长，且长出真叶的健壮幼苗，移栽至土盆，培养。收集的T1代种子继续铺在含有50mg/L潮霉素抗性1/2MS平板上，选取抗性：不抗比为3:1的株系收集T2代种子。T2代在50mg/L潮霉素抗性平板上存活率为100％的认为筛选到纯和抗性植株。对获得的株系采用Real-time PCR检测SmBIC2的表达量(图3)。所用拟南芥actin(NM_179953)引物如下：

SEQ ID NO.9：5′-GTCTGGATTGGAGGGTC-3′

SEQ ID NO.10：5′-TGAGAAATGGTCGGAAA-3′

将筛选得到的阳性转化株和野生型一起置于8h黑暗/16h光下培养。结果显示，BIC2-OE转基因植株与野生型相比具有更长的下胚轴(图4,5)，并且野生型可以在下胚轴可以观察到紫色，说明下胚轴的花青素含量也明显低于野生型(图4,6)，SmBIC2基因具有促进下胚轴伸长，抑制花青素合成的功能。

实施例5茄子SmBIC2基因转茄子的功能验证

所用转化载体为PHB，茄子材料为‘蓝山禾线茄’。将含有SmBIC2-PHB的农杆菌培养至OD 0.8～2.0，6000rpm离心5min，弃上清，菌体沉淀用MS液重悬，调整OD600为0.8～1.2，侵染预培养2d的外植体15min，吸干表面水分后共培养(暗培养)2d。外植体用无菌水清洗4遍，300mg/L的Cb溶液浸泡30min,接种于第一恢复培养基上，培养7d后进行筛选培养。14d继代培养1次，筛选培养42d，当外植体形成不定芽并有真叶时，将其基部切下，转接至生根培养基。待再生植株主根生长至3-5cm，将瓶口敞开2d，清洗根部后将其移栽至营养钵并置于培养箱，待植株生长良好后转至温室培养。

通过PCR鉴定成功转化的阳性植株，并将其连续自交三代获得纯合的转基因株系，对获得的纯合株系采用Real-time qPCR检测SmBIC2的表达量(图10)。所用茄子actin(GU984779.1)引物如下：

SEQ ID NO.11：5′-GTCGGAATGGGACAGAAGGATG-3′

SEQ ID NO.12：5′-GTGCCTCAGTCAGGAGAACAGGGT-3′

将纯合的阳性转化株和野生型一起置于8h黑暗/16h的白光下培养14天。结果显示，BIC2-OE转基因植株与野生型相比具有更长的下胚轴(图7,8)，并且下胚轴的花青素含量也明显低于野生型(图7,9)，同时还采用Real-time qPCR检测花青素合成主要结构基因SmCHS,SmDFR,SmANS的表达量,发现BIC2-OE转基因植株中结构基因的表达量显著低于野生型(图10)，这说明SmBIC2基因具有促进下胚轴伸长，抑制花青素合成的功能。

所用茄子花青素合成结构基因SmCHS引物如下：

SEQ ID NO.13：5′-GGGAACAGTACTCCGGCTAGCC-3′

SEQ ID NO.14：5′-AACACCTGAAATTGGGTCTGAACCA-3′

所用茄子花青素合成结构基因SmDFR引物如下：

SEQ ID NO.15：5′-CATTGAGACTTGCCGACAGA-3′

SEQ ID NO.16：5′-ATTCTCCTTGCCACTTGCAT-3′

所用茄子花青素合成结构基因SmANS引物如下：

SEQ ID NO.17：5′-CTCGATTCCCACCTCGGACCTT-3′

SEQ ID NO.18：5′-TCAGCTGCAGCGTCCTGTTTGT-3′

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 茄子SmBIC2基因及蛋白的用途

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 579

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaagaact tcgaatcttt gtcaatggtg gatgatggag aaaaaatagg tgattttttt 60

gactccgcga agaaagaaaa tcaagaacta gtctctcatg ataaacaagg taagtatcag 120

catcgagaat ctacgaagaa ctttagatct ttgttaatgg tggatgatgg agaaaaaata 180

ggagattttt tcgactccac gaagaaagaa aatcaaaaac tagtctctcg tgataaacaa 240

ggtgagtatc agcatcaaga atctatcaag aacgttaaat ctttgtcgat ggtagatgat 300

aataaaaagg gcgatttttt tgtcctatcg gagaaattag gattatcggg gcgtgagaag 360

ttgaagaggc attggagaga agttggaggt agggtttttg tgccagagag atgggggcat 420

gagggttctt tgagggaatg gatggattgt tcttcctttg ataaaatact agattcaaag 480

ggactaaaat cggctcgaga agccttgatg tctcaaggaa aacgagtacg ttcaagttca 540

actacaactt caagaatatt cgaaatcaga agtagatag 579

<210> 2

<211> 192

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Asn Phe Glu Ser Leu Ser Met Val Asp Asp Gly Glu Lys Ile

1 5 10 15

Gly Asp Phe Phe Asp Ser Ala Lys Lys Glu Asn Gln Glu Leu Val Ser

20 25 30

His Asp Lys Gln Gly Lys Tyr Gln His Arg Glu Ser Thr Lys Asn Phe

35 40 45

Arg Ser Leu Leu Met Val Asp Asp Gly Glu Lys Ile Gly Asp Phe Phe

50 55 60

Asp Ser Thr Lys Lys Glu Asn Gln Lys Leu Val Ser Arg Asp Lys Gln

65 70 75 80

Gly Glu Tyr Gln His Gln Glu Ser Ile Lys Asn Val Lys Ser Leu Ser

85 90 95

Met Val Asp Asp Asn Lys Lys Gly Asp Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys

100 105 110

Leu Gly Leu Ser Gly Arg Glu Lys Leu Lys Arg His Trp Arg Glu Val

115 120 125

Gly Gly Arg Val Phe Val Pro Glu Arg Trp Gly His Glu Gly Ser Leu

130 135 140

Arg Glu Trp Met Asp Cys Ser Ser Phe Asp Lys Ile Leu Asp Ser Lys

145 150 155 160

Gly Leu Lys Ser Ala Arg Glu Ala Leu Met Ser Gln Gly Lys Arg Val

165 170 175

Arg Ser Ser Ser Thr Thr Thr Ser Arg Ile Phe Glu Ile Arg Ser Arg

180 185 190

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaagaact tcgaatcttt gtca 24

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctatctactt ctgatttcga atattct 27

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

attttttcga ctccacgaag aaaga 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acttctcacg ccccgataat cctaa 25

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtcggaatgg gacagaagga tg 22

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtgcctcagt caggagaaca gggt 24

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtctggattg gagggtc 17

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgagaaatgg tcggaaa 17

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtcggaatgg gacagaagga tg 22

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtgcctcagt caggagaaca gggt 24

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gggaacagta ctccggctag cc 22

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aacacctgaa attgggtctg aacca 25

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cattgagact tgccgacaga 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

attctccttg ccacttgcat 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctcgattccc acctcggacc tt 22

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tcagctgcag cgtcctgttt gt 22