阅读说明：本技术 一种壳寡糖衍生物、制备方法及在预防和/或治疗猪腹泻中的应用 (Chitosan oligosaccharide derivative, preparation method and application of chitosan oligosaccharide derivative in preventing and/or treating porcine diarrhea ) 是由 杜昱光 任立世 闫雅璐 焦思明 程功 孙明 于 2020-08-25 设计创作，主要内容包括：本发明属于糖工程应用技术领域,公开了一种壳寡糖衍生物、制备方法及在预防和/或治疗猪腹泻中的应用。所述制备方法包括以下步骤：1)将乳糖和壳寡糖以一定的质量比混合,加入乳糖酶,在加热条件下进行混合搅拌反应得到反应液；2)使反应液中的乳糖酶失活,再将反应液冻干,得到产物。本发明通过壳寡糖和乳糖合成出一种壳寡糖衍生物,其具有与传统壳寡糖不同的结构及性能,能够在抑制产肠毒素大肠杆菌K88粘附肠上皮细胞中发挥优异的作用,从而可以作为预防和/或治疗猪腹泻的饲料添加剂/口服液使用,有效降低由产肠毒素大肠杆菌K88导致的猪腹泻,不仅有效降低成本,且不易产生耐药性。(The invention belongs to the technical field of sugar engineering application, and discloses a chitosan oligosaccharide derivative, a preparation method and application thereof in preventing and/or treating porcine diarrhea. The preparation method comprises the following steps: 1) mixing lactose and chitosan oligosaccharide in a certain mass ratio, adding lactase, and carrying out mixing and stirring reaction under a heating condition to obtain a reaction solution; 2) inactivating lactase in the reaction solution, and freeze-drying the reaction solution to obtain the product. The chitosan oligosaccharide derivative is synthesized by chitosan oligosaccharide and lactose, has different structure and performance from the traditional chitosan oligosaccharide, can play an excellent role in inhibiting enterotoxigenic escherichia coli K88 from adhering to intestinal epithelial cells, can be used as a feed additive/oral liquid for preventing and/or treating pig diarrhea, effectively reduces pig diarrhea caused by enterotoxigenic escherichia coli K88, effectively reduces the cost, and is not easy to generate drug resistance.)

一种壳寡糖衍生物、制备方法及在预防和/或治疗猪腹泻中的 应用

技术领域

本发明属于糖工程应用技术领域，公开了一种壳寡糖衍生物、制备方法及在预防和/或治疗猪腹泻中的应用。

背景技术

根据国家***数据显示，我国猪肉产量占肉类总产量的56％(数据来自国家***)。随着我国养猪规模的扩大，仔猪的死亡数不断升高且有进一步加重的趋势，每年约有1.4亿头仔猪死亡，死亡率从7％到37％浮动。仔猪死亡每年为养猪行业造成巨大的经济损失。造成仔猪死亡的原因有很多，例如仔猪自身机能、饲料与饲养、应激压力等等因素。其中仔猪腹泻是引起仔猪死亡的主要原因，约有4000多万头仔猪死于腹泻。

目前，针对仔猪腹泻，普遍的方法是在仔猪和哺乳母猪料中添加抗生素，降低仔猪感染细菌和病毒的风险，提高仔猪抗感染能力，治疗仔猪腹泻疾病等。该法在一定程度上能起到起到有效防治的作用，但该法存在完全治愈率低、反复发病率高、引起仔猪免疫抑制、治疗时间长等缺陷。尤其随着细菌耐药性的产生，抗生素的效果也大打折扣，远远不能满足腹泻这种多因素性疾病的防治。

产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引起小猪腹泻的主要原因之一。其中ETEC K88、K99和987P为主要的致病菌，约有56％到70％的小猪腹泻与ETEC感染有关。目前治疗腹泻病的方法多为补液或抗生素治疗。抗生素的禁用迫使养猪产业寻找其他预防治疗的途径。

产肠毒素大肠杆菌致病分为两步，首先ETEC利用鞭毛粘附于仔猪肠表皮细胞，使得ETEC定植于宿主体内；定植后的ETEC将释放肠毒素(ST和LT)，使得水和电解质通过Cl-离子通道进入肠道，引起腹泻。

粘附是ETEC等致病菌致病至关重要的环节，致病菌通过菌体表面的粘附蛋白粘附于宿主细胞上不仅可以抵抗宿主自身的清洗机制利于定植，便于获取营养物质，大量繁殖；此外还可以促进毒素或其他致病因子的释放。粘附蛋白中有一段糖链识别域(Carbohydrate recognition domain)，糖链识别域识别宿主细胞上的糖蛋白从而建立粘附，因此抑制或预防ETEC与宿主上皮细胞的最初粘附，常被称为抗粘附治疗，正在成为抗生素的替代方法及抗细菌感染的方案。

壳寡糖又叫壳聚寡糖、低聚壳聚糖，是将壳聚糖经特殊的生物酶技术(也有使用化学降解、微波降解技术的报道)降解得到的一种聚合度在2～20之间寡糖产品，分子量≤3200Da，是水溶性较好、功能作用大、生物活性高的低分子量产品。它具有壳聚糖所没有的较高溶解度，全溶于水，容易被生物体吸收利用等诸多独特的功能，其作用为壳聚糖的14倍。

基于壳寡糖的优良特性，现有技术中已将其作为防治仔猪腹泻的添加剂来使用，经检索，已有相关的申请案公开，如中国专利申请号为201910856823.7，公开日期为2019年12月13日的申请案公开了一种防治仔猪腹泻的饲料添加剂，该添加剂包括以下重量份数的原料：白术提取物6～12份、黄连提取物6～12份、党参提取物4～8份、甘草提取物1～3份、壳聚糖0.6～1.3份、亚麻籽油酸1～3份及改性氧化锌2～4份；其中，改性氧化锌主要由氧化锌、硬脂酸钠与葡萄糖酸制备得到。该饲料添加剂主要依赖于传统氧化锌降低小猪的腹泻率，加入壳聚糖及亚麻籽油酸主要用于提高氧化锌饲喂的时候的适口性，同时增强仔猪的免疫力，因此壳寡糖虽然性质优异，其单独并不能起到降低小猪腹泻率的效果，大量物质的配制导致成本过高。

基于现有技术的缺陷，亟需发明一种新的成本低廉、使用方便且能够有效降低小猪腹泻率的方法及产品。

发明内容

1.要解决的问题

针对现有技术中降低小猪腹泻率的方法中，采用抗生素容易产生耐药性的问题；以及采用氧化锌适口性差、需要搭配多种添加剂导致成本较高的问题，本发明通过壳寡糖和乳糖合成出一种新的壳寡糖衍生物，其具有与传统壳寡糖不同的结构和性能，能够在抑制产肠毒素大肠杆菌K88粘附肠上皮细胞中发挥优异的作用，从而可以作为饲料添加剂/口服液使用，有效的降低由产肠毒素大肠杆菌K88导致的猪腹泻，不仅有效降低成本，且不易产生耐药性。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

本发明提供了一种壳寡糖衍生物的制备方法，包括以下步骤：

1)将乳糖和壳寡糖以一定的质量比混合，加入乳糖酶在加热条件下进行混合搅拌反应；

2)使反应液中的乳糖酶失活后，再将反应液冻干，得到产物。

作为本发明更进一步的改进，所述乳糖和壳寡糖的质量比为(1～3)：5。

作为本发明更进一步的改进，所述步骤2)中使乳糖酶失活的方式为：将反应液升温至80℃以上维持20～30分钟将酶失活。

作为本发明更进一步的改进，所述步骤1)中加热温度30～50℃，搅拌反应时间不少于24h。

作为本发明更进一步的改进，本发明提供了一种壳寡糖衍生物，采用HPLC的检测图谱中，最强特征峰的出峰时间位于8.988min，次强度特征峰出峰时间位于13.389min。

作为本发明更进一步的改进，所述分子排阻色谱检测图中含有两个峰，其中第一个峰的相对平均分子质量为659.72Da，第二个峰的相对平均分子质量为212.81Da。

作为本发明更进一步的改进，本发明提供了一种壳寡糖衍生物在抑制产肠毒素大肠杆菌与肠细胞黏附中的应用方法。

作为本发明更进一步的改进，所述的产肠毒素大肠杆菌包括大肠杆菌K88，和/或所述肠细胞包括猪肠上皮细胞。

作为本发明更进一步的改进，本发明提供了一种预防和/或治疗猪腹泻的饲料添加剂/口服液，所述饲料添加剂/口服液中含有所述的壳寡糖衍生物。

作为本发明更进一步的改进，所述壳寡糖衍生物作为饲料添加剂应用时可以将壳寡糖衍生物添加到饲料中使用。

所述壳寡糖衍生物作为口服液使用时，将其配制为浓度为5～50mg/mL的壳寡糖衍生物溶液。

作为本发明更进一步的改进，有效使用浓度优选为5～10mg/mL。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明的壳寡糖衍生物，能够有效抑制产肠毒素大肠杆菌K88与猪小肠上皮细胞的黏附，从而从根本上解决猪腹泻的问题，与现有技术中通过添加抗生素预防和治疗猪腹泻相比不容易产生耐药性，与通过添加氧化锌等专用防腹泻添加剂相比具有更好的适口性，不需要添加大量的复配物即可发挥优异的性能，效果优异。

(2)本发明的壳寡糖衍生物，在5～50mg/ml的浓度范围均体现稳定的抑菌效果，浓度在10mg/ml的抑菌率可达到64.37％，相对比的10mg/mL的乳糖的抑菌粘附率仅为6.90％，未经改造的壳寡糖的抑菌粘附率仅为7.47％，涂平板实验也显示出本发明的壳寡糖衍生物体现出比传统壳寡糖更显著的抑制产肠毒素大肠杆菌K88粘附现象。由此可知，本发明将乳糖和壳寡糖复合后制备的壳寡糖衍生物生成了不同于传统壳寡糖的结构，由此产生预料不到的对产肠毒素大肠杆菌K88与猪小肠上皮细胞的黏附抑制效果，从针对该产物实施的HPLC分析、LC-MS分析及分子排阻色谱分析的结果中得到该产物相关结构的确证信息。

(3)本发明的寡糖衍生物，由传统的壳寡糖及乳糖通过简单方法制备，通过添加该产物本身即可发挥优异的抑菌黏附性能，与现有技术中需要添加多种添加剂相比，能有效降低成本。同时基于该壳寡糖衍生物所具有的良好水溶性，可以直接配制成溶液或添加到饲料中，使用方式灵活；该寡糖衍生物成本低廉，效果优异，利于推广使用。

附图说明

图1为传统的壳寡糖的HPLC色谱图；

图2为本发明制备的壳寡糖衍生物RX COS-K88的HPLC检测色谱图；

图3为本发明制备的壳寡糖衍生物RX COS-K88的LC-MS检测表征图；

图4为本发明制备的壳寡糖衍生物RX COS-K88的分子排阻色谱检测结果；

图5为不同分子质量聚乙二醇分子排阻色谱检测图谱；

图6为实施例2中各种寡糖的抑菌粘附率柱状图对比；

图7为实施例2中的寡糖涂平板菌落生长情况。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

需要说明的是，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”等用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。

如本文所使用，术语“......中的至少一个”旨在与“......中的一个或多个”同义。例如，“A、B和C中的至少一个”明确包括仅A、仅B、仅C以及它们各自的组合。

浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。

任何方法或过程权利要求中所述的任何步骤可以以任何顺序执行，并且不限于权利要求中提出的顺序。

实施例1

本发明的壳寡糖衍生物RXCOS-K88的制备方法，包括以下步骤：

将乳糖和壳寡糖按照质量比(1～3)：5的条件混合，然后加入乳糖酶，在30～50℃条件下，搅拌混合反应不低于24小时，然后将反应液升温至80℃维持20～30分钟将酶失活，收集反应液冻干得到产物，将该产物命名为RXCOS-K88。对该产物分别进行HPLC、MS、平均分子量检测。

A)本发明的壳寡糖衍生物RXCOS-K88的HPLC表征：

采用HPLC的方法对RX COS-K88产品进行表征，来区别其与传统壳寡糖的结构上的差异。

具体方法如下：分别将RX COS-K88样品和传统的壳寡糖样品均配制浓度为10mg/ml的水溶液；

检测条件如下：华谱(S6000)色谱仪；华谱XAmide(5μm，100A，4.6*250mm)色谱柱；检测器为ELSD检测器，蒸发温度90℃；雾化温度：60℃；流动相：B：乙腈，C：100mM pH3.2甲酸铵；进样量：10μL；柱温30℃；洗脱程序见表1。

表1洗脱程序

结果显示：传统壳寡糖的HPLC检测结果如图1所示，本发明的方法制备的壳寡糖衍生物RX COS-K88的HPLC检测结果如图2所示，其中图2中标记部分为与传统壳寡糖的主要区别部分，由图1和图2的对比可知，本发明制备的产物RX COS-K88具有特有的组分信息，使其可以有效的与传统的壳寡糖进行区别。具体为：相同条件下，RX COS-K88的最强特征峰的出峰时间位于8.988min，次强度特征峰出峰时间位于13.389min，而传统壳寡糖在对应的保留时间均未出峰。

B)LC-MS表征

将RX COS-K88产品配制浓度为10mg/ml的水溶液。

LC-MS的检测条件如下：

色谱柱：[email protected] Amide(150mm×2.1mm，2.5μm，Waters)；乙腈、水及甲酸铵(100mM，pH3.2)为流动相，梯度洗脱，运行时间为60min。水(A)、乙腈(B)和甲酸铵(C)梯度洗脱程序如下：0～50min，75％B与15％C；50～55min，50％B与15％C；55-60min，75％B与15％C。柱温30℃，流速0.25mL/min，进样量10μL。CAD检测：雾化温度为300℃，气源为N2，压力为100psi。所得到的LC-MS表征图谱如图3所示。

结果显示：经LC-MS分析发现其有较多与传统壳寡糖相异的特征峰出现，需要进一步验证其结构特征。

C)相对平均分子质量测定

具体方法如下：以不同分子质量的聚乙二醇作为标准品，测定RX COS-K88相对平均分子质量，实验条件如下：RX COS-K88样品浓度为10mg/mL的水溶液，进样量6μL，华谱(S6000)色谱仪；色谱柱为：TSKgel G2500PWxl；检测器为ELSD检测器，蒸发温度90℃；雾化温度：60℃；流动相：0.125M乙酸水溶液，流速：0.3ml/min，等度洗脱40min。

图4为RX COS-K88分子排阻色谱检测图谱；图5为不同分子质量聚乙二醇分子排阻色谱检测图谱；测试中的不同分子量的标准品的保留时间检测结果如表2；由标准品得到的标准曲线为：y＝-2.747ln(x)+46.206，通过将不同峰对应的保留时间代入标准曲线计算，计算所得的RX COS-K88两种不同分子量检测结果见表3。

表2标准品检测结果

表3 RX COS-K88检测结果

经分子排阻色谱法测定本发明的壳寡糖衍生物(RX COS-K88)相对平均分子质量发现主要分为两部分，其中1#号峰相对平均分子质量为659.72Da，2#峰相对平均分子质量为212.81Da。

实施例2

本实施例为实施例1制备的RX COS-K88在产肠毒素大肠杆菌K88(ETEC K88)与肠细胞黏附中的应用效果试验，步骤如下：

产肠毒素大肠杆菌K88(ETEC K88)复苏

-80℃甘油储藏菌在LB盘子上划线复苏，于37℃过夜培养。将盘子上的菌落用PBS(pH 7.4)冲洗下来，取100μL涂与LB盘子上，与37℃过夜培养。将LB上的菌用PBS洗下来，用PBS将OD₆₀₀稀释至0.6，置于冰上备用。

猪小肠上皮细胞系(IPEC-J1)培养

猪小肠上皮细胞系(IPEC-J1)与添加了青霉素-链霉素与10％(体积浓度)的胎牛血清培养基DMEM/F12，于37℃，5％CO₂中培养。直到细胞融合。细胞融合后，将IPEC-J1细胞接种于24孔细胞培养板中(Corning，US)。在抗粘附实验的前一天，将含抗生素的标准培养基替换为不含抗生素的培养基。

抗粘附实验

该实验中实验组为5mg/mL的RX COS-K88水溶液、10mg/mL的RX COS-K88水溶液、50mg/mL的RX COS-K88水溶液、对照组为10mg/mL的乳糖水溶液和10mg/mL的壳寡糖水溶液。

具体操作如下：将猪小肠上皮细胞系(IPEC-J1)在24孔板中生长融合后，用PBS(pH7.4)清洗3遍。加入10％(体积浓度)的胎牛血清封闭30分钟。然后将500μL预孵育(室温30分钟)1：1混合的细菌-寡糖混合物加入IPEC-J1细胞中，置于37℃孵育30分钟。用PBS清洗三次，确保将没有粘附于细胞上的大肠杆菌去除。加入500μL的0.1％(体积浓度)Triton X-100，与室温静置30min，将细菌从细胞上释放出来。实验中各寡糖设置组浓度及结果统计如表4所示。

实验中各寡糖设置组的抑菌粘附率柱状图如图6所示。

表4实验中各寡糖设置组的浓度及结果统计

根据表4的结果可知，在同等浓度条件下(10mg/ml)，乳糖的抑菌粘附率仅为6.90％，未经改造的壳寡糖的抑菌粘附率仅为7.47％，均未体现出显著的抑菌率，而本发明的方法制备的壳寡糖衍生物(RX COS-K88)的抑菌粘附率则可以达到64.37％，体现出优异的抑菌效果。结果还表明，在5mg/ml～50mg/ml的浓度范围条件下均体现稳定的抑菌效果，抑菌率在41.95％～64.37％，浓度在10mg/mL的抑菌率最高。具体趋势参见图6的各种寡糖抑菌粘附率柱状图。

最后，用涂布的方法将10mg/mL的RX COS-K88水溶液培养于LB琼脂上计数，同时设置空白对照组与10mg/mL的传统壳寡糖水溶液对照组。涂平板菌落生长情况如图7所示，其中图A为产肠毒大肠杆菌K88空白对照组，图B为使用10mg/ml传统壳寡糖(RX14)处理的对照组，图C为使用10mg/ml本发明的产品RX COS-K88处理组。从图7涂布结果中可以看出，本发明的产品RX COS-K88能够有效的抑制产肠毒素大肠杆菌K88粘附肠上皮细胞，从而有效的降低由产肠毒素大肠杆菌K88导致的腹泻。