阅读说明：本技术 一种合成乳-n-二糖的方法 (A method of synthesis cream-N- disaccharides ) 是由 方诩 杜志强 于 2019-10-31 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种合成乳-<I>N</I>-二糖的方法,属于生物工程及寡糖合成技术领域。本发明利用生物安全性好且应用广泛的多酶催化体系,通过在多酶反应体系中引入ATP再生循环系统,提高乳-<I>N</I>-二糖合成及底物利用率。本发明提供了一个新的乳-<I>N</I>-二糖合成途径,为乳-<I>N</I>-二糖的大规模工业生产奠定了基础,具有重要的经济价值和社会效益。同时本发明合成方法高效温和、简便易行,成本低、适合产业化生产,具有良好的实际应用之价值。(The present invention provides a kind of synthesis cream- N The method of disaccharides belongs to bioengineering and oligosaccharides synthesis technical field.The present invention good and widely used multienzyme catalyst system using biological safety improves cream-by introducing ATP regeneration cycle system in multienzymatic reaction system N Disaccharides synthesis and substrate utilization ratio.The present invention provides a new creams- N Disaccharides route of synthesis, for cream- N The large-scale industrial production of disaccharides is laid a good foundation, and has important economic value and social benefit.Synthetic method of the present invention is efficiently mild, simple and easy to do simultaneously, at low cost, suitable industrialization production, the value with good practical application.)

一种合成乳-N-二糖的方法

技术领域

本发明属于生物工程及寡糖合成技术领域，具体涉及一种合成乳-N-二糖的方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

母乳作为新生儿出生后唯一与母体联系的物质和能量纽带，被认为是婴儿营养的黄金标准。除了提供婴儿生长所必需的蛋白质、脂肪和碳水化合物等营养物质之外，母乳还提供了能够促进婴儿健康和发育的酶、抗体、生长因子和寡糖等活性组分。进一步研究发现，与牛羊乳相比，最大的不同在于母乳中含有丰富的功能性人乳寡糖及其衍生物（HumanMilk Oligosaccharides，HMOs），其含量高达12-24 g/L，仅次于乳糖和脂质成分，为母乳中第三大营养物质。HMOs对于人体，特别是针对婴幼儿的消化系统、肠道健康及免疫系统完善有特殊的功效。近期研究发现，HMOs不仅可以作为肠道益生菌的益生元，调节和促进婴儿肠道免疫屏障的成熟，而且可以作为病原体的诱饵分子、具有抑制细菌和抗真菌作用，保护婴幼儿免受病原体的感染。因此针对HMOs的研究对于婴幼儿健康有着重要意义，并且通过在奶粉中添加HMOs模拟母乳成分，对于一些无法进行母乳喂养的婴儿以及哺乳期后婴儿的营养健康保障尤为重要。

然而，有限的来源及难以利用化学方法规模化合成，制约了其生物学功能的研究和广泛应用。为了突破此瓶颈，因其来源途径有限，亟需建立简洁、高效、经济地大量获得核心结构乳-N-二糖(LNB，Galβ1-3GlcNAc，化学结构式如下)的合成途径。因此，生物法合成乳-N-二糖(LNB)的技术成本低，且合成过程简单，分离方法简便。

目前已有多项专利集中在利用大肠杆菌中生产人乳寡糖生物合成技术，如：

专利名：“一种岩藻糖基转移酶及其基因工程菌和应用”（CN201611147477.8）

专利名：“在具有经改造的输入/输出的微生物宿主中人乳寡糖的产生”（CN201680052611.8）

专利名：“一种岩藻糖基转移酶及其应用”（CN201611147478.2）

专利名：“用于制备含N-乙酰乳糖胺的四糖乳糖-N-新四糖(LNNT)的方法”（CN201510751641.5）。

上述专利中均采用以大肠杆菌作为宿主，异源生产人乳寡糖的技术。但是大肠杆菌内毒素的去除是大规模工业生产中的一个重大挑战。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，也称为脂多糖，是一种对人体能够产生毒性物质。然而，对于尤其是作为婴儿奶粉的添加剂人乳寡糖来说，食品安全性显然是非常重要。因此寻找安全性好、产量稳定、生产效率高从而使之更适合规模工业化生产的人乳寡糖的合成方法尤为重要。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明利用生物安全性好且应用广泛的多酶催化体系，通过在多酶反应体系中引入ATP再生循环系统，提高乳-N-二糖合成及底物利用率。本发明提供了一个新的乳-N-二糖合成途径，为乳-N-二糖的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。

本发明的第一个方面，提供一种合成乳-N-二糖的方法，所述方法包括：

在含有半乳糖（Gal）、乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）、乳糖（Lac）为底物的反应体系中，加入半乳糖激酶（GalK）、乳-N-二糖磷解酶（LNBP）制备乳-N-二糖；

在上述反应体系中，还加入乙酰磷酸、乙酸激酶（ACK）进行ATP的原位再生。

进一步的，所述方法还包括：分离产物乳-N-二糖及体系中存在的ATP、ADP。

本发明的合成原理如下：本发明构建以半乳糖为底物的多酶催化体系合成乳-N-二糖。反应底物半乳糖在半乳糖激酶催化下生成半乳糖-1-磷酸，同时ATP降解为ADP；进一步的半乳糖-1-磷酸在乳-N-二糖磷解酶（LNBP）作用下，生成乳-N-二糖。在乙酸激酶（ACK）作用下，上述得到的ADP结合乙酰磷酸再生为ATP，实现ATP的再生。本发明反应物中只需要投入低浓度的ATP，大大降低反应成本及提高了底物转化效率，避免了高浓度ATP抑制半乳糖激酶的作用，从而使得底物实现完全转化，且反应时间缩短。

本发明的第二个方面，提供上述合成方法制备合成的乳-N-二糖。另外，基于本发明的合成方法，合成所有含有和/或以乳-N-二糖为骨骼构造的寡糖或多糖亦在本发明的保护范围之内。

本发明有益技术效果：本发明以半乳糖为原料底物，通过两步催化所合成的寡糖结构包括乳-N-二糖，同时，还可以合成所有以乳-N-二糖为骨骼构造的寡糖或多糖，产品制备成本低、实用价值高。本发明利用生物安全性好且应用广泛的多酶催化体系，通过在多酶反应体系中引入ATP再生循环系统，建立了简化和经济的酶法合成乳-N-二糖与ATP再生的偶联体系，提高乳-N-二糖合成及底物利用率。

综上，本发明提供了一个新的乳-N-二糖合成途径，为乳-N-二糖及其类似物的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。同时本发明所用原料易得，合成方法高效温和、简便易行，成本低、绿色环保、适合产业化生产，具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1 为本发明以半乳糖底物两步催化生成乳-N-二糖的示意图。

图2 为本发明实施例2中引入ATP再生循环后，5 mM ATP起始量下乳-N-二糖合成比较图。

图3为本发明实施例3中引入ATP再生循环后，7.5 mM ATP起始量下乳-N-二糖合成比较图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如 Sambrook 等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

如前所述，目前人乳寡糖难以使用化学方法规模化合成，而采用生物技术异源生产人乳寡糖，除普遍生产效率不高之外，又易产生食品安全性问题。

有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种合成乳-N-二糖的方法，所述方法包括：

在含有半乳糖、乙酰葡萄糖胺、乳糖为底物的反应体系中，加入半乳糖激酶、乳-N-二糖磷解酶制备乳-N-二糖；

在上述反应体系中，还加入乙酰磷酸、乙酸激酶进行ATP的原位再生。本发明针对半乳糖激酶催化步骤中消耗一分子ATP能量，构建以但不局限与乙酸激酶在乙酰磷酸实现ATP能量再生。本发明实验结果证明，通过引入能量再生循环，能够实现ATP再生循环以及底物的全转化，从而有效提高乳-N-二糖的合成效率。

本发明的又一具体实施方式中，所述方法还包括：分离产物乳-N-二糖及反应体系中存在的ATP、ADP。

本发明中，所用到的酶类的来源没有特别的限制，可以是自然界的细菌、也可以是酵母或真菌等微生物菌体中提取而得；可以是通过基因重组由基因工程菌生产而得；可以是由自然界的植物组织或动物组织中提取而得。酶的产品形态也无特别限制，可以是固体、粉末、液体、或通过物理或化学的方法固定在载体上的固定化酶；酶可以是市售的商品，也可以是企业或个人自制的产品。

本发明的又一具体实施方式中，所述半乳糖激酶、乳-N-二糖磷解酶（LNBP）和乙酸激酶均采用基因重组由基因工程菌生产获得。

具体的，所述生产方法包括：分别克隆来源于半乳糖激酶、乳-N-二糖磷解酶及乙酸激酶表达载体；通过培养、诱导相应表达载体的宿主，获得目标酶蛋白。

本发明的又一具体实施方式中，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌体或人工染色体中的任意一种或多种；病毒载体可包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体，人工染色体包括细菌人工染色体(BAC)、噬菌体P1衍生的载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)；进一步优选为质粒；更进一步优选为pET-28a质粒；

本发明的又一具体实施方式中，所述宿主包括但不限于细菌、真菌和真核细胞，进一步选自埃希氏大肠杆菌、芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、里氏木霉和草酸青霉；更进一步优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的又一具体实施方式中，所述生产方法包括：分别克隆来源于半乳糖激酶、LNBP及乙酸激酶表达质粒pET28a-galk，pET28a-Lnbp和pET28a-ack；通过培养、诱导相应表达质粒的BL21(DE3)菌株，通过纯化（优选采用镍柱纯化），获得目标酶蛋白。

其中，所述半乳糖激酶来源菌种包括但不限于大肠杆菌；LNBP来源菌种包括但不限于双歧杆菌；ACK来源菌种包括但不限于大肠杆菌。

本发明的又一具体实施方式中，

所述半乳糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述LNBP的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述乙酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明的又一具体实施方式中，反应体系中还含有ATP，进一步所述ATP浓度为5-15mM（优选为7.5mM）。

反应体系中还含有镁离子（优选使用MgCl₂）和 Tris-HCl缓冲液。

本发明的又一具体实施方式中，所述MgCl₂浓度为1-10 mM（优选为3 mM）；；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为10-200mM（优选为100 mM）。

本发明的又一具体实施方式中，反应体系的反应温度为25-45℃，反应pH值为5.8-7.5。

本发明的又一具体实施方式中，所述半乳糖、乙酰葡萄糖胺底物浓度均为10-20mM。

本发明的又一具体实施方式中，所述半乳糖激酶浓度为1-10U/mL。

本发明的又一具体实施方式中，所述LNBP酶浓度为100-300U/mL。

本发明的又一具体实施方式中，ATP原位再生所需的乙酸激酶浓度为1-10 U/mL，乙酰磷酸浓度为2.5-5 mM。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述合成方法合成的乳-N-二糖。另外，基于本发明的合成方法，合成所有含有以乳-N-二糖为骨骼构造的寡糖或多糖亦在本发明的保护范围之内。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

实施例1：以半乳糖为底物合成乳-N-二糖

在1mL反应体系中加入10 mM半乳糖，10 mM ATP，10 mM GlcNAc，3 mM MgCl₂，100 mMTris-HCl，5 U Galk，168 U 乳-N-二糖磷解酶。如表1所示，其中Control为不添加乳-N-二糖磷解酶（LNBP）的对照组，37℃反应12 h后，反应体系煮沸5 min，离心取上清，过滤膜后，Biorad-HPX柱，RID检测相应底物及产物，反应检测图谱（HPLC）比较结果验证合成了乳-N-二糖。

表1 以半乳糖底物两步催化生成乳-N-二糖的反应表

	Gal mM	ATP mM	GalK mg	MgCl<sub>2</sub> mM	LNBP mg	GlcNAc mM
							Control	10	10	5 U	3		10
1	10	10	5 U	3	168 U	10

实施例2：引入ATP再生循环合成乳-N-二糖

在1mL反应体系中加入10 mM半乳糖，7.5 mM ATP，2.5 mM乙酰磷酸，10 mM GlcNAc，3mM MgCl₂，100 mM Tris-HCl，5 U Galk，3 U ACK，168 U LNBP。如表2所示，Control对照中ATP初始浓度为10 mM，反应体系中不引入ATP循环反应，37℃反应12 h后，反应体系煮沸5min，离心取上清，过滤膜后，Biorad-HPX柱，RID检测相应底物及产物。如图2所示，ATP-1反应条件下，LNB合成相比于对照组（未加入ATP）提高1.60倍。

实施例3：在1mL反应体系中加入10 mM半乳糖， 5 mM ATP，5 mM乙酰磷酸，10 mMGlcNAc，3 mM MgCl₂，100 mM Tris-HCl，5 U Galk，3 U ACK，168 U LNBP。如表2所示，Control对照中ATP初始浓度为10 mM，反应体系中不引入ATP循环反应，37℃反应12 h后，反应体系煮沸5 min，离心取上清，过滤膜后，Biorad-HPX柱，RID检测相应底物及产物。如图3所示，ATP-2反应条件下，LNB合成相比于对照组（未加入ATP）提高1.49倍。

表2引入ATP再生循环后以半乳糖底物两步催化生成乳-N-二糖的反应表

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 烟台华康荣赞生物科技有限公司

<120> 一种合成乳-N-二糖的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 382

<212> PRT

<213> Galk

<400> 1

Met Ser Leu Lys Glu Lys Thr Gln Ser Leu Phe Ala Asn Ala Phe Gly

1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

Arg Val Met Ala Ala Asp Tyr Glu Asn Gln Leu Asp Glu Phe Ser Leu

65 70 75 80

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Arg Gly Val Val Lys His Leu Gln Leu Arg Asn Asn Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Val Asp Met Val Ile Ser Gly Asn Val Pro Gln Gly Ala Gly Leu Ser

115 120 125

Ser Ser Ala Ser Leu Glu Val Ala Val Gly Thr Val Leu Gln Gln Leu

130 135 140

Tyr His Leu Pro Leu Asp Gly Ala Gln Ile Ala Leu Asn Gly Gln Glu

145 150 155 160

Ala Glu Asn Gln Phe Val Gly Cys Asn Cys Gly Ile Met Asp Gln Leu

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Thr Arg Arg Glu Gln Cys Glu Thr Gly Ala Arg Phe Phe Gln Gln Pro

225 230 235 240

Ala Leu Arg Asp Val Thr Ile Glu Glu Phe Asn Ala Val Ala His Glu

245 250 255

Leu Asp Pro Ile Val Ala Lys Arg Val Arg His Ile Leu Thr Glu Asn

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275 280 285

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Ala Val Ile Gly Asp Lys Gly Gly Val Arg Met Thr Gly Gly Gly Phe

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<211> 751

<212> PRT

<213> LNBP

<400> 2

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Lys Ile Tyr Ser Ala Tyr Phe Pro Thr Arg Ala His Asn Glu Trp Ile

50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

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Pro Val Glu Met Tyr Asn His Leu Thr Asn Gly Trp Gly Asp Lys Glu

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180 185 190

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Ser Pro Ala Ala Leu Asp Asp Phe Glu Lys Glu Tyr Gly Tyr Arg Leu

245 250 255

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Val Pro Arg Lys Ala Gln Arg Asp Trp Ile Asp Phe Leu Ser Gly Phe

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325 330 335

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165 170 175

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