阅读说明：本技术 一种新型复合制剂及其在细菌性病害中的应用 (Novel composite preparation and application thereof in bacterial diseases ) 是由 何四龙 谢晓莉 丛郁 徐旭凌 肖逍 丁良 于浩 樊小九 许文建 徐天舜 许小康 于 2020-07-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种新型复合制剂及其在细菌性病害中的应用,属于细菌性病害防治技术领域,所述新型复合制剂为噬菌体和益生菌配伍制剂,该复合制剂在弧菌病害、大肠杆菌病、沙门氏菌病、爱德华氏病菌、假单细胞菌病、屈挠杆菌病、链球菌病、巴氏杆菌病、布氏杆菌病、克雷伯氏菌病、嗜水气单胞菌病、金黄色葡萄球菌病、绿脓杆菌病、由茄科雷尔氏菌侵染引起的青枯病、由假单孢杆菌侵染引起的斑点病、由黄单孢杆菌侵染引起的叶枯病和溃疡病、由假单孢杆菌侵染引起的青枯病、由欧文氏杆菌侵染引起的腐烂病、由癌肿野杆菌侵染引起的畸型病等细菌性病害中有良好的应用效果。(The invention discloses a novel composite preparation and application thereof in bacterial diseases, belonging to the technical field of bacterial disease control, wherein the novel composite preparation is a compatible preparation of bacteriophage and probiotics, the compound preparation has good application effect in vibrio diseases, colibacillosis, salmonellosis, Edwardsiella, pseudomonad, flexobacillosis, streptococcosis, pasteurellosis, brucellosis, Klebsiella, Aeromonas hydrophila, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, bacterial wilt caused by infection of Ralstonia solanacearum, spot disease caused by infection of pseudomonad, leaf blight and ulcer disease caused by infection of Xanthomonas, bacterial wilt caused by infection of pseudomonad, rot disease caused by infection of Erwinia europaea, teratocarcinosis caused by infection of wild bacillus oncoma and other bacterial diseases.)

一种新型复合制剂及其在细菌性病害中的应用

技术领域

本发明涉及细菌性病害防治领域，更具体地说，它涉及一种新型复合制剂及其在细菌性病害中的应用。

背景技术

近年来，细菌性病害对水产养殖、毛皮动物养殖、家禽家畜养殖、农作物栽培等领域造成非常大的经济损失，针对细菌性病害的问题，研究者们也在不断地探寻新的解决方案，作为针对细菌具有专一性的噬菌体和绿色无应激性的益生菌也正逐步受到研究者们的亲睐，例如：

专利CN201710953780.5公布了利用2株副溶血弧菌噬菌体和3株溶藻弧菌噬菌体混合的鸡尾酒方案针对水产养殖中的弧菌进行防治；专利CN200510009788.3公布了利用副干酪乳杆菌HD1-7的天然代谢产物肽类作为防腐剂在大肠杆菌等致病菌中进行防治应用；专利CN201910354887.7公布了一种由地衣芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌所产抑菌物复配的鲜切果蔬保鲜剂；专利CN202010093203.5公布了一株解淀粉芽孢杆菌TBA03及其应用，能有效防治烟草青枯雷尔氏菌病害，缓解烟草青枯病害。

上述技术方案均未针对噬菌体与益生菌配伍的使用展开深入研究，采用噬菌体或益生菌单一配伍的方案很难达到细菌性病害综合防治的预期，在噬菌体与益生菌配伍制备复合制剂这一方面仍存在技术空白。

发明内容

针对现有技术存在的空缺，本发明的目的在于围绕噬菌体和益生菌的配伍使用为技术突破口，提供一种新型复合制剂及其在细菌性病害中的应用，工艺可操作性强，具有普适性和推广性。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种新型复合制剂及其在细菌性病害中的应用，所述新型复合制剂为噬菌体和益生菌配伍制剂，该新型复合制剂在弧菌病害、大肠杆菌病、沙门氏菌病、爱德华氏病菌、假单细胞菌病、屈挠杆菌病、链球菌病、巴氏杆菌病、布氏杆菌病、克雷伯氏菌病、嗜水气单胞菌病、金黄色葡萄球菌病、绿脓杆菌病、由茄科雷尔氏菌侵染引起的青枯病、由假单孢杆菌侵染引起的斑点病、由黄单孢杆菌侵染引起的叶枯病和溃疡病、由假单孢杆菌侵染引起的青枯病、由欧文氏杆菌侵染引起的腐烂病、由癌肿野杆菌侵染引起的畸型病等细菌性病害中的应用。

进一步，所述新型复合制剂为益生菌和噬菌体配伍制剂。

进一步，所述噬菌体和益生菌的组分比为1～5:5～1。

进一步，所述噬菌体为单株噬菌体或多株噬菌体的混合物。

进一步，所述益生菌为单株益生菌或多株益生菌的混合物。

进一步，所述噬菌体为副溶血性弧菌噬菌体、溶藻弧菌噬菌体、哈维氏弧菌噬菌体、霍乱弧菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、地毯草黄单胞菌噬菌体、茄科雷尔氏菌噬菌体、金黄色葡萄球菌噬菌体、嗜水气单胞菌噬菌体、无乳链球菌噬菌体、海豚链球菌噬菌体、铜绿假单胞菌噬菌体、肺炎克雷伯氏菌噬菌体、鲍曼不动杆菌噬菌体、痤疮丙酸杆菌噬菌体、根癌农杆菌噬菌体、密执安棒杆菌噬菌体、李斯特菌噬菌体、空肠弯曲杆菌噬菌体或产气荚膜梭菌噬菌体的一种或多种。

进一步，所述益生菌为嗜热链球菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、詹氏乳杆菌、格氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、布氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、卷曲乳杆菌、发酵乳杆菌、德氏乳杆菌、约氏乳杆菌、短乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、清酒乳杆菌和唾液乳杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌双乙酰亚种、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、肠膜明串珠菌、柠檬明串珠菌、产丙酸丙酸杆菌、费氏丙酸杆菌谢氏亚种、小牛葡萄球菌、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、酿酒酵母、毕赤酵母、产朊假丝酵母、马克斯克鲁维酵母、海洋红酵母、啤酒酵母、季也蒙假丝酵母或布拉氏酵母一种或多种。

进一步，所述噬菌体是依次通过如下步骤进行制备：种子培养，富集培养，除菌纯化和/或干燥。

进一步，所述益生菌是依次通过如下步骤进行制备：种子培养，发酵培养，菌体收集和/或干燥。

综上所述，本发明具有以下有益效果：通过噬菌体与益生菌的配伍获得新型复合制剂，能够增强两者之间的优势，提高整体抑菌或杀菌的效果，改善生长环境，应用在细菌病害防治中，具有良好的应用前景。

具体实施方式

以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。

以下实例中，所涉及菌株代号均为本公司的命名方式编号，部分菌株为市场购买获得。

副溶血性弧菌噬菌体VP46(Vibrio parahaemolyticus phage VP46)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日；保藏编号为CCTCC NO：M 2016290。

副溶血性弧菌噬菌体VP48(Vibrio parahaemolyticus phageVP48)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日；保藏编号为CCTCC NO：M 2016291。

副溶血性弧菌噬菌体VP7(Vibrio parahaemolyticus phageVP7)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年5月26日；保藏编号为CCTCC NO：M 2016289。

金黄色葡萄球菌噬菌体BP-13A(Staphylococcus aureus phageBP-13A)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年9月28日、保藏编号CCTCC NO：M 2016535。

茄科雷尔氏菌噬菌体GP3(Ralstonia solanacearum phage GP3)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2016年11月10日；保藏编号为CCTCC NO：M 2016635。

以下实例中，供试菌株为市场购买获得，该供试菌种处于公开状态，科学工作者可以向相关单位索取。

植物乳杆菌菌株保藏编号为CCTCC AB 2013128；枯草芽孢杆菌菌株保藏编号为CCTCC AB 13003；屎肠球菌保藏编号为CCTCC AB 2010212；产朊假丝酵母编号为CCTCC AY91011。

以下实例中，

TSB液体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL。

MRS液体培养基的配方为：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉浸粉5g，酵母浸粉4g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，醋酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温1g，蒸馏水1000mL。

LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL。

YEPD液体培养基的配方为：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。

实施例1：

副溶血性弧菌噬菌体的制备

种子培养：将活化后的副溶血性弧菌宿主菌，接入TSB培养基中，接种比例为2％，220rpm，37℃培养4h，获得副溶血性弧菌宿主菌种子液。

富集培养：将副溶血性弧菌噬菌体和宿主菌接入TSB培养基中，感染复数MOI值为5×10^-6，宿主菌接种比例为5％，190rpm，37℃培养5h。

除菌纯化：发酵结束后，发酵液经7000rpm离心10min后收集上清，清液用0.22μm滤膜除菌纯化，获得副溶血性弧菌噬菌体水剂，VP46、VP48和VP7的效价分别为5.7×10¹⁰PFU/mL、4.8×10¹⁰PFU/mL和4.5×10¹⁰PFU/mL。

干燥：按组分比3:1比例添加保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉15份、甘油3份、谷氨酸钠4份、蔗糖5份，混匀干燥后粉碎过筛，获得噬菌体粉剂，VP46、VP48和VP7的效价分别为1.1×10¹²PFU/g、9.5×10¹¹PFU/g和7.7×10¹¹PFU/g。

实施例2：

金黄色葡萄球菌噬菌体的制备

种子培养：将活化后的金黄色葡萄球菌宿主菌，接入TSB培养基中，接种比例为1％，190rpm，36℃培养6h，获得金黄色葡萄球菌宿主菌种子液。

富集培养：将金黄色葡萄球菌噬菌体和宿主菌接入TSB培养基中，感染复数MOI值为3×10^-5，宿主菌接种比例为10％，190rpm，36℃培养6h。

除菌纯化：发酵结束后，发酵液经8000rpm离心8min后收集上清，清液用0.22μm滤膜除菌纯化，获得金黄色葡萄球菌噬菌体水剂，BP-13A的效价为5.1×10¹⁰PFU/mL。

干燥：按组分比3:1比例添加保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉15份、甘油3份、谷氨酸钠4份、蔗糖5份，混匀干燥后粉碎过筛，获得噬菌体粉剂，BP-13A的效价为9.3×10¹¹PFU/g。

实施例3：

茄科雷尔氏菌噬菌体的制备

种子培养：将活化后的茄科雷尔氏菌宿主菌，接入TSB培养基中，接种比例为5％，150rpm，30℃培养16h，获得茄科雷尔氏菌宿主菌种子液。

富集培养：将茄科雷尔氏菌噬菌体和宿主菌接入TSB培养基中，感染复数MOI值为1×10^-2，宿主菌接种比例为8％，160rpm，30℃培养12h。

除菌纯化：发酵结束后，发酵液经7600rpm离心13min后收集上清，清液用0.22μm滤膜除菌纯化，获得茄科雷尔氏菌噬菌体水剂，GP3的效价为2.6×10¹⁰PFU/mL。

干燥：按组分比3:1比例添加保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉15份、甘油3份、谷氨酸钠4份、蔗糖5份，混匀干燥后粉碎过筛，获得噬菌体粉剂，GP3的效价为1.9×10¹¹PFU/g。

实施例4：

植物乳杆菌的制备

种子培养：将活化后的植物乳杆菌，接入MRS培养基中，接种比例为10％，35℃静止培养12h，获得植物乳杆菌种子液。

发酵培养：将植物乳杆菌种子液接入MRS培养基中，接种比例为5％，50rpm，35℃培养10h。

菌体收集：发酵结束后，发酵液经10000rpm离心10min后收集菌体和发酵代谢产物清液。

干燥：菌体按组分比3:1比例添加保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉10份、甘油5份、谷氨酸钠2份、蔗糖3份，混匀干燥后粉碎过筛，获得植物乳杆菌粉剂，活菌数为1.8×10¹¹CFU/g。

实施例5：

枯草芽孢杆菌的制备

种子培养：将活化后的枯草芽孢杆菌，接入LB培养基中，接种比例为10％，200rpm，37℃培养5h，获得枯草芽孢杆菌种子液。

发酵培养：将枯草芽孢杆菌种子液接入LB培养基中，接种比例为8％，230rpm，37℃培养24h。

菌体收集：发酵结束后，发酵液经10000rpm离心10min后收集菌体和发酵代谢产物清液。

干燥：菌体按组分比3:1比例添加保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉10份、甘油5份、谷氨酸钠2份、蔗糖3份，混匀干燥后粉碎过筛，获得枯草芽孢杆菌粉剂，活菌数为5.6×10¹⁰CFU/g。

实施例6：

屎肠球菌的制备

种子培养：将活化后的屎肠球菌，接入TSB培养基中，接种比例为2％，200rpm，37℃培养6h，获得屎肠球菌种子液。

发酵培养：将屎肠球菌种子液接入TSB培养基中，接种比例为6％，200rpm，37℃培养9h。

菌体收集：发酵结束后，发酵液经10000rpm离心10min后收集菌体和发酵代谢产物清液。

干燥：菌体按组分比3:1比例添加保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉10份、甘油5份、谷氨酸钠2份、蔗糖3份，混匀干燥后粉碎过筛，获得屎肠球菌粉剂，活菌数为8.4×10¹⁰CFU/g。

实施例7：

产朊假丝酵母的制备

种子培养：将活化后的产朊假丝酵母，接入YEPD培养基中，接种比例为15％，180rpm，31℃培养16h，获得产朊假丝酵母种子液。

发酵培养：将产朊假丝酵母种子液接入YEPD培养基中，接种比例为10％，200rpm，31℃培养24h。

菌体收集：发酵结束后，发酵液经8500rpm离心15min后收集菌体和发酵代谢产物清液。

干燥：菌体按组分比3:1比例添加保护剂，保护剂配比为：脱脂奶粉10份、甘油5份、谷氨酸钠2份、蔗糖3份，混匀干燥后粉碎过筛，获得产朊假丝酵母粉剂，活菌数为6.8×10¹⁰CFU/g。

实施例8：

副溶血性弧菌噬菌体和植物乳杆菌复合制剂对南美白对虾生长影响的攻毒实验副溶血性弧菌噬菌体由实施例1制备获得；副溶血性弧菌噬菌体由实施例4制备获得。

试验过程：在南美白对虾的养殖池中加入终浓度为1x10⁵CFU/mL副溶血性弧菌菌液对南美白对虾进行攻毒试验，试验分复合制剂组、噬菌体组、益生菌组、普通组和阴性对照组，连续观察2周，每日观察并统计南美白对虾的死淘率，结果详见表1。复合制剂组为攻毒并添加终浓度为1x10⁶复合制剂，加水混匀后泼洒，复合制剂中噬菌体和益生菌的组分比为4:1，副溶血性弧菌噬菌体为粉剂，植物乳杆菌为粉剂，副溶血性弧菌噬菌体VP46、VP48和VP7的组分比为1:1:1；噬菌体组为攻毒并添加终浓度为1x10⁶PFU/mL副溶血性弧菌噬菌体，加水混匀后泼洒，副溶血性弧菌噬菌体为粉剂，VP46、VP48和VP7的组分比为1:1:1；益生菌组为攻毒并添加终浓度为1x10⁶CFU/mL益生菌，加水混匀后泼洒，植物乳杆菌为粉剂；普通组为攻毒但不添加制剂；阴性对照组为未作攻毒处理。死淘率＝(南美白对虾死淘数/南美白对虾总数)×100％。

表1复合制剂对南美白对虾死淘率的影响

如表1，复合制剂组与普通组的南美白对虾死淘率相比，前者更低，说明复合制剂对弧菌的抑菌作用显著，复合制剂组相比较噬菌体组和益生菌组在控制死淘率方面结果更佳，进一步说明通过配伍噬菌体和益生菌获得的新型复合制剂，能够增强噬菌体和益生菌杀菌或抑菌的协同作用，同时有利于改善南美白对虾的水质环境，且对南美白对虾无其它毒害作用，安全性较高。

实施例9：

茄科雷尔氏菌噬菌体、枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母复合制剂对姜瘟病的应用茄科雷尔氏菌噬由实施例3制备获得，菌体枯草芽孢杆菌由实施例5制备获得；产朊假丝酵母由实施例7制备获得。

试验过程：在生姜根部灌注终浓度为1x10⁵CFU/mL茄科雷尔氏菌菌液对生姜进行攻毒试验，试验分阴性对照组、复合制剂组和普通组，连续观察2周，每日观察并统计生姜的坏死率，结果详见表2。复合制剂组为攻毒并添加终浓度为1x10⁶复合制剂，加水混匀后灌根，复合制剂中噬菌体和益生菌的组分比为1:1，茄科雷尔氏菌噬菌体为水剂，枯草芽孢杆菌为粉剂，产朊假丝酵母为代谢产物水剂，枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母的组分比为3:1；噬菌体组为攻毒并添加终浓度为1x10⁶PFU/mL茄科雷尔氏菌噬菌体，加水混匀后灌根，茄科雷尔氏菌噬菌体为水剂；益生菌组为攻毒并添加终浓度为1x10⁶CFU/mL益生菌，加水混匀后灌根，枯草芽孢杆菌为粉剂，产朊假丝酵母为代谢产物水剂；普通组为攻毒但不含有复合制剂；阴性对照组为未作攻毒处理。坏死率＝(生姜坏死数/生姜总数)×100％。

表2复合制剂对生姜坏死率的影响

如表2，复合制剂组与普通组的生姜坏死率相比，前者更低，说明复合制剂对茄科雷尔氏菌的抑菌作用显著，复合制剂组相比较噬菌体组和益生菌组在控制坏死率方面的结果更佳，进一步说明通过配伍噬菌体和益生菌获得的新型复合制剂，能够增强噬菌体和益生菌杀菌或抑菌的协同作用，同时有利于改善生姜根部的土壤环境，且对生姜无其它毒害作用，安全性较高。

实施例10：

金黄色葡萄球菌噬菌体、屎肠球菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌复合制剂对仔猪油皮病的应用

金黄色葡萄球菌噬菌体由实施例2制备获得；屎肠球菌由实施例6制备获得；枯草芽孢杆菌由实施例5制备获得；植物乳杆菌由实施例4制备获得。

试验过程：将仔猪表皮用砂纸打磨至至轻微创伤，在其创口处涂抹终浓度1x10⁵CFU/mL金黄色葡萄球菌对仔猪进行攻毒试验，试验分阴性对照组、复合制剂组和普通组，连续观察2周，每日观察并统计仔猪表皮的发病率，结果详见表3。复合制剂组为攻毒并添加终浓度为1x10⁶复合制剂，加水混匀后涂抹，复合制剂中噬菌体和益生菌的组分比为1:3，金黄色葡萄球菌噬菌体为粉剂，屎肠球菌为发酵代谢水剂，枯草芽孢杆菌为粉剂，植物乳杆菌为发酵代谢水剂，屎肠球菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌的组分比为1:5:3；噬菌体组为攻毒并添加终浓度为1x10⁶PFU/mL金黄色葡萄球菌噬菌体，加水混匀后涂抹，金黄色葡萄球菌噬菌体为粉剂；益生菌组为攻毒并添加终浓度为1x10⁶CFU/mL益生菌，加水混匀后涂抹，屎肠球菌为发酵代谢水剂，枯草芽孢杆菌为粉剂，植物乳杆菌为发酵代谢水剂；普通组为攻毒但不含有复合制剂；阴性对照组为未作攻毒处理。发病率＝(仔猪油皮病发病数/仔猪总数)×100％。

表3复合制剂对仔猪油皮病发病率的影响

时间	复合制剂组	噬菌体组	益生菌组	普通组	阴性对照组
						1DAY	0％	0％	0％	0％	0％
2DAY	0％	0％	1％	1％	0％
						3DAY	1％	1％	1％	2％	0％
4DAY	1％	2％	2％	3％	0％
						5DAY	2％	2％	4％	5％	0％
6DAY	3％	3％	5％	6％	0％
						7DAY	5％	5％	6％	7％	1％
8DAY	6％	7％	8％	8％	1％
						9DAY	7％	8％	9％	10％	2％
10DAY	8％	9％	11％	12％	2％
						11DAY	8％	9％	13％	15％	3％
12DAY	9％	10％	15％	17％	4％
						13DAY	10％	10％	18％	20％	5％
14DAY	10％	11％	22％	25％	5％

如表3，复合制剂组与普通组的仔猪发病率相比，前者更低，说明复合制剂对金黄色葡萄球菌的抑菌作用显著，复合制剂组相比较噬菌体组和益生菌组在控制仔猪发病率方面的结果更佳，进一步说明通过配伍噬菌体和益生菌获得的新型复合制剂，能够增强噬菌体和益生菌杀菌或抑菌的协同作用，同时有利于改善仔猪创伤的皮肤修复，且对仔猪无其它毒害作用，安全性较高。

综合实施例1-10，所制备的新型复合制剂，能够充分体现出噬菌体和益生菌各自的优势，能针对细菌性病害均起到显著的防治效果，且过程温和，无应激性反应，绿色环保，安全性较高，在细菌性病害应用领域具有广阔前景。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。