具体实施方式

定义

如本文使用的，除非上下文另有明确说明，否则下述术语及其同源词应该具有下述含义：

“载体”指活性化合物与其一起施用的溶剂、添加剂、赋形剂、分散介质、增溶剂、包衣、防腐剂、等渗剂和吸收延迟剂、表面活性剂、推进剂、稀释剂、媒介物等等。此类载体可以是无菌液体，例如水、盐水溶液、右旋糖水溶液、甘油水溶液和油，所述油包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。

“药学上可接受的载体”指生理学上相容的任何和所有溶剂、添加剂、赋形剂、分散介质、增溶剂、包衣、防腐剂、等渗剂和吸收延迟剂、表面活性剂、推进剂、稀释剂、媒介物等等。在药剂中通常使用的量下，对待治疗的受试者无害的含义上，载体必须是“可接受的”。药学上可接受的载体与组合物的其它成分相容，而不致使该组合物不适合于其预期目的。此外，药学上可接受的载体适合用于如本文提供的受试者，而无过度的不利副作用(例如毒性、刺激性和过敏反应)。当副作用的风险超过由该组合物提供的益处时，它们是“过度的”。药学上可接受的载体或赋形剂的非限制性实例包括任何标准药物载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、以及乳剂例如油/水乳剂和微乳剂。合适的药物载体例如在E.W. Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版中进行描述。

“杀菌的”指经过18-24小时的时期，在初始细菌群体中引起细菌的死亡、或能够将细菌杀死到至少3-log10(99.9%)或更好减少的程度的特性。

“抑菌的”指抑制细菌生长的特性，包括抑制生长中的细菌细胞，因此经过18-24小时的时期，在初始细菌群体中引起2-log10(99%)或更好且直到刚好低于3-log的减少。

“抗菌的”指抑菌剂和杀菌剂两者。

“抗生素”指具有对细菌具有负面作用的特性，例如致死性或生长减少的化合物。抗生素可以对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或两者具有负面作用。例如，抗生素可以影响细菌中的细胞壁肽聚糖生物合成、细胞膜完整性、或者DNA或蛋白质合成。针对革兰氏阳性菌具有活性的抗生素的非限制性实例包括甲氧西林、万古霉素、达托霉素、莫匹罗星、溶葡萄球菌素、青霉素、氯唑西林、红霉素、碳青霉烯、头孢菌素、糖肽、林可酰胺、阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素、泰利霉素、螺旋霉素和非达霉素。

“药物抗性的”一般指对药物的抗菌活性具有抗性的细菌。当以某些方式使用时，药物抗性可以特别指抗生素抗性。在一些情况下，一般易受特定抗生素影响的细菌可以发展对抗生素的抗性，从而成为药物抗性微生物或菌株。“多重药物抗性的”(“MDR”)病原体是已发展出对各自用作单一疗法的至少两类抗微生物药物的抗性的病原体。例如，已发现某些金黄色葡萄球菌菌株对几种抗生素包括甲氧西林和/或万古霉素是抗性的(AntibioticResistant Threats in the United States，2013，U.S. Department of Health andServices，Centers for Disease Control and Prevention)。使用确定细菌对药物或抗生素的敏感性或抗性的常规实验室技术，本领域技术人员可以容易地确定细菌是否是药物抗性的。

“有效量”指这样的量，当以适当的频率或给药方案施加或施用时，所述量足以预防、减少、抑制或消除细菌生长或细菌负荷，或者预防、减少或改善待治疗病症(例如细菌病原体生长或感染)的发作、严重性、持续时间或进展，预防待治疗病症的进展，引起待治疗病症的消退，或者增强或改善另一种疗法，例如抗生素或抑菌疗法的预防或治疗效应。

“共施用”预期包括两种试剂，例如溶素肽和抗生素或任何其它抗菌剂，以序贯方式的分开施用，以及这些试剂以基本上同时的方式的施用，例如以单一混合物/组合物或以分开给予的剂量，但仍然基本上同时(例如在同一天或24小时时期内的不同时间)施用于受试者。溶素肽与一种或多种另外的抗菌剂的此类共施用可以作为持续长达数天、数周或数月的连续治疗提供。另外，取决于用途，共施用无需是连续的或同延的。例如，如果用途是作为局部抗菌剂，以治疗例如细菌性溃疡或受感染的糖尿病性溃疡，则溶素多肽可以最初仅在首次抗生素使用的24小时内施用，然后抗生素使用可以无需溶素多肽的进一步施用而继续。

“受试者”指哺乳动物、植物、低等动物、单细胞生物或细胞培养物。例如，术语“受试者”预期包括易受细菌感染影响或遭受细菌感染的生物，例如原核生物和真核生物，所述细菌感染例如革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染。受试者的实例包括哺乳动物，例如人、犬、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在某些实施方案中，受试者是人，例如患有革兰氏阳性菌感染，处于患有革兰氏阳性菌感染的风险中、或易受革兰氏阳性菌感染影响的人，无论此类感染是全身的、局部的或者以其它方式集中或局限于特定器官或组织。

“多肽”与术语“蛋白质”和“肽”可互换使用，并且指由氨基酸残基制备的聚合物。在某些实施方案中，多肽具有至少约30个氨基酸残基。该术语不仅可以包括以分离形式的多肽，还可以包括其活性片段和衍生物。术语“多肽”还涵盖了包含修饰的溶素多肽并维持溶素功能的融合蛋白或融合多肽。取决于上下文，多肽可以是天然存在的多肽，或者重组、改造或合成产生的多肽。特定的溶素多肽可以例如通过酶促或化学切割而衍生自天然蛋白质或从天然蛋白质中移除，或者可以使用常规的肽合成技术(例如固相合成)或分子生物学技术(例如Sambrook，J.等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)中公开的那些)进行制备，或者可以被策略性地截短或分段，产生活性片段，维持针对相同或至少一种共同靶细菌的裂解活性。

“融合多肽”指起因于两个或更多个核酸区段的融合的表达产物，导致通常具有两个或更多个结构域或区段(其具有不同特性或功能性)的融合表达产物。在某些实施方案中，术语“融合多肽”还指这样的多肽或肽，其包含直接或者经由氨基酸或肽接头共价连接的两个或更多个异源多肽或肽。形成融合多肽的多肽通常将C末端连接至N末端，尽管它们也可以将C末端连接至C末端、将N末端连接至N末端、或将N末端连接至C末端。术语“融合多肽”可以与术语“融合蛋白”互换使用。因此，开放式表达“包含某种结构的多肽”包括比所述结构更大的分子，例如融合多肽或构建体。本文提及的构建体可以制备为融合多肽或缀合物(通过连接两个或更多个部分)。

“异源的”指并非天然邻接的核苷酸、肽或多肽序列。例如，在本公开内容的上下文中，术语“异源的”可以用于描述两种或更多种肽和/或多肽的组合或融合，其中所述融合肽或多肽通常在自然界中未发现，例如修饰的溶素多肽和阳离子和/或聚阳离子肽、两亲性肽、sushi肽(Ding等人Cell Mol Life Sci.，65(7-8):1202-19(2008))、防御素肽(Ganz，T.Nature Reviews Immunology 3，710-720(2003))、疏水性肽和/或抗微生物肽，其可能具有增强的裂解活性。该定义中包括的是两个或更多个溶素多肽或其活性片段。这些可以用于制备具有裂解活性的融合多肽。

“活性片段”指保留了片段从其中获取的分离多肽的一种或多种功能或生物活性的多肽的一部分。如本文使用的，溶素多肽的活性片段抑制至少一个革兰氏阳性菌物种例如金黄色葡萄球菌的生长、或减少其群体、或将其杀死。

“两亲性肽”指具有亲水和疏水官能团两者的肽。在某些实施方案中，二级结构将疏水性和亲水性氨基酸残基置于两亲性肽的相对侧(例如，当肽在溶剂例如水中时，内侧相对于外侧)。在某些实施方案中，这些肽可以采取螺旋二级结构，例如α螺旋二级结构。

“阳离子肽”指具有高百分比的带正电荷的氨基酸残基的肽。在某些实施方案中，阳离子肽具有8.0或更大的pKa值。在本公开内容的上下文中，术语“阳离子肽”还涵盖了聚阳离子肽，其是由大部分带正电荷的氨基酸残基，例如赖氨酸和/或精氨酸残基组成的合成产生的肽。并非带正电荷的氨基酸残基可以是中性荷电的氨基酸残基，带负电荷的氨基酸残基和/或疏水性氨基酸残基。

“疏水基团”指对于水分子具有低亲和力或无亲和力，但对于油分子具有更高亲和力的化学基团，例如氨基酸侧链。疏水物质在水或水相中趋于具有低溶解性或无溶解性，并且通常是非极性的，但在油相中趋于具有更高的溶解性。疏水性氨基酸的实例包括甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp)。

如本文使用的，“加强”指高于其另外可能的情况的试剂的活性(例如抗微生物活性)程度。“加强”涵盖了累加以及协同(超加性)效应。

“协同”或“超加性”指通过两种物质组合造成的有益效应，其超过两种试剂独立起作用的效应总和。在某些实施方案中，协同或超加性效应显著地(即统计学显著地)超过了两种试剂独立起作用的效应总和。一种或两种活性成分可以以亚阈值水平采用，即在其下如果活性物质个别地采用则不产生效应或产生非常有限的效应的水平。可以通过此处所述的测定如棋盘测定来测量效应。

“治疗”指任何过程、动作、施加、疗法等等，其中受试者包括人类经受医疗救助，目的是直接或间接治愈病症、根除病原体或改善受试者的状况。治疗还指减少发病率、减轻症状、消除复发、预防复发、预防发病、减少发病风险、改善症状、改善预后或其组合。“治疗”可以进一步涵盖减少受试者中的细菌群体、生长速率或毒力，并且从而控制或减少受试者中的细菌感染，或者器官、组织或环境的细菌污染。因此，减少发病率的“治疗”有效抑制特定周围环境中的至少一种革兰氏阳性菌的生长，无论所述周围环境是受试者还是环境。另一方面，已经确定的感染的“治疗”指减少导致感染或污染的革兰氏阳性菌的群体、杀死革兰氏阳性菌、抑制革兰氏阳性菌的生长和/或根除革兰氏阳性菌。

术语“预防”包括预防病症例如细菌感染的发生、复发、扩散、发作或建立。并不预期将本公开内容限于完全预防或感染建立的预防。在一些实施方案中，发作被延迟，或随后感染性疾病的严重性或感染其的机会减少，并且这些构成预防的实例。关于对生物膜预防的具体提及，该术语包括预防生物膜的形成，例如通过干扰目的表面，例如医疗装置(例如，吸入器、导管、插管、瓣膜或其它假体)的表面上的细菌粘附。

“感染性疾病”指表现出临床或亚临床症状的疾病，例如发烧、败血症或菌血症的检测，以及当与此类病理状况相关的症状尚未表现出时，可以通过细菌病原体的生长(例如，在培养物中)进行检测的疾病。就医疗装置而言，特别地，感染性疾病应该包括含有细菌，例如葡萄球菌属或链球菌属细菌，并且在此类装置使用时形成的生物膜。

在肽或多肽(其如本文陈述的包括活性片段)的上下文中，术语“衍生物”预期涵盖例如修饰为含有除氨基酸外的一个或多个化学部分的多肽，所述氨基酸基本上不会不利地影响或破坏多肽的活性，例如裂解活性。化学部分可以例如经由氨基末端氨基酸残基、羧基末端氨基酸残基、或在内部氨基酸残基处与肽共价连接。此类修饰可以是天然的或非天然的。在某些实施方案中，非天然修饰可以包括在反应性部分上保护基团或封端基团的添加、可检测标记例如抗体和/或荧光标记的添加、糖基化的添加或修饰、或填充基团(bulkinggroup)例如PEG(聚乙二醇化)的添加、以及本领域技术人员已知的其它变化。在某些实施方案中，非天然修饰可以是封端修饰，例如N末端乙酰化和C末端酰胺化。可以加入溶素多肽中的示例性保护基团包括但不限于t-Boc和Fmoc。常用的荧光标记蛋白例如但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和mCherry是紧凑蛋白质，其可以与溶素多肽共价或非共价结合，或者与溶素多肽融合，而不干扰细胞蛋白质的正常功能。在某些实施方案中，将编码荧光蛋白的多核苷酸插入溶素多核苷酸序列的上游或下游。这将产生并不干扰细胞功能或它与之附着的溶素多肽的功能的融合蛋白(例如，溶素多肽::GFP)。聚乙二醇(PEG)与蛋白质的缀合已用作用于延长许多药物蛋白质的循环半衰期的方法。因此，在溶素多肽衍生物的上下文中，术语“衍生物”涵盖了通过一个或多个PEG分子的共价附着进行化学修饰的溶素多肽。预料与未聚乙二醇化的溶素多肽相比，聚乙二醇化的溶素多肽显示出延长的循环半衰期，同时保留生物活性和治疗活性。另一个实例是“artilysin”的使用，由此短的聚阳离子和两亲性α螺旋附加到溶素多肽的N或C末端以改善体外抗菌活性，例如链球菌溶素以改善体外抗链球菌活性。

“氨基酸序列同一性百分比”指在比对序列并在需要时引入缺口以达到最大的序列同一性百分比，并且不将任何保守取代视为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列例如溶素多肽序列中的氨基酸残基等同的氨基酸残基的百分比。为了确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对，可以通过在本领域的技术内的各种方式来实现，例如使用可公开获得的软件如BLAST或例如从DNASTAR商购可得的软件。两个或更多个多肽序列可以是0-100%等同的任何值，或两者之间的任何整数值。在本公开内容的上下文中，当至少80%的氨基酸残基(优选至少约85%，至少约90%，且优选至少约95%，至少约98%或至少99%)等同时，两个多肽是“基本上等同的”。如本文所述，术语“氨基酸序列同一性百分比(%)”也适用于肽。因此，术语“基本上等同的”将涵盖分离的多肽和肽，例如本文所述的那些的突变、截短、融合或以其它方式进行序列修饰的变体及其活性片段，以及与参考(野生型或其它完整)多肽相比，具有基本序列同一性(例如，如例如通过上文提及的一种或多种方法测量的至少80%、至少85%、至少90%、至少95%同一性、至少98%同一性、或至少99%同一性)的多肽。当至少约80%的氨基酸残基(优选至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%同一性或至少约99%同一性)等同、或代表保守取代时，两个氨基酸序列是“基本上同源的”。当多肽例如本文所述的溶素和/或融合多肽的一个或多个、或几个、或至多10%、或至多15%、或至多20%的氨基酸，由类似或保守的氨基酸取代进行取代时，本公开内容的多肽的序列是基本上同源的，并且其中所得到的多肽，例如本文所述的溶素和/或融合多肽，具有参考多肽，例如本文所述的溶素和/或融合多肽的至少一种活性、抗菌效应和/或细菌特异性。

如本文使用的，“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基由具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基替换的取代。具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族已在本领域中进行定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。

“可吸入组合物”指本公开内容的药物组合物，其被配制用于在常规或辅助呼吸期间或者结合常规或辅助呼吸，直接递送至呼吸道(例如，通过气管支气管内、肺和/或鼻施用)，包括但不限于雾化、雾状、干粉和/或气溶胶化制剂。

“生物膜”指附着至表面并聚集在水合聚合物基质中的细菌，所述水合聚合物基质可以由细菌和/或宿主衍生的组分组成。生物膜是微生物的聚集体，其中细胞在生物或非生物表面上彼此粘附。这些粘附细胞频繁地嵌入基质内，所述基质由细胞外聚合物质(EPS)(但不限于其)构成。也称为粘液(slime)(尽管并非描述为粘液的所有东西都是生物膜)或斑块的生物膜EPS，是一般由细胞外DNA、蛋白质和多糖组成的聚合物团块。在某些实施方案中，生物膜可以含有葡萄球菌属和/或链球菌属细菌。

在适合于针对某些细菌使用的抗生素的上下文中，“合适的”指发现针对那些细菌有效的抗生素，即使随后发展抗性。

“野生型PlySs2溶素”和“PlySs2溶素”指具有以下氨基酸序列的多肽：

MTTVNEALNNVRAQVGSGVSVGNGECYALASWYERMISPDATVGLGAGVGWVSGAIGDTISAKNIGSSYNWQANGWTVSTSGPFKAGQIVTLGATPGNPYGHVVIVEAVDGDRLTILEQNYGGKRYPVRNYYSAASYRQQVVHYITPPGTVAQSAPNLAGSRSYRETGTMTVTVDALNVRRAPNTSGEIVAVYKRGESFDYDTVIIDVNGYVWVSYIGGSGKRNYVATGATKDGKRFGNAWGTFK(SEQ ID NO：1；245个氨基酸残基，包括在翻译后加工过程中去除的起始甲硫氨酸残基，留下244个氨基酸的肽)。

如本文使用的，“修饰的溶素多肽”指野生型PlySs2溶素的非天然存在的变体(或其活性片段)。修饰的溶素多肽具有在CHAP结构域和/或SH3b结构域中的至少一个氨基酸取代，并且抑制至少一个革兰氏阳性菌物种例如金黄色葡萄球菌的生长、减少其群体或将其杀死。修饰的溶素多肽，例如具有选自SEQ ID NO：3-17的氨基酸序列的修饰的溶素多肽，公开于例如PCT申请号PCT/US2019/019638中，所述PCT申请整体引入本文作为参考。当该术语在本文中使用时，溶素多肽涵盖了修饰的溶素多肽。

在本公开内容的溶素多肽或其片段的裂解活性(抗微生物活性)的上下文中使用的“基本上”，意指野生型PlySs2溶素的至少相当一部分的抗菌活性，使得在此类活性的基础上，溶素多肽或其片段可单独使用或连同其它抗微生物剂(例如一种或多种抗生素和/或溶葡萄球菌素)一起使用，以通过杀死这些细菌来抑制、对抗或消除葡萄球菌或链球菌感染。与野生型PlySs2溶素相比，此类基本活性的非限制性实例包括野生型溶素的MIC的不多于约5倍，例如不多于约4倍、不多于约3倍或不多于约2倍。其它活性的量度可以是例如最小生物膜消除浓度(MBEC)，或使用例如动物模型，例如小鼠中性粒细胞减少症大腿感染模型(MNTI)的体内功效。再其它量度可以是与抗生素(例如万古霉素，达托霉素或β-内酰胺抗生素包括苯唑西林、萘夫西林和头孢唑林)协同作用的能力，或者改善、预防或延迟抗生素的细菌抗性发展的能力。

溶素多肽

本申请涉及溶素多肽在使革兰氏阳性菌对至少一种β-内酰胺抗生素重新敏感的方法中的用途。

溶素多肽，包括溶素PlySs2，证实了针对多重细菌的广泛杀死活性，所述多重细菌特别是革兰氏阳性菌，包括葡萄球菌属和链球菌属细菌菌株，与某些抗生素包括β-内酰胺抗生素组合提供了显著的协同作用，并且可以显著地减少抗生素所需的有效MIC剂量。此外，溶素多肽，包括溶素PlySs2，提供了使某些β-内酰胺抗生素对革兰氏阳性菌菌株重新敏感的能力，所述革兰氏阳性菌菌株先前不易受β-内酰胺抗生素影响。

溶素多肽可以与抗生素组合或共施用，所述抗生素包括例如β-内酰胺抗生素，例如苯唑西林、萘夫西林、头孢唑林和/或类似抗生素中的一种或多种，特别是用于使已发展出对抗生素的抗性的革兰氏阳性菌重新敏感。在一个特定方面，将溶素多肽与苯唑西林组合或共施用，以使革兰氏阳性菌，包括金黄色葡萄球菌，特别包括MRSA，对苯唑西林重新敏感。在一个特定方面，将溶素多肽与萘夫西林组合或共施用，以使革兰氏阳性菌，包括金黄色葡萄球菌，特别包括MRSA，对萘夫西林重新敏感。在一个特定方面，将溶素多肽与头孢唑林组合或共施用，以使革兰氏阳性菌，包括金黄色葡萄球菌，特别包括MRSA，对头孢唑林重新敏感。在本发明的一个方面，与溶素多肽的组合或共施用显著地减少了杀死革兰氏阳性菌，例如金黄色葡萄球菌，特别包括MRSA所需的抗生素剂量。

根据本发明，可以采用在本领域的技术内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中得到充分说明。参见例如，Sambrook等人，“Molecular Cloning: ALaboratory Manual”(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”第I-III卷[Ausubel，R. M.，编辑(1994)]；“Cell Biology: A Laboratory Handbook”第I-IIII卷[J.E. Celis，编辑(1994)]；“Current Protocols in Immunology”第I-III卷[Coligan，J.E.，编辑(1994)]；“Oligonucleotide Synthesis” [(M. J. Gait编辑1984)]；“NucleicAcid Hybridization” [B. D. Hames & S. J. Higgins编辑(1985)]；“TranscriptionAnd Translation” [B. D. Hames & S. J. Higgins,编辑(1984)]；“Animal CellCulture” [R. I. Freshney，编辑(1986)]；“Immobilized Cells and Enzymes” [IRLPress,(1986)]；以及B. Perbal，“A Practical Guide To Molecular Cloning”(1984)。

本文进一步公开的是在其中不存在溶素的情况下抗生素的使用失败的条件下，革兰氏阳性菌感染中溶素依赖性的抗生素功效增强。本文呈现的数据示出了PlySs2介导的抗生素活性增强，并且指示了溶素和β-内酰胺抗生素之间的一般协同作用、以及革兰氏阳性菌对β-内酰胺抗生素的重新敏感。

本文公开的溶素多肽，包括PlySs2和修饰的溶素多肽，能够杀死众多不同的革兰氏阳性菌菌株和物种，包括葡萄球菌属、链球菌属、李斯特菌属或肠球菌属细菌。特别地，PlySs2在杀死葡萄球菌菌株方面是活性的，所述葡萄球菌菌株包括抗生素敏感性和抗生素抗性金黄色葡萄球菌菌株(例如MSSA和MRSA)两者。PlySs2和修饰的溶素多肽也可能在杀死链球菌菌株(包括A群和B群链球菌菌株)方面是活性的。

在一些实施方案中，本文的溶素多肽减少了抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。可以使用评价MIC的任何已知方法。在一些实施方案中，棋盘测定用于确定溶素对抗生素浓度的作用。棋盘测定基于通过肉汤微量稀释用于MIC测定的CLSI方法的修改(参见Clinical andLaboratory Standards Institute(CLSI)，CLSI. 2015. Methods for DilutionAntimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically；Approved Standard-10th Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute，Wayne，PA，其整体引入本文作为参考，以及Ceri等人1999. J. Clin. Microbiol. 37:1771-1776，其也整体引入本文作为参考)。

通过首先制备例如96孔聚丙烯微量滴定板的列来构造棋盘，其中每个孔具有相同量的沿着水平轴稀释2倍的抗生素。在分开的平板中，制备可比较的行，其中每个孔具有相同量的沿着垂直轴稀释例如2倍的溶素。然后将溶素和抗生素稀释物组合，使得每列具有恒定量的抗生素和溶素的二倍稀释物，而每一行具有恒定量的溶素和抗生素的二倍稀释物。因此，每个孔具有溶素和抗生素的独特组合。将细菌以给定浓度加入药物组合中。然后，在37℃下在环境空气中例如16小时后，记录单独和组合的每种药物的MIC。对于每种药物计算总分级抑菌浓度(∑FIC)，并且最小∑FIC值(∑FICmin)用于确定溶素/抗生素组合的效应。

在某些实施方案中，溶素多肽是PlySs2或其活性片段。PlySs2是噬菌体溶素，其可以衍生自猪链球菌细菌。PlySs2证实了针对多重细菌的广泛杀死活性，所述多重细菌包括革兰氏阳性菌，包括葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属和李斯特菌属细菌菌株，包括抗生素抗性金黄色葡萄球菌，例如MRSA和VRSA。野生型PlySs2具有下述氨基酸序列：

MTTVNEALNNVRAQVGSGVSVGNGECYALASWYERMISPDATVGLGAGVGWVSGAIGDTISAKNIGSSYNWQANGWTVSTSGPFKAGQIVTLGATPGNPYGHVVIVEAVDGDRLTILEQNYGGKRYPVRNYYSAASYRQQVVHYITPPGTVAQSAPNLAGSRSYRETGTMTVTVDALNVRRAPNTSGEIVAVYKRGESFDYDTVIIDVNGYVWVSYIGGSGKRNYVATGATKDGKRFGNAWGTFK(SEQ ID NO：1)。SEQ ID NO：1具有245个氨基酸残基，包括在翻译后加工过程中去除的起始甲硫氨酸残基，留下244个氨基酸的多肽。氨基酸残基1至146对应于CHAP结构域，且氨基酸残基157至245对应于SH3b结构域；两个结构域之间的天然存在的接头是PPGTVAQSAP(SEQ ID NO：2)。

在某些实施方案中，溶素多肽是具有裂解活性的修饰的溶素多肽。如本文使用的，“裂解活性”涵盖了溶素杀死细菌、减少细菌群体或抑制细菌生长的能力。裂解活性还涵盖了去除或减少生物膜的能力，和/或降低抗生素的最小抑菌浓度(MIC)的能力。与野生型PlySs2溶素多肽相比，修饰的溶素多肽可以包含至少一个氨基酸取代，其中所述野生型PlySs2溶素多肽具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列、半胱氨酸、组氨酸依赖性酰胺水解酶/肽酶(CHAP)结构域、以及细胞壁结合(SH3b)结构域，并且其中至少一个氨基酸取代在CHAP结构域和/或SH3b结构域中，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死。通常，与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。在某些实施方案中，至少一个氨基酸取代在CHAP结构域中。在某些实施方案中，至少一个氨基酸取代在SH3b结构域中。在某些实施方案中，至少一个氨基酸取代在CHAP结构域和SH3b结构域中。

在一些实施方案中，修饰的溶素多肽与参考溶素多肽，例如野生型PlySs2(SEQ IDNO：1)具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%，例如至少95%，例如至少98%或例如至少99%的序列同一性。

在一些实施方案中，修饰的溶素多肽保留参考溶素多肽的一种或多种功能或生物活性。在一些实施方案中，修饰改善了溶素的抗菌活性。通常，与参考溶素多肽相比，溶素变体具有改善的体外抗菌活性(例如在缓冲液和/或培养基中)。在其它实施方案中，溶素变体具有改善的体内抗菌活性(例如，在动物感染模型中)。

在某些实施方案中，至少一个取代是在CHAP结构域中，在选自SEQ ID NO：1的氨基酸残基35、92、104、128和137的至少一个位置中。在某些实施方案中，至少一个取代是在SH3b结构域中，在选自SEQ ID NO：1的氨基酸残基164、184、195、198、204、206、212和214的至少一个位置中。在某些实施方案中，修饰的溶素多肽具有在CHAP结构域中，在选自SEQ IDNO：1的氨基酸35、92、104、128和137的至少一个位置中的至少一个取代，以及在SH3b结构域中，在选自SEQ ID NO：1的氨基酸残基164、184、195、198、204、206、212和214的至少一个位置中的至少一个取代。

在一些实施方案中，CHAP结构域中的至少一个氨基酸取代选自R35E、L92W、V104S、V128T和Y137S。在某些实施方案中，SH3b结构域中的至少一个氨基酸取代选自Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、I206E、V212A、V212E和V214G。

在某些实施方案中，修饰的溶素多肽具有在CHAP结构域中，选自R35E、L92W、V104S、V128T和Y137S的至少一个氨基酸取代，以及在SH3b结构域中，选自Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、I206E、V212A、V212E和V214G的至少一个氨基酸取代。

在另外其它实施方案中，修饰的溶素多肽具有在CHAP结构域中的至少两个氨基酸取代；在再其它实施方案中，修饰的溶素多肽具有在SH3b结构域中的至少两个氨基酸取代；在其它实施方案中，修饰的溶素多肽具有在SH3b结构域中的至少三个氨基酸取代。在另外其它实施方案中，修饰的溶素多肽具有在CHAP和SH3b结构域之间分布的5、6、7或8个氨基酸取代，并且在某些实施方案中，SEQ ID NO：1的氨基酸序列通过选自以下的3-9个氨基酸取代进行修饰：R35E、L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、1206E、V212E、V212A和V214G。

在某些实施方案中，相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列，修饰的溶素多肽包含下述氨基酸取代：(i)L92W、V104S、V128T和Y137S(pp55)；(ii)Y164N、N184D、R195E、V204K和V212E(pp388)；(iii)L92W、V104S、V128T、Y137S、S198H和I206E(pp61)；(iv)L92W、V104S、V128T、Y137S、S198Q、V204A和V212A(pp65)；(v)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D和S198Q(pp296)；(vi)V128T、Y137S和Y164K(pp616)；(vii)R35E、L92W、V104S、V128T和Y137S(pp400)；(viii)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、V204K和V212E(pp628)；(ix)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D、S198Q、V204K和V212E(pp632)；(x)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N和N184D(pp324)；(xi)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N和R195E(pp325)；(xii)L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D、V204A和V212A(pp341)；(xiii)L92W、V104S、V128T、Y137S和Y164K(pp619)；(xiv)L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、I206E和V214G(pp642)；以及(xv)L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D和S198H(pp338)。在某些实施方案中，修饰的溶素多肽具有选自SEQ ID NO. 3-17之一的氨基酸序列。

在某些实施方案中，修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：3具有至少80%的序列同一性，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。在某些实施方案中，编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：3具有至少85%的序列同一性。在某些实施方案中，编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：3具有至少85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。

在某些实施方案中，修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：4具有至少80%的序列同一性，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。在某些实施方案中，编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：4具有至少85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。

在某些实施方案中，修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：5具有至少80%的序列同一性，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。在某些实施方案中，编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：5具有至少85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。

在某些实施方案中，修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：6具有至少80%的序列同一性，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。在某些实施方案中，编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：6具有至少85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。

在某些实施方案中，修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：7具有至少80%的序列同一性，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。在某些实施方案中，编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：7具有至少85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。

在某些实施方案中，修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：8具有至少80%的序列同一性，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。在某些实施方案中，编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：8具有至少85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。

在某些实施方案中，修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：9具有至少80%的序列同一性，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。在某些实施方案中，编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：9具有至少85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。

在某些实施方案中，修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：10具有至少80%的序列同一性，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。在某些实施方案中，编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：10具有至少85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。

在某些实施方案中，修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：11具有至少80%的序列同一性，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。在某些实施方案中，编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：11具有至少85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。

在某些实施方案中，修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：12具有至少80%的序列同一性，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。在某些实施方案中，编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：12具有至少85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。

在某些实施方案中，修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：13具有至少80%的序列同一性，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。在某些实施方案中，编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：13具有至少85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。

在某些实施方案中，修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：14具有至少80%的序列同一性，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。在某些实施方案中，编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：14具有至少85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。

在某些实施方案中，修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：15具有至少80%的序列同一性，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。在某些实施方案中，编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：15具有至少85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。

在某些实施方案中，修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：16具有至少80%的序列同一性，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。在某些实施方案中，编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：16具有至少85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。

在某些实施方案中，修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：17具有至少80%的序列同一性，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。在某些实施方案中，编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：17具有至少85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。

在某些实施方案中，相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列，修饰的溶素多肽包含下述氨基酸取代：L92W、V104S、V128T和Y137S。在某些实施方案中，相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列，修饰的溶素多肽包含下述氨基酸取代：L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D和S198Q(pp296)。

还公开的是本文公开的修饰的溶素多肽的活性片段，其中所述活性片段包括CHAP结构域和/或SH3b结构域中的一个或多个氨基酸取代。

本文进一步公开的是嵌合溶素，其包含如本文公开的修饰的PlySs2 CHAP结构域、以及另一种溶素的结合结构域或另一种溶素的催化结构域、以及如本文公开的修饰的PlySs2 SH3b结构域。

多核苷酸

在一个方面，本公开内容涉及分离的多核苷酸，其包含编码如本文公开的溶素多肽或其活性片段的核酸分子。在某些实施方案中，溶素多肽是PlySs2溶素多肽(SEQ ID NO：1)。在某些实施方案中，溶素多肽选自修饰的溶素多肽(SEQ ID NO. 3-17)。在某些实施方案中，编码的溶素多肽或其活性片段抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死。

在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中与野生型PlySs2多肽(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽包含至少一个氨基酸取代，其中所述修饰的溶素多肽包含在CHAP结构域中，在选自SEQ ID NO：1的氨基酸残基35、92、104、128和137的至少一个位置中的至少一个氨基酸取代，和/或在SH3b结构域中，在选自SEQ ID NO：1的氨基酸残基164、184、195、198、204、206、212和214的至少一个位置中的至少一个氨基酸取代。在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含在SEQ ID NO：1的氨基酸残基92、104、128和137中的氨基酸取代。在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含在SEQ ID NO：1的氨基酸残基92、104、128、137、164、184和198中的氨基酸取代。

在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含相对于SEQ ID NO：1的下述氨基酸取代中的一个或多个：R35E、L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、1206E、V212E、V212A和V214G。在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含位于CHAP结构域中的下述氨基酸取代中的一个或多个：R35E、L92W、V104S、V128T和Y137S，和/或位于SH3b结构域中的下述氨基酸取代中的一个或多个：Y164N、Y164K、N184D、R195E、S198H、S198Q、V204K、V204A、I206E、V212A、V212E和V214G。

在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含相对于SEQ ID NO：1的下述氨基酸取代：L92W、V104S、V128T和Y137S。在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸分子编码与SEQ ID NO：3具有至少80%序列同一性的修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。在某些实施方案中，编码的修饰的溶素多肽与SEQ ID NO：3具有至少85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。

在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含相对于SEQ ID NO：1的下述氨基酸取代：L92W、V104S、V128T、Y137S、S198H和I206E。在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸分子编码与SEQ ID NO：4具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ IDNO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。

在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含相对于SEQ ID NO：1的下述氨基酸取代：L92W、V104S、V128T、Y137S、S198Q、V204A和V212A。在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸分子编码与SEQ ID NO：5具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。

在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含相对于SEQ ID NO：1的下述氨基酸取代：L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D和S198Q。在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸分子编码与SEQ ID NO：6具有至少80%序列同一性的修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。在某些实施方案中，编码的修饰的溶素多肽与SEQ IDNO：6具有至少85%、85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。

在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含相对于SEQ ID NO：1的下述氨基酸取代：L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K和N184D。在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸分子编码与SEQ ID NO：7具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ IDNO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。

在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含相对于SEQ ID NO：1的下述氨基酸取代：L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164N和R195E。在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸分子编码与SEQ ID NO：8具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ IDNO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。

在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含相对于SEQ ID NO：1的下述氨基酸取代：L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D和S198H。在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸分子编码与SEQ ID NO：9具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ IDNO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。

在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含相对于SEQ ID NO：1的下述氨基酸取代：L92W、V104S、V128T、Y137S、N184D、V204A和V212A。在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸分子编码与SEQ ID NO：10具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。

在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含相对于SEQ ID NO：1的下述氨基酸取代：Y164N、N184D、R195E、V204K和V212E。在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸分子编码与SEQ ID NO：11具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。

在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含相对于SEQ ID NO：1的下述氨基酸取代：R35E、L92W、V104S、V128T和Y137S。在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸分子编码与SEQ ID NO：12具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。

在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含相对于SEQ ID NO：1的下述氨基酸取代：V128T、Y137S和Y164K。在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸分子编码与SEQ ID NO：13具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。

在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含相对于SEQ ID NO：1的下述氨基酸取代：L92W、V104S、V128T、Y137S和Y164K。在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸分子编码与SEQ ID NO：14具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。

在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含相对于SEQ ID NO：1的下述氨基酸取代：L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、V204K和V212E。在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸分子编码与SEQ ID NO：15具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。

在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含相对于SEQ ID NO：1的下述氨基酸取代：L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、N184D、S198Q、V204K和V212E。在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸分子编码与SEQ ID NO：16具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。

在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含相对于SEQ ID NO：1的下述氨基酸取代：L92W、V104S、V128T、Y137S、Y164K、I206E和V214G。在某些实施方案中，核酸分子编码修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列。在某些实施方案中，核酸分子编码与SEQ ID NO：17具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的修饰的溶素多肽，其中所述修饰的溶素多肽抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死，并且任选地其中与野生型PlySs2(SEQ ID NO：1)相比，修饰的溶素多肽具有减少的免疫原性。

载体和宿主细胞

在另一个方面，本公开内容涉及包含分离的多核苷酸或本文分离的多核苷酸的互补序列的载体，所述分离的多核苷酸包含编码本文公开的溶素多肽的核酸分子。在一些实施方案中，载体是质粒或粘粒。在其它实施方案中，载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组内。在一些实施方案中，载体可以在它引入其内的宿主细胞中自主复制。在一些实施方案中，载体可以在引入宿主细胞内之后整合到宿主细胞的基因组内，并且从而连同宿主基因组一起复制。

在一些实施方案中，在本文中称为“重组表达载体”或“表达载体”的特定载体，可以指导它们与之可操作连接的基因的表达。当多核苷酸序列与另一核苷酸序列置于功能关系内时，它是“可操作地连接的”。例如，如果启动子或调控DNA序列和编码RNA和/或蛋白质的DNA序列是可操作地连接，或者这样定位使得启动子或调控DNA序列影响编码或结构DNA序列的表达水平，则两种序列被说成是“可操作地连接的”。可操作地连接的DNA序列通常但不一定是邻接的。

一般地，适合于在宿主中维持、繁殖或表达多肽的任何系统或载体，都可以用于表达本文公开的溶素多肽或其片段。可以通过各种众所周知和常规的技术中的任一种，将适当的DNA/多核苷酸序列插入表达系统内，所述技术例如Sambrook等人，编辑，Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第三版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)中阐述的那些。另外，标签也可以加入本公开内容的溶素多肽或其片段中，以提供方便的分离方法，所述标签例如c-myc、生物素、聚His等。用于此类表达系统的试剂盒是商购可得的。

广泛多样的宿主/表达载体组合可以用于表达编码本文溶素多肽的多核苷酸序列。大量的合适载体是本领域技术人员已知的，并且是商购可得的。合适载体的实例在例如Sambrook等人，编辑，Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第三版)，第1-3卷，ColdSpring Harbor Laboratory(2001)中提供。此类载体尤其包括染色体载体、附加型载体和病毒衍生的载体，例如衍生自细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒的载体，所述病毒例如杆状病毒、乳多空病毒如SV40、牛痘病毒、腺病毒、鸡痘病毒、假狂犬病毒和逆转录病毒，以及衍生自其组合的载体，例如衍生自质粒和噬菌体遗传元件的载体，如粘粒和噬菌粒。

此外，载体可以提供本公开内容的溶素多肽的组成型或诱导型表达。合适的载体包括但不限于SV40的衍生物和已知的细菌质粒，例如大肠杆菌(E. coli)质粒colEl、pCRl、pBR322、pMB9及其衍生物，质粒例如RP4、pBAD24和pBAD-TOPO；噬菌体DNA，例如噬菌体A的众多衍生物，例如NM989，以及其它噬菌体DNA，例如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒，例如2D质粒或其衍生物；可用于真核细胞中的载体，例如可用于昆虫或哺乳动物细胞中的载体；衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，例如已进行修饰以采用噬菌体DNA或其它表达控制序列的质粒；等等。上文提到的许多载体从供应商例如New England Biolabs Inc.、Addgene、Takara Bio Inc.、ThermoFisher Scientific Inc.等商购可得。

另外，载体可以包含各种调控元件(包括启动子、核糖体结合位点、终止子、增强子、用于控制表达水平的各种顺式元件)，其中根据宿主细胞来构建载体。广泛多样的表达控制序列(控制与其可操作地连接的多核苷酸序列的表达的序列)中的任一种都可以用于这些载体中，以表达编码本公开内容的溶素多肽的多核苷酸序列。有用的控制序列包括但不限于：SV40、CMV、牛痘、多瘤或腺病毒的早期或晚期启动子，lac系统，trp系统，TAC系统，TRC系统，LTR系统，噬菌体A的主要操纵子和启动子区，fd外壳蛋白的控制区，3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，酸性磷酸酶(如Pho5)的启动子，酵母交配因子的启动子，用于在细菌中表达的大肠杆菌启动子，以及已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的其它启动子序列，及其各种组合。通常，编码溶素多肽或其片段的多核苷酸序列与异源启动子或调控元件可操作地连接。

在另一个方面，本公开内容涉及分离的宿主细胞，其包含本文公开的任何载体，包括包含编码本公开内容的溶素多肽的多核苷酸序列的表达载体。广泛多样的宿主细胞可用于表达本文多肽。适合于表达本文多肽的宿主细胞的非限制性实例包括众所周知的真核和原核宿主，例如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)的菌株，真菌例如酵母，以及动物细胞例如CHO、Rl.l、B-W和L-M细胞，非洲绿猴肾细胞(例如COS 1、COS 7、BSCl、BSC40和BMT10)，昆虫细胞(例如Sf9)，以及组织培养中的人细胞和植物细胞。

尽管表达宿主可以是任何已知的表达宿主细胞，但在一个典型实施方案中，表达宿主是大肠杆菌菌株之一。这些包括但不限于商购可得的大肠杆菌菌株，例如Top10(ThermoFisher Scientific，Inc.)、DH5a(Thermo Fisher Scientific，Inc.)、XLI-Blue(Agilent Technologies，Inc.)、SCSllO(Agilent Technologies，Inc.)、JM109(Promega，Inc.)、LMG194(ATCC)、以及BL21(Thermo Fisher Scientific，Inc.)。使用大肠杆菌作为宿主系统有几个优点，包括：快速生长动力学，其中在最佳环境条件下，其倍增时间为约20分钟(Sezonov等人，J. Bacterial. 189 8746-8749(2007))，易于达到高密度培养物，用外源DNA容易且快速转化等。关于大肠杆菌中的蛋白质表达的细节，包括质粒选择以及菌株选择，由Rosano，G.和Ceccarelli，E.，Front Microbial.，5: 172(2014)详细讨论。

本文溶素多肽的有效表达取决于各种因素，例如最佳表达信号(在转录和翻译水平两者上)、正确的蛋白质折叠和细胞生长特征。关于构建载体的方法和将构建的重组载体转导到宿主细胞内的方法，可以利用本领域已知的常规方法。尽管应理解并非所有的载体、表达控制序列和宿主都同样良好地发挥功能，以表达编码公开内容的溶素多肽的多核苷酸序列，但无需过度实验，本领域技术人员将能够选择适当的载体、表达控制序列和宿主，以实现所需的表达，而不脱离本公开内容的范围。

本公开内容的溶素多肽可以通过众所周知的方法，从重组细胞培养物中回收且纯化，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析和凝集素层析。高效液相层析也可以用于溶素多肽纯化。

可替代地，用于产生本公开内容的溶素多肽的载体系统可以是无细胞表达系统。各种无细胞表达系统是商购可得的，包括但不限于可从Promega、LifeTechnologies、Clonetech等获得的那些。

包含溶素多肽的组合物

本文公开的溶素多肽可以单独或与一种或多种常规抗生素和其它杀菌剂一起，掺入抗微生物和杀菌组合物及其单位剂型内。

通常，组合物含有其量有效杀死革兰氏阳性菌的如本文公开的溶素多肽。在某些实施方案中，革兰氏阳性菌选自金黄色葡萄球菌；单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)；凝固酶阴性葡萄球菌，例如来自表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)群、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)群、模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)群、中间葡萄球菌(Staphylococcus intermedius)群、松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)群、以及猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)群；猪链球菌；化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)；无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)；停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)；肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)；草绿色链球菌(viridans streptococci)群中包括的物种，例如咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosis)群、轻型链球菌(Streptococcus mitis)群、血链球菌(Streptococcus sanguinis)群、牛链球菌(Streptococcus bovis)群、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)群、以及变形链球菌(Streptococcus mutans)群；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；和屎肠球菌(Enterococcus faecium)。

本文公开的组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、粒丸、胶囊、含有液体的胶囊、粉末、缓释制剂、栓剂、棉塞施加、气溶胶、喷雾剂、锭剂、糖锭、糖果、注射剂、口香糖、软膏、涂片、定时释放贴剂、吸收液体的擦布及其组合。因此，组合物可以作为固体采用，例如片剂、用于重构的冻干粉末、脂质体或胶束，或者组合物可以作为液体采用，例如溶液、悬浮液、含漱液、乳剂、或者填充固体或液体的胶囊，例如用于经口使用。在某些实施方案中，组合物可以是用于直肠施用的栓剂或胶囊的形式，或者是用于肠胃外(包括例如静脉内或皮下)或局部(例如皮肤、鼻、咽或肺)使用的无菌可注射或可吸入溶液或悬浮液的形式。此类组合物包括药物组合物，并且其单位剂型可以包含以常规或专门比例的常规或新成分，伴随或不伴随另外的活性化合物或成分。此类单位剂型可以含有与待采用的预期日剂量范围相称的，活性成分的任何合适有效量。

载体和赋形剂可以选自对于人或兽医学用途可接受的各种各样的物质。药学上可接受的载体或赋形剂的非限制性实例包括任何标准药物载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、多元醇、二糖或多糖、以及乳剂例如油/水乳剂和微乳剂。其它稳定赋形剂包括稳定和保护溶液(SPS)的有专利权的共混物、环糊精和重组人白蛋白(rHSA)。其它赋形剂可以包括填充剂、缓冲剂、张力调节剂(例如盐和氨基酸)、表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂和共溶剂。对于包含本文公开的溶素多肽的固体经口组合物，合适的药学上可接受的赋形剂包括但不限于淀粉、糖、稀释剂、制粒剂、润滑剂、结合剂、崩解剂等等。对于液体经口组合物，合适的药学上可接受的赋形剂可以包括但不限于水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂等等。对于局部用固体组合物，例如乳膏、凝胶、泡沫、软膏或喷雾剂，合适的赋形剂可以包括但不限于乳膏、纤维素或油性基质、乳化剂、硬化剂、流变改性剂或增稠剂、表面活性剂、润肤剂、防腐剂、保湿剂、碱化剂或缓冲剂和溶剂。

例如，本文公开的溶素多肽可以与缓冲液组合，所述缓冲液将液体悬浮液、溶液或乳剂的pH维持在基本上不影响溶素多肽的活性的范围内。例如，其中在施用后发现活性成分的组合物或环境的期望pH范围可以为约4.0至约9.0，例如约4.5至约8.5。

可以任选地包括稳定缓冲液，以允许溶素多肽以优化的方式发挥其活性。缓冲液可以含有还原剂，例如二硫苏糖醇。稳定缓冲液也可以是或包括金属螯合剂，例如乙二胺四乙酸二钠盐，或者它可以含有磷酸盐或柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液、或任何其它缓冲剂例如Tris或琥珀酸盐。

温和表面活性剂可以以有效加强组合物中使用的溶素多肽的疗效的量包括在药物组合物中。合适的温和表面活性剂尤其可以包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇和脂肪酸的酯(例如Tween系列)、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(例如Triton-X系列)、正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷、正癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正十二烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷、泊洛沙姆、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚乙二醇和生物学上存在的表面活性剂例如脂肪酸、甘油酯、甘油单酯、脱氧胆酸盐和脱氧胆酸的酯。

防腐剂也可以用于本文公开的组合物中，并且例如可以占按总组合物重量计的约0.05%至约0.5%。防腐剂的使用可以确保如果产物被微生物污染，则制剂将预防或减少微生物生长(或减弱制剂的效力)。示例性的防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、氯二甲酚、苯甲酸钠、DMDM乙内酰脲、3-碘-2-丙基丁基氨基甲酸酯、山梨酸钾、氯己定二葡萄糖酸盐或其组合。

对于经口施用，可以将本文公开的溶素多肽配制成固体或液体制剂，例如片剂、胶囊、粉末、溶液、悬浮液和分散体。对于以片剂或胶囊形式的经口施用，活性成分可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合，所述赋形剂例如结合试剂(例如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇、其它还原糖和非还原糖、微晶纤维素、硫酸钙或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、硬脂酸、硬脂酰富马酸钠、山嵛酸甘油酯、硬脂酸钙等等)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或乙醇酸淀粉钠)；润湿剂(例如月桂基硫酸钠)、着色剂和调味剂、明胶、甜味剂、天然和合成树胶(例如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸盐)、缓冲盐、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等等。对于以液体形式的经口施用，药物组分可以与无毒的药学上可接受的惰性载体(例如乙醇、甘油、水)、悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)、乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)、非水性媒介物(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油)、防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)等等组合。也可以加入稳定剂如抗氧化剂(例如BHA、BHT、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠或柠檬酸)，以稳定剂型。

在某些实施方案中，片剂可以通过本领域众所周知的方法进行包被。本文公开的组合物还可以引入微球体或微胶囊中，所述微球体或微胶囊例如由聚乙醇酸/乳酸(PGLA)制成。用于经口施用的液体制剂可以采取例如溶液、糖浆、乳剂或悬浮液的形式，或者它们可以作为干燥产物呈现，用于在使用前用水或其它合适的媒介物重构。用于经口施用的制剂可以适当地进行配制，以提供活性化合物的控制或延缓释放。

活性剂也可以以脂质体递送系统的形式施用，例如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。如众所周知的，脂质体可以由各种磷脂，例如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱形成。

为了制备固体组合物，例如片剂和丸剂，如本文公开的溶素多肽可以与药物赋形剂混合，以形成固体预配制组合物。需要时，片剂可以通过标准技术进行糖衣包被或肠溶衣包被。片剂或丸剂可以进行包被或以其它方式配混，以提供具有延长或延迟作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包括内部剂量和外部剂量组分，后者为在前者上的包封形式。这两种组分可以由肠溶层分开，所述肠溶层作用于抵抗胃中的崩解，并且允许内部组分完整通过进入十二指肠内或在释放中进一步延迟。各种材料可以用于此类肠溶层或包衣，此类材料包括许多聚合酸，以及聚合酸与此类材料如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素的混合物。类似地，经口施用的药剂可以以时间控制释放媒介物的形式施用，包括扩散控制系统、渗透装置、溶出控制基质和易蚀/可降解基质。

如本文公开的局部用组合物可以进一步包含药学上或生理学上可接受的载体，例如皮肤病学或耳科可接受的载体。在皮肤病学可接受的载体的情况下，此类载体可以与皮肤、指甲、粘膜、组织和/或毛发相容，并且可以包括满足这些要求的任何照常规使用的皮肤病学载体。在耳科可接受的载体的情况下，载体可以与耳的所有部分相容。此类载体可以由本领域普通技术人员容易地选择。用于本文公开的化合物的局部施用的载体包括但不限于矿物油、液体石蜡、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯和/或聚氧丙烯化合物、乳化蜡、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。在配制皮肤软膏时，本公开内容的活性组分可以在油质烃基、无水吸收基、油包水吸收基、水包油水可去除基和/或水溶性基中进行配制。在配制耳用组合物时，本公开内容的活性组分可以在水性聚合物悬浮液中进行配制，所述水性聚合物悬浮液包括此类载体例如葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖凝胶、Gelrite®、纤维素聚合物如羟丙基甲基纤维素、以及含羧基聚合物例如丙烯酸的聚合物或共聚物、以及其它聚合物缓和剂。如本文公开的局部用组合物可以是适合于局部施加的任何形式，包括水性、水-醇或油性溶液；洗剂或血清分散体；水性、无水或油性凝胶；通过将脂肪相分散在水相中(O/W或水包油)，或相反地将水相分散在脂肪相中(W/O或油包水)得到的乳剂，微乳剂或可替代地微胶囊，微粒或离子和/或非离子型脂质囊泡分散体，乳膏，洗剂，凝胶，泡沫(其可以使用加压罐、合适的施药器、乳化剂和惰性推进剂)，香精，乳，悬浮液或贴剂。本文公开的局部用组合物还可以含有佐剂，例如亲水性或亲脂性胶凝剂、亲水性或亲脂性活性剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、香料、填料、防晒剂、气味吸收剂和染料。在一个进一步方面，本文公开的局部用组合物可以与装置结合施用，所述装置例如透皮贴剂、敷料、垫、包裹物、基质和绷带，其能够粘附或以其它方式与受试者的皮肤或其它组织或器官结合，能够递送治疗有效量的如本文公开的一种或多种溶素多肽或其片段。

在一些实施方案中，本文公开的局部用组合物另外包含用于治疗局部烧伤的一种或多种组分。此类组分可以包括但不限于丙二醇水凝胶；二醇、纤维素衍生物和水溶性铝盐的组合；防腐药；抗生素；和皮质类固醇。也可以添加保湿剂(例如固体或液体蜡酯)、吸收促进剂(例如亲水性粘土或淀粉)、增粘剂和皮肤保护剂。局部用制剂可以以漂洗剂例如漱口液的形式。参见例如，WO2004/004650。

本文公开的溶素多肽也可以通过注射包含适当量的溶素多肽和载体的治疗剂来施用。例如，溶素多肽可以肌内、脑室内、鞘内、真皮下、皮下、腹膜内、静脉内、或者通过直接注射或连续输注来施用，以治疗细菌例如革兰氏阳性菌导致的感染。载体可以由蒸馏水、盐水溶液、白蛋白、血清或其任何组合构成。另外，肠胃外注射的药物组合物可以包含溶素多肽的药学上可接受的水溶液或非水溶液，加上下述中的一种或多种：pH缓冲溶液、佐剂(例如防腐剂、湿润剂、乳化剂、稳定剂和分散试剂)、脂质体制剂、纳米颗粒、分散体、悬浮液和乳剂，以及用于恰在使用前重构成无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。

在某些实施方案中，注射用制剂可以以单位剂型存在于例如安瓿或多剂量容器中，并且在某些实施方案中，可以包括添加的防腐剂。组合物可以采取此类形式如赋形剂、悬浮液、溶液或者在油性或水性媒介物中的乳剂，并且可以含有配制试剂，例如悬浮、稳定、填充和/或分散试剂。活性成分可以是粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原水重构。缓冲剂的实例可以包括组氨酸、Tris、磷酸盐、琥珀酸、柠檬酸盐、甲硫氨酸、胱氨酸、甘氨酸、温和表面活性剂、钙和镁。还可以包括还原剂，例如二硫苏糖醇。

在其中肠胃外注射是选定的施用模式的情况下，可以使用等渗制剂。一般地，用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，可以使用等渗溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。稳定剂可以包括组氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、精氨酸、明胶和白蛋白例如人或牛血清白蛋白。普通技术人员将容易了解，许多前述赋形剂也可以用于注射用组合物中。

血管收缩剂可以加入本文公开的组合物中。在某些实施方案中，可以提供无菌且无热原的组合物。

在另一个实施方案中，本文公开的组合物可以是干燥的可吸入粉末或其它可吸入组合物，例如气溶胶或喷雾剂。本文公开的可吸入组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。为了通过吸入施用，溶素多肽可以方便地以来自此类装置(如吸入器、加压气溶胶分配器或喷雾器)的气溶胶喷雾呈现的形式递送，伴随使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压气溶胶的情况下，可以通过提供阀门来确定剂量单位，以递送计量的量。可以配制用于吸入器或吹入器中的例如明胶的胶囊和药液筒，其含有活性成分和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。

在一个实施方案中，本文公开的溶素多肽可以配制为干燥的可吸入粉末或者气溶胶或喷雾剂。在具体实施方案中，溶素多肽吸入溶液可以进一步与用于气溶胶递送的推进剂一起配制。在某些实施方案中，溶液可以是雾状的。许多分配装置在本领域中可用于通过吸入递送药物组合物，包括多肽。这些包括喷雾器、加压气溶胶分配器和吸入器。

表面活性剂可以加入如本文公开的可吸入药物组合物中，以便降低药剂和推进剂之间的表面和界面张力。当药剂、推进剂和赋形剂形成悬浮液时，可能需要或可能不需要表面活性剂。当药剂、推进剂和赋形剂形成溶液时，表面活性剂可能是必需的或可能不是必需的，部分取决于特定药剂和赋形剂的溶解性。表面活性剂可以是任何合适的无毒化合物，其与药剂不反应，并且降低药剂、赋形剂和推进剂之间的表面张力和/或充当阀门润滑剂。

合适表面活性剂的实例包括但不限于：油酸；脱水山梨糖醇三油酸酯；十六烷基氯化吡啶鎓；大豆卵磷脂；聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯；聚氧乙烯(10)硬脂醚；聚氧乙烯(2)油醚(oleyl ether)；聚氧丙烯-聚氧乙烯乙二胺嵌段共聚物；聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单硬脂酸酯；聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯；聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物；蓖麻油乙氧基化物；及其组合。

合适推进剂的实例包括但不限于：二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷和二氧化碳。

用于可吸入组合物中的合适赋形剂的实例包括但不限于：乳糖、淀粉、中链脂肪酸的丙二醇二酯；中链脂肪酸、短链或长链的甘油三酸酯、或其任何组合；全氟二甲基环丁烷；全氟环丁烷；聚乙二醇；薄荷醇；丙二醇单月桂酸酯(lauroglycol)；二甘醇单乙醚；中链脂肪酸的聚乙二醇化甘油酯；醇；桉树油；短链脂肪酸；及其组合。

在一些实施方案中，本文公开的组合物包含鼻施加剂。鼻施加剂包括例如鼻喷雾剂、滴鼻剂、鼻软膏、鼻洗液、鼻注射剂、鼻填充物、支气管喷雾剂和吸入剂，或间接地通过使用润喉片、漱口液或含漱液，或通过使用施加于鼻孔或脸的软膏，或这些施加方法和类似施加方法的任何组合。

本文公开的组合物也可以配制为用于直肠施用，例如作为栓剂或保留灌肠剂(例如，含有常规的栓剂基质，例如可可脂或其它甘油酯)。

在某些实施方案中，本文公开的组合物可以进一步包含至少一种抗生素，例如有效抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死的至少一种抗生素。在某些实施方案中，至少一种抗生素有效针对以下中的一种或多种：金黄色葡萄球菌；单核细胞增多性李斯特菌；凝固酶阴性葡萄球菌，例如来自表皮葡萄球菌群、腐生葡萄球菌群、模仿葡萄球菌群、中间葡萄球菌群、松鼠葡萄球菌群和猪葡萄球菌群；猪链球菌；化脓性链球菌；无乳链球菌；停乳链球菌；肺炎链球菌；草绿色链球菌群中包括的物种，例如咽峡炎链球菌群、轻型链球菌群、血链球菌群、牛链球菌群、唾液链球菌群和变形链球菌群；粪肠球菌；和屎肠球菌。

在本文公开的组合物的某些实施方案中，与至少一种抗生素组合的溶素多肽可以显示出协同作用，例如在溶素多肽、片段或抗生素抑制至少一个革兰氏阳性菌物种的生长、减少其群体或将其杀死的能力中的协同作用。协同作用可以指两种活性剂的组合的抑制活性，其中关于所述组合的分级抑菌浓度(FIC)指数小于1，并且对于强协同作用，小于或等于0.5。试剂的FIC是当与另一种试剂组合使用时，杀死细菌的试剂的最小浓度，除以当第一试剂单独使用时具有相同效应的第一试剂的浓度。关于A和B组合的FIC指数是其个别FIC值的总和。

协同作用可以在棋盘测定中进行评估(并且可以通过时间杀死曲线进行验证)。每个棋盘测定生成许多不同的组合，并且按照惯例，最有效组合的FIC值用于计算FIC指数。FIC指数定义了相互作用的性质。具有加性相互作用的抗微生物剂具有FIC指数1；FIC指数<1定义了协同相互作用；FIC指数>1的组合是拮抗性的。FIC指数越低，组合的协同作用越强。参见例如，Singh，P.K.等人，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 279: L799–L805，2000。基于溶素多肽和抗生素的共施用，协同作用已暗示了有效的、新的通用抗感染策略。特别地，溶素多肽和抗生素中的每种和两者可以以减少的剂量和量施用，伴随增强的杀菌和抑菌活性，并且伴随降低的抗性发展风险。换言之，协同作用的益处不仅在一种或两种试剂以亚MIC浓度使用时才实现，尽管可以通过用每种试剂的亚MIC浓度测试来揭示协同作用的存在。

方法

本文公开的溶素多肽可以施用于有此需要的受试者，例如活动物(包括人)，用于治疗、减轻或改善、缓解或消除易受其影响的适应症或状况。特别地，如本文公开的，溶素多肽可以与至少一种β-内酰胺抗生素共施用，并且用于使革兰氏阳性菌对至少一种β-内酰胺抗生素重新敏感的方法中。

相应地，本公开内容的溶素多肽可以与至少一种β-内酰胺抗生素在体内共施用，例如以治疗受试者中由于革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌的细菌感染，以及在体外共施用，例如以减少例如在例如医疗装置的表面上的细菌污染水平，并且使革兰氏阳性菌对至少一种β-内酰胺抗生素重新敏感。

如上文讨论的，当先前对特定抗生素敏感的细菌发展出对该抗生素的抗性时，可能出现抗生素抗性，并且抗生素的进一步施用无法预防、控制、破坏或治疗细菌感染。重新敏感是细菌恢复对抗生素的敏感性的能力，细菌先前针对所述抗生素是抗性的。因此，根据某些方面，本文公开的是使受试者中的革兰氏阳性菌对至少一种抗生素，例如至少一种β-内酰胺抗生素重新敏感的方法，该方法包括向受试者共施用至少一种抗生素和溶素多肽，从而使革兰氏阳性菌对至少一种抗生素重新敏感。在某些实施方案中，溶素多肽可以是PlySs2(SEQ ID NO：1)或其活性片段。在某些实施方案中，溶素多肽可以是修饰的溶素多肽，其具有选自SEQ ID NO. 3-17的氨基酸序列。

在一个方面，溶素多肽和至少一种抗生素是序贯施用的；例如，在某些实施方案中，在施用至少一种抗生素之前施用溶素多肽。在一个方面，溶素多肽和至少一种抗生素是基本上同时施用的。在某些实施方案中，在施用溶素多肽之前，至少一种抗生素对减少革兰氏阳性菌的群体、杀死革兰氏阳性菌、抑制其生长和/或将其根除是无效的。

在一些实施方案中，本文溶素多肽可以与至少一种β-内酰胺抗生素共施用，用于使形成生物膜的革兰氏阳性菌对至少一种β-内酰胺抗生素重新敏感，并且预防、控制、破坏和治疗由革兰氏阳性菌形成的细菌生物膜。当微生物细胞彼此粘附并嵌入表面上的细胞外聚合物质(EPS)的基质中时，出现生物膜形成。在富含生物大分子(例如多糖、核酸和蛋白质)和营养素的此类受保护环境中，微生物的生长允许增强的微生物串扰和增加的毒力。生物膜可能在任何支持环境中发展，所述支持环境包括生物和非生物表面，例如CF肺的粘液塞、被污染的导管、植入物、隐形眼镜等(Sharma等人Biologicals，42(1):1-7(2014)，其整体引入本文作为参考)。由于生物膜保护细菌，因此它们经常对传统的抗微生物处理更具抗性，使其成为严重的健康风险，其通过每年报告的多于一百万例导管相关性尿路感染(CAUTI)得到证明，其中许多可以归于生物膜相关细菌(Donlan，RM(2001)Emerg Infect Dis7(2):277-281； Maki D和Tambyah P(2001)Emerg Infect Dis 7(2):342-347)。

因此，在一个实施方案中，本公开内容的溶素多肽可以与至少一种β-内酰胺抗生素共施用，并且用于使革兰氏阳性菌对至少一种β-内酰胺抗生素重新敏感，并且当革兰氏阳性菌受到细菌生物膜的保护时，预防、控制、破坏和治疗由于革兰氏阳性菌的细菌感染。

在一个方面，本公开内容涉及使如本文所述的革兰氏阳性菌对至少一种β-内酰胺抗生素重新敏感的方法，其包括向诊断有细菌感染、处于细菌感染的风险中、或显示出细菌感染的症状的受试者施用如本文所述的药物组合物。

本文公开的协同作用数据指示了，在一些实施方案中，本文溶素能够驱动革兰氏阳性菌的重新敏感，所述革兰氏阳性菌包括MDR生物，例如实施例中所述的MRSA。一般地，重新敏感在协同组合中出现，其中抗生素MIC值低于建立的断点，例如，对于抗生素敏感性细菌<2的MIC值，对于中度敏感性细菌为4的MIC值，以及对于抗生素抗性细菌，例如β-内酰胺抗性分离株> 8的MIC值。参见Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)，CLSI. 2019. M100 Performance Standards for Antimicrobial SusceptibilityTesting；第29版。Clinical and Laboratory Standards Institute，Wayne，PA。如本文使用的，断点值是选定的抗生素浓度(例如，mg/L)，其限定了细菌菌株是对抗生素敏感还是抗性。如果抗生素的MIC值小于或等于断点值，则细菌被视为对该抗生素敏感。

术语“感染”和“细菌感染”意欲包括呼吸道感染(RTI)，例如患有囊性纤维化(CF)的患者中的呼吸道感染，下呼吸道感染，例如慢性支气管炎急性加剧(ACEB)，急性鼻窦炎，社区获得性肺炎(CAP)，医院获得性肺炎(HAP)和医院呼吸道感染；性传播疾病，例如淋球菌性宫颈炎和淋球菌性尿道炎；尿路感染；急性中耳炎；败血症包括新生儿败血症和导管相关败血症；和骨髓炎。还考虑了由药物抗性细菌和多重药物抗性细菌引起的感染。

由革兰氏阳性菌引起的感染的非限制性实例可以包括：A)医院感染：1. 尤其是在囊性纤维化患者和机械通气患者中的呼吸道感染；2. 菌血症和败血症；3. 伤口感染，特别是烧伤受害者的伤口感染；4. 尿路感染；5. 侵入性装置上的手术后感染；6. 通过静脉内施用被污染的药物溶液的心内膜炎；7. 具有获得性免疫缺陷综合症、癌症化学疗法、类固醇疗法、血液系统恶性肿瘤、器官移植、肾脏替代疗法和伴有严重中性粒细胞减少症的其它状况的患者中的感染。B)社区获得性感染：1. 社区获得性呼吸道感染；2. 脑膜炎；3. 通过被污染的水引起的毛囊炎和耳道感染；4. 老年人和糖尿病患者中的恶性外耳炎；5. 儿童中的跟骨骨髓炎；6. 通常与被污染的隐形眼镜相关的眼部感染；7. 手频繁暴露于水的人中的皮肤感染，例如指甲感染；8. 胃肠道感染；以及9. 骨骼肌肉系统感染。

本文方法的一个或多个革兰氏阳性菌物种可以包括如本文所述或本领域已知的任何革兰氏阳性菌物种。通常，革兰氏阳性菌物种可以包括单核细胞增多性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌(包括至少40个公认的物种，包括但不限于表皮葡萄球菌群、腐生葡萄球菌群、模仿葡萄球菌群、中间葡萄球菌群、松鼠葡萄球菌群、猪葡萄球菌群、以及由“未指定物种群”提及的任何分离株)、猪链球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、肺炎链球菌、草绿色链球菌群中包括的任何另外物种(包括但不限于咽峡炎链球菌群、轻型链球菌群、血链球菌群、牛链球菌群(现为解没食子酸链球菌(gallolyticus))、唾液链球菌群和变形链球菌群中包括的所有物种和菌株)、粪肠球菌和屎肠球菌。革兰氏阳性菌的其它实例包括但不限于放线菌属(Actinomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和梭菌属(Clostridium)。

本公开内容的溶素多肽或其片段与一种或多种β-内酰胺抗生素共施用，所述β-内酰胺抗生素包括但不限于青霉素及其衍生物、头孢菌素、单环内酰胺、碳青霉烯和碳头孢烯。在某些实施方案中，至少一种β-内酰胺抗生素可以选自青霉素、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、替莫西林、阿莫西林、氨苄西林、美西林、羧苄西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林、哌拉西林、头孢唑林、头孢氨苄、头孢菌素、头孢噻吩、头孢克洛、头孢孟多、头孢呋辛、头孢替坦、头孢西丁、头孢克肟、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢地尼、头孢吡肟、头孢匹罗、头孢洛林、比阿培南、多利培南、厄他培南、法罗培南、亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、雷珠培南、泰比培南和噻烯霉素。在某些实施方案中，至少一种β-内酰胺抗生素可以选自苯唑西林、萘夫西林、头孢唑林和甲氧西林。在某些实施方案中，可能期望个别地或以如在本领域的技术内的各种组合，施用一种或更多种另外的标准护理抗生素或作为最后一招的抗生素。除β-内酰胺抗生素外，针对革兰氏阳性菌使用的传统抗生素在本文中进行描述，并且可以例如包括万古霉素、达托霉素、莫匹罗星、溶葡萄球菌素、青霉素、氯唑西林、红霉素、碳青霉烯、头孢菌素、糖肽、林可酰胺、阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素、泰利霉素、螺旋霉素和非达霉素。

将本公开内容的溶素多肽与至少一种β-内酰胺抗生素组合提供了有效的抗菌方案。在一些实施方案中，本公开内容的溶素多肽或其活性片段与一种或多种β-内酰胺抗生素的共施用可以按以下进行：减少的剂量和量的溶素多肽或β-内酰胺抗生素或两者，和/或伴随加强的杀菌和抑菌活性的减少频率和/或持续时间的治疗，抗生素抗性的风险降低以及有害的神经或肾脏副作用的风险降低。如本文使用的，术语“减少的剂量”指与具有相同活性成分的单一疗法相比，组合中的一种活性成分的剂量。在一些实施方案中，与各自的单一疗法相比，组合中的溶素多肽或β-内酰胺抗生素的剂量可能是亚最佳的或甚至亚阈值的。

在一些实施方案中，本公开内容提供了通过向受试者施用本文公开的一种或多种溶素多肽连同目的β-内酰胺抗生素，与单独使用的所述β-内酰胺抗生素的活性相比，加强一种或多种β-内酰胺抗生素针对革兰氏阳性菌的抗生素活性的方法。共施用溶素多肽和β-内酰胺抗生素有效针对革兰氏阳性菌，并且允许克服针对抗生素的抗性和/或以较低剂量采用抗生素，减少不期望的副作用。

在使革兰氏阳性菌对至少一种β-内酰胺抗生素重新敏感的方法的一些实施方案中，该方法包括使革兰氏阳性菌与如本文所述的溶素多肽和至少一种β-内酰胺抗生素接触，其中所述革兰氏阳性菌存在于例如医院以及其它健康有关或公共用途的建筑物中的医疗装置、地板、楼梯、墙壁和台面的表面上，以及手术室、急诊室、病房、诊所和浴室等等中的设备的表面上。

可以使用本文描述的方法进行保护的医疗装置的实例包括但不限于医疗装置的管材和其它表面，所述医疗装置例如导尿管、粘液抽吸导管、吸引导管、脐带套管、隐形眼镜、子宫内装置、阴道内和肠内装置、气管内插管、支气管镜、牙科假体和正畸装置、外科器械、牙科器械、管材、牙科输水管、织物、纸张、指示条(例如纸指示条或塑料指示条)、粘合剂(例如水凝胶粘合剂、热熔粘合剂或溶剂基粘合剂)、绷带、组织敷料或愈合装置和闭塞性贴剂、以及医疗领域中使用的任何其它表面装置。装置可以包括电极、外部假体、固定胶带、压迫绷带和各种类型的监视器。医疗装置还可以包括这样的任何装置，其可以置于插入或植入部位处，例如靠近插入或植入部位的皮肤，并且可以包括易受由革兰氏阳性菌定植影响的至少一个表面。

剂量和施用

施用的剂量取决于许多因素，例如待治疗感染的活性；待治疗受试者的年龄、健康和一般身体状况；特定溶素多肽的活性；根据本公开内容的溶素多肽与其配对的抗生素(如果存在的话)的性质和活性；以及此类配对的组合效应。在某些实施方案中，待施用的溶素多肽或其片段的有效量可以落入约0.1-100 mg/kg(或1至100 mcg/ml)的范围内，例如0.5mg/kg至30 mg/kg。在某些实施方案中，溶素多肽可以每天施用1-4次，持续范围为1至14天的时期。考虑到任何协同作用，抗生素可以按标准给药方案或以较低量施用。然而，所有此类剂量和方案(无论是溶素多肽还是与之结合施用的任何抗生素)都经受了优化。最佳剂量可以通过执行如在本领域的技术内的体外和体内先导功效实验来确定，但将本公开内容考虑进去。

考虑本文公开的溶素多肽可以提供快速杀菌，并且当以亚MIC量使用时，可以提供抑菌效应。进一步考虑本文公开的溶素多肽可以针对一系列抗生素抗性细菌是活性的。基于本公开内容，在临床环境中，本文溶素多肽可以是有力的添加剂，用于治疗起于药物抗性和多重药物抗性细菌的感染，并且克服对β-内酰胺抗生素的抗性。

在一些实施方案中，对本文公开的溶素多肽的暴露时间可以影响所需浓度的活性多肽单元/ml。被分类为“长”或“缓慢”释放载体的载体(例如某些鼻喷雾剂或锭剂)可能具有或提供较低浓度的多肽单位/ml，但在更长的时间段内，而“短”或“快速”释放载体(例如，含漱液)可能具有或提供高浓度的多肽单位(mcg)/ml，但在较短的时间段内。存在其中可能期望具有较高的单位/ml剂量或较低的单位/ml剂量的情况。

对于本公开内容的溶素多肽和β-内酰胺抗生素，可以最初在细胞培养测定或动物模型(通常为小鼠、兔、犬或猪)中估计治疗有效剂量。动物模型也可以用于达到期望的浓度范围和施用途径。获得的信息然后可以用于确定人中的有效剂量以及施用途径。可以进一步调整剂量和施用，以提供足够水平的活性成分或维持所需效应。可以加以考虑的另外因素包括疾病状态的严重性；患者的年龄、重量和性别；饮食；所需的治疗持续时间；施用方法；施用时间和频率；药物组合；反应敏感性；对疗法的耐受/应答；和主治医师的判断。

治疗方案可以需要每天施用(例如，每天一次、两次、三次等)，每隔一天(例如，每隔一天一次、两次、三次等)，每半周一次，每周一次、每两周一次、每月一次等。在一个实施方案中，治疗可以作为连续输注给予。单位剂量可以多次施用。间隔也可以是如通过监测临床症状所指示的不规则的。可替代地，单位剂量可以作为缓释制剂施用，在这种情况下，可以使用较不频繁的施用。剂量和频率可能取决于患者而不同。本领域技术人员将理解，此类指南将对于局限性施用(例如鼻内、吸入、直肠等)、或全身性施用(例如经口、直肠(例如经由灌肠剂)、肌内(i.m.)、腹膜内(i.p.)、静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、经尿道等等)进行调整。

本文公开的具体实施方案可以使用“由……组成”和/或“基本上由……组成”的语言，在权利要求中进一步限制。当在权利要求中使用时，无论是按提交还是按修正添加的，过渡术语“由……组成”排除权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。过渡术语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤，以及那些不会实质性影响基本和新型特征的材料或步骤。如此请求保护的本发明的实施方案在本文中固有地或明确地描述且能够实施。申请人保留放弃本文描述的任何实施方案或特征的权利。

实施例

本文所述的方法和溶素多肽及其制备、表征和用途，与下述实施例结合将得到更好地理解，所述实施例预期作为对本公开内容的范围的说明而非限制。

实施例1 - PlySs2溶素和β-内酰胺抗生素之间的协同作用

使用逐步方法来评估作为重新敏感剂的PlySs2。首先，肉汤微量稀释棋盘测定用于确定针对9个不同MRSA菌株，关于PlySs2与三种β-内酰胺抗生素[苯唑西林(OXA)、萘夫西林(NAF)和头孢唑啉(CFZ)]的组合的分级抑菌浓度指数(FICI)值。生成了来自棋盘测定的数据，以确定与其各自活性相比，PlySs2与β-内酰胺抗生素的相互作用和效力。这种比较表示为FICI值，其中≤0.5的值与协同作用一致，>0.5-<1的值是高度加性的，1-≤2的值是无差异的，而>2的值是拮抗性的。还显示了对于单独(初始)和组合(最终)的每种试剂测定的代表性的单一试剂MIC。重新敏感在协同组合中出现，其中β-内酰胺抗生素MIC值低于确定的断点，例如对于β-内酰胺敏感性分离株<2的MIC值，对于β-内酰胺抗性分离株> 4的MIC值4。参见Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)，CLSI. 2019. M100Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing；第29版。Clinical and Laboratory Standards Institute，Wayne，PA。

如下表1中指示的，与PlySs2的协同组合证实了对于所检查的九个MRSA菌株中的每个，OXA、NAF和CFZ MIC减少至低于断点值。这些观察与重新敏感一致。PlySs2溶素使抗生素抗性细菌菌株对常规抗生素重新敏感的能力指示了，这些生物制品作为对抗且逆转抗微生物抗性的治疗剂的益处。

表1 - 单独和组合的PlySs2和β-内酰胺抗生素针对MRSA菌株的抗菌活性

如表1中所示，PlySs2和每种β-内酰胺抗生素的所有组合都显示出针对所评估的9个MRSA菌株的协同作用。此外，MRSA菌株恢复了对β-内酰胺的敏感性，如通过MIC值减少至低于对于金黄色葡萄球菌建立的β-内酰胺断点所证实的。

实施例2 - 体外PlySs2溶素暴露增加了苯唑西林敏感性

进行了连续传代抗性研究，以评价当与用于治疗金黄色葡萄球菌感染的苯唑西林组合使用时，PlySs2溶素压制抗生素抗性出现的能力。用于执行连续传代实验的方法分别在以下中进行描述：Palmer等人，Genetic basis for daptomycin resistance in enterococci，Antimicrobial Agents and Chemotherapy(2011)；55:3345-56，以及Berti等人，Altering the Proclivity towards Daptomycin Resistance in Methicillin- Resistant Staphylococcus aureus Using Combinations with Other Antibiotics，Antimicrobial Agents and Chemotherapy(2012)；56:5046-53。对于在苯唑西林的存在下、或在PlySs2溶素的1.1倍稀释物或2倍稀释物的存在下生长的MRSA金黄色葡萄球菌菌株(MW2)，评价了MIC值的增加。

执行了21天的体外连续传代抗性测定，以确定PlySs2(单独)对苯唑西林和PlySs2MIC值的影响，以及类似于先前显示的“跷跷板(seesaw)”效应的可能性，由此对达托霉素或万古霉素的暴露伴随着对β-内酰胺抗生素的敏感性(以及重新敏感的可能性)增加[Renzoni等人，Molecular Bases Determining Daptomycin Resistance-Mediated Resensitizatoin to β-Lactams(Seesaw Effect)in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus，Antimicrobial Agents and Chemotherapy(2017)61(1):e01634-16，以及Werth等人，Evaluation of Ceftaroline Activity against Heteroresistant Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus and Vancomycin- Intermediate Methicillin-Resistant S. aureus Strains in an In VitroPharmacokinetic/Pharmacodynamic Model: Exploring the ‘Seesaw Effect’，Antimicrobial Agents and Chemotherapy(2013)；57(6):2664-68]。

使用1.1倍和2倍的PlySs2稀释系列，在每天的基础上，将MRSA菌株MW2一式三份地连续传代21天。如图1-3中所示，仅观察到在PlySs2 MIC值中的适度的2倍转变。PlySs2暴露导致跷跷板效应，伴随减少的OXA MIC(从64 μg/mL到16 μg/mL的0.25 MIC倍数变化)。参见图1-3。这种跷跷板效应，即MRSA对PlySs2的敏感性降低，伴随着对苯唑西林的敏感性的反常增加，指示了PlySs2溶素使MRSA对苯唑西林重新敏感的能力。紧在观察到的MIC转变之前(对于图1-3分别为第16、11和8天)、以及紧在其之后(对于图1-3分别为第17、12和9天)，获取了三个MRSA MW2菌株分离株，用于全基因组测序。

已知达托霉素使MRSA对苯唑西林重新敏感的能力通过mprF介导的细胞膜修饰来驱动，所述修饰导致PBP 2a(mecA产物)成熟所需因子的错误定位[Renzono等人(2017)]。为了起始PlySs2效应的类似研究，通过全基因组测序(WGS)和SNP/INDEL，分析了紧在PlySs2和OXA MIC值中的转变之后获得的三种突变体衍生物(分别参见图1-3的第17、12和9天)；同样地，分析了紧在MIC值中的转变之前获得的对照菌株(对于图1-3分别为第16、11和8天)，并且与突变株进行比较。如下表2中所示，牵涉三个不同的突变，并且如Abdelhamed等人，A novel suicide plasmid for efficient gene mutation in Listeria monocytogenes，Plasmid(2015)；81:1-8中所述，在干净的遗传背景下，使用两步等位基因交换方法，确认了每个突变对PlySs2和OXA MIC的影响。

表2 - 与PlySs2介导的OXA MIC中的减少相关的突变

^a 在金黄色葡萄球菌MW2的参考基因组(GenBank登录号：NC_003923.1)中的位置

^b 与计算预测的多态性重叠的注释的开放读码框

如表2中所示，编码三种不同的细胞壁修饰酶(即，murA、lyrA和oatA)的基因座中或附近的突变，各自独立地足以减少苯唑西林MIC。这些发现与模型一致，在所述模型中，通过关于PlySs2的murA、lyrA和/或oatA介导的细胞壁扰动，减少了青霉素结合蛋白2a(PBP2a)的膜量，如对于mprF和达托霉素观察到的[Renzoni等人(2017)]。尽管不希望受到理论的束缚，但同样假设对PlySs2的暴露可以介导PBP 2a的减少。

实施例3 - 离体PlySs2暴露增强了苯唑西林敏感性的增加

如Xiong等人，Comparative efficacy of telavancin and daptomycin in experimental endocarditis due to multi-clonotype MRSA strains，J. Antimic.Chemo.(2016)；71(1):2890-94中公开的，对MRSA感染性心内膜炎(IE)的标准兔模型中的PlySs2治疗后回收的组织样品执行离体分析。标准的兔IE模型用于确认PlySs2治疗对苯唑西林MIC的影响。在IE模型中用单一剂量的PlySs2(0.18 mg/kg至1.4 mg/kg)治疗后四天，从瓣膜赘生物中回收分离株，并且在TSAB(非选择性条件，表3和4)、以及补充有一系列浓度的PlySs2的TSAB(选择性条件，表5和6)上铺平板。对于PlySs2和苯唑西林两者，确定了MRSA分离株的MIC值。下表3和表4分别显示了，对于经受非选择性条件的瓣膜赘生物，对于PlySs2和苯唑西林计算的MIC。注意到金黄色葡萄球菌菌株MW2的PlySs2 MIC为1 μg/mL，并且金黄色葡萄球菌菌株MW2的苯唑西林MIC为32 μg/mL。

表3 - PlySs2 MIC

表4 – 苯唑西林MIC

如表3中所示，PlySs2 MIC保持稳定在1 μg/mL。然而，如表4中所示，PlySs2暴露导致苯唑西林敏感性增加。参见例如，对于在以1.4 mg/kg的PlySs2暴露后的7个样品、以及在以0.35 mg/kg的PlySs2暴露后的6个样品，<2 μg/mL的苯唑西林MIC。

表5显示了经受选择性条件的瓣膜赘生物上的细菌分离株的Log₁₀ CFU/g，并且表6显示了对于经受选择性条件的瓣膜赘生物，对于PlySs2和苯唑西林计算的MIC。

表5 – 赘生物的Log₁₀ CFU/g

表6 – PlySs2和苯唑西林MIC

如表6中所示，PlySs2 MIC在很大程度上保持稳定在1 μg/mL，并且仅显示出2倍增加，而PlySs2暴露导致苯唑西林敏感性增加。参见例如，对于在以1.4 mg/kg的PlySs2暴露后的3个样品、以及在以0.35 mg/kg的PlySs2暴露后的7个样品，<2 μg/mL的苯唑西林MIC。这证明了苯唑西林MIC值从32 μg/mL到<2 μg/mL的大于16倍减少。因此，相对于体外观察到的重新敏感，在体内观察到的重新敏感极大地增强。此外，对于PlySs2，仅观察到至多两倍的MIC增加。

与上文实施例2中讨论的连续传代测定中显示出重新敏感表型的分离株一样，来自兔IE研究的分离株同样经历了全基因组测序和另外的遗传分析，以鉴定具体的目的突变。

鉴定了来自显示出苯唑西林MIC的32倍降低的瓣膜赘生物的两个突变体，通过全基因组测序和SNP/INDEL进行分析，并且与三个对照分离株进行比较。每个突变体和对照菌株的PlySs2和苯唑西林MIC显示于下表7和8中，其中+指示存在突变，而–表示不存在突变。

表7 – 关于在体内与PlySs2介导的苯唑西林MIC减少相关的突变的对照菌株

^a 在金黄色葡萄球菌MW2的参考基因组(GenBank登录号：NC_003923.1)中的位置

^b 与计算预测的多态性重叠的注释的开放读码框

表8 - 关于在体内与PlySs2介导的苯唑西林MIC减少相关的突变的突变株

^a 在金黄色葡萄球菌MW2的参考基因组(GenBank登录号：NC_003923.1)中的位置

^b 与计算预测的多态性重叠的注释的开放读码框

从本文的实施例可以得出结论，在体外和体内研究中，PlySs2处理使MRSA对β-内酰胺抗生素重新敏感。与PlySs2的有力协同作用使β-内酰胺MIC降至低于断点，而对预料的对PlySs2的敏感性没有不利影响。此外，对单独的PlySs2的暴露可选择细胞壁生物合成基因或SCCmec中的突变，其降低苯唑西林MIC。通过恢复MRSA菌株对β-内酰胺抗生素的敏感性，PlySs2不仅可以用于对抗抗微生物抗性，还可以逆转抗微生物抗性。