具体实施方式

以下，详细说明本发明。

本发明提供一种细胞-水凝胶组合物，包含细胞及水凝胶，为珠形态。

并且，本发明提供细胞-水凝胶组合物的用途，用作用于预防或治疗肌肉骨骼疾病、瘘管病或炎症性疾病的药学组合物，上述细胞-水凝胶组合物包含细胞及水凝胶，为珠形态。

在本发明的一实施方式中，优选地，上述细胞及水凝胶的直径为0.1mm至5mm，更优选为0.5mm以上且5mm以下，最优选为1mm以上且4mm以下。

在本发明的一实施方式中，优选地，上述细胞为选自由干细胞、体细胞及生殖细胞组成的组中的一种，但不限定于此。

在本发明的一实施方式中，优选地，上述水凝胶为选自由纤维蛋白胶、透明质酸、明胶、胶原蛋白、海藻酸、壳聚糖、纤维素、果胶、甲基丙烯酸-2-羟乙酯衍生物及其共聚物、聚氧化乙烯以及聚乙烯醇组成的组中的一种或者两种以上。

在本发明的一实施方式中，优选地，上述肌肉骨骼疾病为选自由关节外伤、骨骼疾病、肌肉弱化、关节的神经损伤引起的肌炎、肌筋膜疼痛综合征、肌腱炎、腱鞘炎、滑囊炎、腱鞘囊肿、腕管综合征、盖恩管综合证、手腕肌腱炎、手腕振动综合征、扳机指、腱鞘囊肿、白指病、雷诺氏综合征、外上髁炎、内上髁炎、桡管综合征、尺管综合征、鹰嘴滑囊炎、正中神经返支卡压征、肩关节撞击综合征、粘连性关节囊炎、退行性关节炎、龟颈综合征、神经根型颈椎病、腰骶部劳损、腰椎间盘突出症、脊椎滑脱症、脊椎前移症、退行性腰椎疾病、退行性疾病、尿失禁、韧带及肌腱损伤组成的组中的一种，但不限定于此。

在本发明的一实施方式中，上述瘘管病可以为瘘管性克罗恩病，但不限定于此。

在本发明的一实施方式中，优选地，上述炎症性疾病为选自由特应性皮炎、全身性红斑狼疮、红斑狼疮、冻疮样红斑狼疮、结核性红斑狼疮、红斑狼疮肾炎、营养不良性大疱性表皮松懈症、银屑病、风湿热、类风湿性关节炎、腰痛、纤维肌肉痛、筋膜疾病、未分化脊柱关节病、未分化关节病、关节炎、炎症性骨溶解、反应性关节炎、骨关节炎、硬皮病、骨质疏松症、病毒或细菌感染引起的慢性炎症疾病、大肠炎、溃疡性大肠炎、炎症性肠疾病、真菌感染、烧伤、外科或牙科手术引起的伤口、糖尿病足溃疡、I型糖尿病、II型糖尿病、溃疡性皮肤疾病、鼻窦炎、鼻炎、结膜炎、哮喘、皮肤炎、炎症性胶原血管病、肾小球肾炎、脑炎、炎症性肠炎、慢性阻塞性肺疾病、败血症、败血性休克、肺纤维化、动脉粥样硬化、心肌炎、心内膜炎、心包炎、囊性纤维化、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、麻风病、梅毒、莱姆病(Lyme disease)、包柔氏螺旋体病(Borreliosis)、神经性包柔氏螺旋体病、结核病、结节病(Sarcoidosis)、黄斑变性、葡萄膜炎、肠易激综合征、克罗恩病、干燥综合征、慢性疲劳综合征、慢性疲劳免疫功能紊乱综合征、肌痛性脑脊髓炎、肌萎缩性侧索硬化、帕金森病、多发性硬化组成的组中的一种，但不限定于此。

本发明的组合物表现为直径5mm以下的规定的珠形态，易于填充进注射器，能够通过简单的物理方法去除冷冻保存液，可以在给药前轻易去除能够在体内引起多种副作用的作为冷冻保存液成分的二甲基亚砜。具体地，作为上述简单物理方法的一例，将冷冻保存液与珠的混合液装入注射器后，在注射器前端安装具有约100μL孔径(pore size)的过滤器后，推动溶液，则珠被过滤器挡住，从而可以只去除冷冻保存液。

并且，填充进注射器后，可以通过透皮注射、皮下注射、肌内注射、黏膜下注射、腹腔注射等方式给药。

并且，本发明的水凝胶的浓度可以不受特别限制地使用，可以根据多种治疗目的来调节，优选地，可以包含1.8mg/mL至90mg/mL浓度的纤维蛋白原。

并且，本发明提供一种制备细胞-水凝胶组合物的方法，包括：步骤(a)，培养细胞；步骤(b)，混合培养的上述细胞与水凝胶溶液，来形成细胞-水凝胶珠；以及步骤(c)，培养上述细胞-水凝胶珠。

在本发明的一实施方式中，水凝胶可以使用选自由纤维蛋白胶、透明质酸、明胶、胶原蛋白、海藻酸、壳聚糖、纤维素、果胶、甲基丙烯酸-2-羟乙酯衍生物及其共聚物、聚氧化乙烯以及聚乙烯醇组成的组中的一种或者两种以上的复合物，更具体地，可以使用纤维蛋白胶。

在本发明的一实施方式中，上述纤维蛋白胶可以包含浓度为1.8mg/mL至90mg/mL的纤维蛋白原。

在本发明的一实施方式中，优选地，上述细胞及水凝胶为0.1mm至5mm，更优选为0.5mm以上且5mm以下，最优选为1mm以上且4mm以下。

在本发明的一实施方式中，在上述步骤(c)后，还可以包括步骤(d)，将细胞-水凝胶组合物填充进注射器。通过上述本发明的制备方法制备的细胞-水凝胶组合物可以使用10gauge至25gauge的针头直接局部给药。

另一方面，本发明的方法在步骤(c)的培养细胞水凝胶后，还可以包括冷冻及解冻的步骤，冷冻及解冻后可以通过简单的物理方法去除冷冻保存液。

同时，在将本发明的细胞-水凝胶组合物用作注射用的情况下，可根据目的将水凝胶的物性或者物理强度调整得不同来使用，因此并不局限于特定的水凝胶浓度。

在本发明的具体实施例中，本发明人在培养源自人类脂肪的间充质干细胞后，加入至凝血酶溶液后，使用分液器分别向培养容器以1μL～10μL的容量点滴纤维蛋白原和细胞-凝血酶溶液来制备包含细胞的纤维蛋白胶水凝胶珠(以下称细胞-水凝胶珠)(参照图1)。

并且，本发明人确认细胞-水凝胶珠内细胞数量、存活率及细胞特性的结果，确认到根据本发明在水凝胶珠内培养的细胞与作为代表性的间充质干细胞标记物的CD73、CD90、CD105表现出阳性反应，与作为造血细胞标记物的CD34、CD45保持阴性的免疫学特性(参照表1、图2)。

并且，本发明人确认在细胞-水凝胶珠的制备工序中是否在珠内捕获从细胞分泌的活性因子的结果，确认间充质干细胞中分泌的肝细胞生长因子(HGF)及胶原蛋白II型(type 2)显著地被捕获。(参照图3)。

同时，本发明人确认细胞-水凝胶珠的旁分泌因子的分泌效果的结果，确认了本发明的细胞-水凝胶珠在由白细胞介素1β诱发的炎症环境中，缓慢释放出旁分泌因子，由此表现出显著的治疗效果(参照图4)。

因此，通过本发明的方法制备的注射用间充质干细胞-水凝胶组合物具有如下的优点：干细胞附着于水凝胶珠的支架内，干细胞在注射后也不易消失或凋亡，持续发挥干细胞的旁分泌效果，干细胞随着水凝胶的分解缓慢释放，从而增加生着率(参照图5)，并且，可以在不使用蛋白分解酶处理的情况下制备为注射剂型，可以在不损伤细胞膜的情况下使用健康的细胞，同时可在冷冻及解冻后也易于从间充质干细胞-水凝胶珠中去除冷冻保存液。

并且，本发明提供包含本发明的组合物作为有效成分的用于预防及治疗肌肉骨骼疾病、瘘管病或炎症性疾病的细胞治疗剂。

在本发明中，术语“细胞治疗剂”是指将从人体分离、培养及通过特殊操作制备的细胞及组织，以治疗、诊断及预防为目的来使用的医药品。尤其是指为了复原细胞或组织的功能，在体外增殖并筛选活的自身、同种或异种细胞或者通过其他方法来改变细胞的生物学特性等一系列行为，以治疗、诊断及预防为目的来使用的医药品。根据细胞的分化程度，细胞治疗剂大体分为体细胞治疗剂、干细胞治疗剂，更具体地，本发明涉及源自脂肪的干细胞治疗剂。

在本发明中，术语“个体”是指包括已经患有能够通过给药本发明的细胞治疗剂来预防或治疗的疾病的或者可能患有上述疾病的人类在内的所有动物。

上述组合物可以使用于关节外伤、骨骼疾病、肌肉弱化、关节的神经损伤引起的退行性疾病、尿失禁、退行性关节炎、韧带及肌腱损伤、糖尿病足溃疡、下肢缺血性溃疡、瘘管病等多种疾病。

并且，本发明提供一种预防或改善肌肉骨骼疾病、瘘管病或炎症性疾病的方法，包括向个体给药药学有效量的细胞-水凝胶组合物的步骤，上述细胞-水凝胶组合物包含细胞及水凝胶，为珠形态，上述细胞及水凝胶的直径为0.1mm以上且5mm以下。

同时，本发明提供一种治疗肌肉骨骼疾病、瘘管病或炎症性疾病的方法，包括向个体给药药学有效量的细胞-水凝胶组合物的步骤，上述细胞-水凝胶组合物包含细胞及水凝胶，为珠形态，上述细胞及水凝胶的直径为0.1mm以上且5mm以下。

上述细胞-水凝胶、肌肉骨骼疾病、瘘管病及炎症性疾病的说明与有关上述细胞-水凝胶组合物的说明相同，因此具体的说明将引用上述内容。

另一方面，确认通过本发明的方法制备的注射用间充质干细胞-水凝胶组合物具有如下优点，即，干细胞附着于水凝胶珠的支架内，因此干细胞在注射后也不易消失或者凋亡，持续发挥干细胞的旁分泌效果，干细胞随着水凝胶的分解缓慢释放，从而增加生着率，并且，可以在不使用蛋白分解酶处理的情况下制备为注射剂型，可以在不损伤细胞膜的情况下使用健康的细胞，同时可在冷冻及解冻后也易于从间充质干细胞-水凝胶珠中去除冷冻保存液，因此，可以将本发明的细胞-水凝胶组合物有用的用于预防、治疗或改善肌肉骨骼疾病、瘘管病或炎症性疾病。

以下，通过实施例更为具体地说明本发明。

但下述实施例仅用于帮助对本发明的理解，并不使本发明的发明要求保护范围限定于此。

实施例1.源自人类脂肪的间充质干细胞的培养方法

脂肪组织可以通过常规脂肪抽吸术来获取，但不限定于此。

以如下方式从通过脂肪抽吸获取的脂肪组织中分离源自脂肪的间充质干细胞：为了去除血液，使用与脂肪组织等体积的磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤3次～4次。加入与脂肪组织等体积的胶原酶溶液在温度为37℃的水浴中进行反应。将其移入离心分离用试管，在20℃的温度下以1500rpm的转速离心分离10分钟。去除作为上层液的脂肪层后，在不使作为下层液的胶原酶溶液晃动的前提下小心地分离。放入细胞培养基使其悬浮后，在20℃的温度下以1200rpm的转速离心分离5分钟。在此情况下，通过基质-血管分馏将沉淀在下的与上层液分离。将基质-血管分馏悬浮于细胞培养基后接种于培养容器，在37℃、5％的CO₂的的培养箱里培养24小时。去除培养液后，使用磷酸盐缓冲溶液洗涤，利用细胞培养基或者在细胞培养基中包含如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或表皮细胞生长因子(EGF)的细胞生长因子的培养基进行增殖。当源自脂肪的间充质干细胞长至培养容器的80％～90％的程度时，使用胰蛋白酶处理来分离并获得单一细胞。

实施例2.细胞-纤维蛋白胶水凝胶珠的制备及冷冻

1)细胞-纤维蛋白胶水凝胶珠的制备

向1×10⁵个/mL～3×10⁵个/mL的在上述实施例1中获得的源自脂肪的间充质干细胞加入凝血酶溶液。准备1.8mg/mL～90mg/mL的纤维蛋白原。使用分液器以1μL～10μL的容量向培养容器分别点滴纤维蛋白原和细胞-凝血酶溶液来制备包含细胞的纤维蛋白胶水凝胶珠(以下称细胞-水凝胶珠)。

2)培养容器附着培养方法

当细胞-水凝胶珠在培养容器中完全凝固时，直接加入细胞培养基后，在37℃、5％的CO₂的培养箱中培养4天～8天，确认呈半球形形态。

3)悬浮培养方法

并且，可使用悬浮培养方法来替代上述2)的培养容器附着培养方法，当细胞-水凝胶珠完全凝固时，从培养容器的底部摘出珠后放入培养容器中。加入细胞培养基使珠悬浮后，在37℃、5％的CO₂的培养箱中培养4天～8天。另一方面，在悬浮培养的情况下，具有易于大容量培养的优点。

4)细胞-水凝胶珠的洗涤及冷冻

去除培养液后，从培养容器中收集细胞-水凝胶珠。以1∶1的比例混合收集的珠与包含10％～20％二甲基亚砜的人血清白蛋白后，在-80℃的温度下冷冻保存。

另一方面，将冷冻保存液与珠的混合液装入注射器并在注射器前端安装具有约100μL孔径的过滤器后，推动溶液使珠被过滤器挡住，从而以简单的物理方法仅去除冷冻保存液。

图1a为示出观察培养的细胞-水凝胶珠的照片的图，确认到珠的直径为3mm～5mm，细胞在珠内很好地增殖并与纤维蛋白胶水凝胶很好地融合了。

图1b为将在-80℃的温度下冷冻保存的细胞-水凝胶珠解冻后填充进注射器并使用17gauge的针头喷射的显微镜照片。确认到在冷冻、解冻及利用针头注射后，珠仍全都保持规定的形态及大小。

实施例3.细胞-水凝胶珠内的细胞数量、存活率及细胞的特性

使用显微镜观察根据实施例2培养-洗涤-冷冻-解冻的细胞-水凝胶珠的结果，确认到珠内的细胞均匀分布(图1)。然后，向根据实施例2培养-洗涤-冷冻-解冻的细胞-水凝胶珠添加酶来溶解纤维蛋白胶后获得细胞。使用台盼蓝染色来分析细胞数量及细胞存活率的结果，确认每个珠约包含15000个细胞，细胞存活率为95％以上。

使用CD73、CD90、CD105及CD34、CD45染色获得的上述细胞后，使用流式细胞仪进行分析。其结果如图1所示，确认到根据本发明在水凝胶珠内培养的细胞与作为代表性的间充质干细胞标记物的CD73、CD90、CD105表现出阳性反应，与作为造血细胞标记物的CD34、CD45保持阴性的免疫学特性(表1及图2)。

表1

实施例4.细胞-水凝胶珠内包含活性因子

已知在培养间充质干细胞期间分泌多种活性因子。因此，为了确认在细胞-水凝胶珠的制备工序中从细胞分泌的活性因子是否捕获在珠内，取得向根据实施例2培养-洗涤-冷冻-解冻的细胞-水凝胶珠加入酶溶解纤维蛋白胶后的溶出液，分析细胞-水凝胶珠内的活性因子。

其结果如图3所示，确认到作为从间充质干细胞分泌的代表性的活性因子的肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor；HGF)每个珠中约捕获10皮克(pg)，作为主要软骨成分的胶原蛋白II型每个珠中约捕获2皮克(图3)。

实施例5.细胞-水凝胶珠的旁分泌因子的分泌

已知间充质干细胞通过旁分泌作用具有抗炎症功效、抗细胞凋亡功效、细胞增殖促进功效。

因此，向根据实施例2培养-洗涤-冷冻-解冻的细胞-水凝胶珠加入DMEM培养基并培养72小时后，取培养上层液后，取得向剩余的细胞-水凝胶珠加入酶来溶解纤维蛋白胶后的溶出液，来分析从细胞-水凝胶珠中分泌的因子。

并且，为了营造病变部位的微环境(炎症环境)，使用白细胞介素1β(Interleukin1beta；IL-1β)处理后以相同的方式取得培养上层液和溶出液并进行分析。

其结果如图4所示，确认到虽然从间充质干细胞中分泌的已知为代表性炎症调节因子的前列腺素E2(Prostaglandin E2；PGE2)是不在正常环境中分泌，但在炎症环境中促进其分泌(图4)。

并且，确认到从间充质干细胞分泌的代表性生长因子中表现出抗炎症、抗细胞凋亡、细胞增殖促进、血管形成促进效果的肝细胞生长因子和血管内皮生长因子(VascμLarendothelial growth factor；VEGF)在正常环境和炎症环境中均相似地分泌，而在正常环境中轻微分泌的作为关节软骨的主要结构性蛋白质的胶原蛋白II型在炎症环境中的分泌量急剧增加(图4)。

因此，确认到在将本发明的细胞-水凝胶珠向病变环境给药时，可以缓慢释放旁分泌因子来表现出显著的治疗效果。

实施例6.动物实验

在小鼠的左侧、右侧两处皮下注射30个根据实施例2培养-洗涤-冷冻-解冻的细胞-水凝胶珠后，测定7天内的体积变化。

其结果如图5所示，确认到皮下注射后，干细胞也不易消失或凋亡，持续发挥干细胞的旁分泌效果，干细胞随着水凝胶的分解缓慢释放。

实施例7.细胞-水凝胶珠的软骨细胞凋亡抑制能力

抑制作为代表性肌肉骨骼疾病的骨关节炎由于软骨细胞的凋亡而更加恶化。因此，确认根据实施例2制备的细胞-水凝胶珠的软骨细胞凋亡抑制能力。

具体地，将人类软骨细胞接种并附着于48孔培养板(48-well plate)后，加入根据实施例2制备的细胞-水凝胶珠或未包含细胞的水凝胶珠后共培养24小时。然后，分别使用浓度为100μM、200μM及400μM的叔丁基氢过氧化物(T-butyl hydroperoxide，tBOOH)处理16小时来诱导人类软骨细胞的氧化性凋亡。之后，加入水溶性四唑盐(water solubletetrazolium salt，WST-1)培养约3小时后，为了测定活着的细胞数量，测定吸光度。

其结果如图6及表2所示，确认到细胞-水凝胶珠因氧化应激抑制软骨细胞的凋亡(表2及图6)。

表2

实施例8.细胞-水凝胶珠的抗炎症巨噬细胞分化促进能力

使用佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)处理人类单核细胞24小时来诱导分化为巨噬细胞后，加入根据实施例2制备的细胞-水凝胶珠后再培养48小时。之后，收集上层液，使用酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)测定由具有促炎性(pro-inflammatory)特性的激活的M1巨噬细胞分泌的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及由具有抗炎症(anti-inflammatory)特性的激活的M2巨噬细胞分泌的白细胞介素-10(IL-10)的量。

其结果如图7所示，在向人类单核细胞加入佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)的情况下，当分泌的肿瘤坏死因子-α的量为1.00时，若向其中再加入细胞-水凝胶珠，则减少为0.73，与此相反，在加入佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯的情况下，当分泌的白细胞介素-10的量为1.00时，若向其中再加入细胞-水凝胶珠，则增加至1.61，由此确认细胞-水凝胶珠具有抑制炎症反应的效果(图7)。

产业上的可应用性

本发明涉及包含注射型间充质干细胞-水凝胶的组合物及其制备方法，具体地，通过本发明的方法制备的注射用间充质干细胞-水凝胶组合物具有如下优点：干细胞附着于水凝胶珠的支架内，因此干细胞在注射后也不易消失或者凋亡，持续发挥干细胞的旁分泌效果，干细胞随着水凝胶的分解慢慢释放，从而增加生着率，并且，可以在不使用蛋白分解酶处理的情况下制备为注射剂型，从而可以在不损伤细胞膜的情况下使用健康的细胞，同时可在冷冻及解冻后也易于从间充质干细胞-水凝胶珠中去除冷冻保存液，从而可以有用地使用。