用于控制白色念珠菌感染的反义寡聚物
阅读说明：本技术 用于控制白色念珠菌感染的反义寡聚物 (Antisense oligomers for controlling candida albicans infection ) 是由 索尼亚·卡丽娜·莫赖斯·达·席尔瓦 丹妮拉·埃拉·阿林助 努诺·米格尔·莫赖斯·阿泽维多 玛丽 于 2020-02-24 设计创作，主要内容包括：本公开涉及反义寡聚物在治疗或疗法白色念珠菌感染中的用途。本公开进一步描述了反义寡聚物在反义治疗中用于抑制白色念珠菌从酵母到丝状体的形态转化的用途。(The present disclosure relates to the use of antisense oligomers in the treatment or therapy of candida albicans infection. The disclosure further describes the use of antisense oligomers in antisense therapy to inhibit the morphological transformation of candida albicans from yeast to filaments.)
技术领域
本公开涉及反义寡聚物在治疗或疗法白色念珠菌(Candida albicans)感染中的用途。特别地，使用反义寡聚物靶向参与白色念珠菌从酵母到丝状体(filamentous form)形态转化的特异性基因。
本公开进一步描述了反义寡聚物在反义治疗中用于抑制白色念珠菌从酵母到丝状体的形态转化的用途。
背景技术
念珠菌物种通常作为共生微生物存在，但它们也可以作为具有引起浅表和全身感染能力的机会致病菌。由于老年人口和免疫受损患者数量的增加以及留置医疗器械的广泛使用，念珠菌感染(Candida infection)的发病率在过去几年显著增加。白色念珠菌感染仍然是所有念珠菌物种感染中最普遍的；所有念珠菌感染中大约有47％是由念珠菌引起的。
作为双态性真菌，白色念珠菌从共生体转变为致病菌的能力主要是由于其在酵母菌和菌丝相之间进行形态转换的能力，这一特性对其穿透人体组织并逃离宿主免疫系统的能力至关重要。这种能力极大地促进了其致病性。白色念珠菌每年造成约400,000人死亡，其最棘手的毒力因子之一是其形成丝状体的能力。
在过去的几年里，重要的技术进步促进了对白色念珠菌从酵母到丝状体的形态转化的分子生物学的研究。这些进步包括基因组和转录组序列数据的可用性，这些数据对于鉴定和表征与白色念珠菌双态性相关的基因至关重要。一些工作已经证明EFG1、HWP1和HYR1基因作为白色念珠菌丝状形成的诱导物的重要性[1]。
尽管广泛的研究致力于发展新的治疗策略，但仅有限数量的药物可用于对抗浅表性和侵袭性念珠菌感染。实际上，目前临床上仅使用靶向三种不同真菌代谢途径的四种分子类别来治疗念珠菌相关的全身感染：多烯类、唑类和棘白菌素类。其他几类药物，例如吗啉类和烯丙胺类，由于全身施用时疗效不佳或副作用严重，因此仅用作局部药剂[2]。念珠菌多药耐药性的增加、新药的稀缺以及念珠菌物种从共生真菌向病原真菌过渡转换的高可塑性导致念珠菌病病例数量的增加。尽管过去几年疗法取得了进展，但抗真菌药物的开发速度仍然落后于真菌感染的速度。此外，由于毒性问题，这些化合物中的大多数作为全身性药物的潜力有限。
这些因素构成了临床问题，导致高发病率和死亡率(30-37％)以及与患者住院时间延长相关的更高经济成本。住院患者与念珠菌血症相关的平均费用为每次发作性症状5700至85000欧元。这些证据强调需要新的策略来管理白色念珠菌感染。
反义疗法(AST)为治疗许多人类疾病带来了巨大希望。AST的基础概念相对简单：使用特定mRNA的互补序列，其可以抑制后者的表达并诱导DNA向蛋白质翻译的“阻断”。反义寡聚物(ASO)是与靶标mRNA互补的短链核酸[16]。ASO通常由具有基因特异性的未修饰或化学修饰分子的13-25个核苷酸的短序列组成。此外，近年来，已经开发了ASO化学修饰以增强核酸酶抗性，延长组织半衰期、亲和力和效力，并降低特异性毒性。目前有三代ASO。第一代包含硫代磷酸酯骨架修饰，其特征在于非桥连磷酸氧被硫原子取代。开发第二代以增强核酸酶抗性并增加对靶标mRNA的结合亲和力。为此，将2'-O-甲基和2'-O-甲氧乙基(2’-O-methoexyethyl)糖修饰添加到核苷酸的2'位的OH基团。大量研究记录了使用AST作为研究靶标人类蛋白质的生物化学工具[3]。这种方法已被提议作为细菌感染的抗生素治疗的替代方法。福米韦生(商品名Vitarvene)是一种S-oligo，是唯一获得FDA批准的靶向微生物的反义治疗剂。福米韦生在1998年被批准用于治疗巨细胞病毒诱导的视网膜炎。靶向细菌的早期工作发现，经修饰的ASO抑制沙门氏菌(Salmonella)、李斯特菌(Listeria)、布鲁氏菌(Brucella)、假单胞菌(Pseudomonas)、葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)和埃希氏菌(Escherichia)的生长[4]。尽管事实是在过去十年中一直在开发用于控制细菌生长的ASO，但用于控制白色念珠菌)生长的基于反义的应用稀少且未得到充分利用[5]。
文献WO2014144024(A1)公开了生产念珠菌细胞Hyhr1表面蛋白片段的方法。该文献进一步公开了该蛋白质用于针对真菌感染的治疗和免疫的用途。
文献AU2016244238(A1)公开了Hyhr1表面蛋白作为用于免疫的靶点(主动和被动)以及作为播散性念珠菌病的预防性治疗的用途。
文献US2019030141(A1)公开了用于免疫的念珠菌细胞表面蛋白Als3和Hyr1及其组合的片段。
文献CN107304429(A)公开了抑制剂如小分子化合物下调Nuo2蛋白或抑制毒力因子相关基因(ALS3、HWP1和/或ECE1基因表达)的基因的用途。
文献US2017298349(A1)公开了调节念珠菌的HWP1和ALS3表达的基因间非编码RNA分子。该文献进一步公开了非编码RNA分子及其互补分子在调节HWP1或ALS3表达以及调节念珠菌的粘附、酵母到菌丝相转变或生物膜发育中的用途。其目的是预防或治疗念珠菌病。
文献US2005244861(A1)公开了调节白色念珠菌中的HWP1表达所需的核酸以及这些核酸在鉴定抑制HWP1的表达的试剂中的用途。
文献CN1730654(A)公开了ASO序列用于对抗白色念珠菌感染的用途。具体地，该文献公开了针对白色念珠菌I型内含子核酶的核心假结的ASO序列，因此强烈抑制白色念珠菌的剪切反应性。
公开这些事实是为了说明本公开解决的技术问题。
发明内容
本公开描述了ASO靶向参与白色念珠菌从酵母到丝状体的形态转化的特异性基因的用途。本公开进一步描述了ASO在AST抑制白色念珠菌从酵母到丝状体的形态转化中的用途。
ASO是合成寡聚物，其沉默特异性基因的表达。这种特异性通过避免对其他共生念珠菌物种的非预期影响并通过最大限度地减少交叉耐药性的可能性，赋予优于广谱抗真菌药的优势。此外，序列特异性和ASO的短长度对人类基因表达的风险也很小。这种方法的另一个重要优点是能够几乎消除或显著减少发现新抗真菌药所需的时间，从而将潜在可用靶标的范围扩大到任何酵母中具有已知碱基序列的任何基因，例如白念珠菌。
到目前为止，还没有鉴定、设计和合成的ASO来靶向白色念珠菌毒力所需的非必需基因，即参与从酵母到丝状)毒力所需的非必需基因，即参与从酵母到丝状体的形态转化的基因。将ASO应用于一组涉及白色念珠菌菌株最棘手的毒力因子之一的基因，使我们不仅能够开发出针对这种棘手的酵母的新纳米药物，而且还能开发出控制念珠菌病的新策略。本公开旨在鉴定能够与白色念珠菌丝状形成的三个重要调节基因(EFG1、HWP1和HYR1)的mRNA特异性杂交并阻断其分子功能的短序列ASO。这允许开发单独或组合使用的纳米药物，以控制白色念珠菌的侵袭性和致病性。
本公开的一个方面涉及一种分离的寡聚物，作为白色念珠菌丝状形成阻断剂，其包含：选自由以下序列组成的列表的至少一个序列：
SEQ ID No.7-用于EFG1：5’-mG mG mC mA TACCGTTA mU mU mG mU-3’、
SEQ ID No.8-用于HWP1：5'mUmGATAACATGTAATAAGmCmG 3'、
SEQ ID No.9-用于HYR1：5'mGmGmU TGA GAG TAmA mGmC 3’、或它们的组合；或者所述序列的变体，其中基于所述序列的所有核苷酸的同一性，所述序列的变体与所选择的序列具有至少95％的同一性。
本公开的另一个方面涉及一种分离的寡聚物，用于在药物中使用，优选地用于在白色念珠菌相关感染的治疗或疗法中使用，其包含：选自由以下序列组成的列表的至少一个序列：SEQ ID 7、SEQ ID 8、SEQ ID 9或它们的组合；或者所述序列的变体，其中基于所述序列的全部核苷酸的同一性，所述序列的变体与所选择的序列具有至少95％的同一性。特别地，用于在阴道感染和/或口腔感染的治疗或疗法中使用。
在一个实施方式中，基于所述序列的所有核苷酸的同一性，该序列与所选序列具有至少96％的同一性；优选地具有至少97％的同一性、至少98％的同一性、至少99％的同一性或完全相同。
本公开的另一方面涉及包含至少两种分离的寡聚物的组合的组合物，作为控制白色念珠菌丝状形成阻断剂，包含：选自由以下序列组成的列表的至少一个序列：SEQ ID 7、SEQ ID 8、SEQ ID 9或它们的组合；或者所述序列的变体，其中基于所述序列的全部核苷酸的同一性，所述序列的变体与所选择的序列具有至少95％的同一性。
在一个实施方式中，基于所述序列的所有核苷酸的同一性，该序列与所选序列具有至少96％的同一性；优选地具有至少97％的同一性、至少98％的同一性、至少99％的同一性或完全相同。
在一个实施方式中，分离的寡聚物的组合选自以下组合：
SEQ ID 7和SEQ ID 8；
SEQ ID 7和SEQ ID 9；
SEQ ID 8和SEQ ID 9；
SEQ ID 7；SEQ ID 8和SEQ ID 9。
在一个实施方式中，组合物可以是涂料组合物。
本公开的另一方面涉及包含本主题中描述的分离的寡聚物或组合物的制品，优选涂料组合物。
在一个实施方式中，制品可以是医疗器械，特别是贴片、导管、支架、隐形眼镜或起搏器等。
在一个实施方式中，制品可以是阴道内卫生棉条、卫生巾或卫生护垫。
在一个实施方式中，合成了靶向毒力所需的非必需基因的ASO，例如赋予侵袭性和增加白色念珠菌致病性的那些。普遍认为，如果在病原微生物中，特定基因的遗传序列被称为感染的决定因素，合成一条核酸链，其将与所产生的mRNA结合并使其失活，在将其翻译成蛋白质时，将有可能控制其毒力。
在另一个实施方式中，产生了基于AST的潜在ASO的混合物，其能够控制白色念珠菌从酵母到丝状从酵母到丝状体的形态转化，从而控制这种微生物的侵袭性。
在一个实施方式中，对ASO与白色念珠菌细胞的杂交能力进行功能分析。还对ASO抑制靶标基因表达的能力及其减少不同人体体液中白色念珠菌丝状形成的能力进行功能分析。这些分析是使用单独的ASO和ASO的组合完成的。
附图说明
以下附图提供了用于例示说明书的优选实施方式，并且不应被视为限制本发明的范围。
图1示出了根据说明书的反义寡聚物序列。
图2示出了通过荧光原位杂交测定确定的抗EFG1和抗HWP1寡聚物针对念珠菌物种的敏感性和特异性。
图3示出了40nM的抗EFG1、抗HWP1和抗HYR1寡聚物对3T3细胞系(成纤维细胞、胚胎组织、来自CCL3的小鼠、美国典型培养物保藏中心)的细胞毒性作用。
图4示出了抗EFG1、抗HWP1和抗HYR1寡聚物对白色念珠菌丝状形成的影响。
图5示出了在孵育24小时，40nM抗EFG1对白色念珠菌丝状形成、EFG1基因表达和efg1p翻译的影响。
图6示出了在24小时孵育期间与40nM的每种寡聚物(抗EFG1、抗HWP1和抗HYR1)的不同组合对白色念珠菌丝状形成相关的结果。
图7示出了抗EFG1寡聚物对不同人体体液的性能：在24小时期间的人工唾液(AS)和尿液(AU)，和在48小时孵育时的血液。
具体实施方式
本公开涉及ASO靶向参与白色念珠菌从酵母到丝状体的形态转化的特异性基因的用途。
本公开进一步描述了ASO在AST抑制白色念珠菌从酵母到丝状体的形态转化中的用途。
在一个实施方式中，设计并合成靶向三种不同基因的ASO以确保完全阻断白色念珠菌丝状形成。考虑到每个基因对白色念珠菌基因组的高特异性和对智人基因组的低特异性，从每个基因中选择基因组的高特异性和对智人基因组的低特异性，从每个基因中选择靶标区域。选择的区域对于EFG1、HWP1和HYR1分别是(5’-ACAATAACGGTATGCC-3’)、(5'CGCTTATTACATGTTATCA 3')和(5'GCTTACTCTCAACC 3')。
在一个实施方式中，选择用于甲基化的靶标区域是：
SEQ ID No.1-用于EFG1：5’-47ACAATAACGGTATGCC62-3’；
SEQ ID No.2-用于HWP1：5'33CGCTTATTACATGTTATCA513'；
SEQ ID No.3-用于HYR1：5'36GCTTACTCTCAACC49 3'。
在一个实施方式中，对于所选择的靶标区域的每个序列，确定反向互补序列以设计相应的ASO。确定的序列对于EFG1、HWP1和HYR1分别是(5’GGCATACCGTTATTGT 3’)、(5'TGATAACATGTAATAAGCG3’)和(5'GGTTGAGAGTAAGC 3`)。
确定用于甲基化的反向互补序列是：
SEQ ID No.4-用于EFG1：5’GGCATACCGTTATTGT 3’；
SEQ ID No.5-用于HWP1：5'TGATAACATGTAATAAGCG3'；
SEQ ID No.6-用于HYR1：5'GGTTGAGAGTAAGC 3'。
在一个实施方式中，为了提高ASO命中率，属于每个选定序列的部分寡核苷酸基于第二代核酸模拟物设计(2'-O-甲基)进行化学修饰。
在另一个实施方式中，一旦证明在核酸模拟物的每一端包含两个或多个修饰增加其在人血清中的稳定性，就设计并合成反义寡聚物。
在一个实施方式中，抗EFG1寡聚物被设计和合成有四种2'-O-甲基化学修饰(5’-mG mG mC mA TACCGTTA mU mU mG mU-3’)。抗HWP1寡聚物被设计和合成有两种化学修饰(5'mUmGATAACATGTAATAAGmCmG3’)。抗-HYR1寡聚物被设计和合成有三种化学修饰(5'mGmGmU TGA GAG TAmA mGmC 3’)。
在一个实施方式中，甲基化序列是：
SEQ ID No.7-用于EFG1：5’-mG mG mC mA TACCGTTAmU mU mG mU-3’；
SEQ ID No.8-用于HWP1：5'mUmGATAACATGTAATAAGmCmG3'；
SEQ ID No.9-用于HYR1：5'mGmGmU TGA GAG TAmAmGmC 3'。
用于比较的序列的比对方法是本领域公知的，此类方法包括BLAST和FASTA。BLAST算法(Altschul et al.(1990)J Mol Biol 215:403-10)计算序列同一性百分比并对两个序列之间的相似性进行统计分析。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得。在本主题中以百分比表示的序列同一性值是使用具有默认参数的BLAST在整个氨基酸序列上确定的。
在一个实施方式中，图1示出了白色念珠菌的EFG1(抗EFG1)、HWP1(抗HWP1)和HYR1(抗HYR1)基因的ASO序列以及相应的2’-O-甲基化学修饰插入。图1B总结了三个ASO序列在其大小、解链温度和鸟嘌呤和胞嘧啶(GC)百分比方面的特征。
在一个实施方式中，图2示出了通过荧光原位杂交测定确定的抗EFG1和抗HWP1寡聚物针对念珠菌物种的敏感性和特异性。图2A总结了所测试的不同念珠菌物种在37℃下杂交2小时后获得的荧光强度。图2B示出了念珠菌物种与标记有红色荧光素(56-FAM)和绿色荧光素(TYE563)的抗EFG1和抗HWP1杂交的荧光图像。
在一个实施方式中，图3示出了40nM的抗EFG1、抗HWP1和抗HYR1寡聚物对3T3细胞系(成纤维细胞、胚胎组织、来自CCL3的小鼠、美国典型培养物保藏中心)的细胞毒性作用。这些是使用MTS试剂盒(CellTiter 水溶液单一溶液细胞增殖测定，Promega)测量的。误差棒代表标准偏差。
在一个实施方式中，图4示出了抗EFG1、抗HWP1和抗HYR1寡聚物对白色念珠菌丝状形成的影响。图4A示出了40nM的每种寡聚物对白色念珠菌丝状形成抑制百分比的影响。图4B示出了用ASO处理24小时时白色念珠菌丝状形成减少的荧光图像。对照与在没有寡聚物的情况下在相同条件下培养的白色念珠菌相关。误差棒代表标准偏差。测试的不同时间点之间的统计差异(P<0.05)用*标记。
在一个实施方式中，图5A示出了40nM的抗EFG1在孵育24小时后对白色念珠菌丝状形成能力的影响。对EFG1基因表达的影响通过qRT-PCR(如图5B所示)和在通过纳米LC-MS/MS分析获得的efg1p翻译上测量(如图5C所示)。误差棒代表标准偏差。用抗EFG1寡聚物处理和未处理的白色念珠菌之间的统计差异(P<0.05)用*标记。
在一个实施方式中，图6示出了与40nM的每种寡聚物(抗EFG1、抗HWP1和抗HYR1)的不同组合相关的结果。图6A示出了对3T3细胞系的细胞毒性作用。这是使用MTS试剂盒测量的。图6B示出了对白色念珠菌丝状形成的影响(抑制百分比)。图6C示出了在孵育8小时和24小时时白色念珠菌丝状形成减少的荧光图像。误差棒代表标准偏差。用混合的ASO处理和未处理的白色念珠菌之间的统计差异(P<0.05)用*标记。
在一个实施方式中，图7示出了抗EFG1寡聚物对人体体液(AS-人工唾液；AU-人工尿液和血液)的性能。图7A示出了抗EFG1寡聚物对白色念珠菌丝状形成的影响。图7B示出了抗EFG1寡聚物对EFG1基因表达的影响。
上述实施方式是可组合的。
每当在本文献中使用时，术语“包括”旨在表示存在所述特征、整数、步骤、组件，但不排除存在或增加一个或多个其他特征、整数、步骤、组件或其组。
以下权利要求进一步阐述了本公开的特定实施方式。
参考文献
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序列表
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<130> P738.0 WO
<150> PT115349
<151> 2019-03-01
<150> PT115346
<151> 2019-02-28
<160> 9
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EFG1
<400> 1
acaataacgg tatgcc 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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cgcttattac atgttatca 19
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<400> 3
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<220>
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ggcataccgt tattgt 16
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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tgataacatg taataagcg 19
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<220>
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<400> 6
ggttgagagt aagc 14
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<212> RNA
<213> 单链RNA卫星
<220>
<223> EFG1
<400> 7
mgmgmcmata ccgttamumu mgmu 24
<210> 8
<211> 23
<212> RNA
<213> 单链RNA卫星
<220>
<223> HWP1
<400> 8
mumgataaca tgtaataagm cmg 23
<210> 9
<211> 20
<212> RNA
<213> 单链RNA卫星
<220>
<223> HYR1
<400> 9
mgmgmutgag agtamamgmc 20
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