基因疗法dna载体及其应用
阅读说明：本技术 基因疗法dna载体及其应用 (Gene therapy DNA vector and application thereof ) 是由 N.萨韦利瓦 于 2019-12-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及基因工程,并且可以在生物技术、医学和农业中用于制造基因疗法产品。构建携带治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体,以提高人和动物中该治疗性基因的表达水平,所述治疗性基因选自KRT5、KRT14、LAMB3、和COL7A1基因的组,其中基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、或VTvaf17-KRT14、或VTvaf17-LAMB3、或VTvaf17-COL7A1分别具有核苷酸序列SEQ ID NO.1、或SEQ ID NO.2、或SEQ ID NO.3、或SEQ ID NO.4。基因疗法DNA不包含病毒起源的核苷酸序列和抗生素抗性基因,这保证其在人和动物中基因疗法的安全使用。还提供了获得特定载体的方法、载体的用途、携带特定载体的大肠杆菌菌株以及工业上生产特定载体的方法。(The present invention relates to genetic engineering and can be used in biotechnology, medicine and agriculture for the manufacture of gene therapy products. Constructing a gene therapy DNA vector carrying a therapeutic gene based on a gene therapy DNA vector VTvaf17 to improve the expression level of the therapeutic gene in humans and animals, wherein the therapeutic gene is selected from the group of KRT5, KRT14, LAMB3 and COL7A1 genes, wherein the gene therapy DNA vector VTvaf17-KRT5, or VTvaf17-KRT14, or VTvaf17-LAMB3, or VTvaf17-COL7A1 has the nucleotide sequence SEQ ID NO.1, or SEQ ID NO.2, or SEQ ID NO.3, or SEQ ID NO.4, respectively. Gene therapy DNA does not contain nucleotide sequences of viral origin and antibiotic resistance genes, which ensures its safe use in gene therapy in humans and animals. Also provided are methods for obtaining the specific vectors, uses of the vectors, E.coli strains harboring the specific vectors, and methods for industrially producing the specific vectors.)
携带选自KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1基因的组的治疗性基因以提高这些治疗性基因的表达水平的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，其生产和使用方法，携带基因疗法DNA载体的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT5、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT14、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-LAMB3、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1，其产生方法，在工业规模上基因疗法DNA载体的生产方法。
技术领域
本发明涉及基因工程，并且可在生物技术、医学和农业中用于制造基因疗法产品。
背景技术
基因疗法是医学中的创新方法，旨在通过将新的遗传物质递送到患者的细胞中以补偿或遏制突变基因的功能和/或治疗遗传障碍(disorder)来治疗遗传性和获得性疾病。基因表达的终产物可以是RNA分子或蛋白质分子。然而，体内的大多数生理学过程都与蛋白质分子的功能性活性有关，而RNA分子或是蛋白质合成的中间产物，或是进行调节功能。因此，在大多数情况下，基因疗法的目标是向生物体注入基因，所述基因提供由这些基因编码的蛋白质分子的转录和进一步翻译。在本发明的描述中，基因表达是指产生具有由该基因编码的氨基酸序列的蛋白质分子。
一组基因中包含的KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1基因在人和动物体的若干过程中起关键作用。证明了在某些情况下这些蛋白质的低/不足浓度与各种人类疾病之间的相关性，其通过在编码这些蛋白质的正常基因表达中的干扰证实。因此，选自KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1基因的组的基因表达增加的基因疗法具有纠正人和动物中的各种病症的潜力。
COL7A1基因编码VII型胶原。三条前α1(VII)链缠绕在一起形成三链体前胶原分子。前胶原分子由细胞分泌，并且被酶加工从末端移除额外的蛋白质片段。一旦这些分子被加工，它们将自身排列成成熟的VII型胶原的细长束。
COL7A1基因中的突变导致营养不良性大疱性表皮松解症(dystrophicepidermolysis bullosa)。水疱最常发生在轻微受伤的部位，如肘部伸肌面和手足背。愈合导致疤痕，浅表表皮囊肿和色素沉着。有些患者具有指甲营养不良。经常发生真皮外表现，包括对泌尿道和胃肠道，外眼膜的损伤，慢性贫血，骨质疏松和生长迟缓。大疱性表皮松解症患者有高的癌症风险，特别是形成侵袭性鳞状细胞癌。于1978年在英国成立的DEBRAInternational在全球范围内研究和治疗大疱性表皮松解症。根据DEBRA International，世界上每5-10万人产生一名患者。
目前世界范围内对大疱性表皮松解症的治疗以三个方向进行各种研究：基因疗法、重组蛋白疗法和基于细胞的疗法(干细胞应用)。所有这些类型的治疗都处于不同的发展阶段。
治疗大疱性表皮松解症的基因疗法方法包括不同的实验性治疗。在纠正COL7A1基因突变的若干研究中，成功地使用了离体基因组编辑技术(Mencía等人，2018)、编码COL7A1基因的线性DNA分子的微注射(Mecklenbeck等人，2002)、使用整合酶的cDNA整合(Ortiz-Urda等人，2003)、慢病毒载体的皮内注射(Woodley等人，2004)、基于TALEN核酸酶的突变修复技术(Osborn等人，2013)，以及注射自体细胞，即使用各种反转录病毒载体修饰的成纤维细胞或角质形成细胞(Jacków等人，2016，Georgiadis等人，2016，Goto等人，2006)。目前，这些方法的临床试验处于不同的研究阶段(NCT01263379,NCT02810951)。
KRT5和KRT14基因分别编码角蛋白5和角蛋白14蛋白。角蛋白是一组刚性纤维蛋白，其决定皮肤、毛发和指甲的结构。角蛋白5在角质形成细胞中产生。角蛋白5与角蛋白14形成称为角蛋白中间细丝的分子。这些细丝被收集成网状结构，为角质形成细胞的附着和表皮与下层皮肤层之间的连接所必需。角蛋白中间细丝网络为皮肤提供强度和弹性，并保护皮肤免受由摩擦和其他机械应力所致的的损害。KRT5和KRT14中的突变导致约75％的大疱性表皮松解症病例，并且疾病的严重程度取决于基因突变的区域(Bolling、Lemmink、Jansen和Jonkman，2011；Pfendner等人，2016)。在KRT5基因敲除小鼠中，真皮和表皮之间完全缺乏连接(Cao等人，2001；Peters、Kirfel、Büssow、Vidal和Magin，2001)。
除了大疱性表皮松解症之外，KRT5和KRT14基因中的突变还导致诸如网状色素性屈曲异常(reticulate pigmented anomaly of the flexures)(道林-德戈斯二氏病(Dowling-Degos disease))、网状色素性皮肤病(reticular pigmented dermatopathy)(Oberst-Lehn-Hauss色素性皮肤病(Oberst-Lehn-Hauss pigmented dermatopathy))、Naegeli-Franceschetti-Jadassohn综合征(Coulombe PA等人，2017)的疾病。
LAMB3基因编码层粘连蛋白β3(即层粘连蛋白亚基)。层粘连蛋白是一组调节细胞生长、运动和粘附的蛋白质。它们还参与基底膜的形成和构造(organization)，所述基底膜构成薄片状结构，它们在许多组织中分离和支持细胞。层粘连蛋白是连接基底膜两层并帮助形成单一皮肤结构的称为锚定细丝的纤维的主要成分，并且LAMB3基因中的突变导致大疱性表皮松解症。研究表明层粘连蛋白还具有其他若干功能。这种蛋白似乎在伤口愈合和釉质发生(enamel genesis)中是重要的。
从文献中已知，LAMB3基因中的突变可引起遗传性棕色釉质(hereditary brownenamel)(Poulter等人，2014)，并且该基因的一些罕见等位基因与疼痛性脂肪过多症(lipomatosis dolorosa)和2型糖尿病风险相关(Jiao H等人，2016)。
对一名患有大疱性表皮松解症的自愿患者的实验性工作表明，用表达LAMB3基因的反转录病毒载体转染的细胞的移植导致了至少持续一年的给药部位的显著改善(Mavilio等人，2006)。
I/II期临床试验表明，注射表达LAMB3基因的遗传修饰的自体上皮细胞似乎是治疗大疱性表皮松解症的一种有希望的途径(De Rosa L等人，2013)。
因此，本发明的背景表明KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1基因的突变或由这些基因编码的蛋白质的表达不足与一系列疾病的发展相关，所述疾病包括但不限于，结缔组织疾病、伤口愈合、遗传性和获得性病理过程，如大疱性表皮松解症，以及对身体的其他不利病况。这就是KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1基因被归入本专利的原因。提供由KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1基因编码的蛋白质表达的遗传构建体可用于开发用于预防和治疗不同疾病和病理状况的药物。
此外，这些数据表明，在一组基因中包含的KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1基因编码的蛋白的表达不足不仅与病理状况有关，而且与它们发展的易感性有关。此外，这些数据表明，这些蛋白质的表达不足可能不以现有临床实践标准(例如，使用ICD代码)框架内可以明确描述的病理学形式明确出现，但同时导致对人类和动物不利并与生活质量恶化有关的状况。
对提高治疗性基因表达的方法的分析意味着使用不同基因疗法载体的可行性。
将基因疗法载体分为病毒、细胞、和DNA载体(关于基因疗法药物产物的质量、非临床和临床方面的指南EMA/COL7A1/80183/2014)。最近，基因疗法越来越重视非病毒基因递送系统的开发，其中质粒载体位居榜首。质粒载体没有细胞和病毒载体固有的限制。在靶细胞中，它们作为附加体存在，没有整合到基因组中，而产生它们相当便宜，并且没有施用质粒载体而引起的免疫反应或副作用，这使得它们成为遗传疾病的基因疗法和预防(DNA疫苗接种)的便捷工具(Li L,Petrovsky N.//Expert Rev Vaccines.2016；15(3):313-29)。
然而，在基因疗法中质粒载体使用的局限性是：1)用于在细菌菌株中生产构建体的抗生素抗性基因的存在；2)由病毒基因组序列所代表的各种调控元件的存在；3)决定载体递送至靶细胞的效率的治疗性质粒载体的长度。
众所周知，欧洲药品管理局认为有必要避免将抗生素抗性标记基因添加到用于基因疗法的新工程化的质粒载体中(关于开发过程中基因疗法药物产物的设计修改的读后报告(Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinalproducts during development)/2011年12月14日EMA/COL7A1/GTWP/44236/2009先进疗法委员会(Committee for advanced therapies))。该建议主要与DNA载体渗透或水平抗生素抗性基因转移到体内存在的细菌细胞中的潜在危险有关，这些细菌是正常或机会性微生物群落的一部分。此外，抗生素抗性基因的存在显著增加了DNA载体的长度，这降低了其渗透到真核细胞的功效。
值得注意的是，抗生素抗性基因也对DNA载体的生产方法做出了根本性的贡献。如果存在抗生素抗性基因，那么用于产生DNA载体的菌株通常在含有选择性抗生素的培养基中培养，这会在未经充分纯化的DNA载体制剂中造成抗生素痕量的风险。因此，没有抗生素抗性基因的用于基因疗法的DNA载体的生产与菌株的生产有关，其中此类菌株具有独特的特征，例如在无抗生素的培养基中治疗性DNA载体稳定扩增的能力。
此外，欧洲药品管理局建议避免在治疗性质粒载体中存在构成各种病毒的基因组核苷酸序列的提高治疗性基因表达的调控元件(启动子、增强子、翻译后调控元件)(关于基因疗法药物产品的质量、非临床和临床方面的指南草稿(Draft Guideline on thequality,non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinalproducts)，http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/05/WC500187020.pdf)。尽管这些序列可以提高治疗性转基因的表达水平，但是它们造成了与野生型病毒的遗传物质重组和整合到真核基因组中的风险。此外，疗法用的特定基因的过表达的相关性仍然是悬而未决的问题。
疗法载体的大小也是必需的。众所周知，现代质粒载体通常具有不必要的非功能性位点，这些位点会显著增加其长度(Mairhofer J,Grabherr R.//MolBiotechnol.2008.39(2):97-104)。例如，pBR322系列载体中的氨苄西林抗性基因，通常由至少1000bp组成，占载体本身长度的20％以上。观察到载体长度与其渗入真核细胞的能力之间的反向关系；具有小长度的DNA载体有效渗入人和动物细胞中。例如，在关于用383-4548bp DNA载体转染HeLa细胞的一系列实验中，显示渗入功效的差异可高达两个数量级(100倍差异)(Hornstein BD等人//PLoS ONE.2016；11(12):e0167537.)。
因此，为了安全和最大效率的原因在选择DNA载体时，应优先考虑到如下那些构建体，它们不包含抗生素抗性基因，病毒来源的序列，并且其长度允许有效渗入到真核细胞中。以对于基因疗法目的足够的量生产此类DNA载体的菌株应确保使用无抗生素的营养培养基进行稳定的DNA载体扩增的可能性。
用于基因疗法的重组DNA载体的使用实例是产生用于遗传免疫的重组载体的方法(专利号US 9550998 B2)。质粒载体是超螺旋的质粒DNA载体，其用于人和动物细胞中克隆基因的表达。载体包含复制起点，含有人巨细胞病毒启动子和增强子的调控元件，以及来自人T-细胞嗜淋巴细胞病毒的调节序列。
利用噬菌体，通过插入菌株中的sacB基因的反义互补，将载体在无抗生素的专用大肠杆菌菌株中积累。该发明的缺点是在DNA载体组成中存在构成病毒基因组的序列的调控元件。
以下申请是本发明的原型，涉及使用基因疗法的方式来提高来自KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1基因的组的基因的表达水平。
申请号US20020064876A1描述了基于注射由RNA和DNA组成的复合寡核苷酸的发明，用于校正来自KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1基因的组的基因的表达障碍，用于纠正皮肤病理状况，包括遗传性疾病，如大疱性表皮松解症。该发明的缺点是用于纠正基因中的障碍的方法，其改变这些基因的核苷酸序列，然而并非所有的障碍都限于基因编码区中的突变，并且也可能与功能活性不足有关，所述功能活性不足不是由于突变或不能通过该方法纠正的此类突变而导致的。
发明内容
本发明的目的是构建基因疗法DNA载体，以便于在人和动物生物体中提高KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1基因的组的表达水平，所述基因疗法载体结合以下特性：
I)基因疗法DNA载体的效率，以便于提高真核细胞中治疗性基因的表达水平；
II)由于基因疗法DNA载体中不存在代表病毒基因组核苷酸序列的调控元件，因此在人类和动物的基因疗法中安全使用的可能性；
III)由于基因疗法DNA载体中不存在抗生素抗性基因，在人类和动物的基因疗法中安全使用的可能性；
IV)在工业规模上基因疗法DNA载体的可生产性和可构建性。
根据国家监管机构对基因疗法药物的建议，并且特别是欧洲药品管理局的要求，即避免将抗生素抗性标记基因添加到用于基因疗法的新工程化的质粒载体中(关于开发过程中基因疗法药物产物的设计修改的读后报告/2011年12月14日EMA/COL7A1/GTWP/44236/2009先进疗法委员会)，以及避免将病毒基因组添加到用于基因疗法的新工程化的质粒载体中(关于基因疗法药物产品的质量、非临床和临床方面的指南/2015年3月23日，EMA/COL7A1/80183/2014，先进疗法委员会)，在本文中提供了II和III项。
本发明的目的还包括构建携带这些基因疗法DNA载体的菌株，在工业规模上开发和生产这些基因疗法DNA载体。
通过使用基于基因疗法DNA载体VTvaf17产生的基因疗法DNA载体来实现特定目的，所述基因疗法DNA载体用于治疗与皮肤、毛发和指甲的结构构造(structuralorganisation)障碍相关的疾病，角质形成细胞附着和表皮与亚层(sublayer)连接的障碍，伤口愈合障碍，结缔组织病理，包括大疱性表皮松解症、道林-德戈斯二氏病、Oberst-Lehn-Hauss色素性皮肤病、Naegeli-Franceschetti-Jadassohn综合征和棕色釉质，其中所述基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5含有克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的KRT5治疗性基因的编码区，具有核苷酸序列SEQ ID No.1；所述基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14含有克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17上的KRT14治疗性基因的编码区，具有核苷酸序列SEQ ID No.2；所述基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3含有克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17上的LAMB3治疗性基因的编码区，具有核苷酸序列SEQ ID No.3；所述基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1含有克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17上的COL7A1治疗性基因的编码区，具有核苷酸序列SEQ IDNo.4。由于VTvaf17载体部分不超过3200bp的有限大小，构建的基因疗法DNA载体中的每一种，即VTvaf17-KRT5、或VTvaf17-KRT14、或VTvaf17-LAMB3、或VTvaf17-COL7A1具有有效渗入人和动物细胞并表达KRT5、或KRT14、或LAMB3、或COL7A1的能力。
所构建的基因疗法DNA载体中的每一种，即VTvaf17-KRT5、或VTvaf17-KRT14、或VTvaf17-LAMB3、或VTvaf17-COL7A1使用如下核苷酸序列作为结构元件，所述核苷酸序列不是抗生素抗性基因、病毒基因，或病毒基因组的调控元件，这确保其安全用于人和动物的基因疗法。
还开发了携带KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体的生产方法，所述方法涉及如下获得基因疗法DNA载体中的每一种：VTvaf17-KRT5、或VTvaf17-KRT14、或VTvaf17-LAMB3、或VTvaf17-COL7A1：将KRT5、KRT14、LAMB3或COL7A1治疗性基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，并且分别获得基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5，SEQ ID No.1；或VTvaf17-KRT14，SEQ ID No.2；或VTvaf17-LAMB3，SEQ ID No.3；或VTvaf17-COL7A1，SEQ ID No.4，其中所述KRT5、或KRT14、或LAMB3、或COL7A1治疗性基因的编码区通过如下获得：通过从人生物学组织样本分离总RNA，随后使用所获得的寡核苷酸进行反转录反应和PCR扩增，并通过相应的限制性内切核酸酶切割扩增产物，其中由BamHII和HindII、或SalI和EcoRI限制位点进行对基因疗法DNA载体VTvaf17的克隆，其中在无抗生素的情况下选择，
其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、SEQ IDNo.1生产过程中用于反转录反应和PCR扩增：
KRT5_FTTTGGATCCACCATGTCTCGCCAGTCAAGTGTGTCCTTC，
KRT5_R AATAAGCTTCTAGCTCTTGAAGCTCTTCCGGGAGG，
并且通过BamHII和HindIII限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将KRT5F基因的编码区克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17，
其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14、SEQID No.2生产过程中用于反转录反应和PCR扩增：
KRT14_F TTTGGATCCACCATGACCACCTGCAGCCGCCAG，
KRT14_R AATAAGCTTTCAGTTCTTGGTGCGAAGGACCTGC，
并且通过BamHII和HindIII限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将KRT14基因的编码区克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17，
其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3、SEQID No.3生产过程中用于反转录反应和PCR扩增：
LAMB3_FTTAGTCGACCACCATGAGACCATTCTTCCTCTTG，
LAMB3_R ATAGAATTCACTTGCAGGTGGCATAGTAGAG，
并且通过SalI和EcoRI限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将LAMB3基因的编码区克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17，
其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、SEQID No.4生产过程中用于反转录反应和PCR扩增的：
COL7A1_FATCGTCGACCACCATGACGCTGCGGCTTCTGGT，
COL7A1_R ATAGAATTCAGTCCTGGGCAGTACCTGTC，
并且通过SalI和EcoRI限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将COL7A1基因的编码区克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17。
开发了使用携带KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体用于治疗与皮肤、毛发和指甲的结构构造障碍相关的疾病，角质形成细胞附着和表皮与亚层连接的障碍，伤口愈合障碍，结缔组织病理，包括大疱性表皮松解症、道林-德戈斯二氏病、Oberst-Lehn-Hauss色素性皮肤病、Naegeli-Franceschetti-Jadassohn综合征和棕色釉质，所述方法涉及用从基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的所构建的基因疗法DNA载体的组选择的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体，或选择的若干种基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体转染患者或动物器官和组织的细胞；和/或将通过从基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的所构建的基因疗法DNA载体选择的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体或选择的若干种基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体转染的所述患者或动物的自体细胞注射入相同患者或动物的器官和组织；和/或将从基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的所构建的基因疗法DNA载体的组选择的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体或选择的若干种基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体注射入相同患者或动物的器官和组织，或所指示的方法的组合。
开发了用于构建基因疗法DNA载体的菌株的生产方法，所述基因疗法DNA载体用于治疗与皮肤、毛发和指甲的结构构造障碍相关的疾病，角质形成细胞附着和表皮与亚层连接的障碍，伤口愈合障碍，结缔组织病理，包括大疱性表皮松解症、道林-德戈斯二氏病、Oberst-Lehn-Hauss色素性皮肤病、Naegeli-Franceschetti-Jadassohn综合征和棕色釉质，所述方法涉及制备大肠杆菌菌株SCS110-AF的电感受态细胞，并用基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、或基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14、或基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3、或基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1对这些细胞进行电穿孔。之后，将细胞倒入含有选择性培养基的琼脂板(培养皿)，所述选择性培养基含有酵母浸膏、蛋白胨、6％蔗糖、和10μg/ml氯霉素，并且作为结果，获得大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT5、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT14、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-LAMB3、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1。
要求保护大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT5，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5供其生产，在基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择；或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT14，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14供其生产，在基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择；或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-LAMB3，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3供其生产，在基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择；或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1供其生产，在基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择，用于治疗与皮肤、毛发和指甲的结构构造障碍相关的疾病，角质形成细胞附着和表皮与亚层连接的障碍，伤口愈合障碍，结缔组织病理，包括大疱性表皮松解症、道林-德戈斯二氏病、Oberst-Lehn-Hauss色素性皮肤病、Naegeli-Franceschetti-Jadassohn综合征和棕色釉质。
开发在工业规模上生产携带KRT5、或KRT14、或LAMB3、或COL7A1治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体的方法，所述基因疗法DNA载体用于治疗与皮肤、毛发和指甲的结构构造障碍相关的疾病，角质形成细胞附着和表皮与亚层连接的障碍，伤口愈合障碍，结缔组织病理，包括大疱性表皮松解症、道林-德戈斯二氏病、Oberst-Lehn-Hauss色素性皮肤病、Naegeli-Franceschetti-Jadassohn综合征和棕色釉质，所述方法涉及如下生产基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、或基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14、或基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3、或基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1：通过用选自大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT5、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT14、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-LAMB3、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A116.的种子培养物对含有制备的培养基的培养烧瓶接种，然后将细胞培养物在培养箱摇床上孵育并转移到工业发酵罐中，然后培养到稳定期，然后提取含有靶DNA产物的级份，进行多级过滤，并通过色谱法纯化。
附图说明
本发明的实质在以下图中进行解释，其中：
图1
显示携带选自KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1基因的组的治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17的结构，其构成能够在大肠杆菌细胞中自主性复制的环状双链DNA分子。
图1显示了对应于以下内容的结构：
A-基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5，
B基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT144，
C基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3，
D-基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1。
将载体的以下结构元件以如下结构指示：
EF1a-人延长因子EF1A的启动子区域，其具有基因的第一个内含子中包含的内在增强子。它确保重组的基因在大多数人组织中的高效转录。
分别对应于KRT5(图1A)、或KRT14(图1B)、或LAMB3(图1C)或COL7A1(图1D)的编码区的治疗性基因的阅读框，
hGH-TA-人生长因子基因的转录终止子和聚腺苷酸化位点。
ori-用于自主性复制的复制起点，具有单核苷酸取代以增加大多数大肠杆菌菌株细胞中的质粒产生。
RNA-out-在使用大肠杆菌菌株SCS 110-AF的情况下，允许无抗生素阳性选择的转座子Tn 10的调控元件RNA-out。
标记独特的限制位点。
图2
显示了在HDFa原代人真皮成纤维细胞培养物(ATCC PCS-201-012)中，在用基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5转染这些细胞前和转染后48小时，治疗性基因(即KRT5基因)的cDNA扩增子积累的图，以便于评价渗入真核细胞的能力和功能性活性，即在mRNA水平上的治疗性基因的表达。
在反应过程中，将扩增子积累的曲线显示在图2中，对应于：
1-在用DNA载体VTvaf17-KRT5转染前，HDFa原代人真皮成纤维细胞培养物中KRT5基因的cDNA，
2-在用DNA载体VTvaf17-KRT5转染后，HDFa原代人真皮成纤维细胞培养物中KRT5基因的cDNA，
3-在用DNA载体VTvaf17-KRT5转染前，HDFa原代人真皮成纤维细胞培养物中B2M基因的cDNA，
4-在用DNA载体VTvaf17-KRT5转染后，HDFa原代人真皮成纤维细胞培养物中B2M基因的cDNA。
将GenBank数据库中，编号NM 004048.2下列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因用作参考基因。
图3
显示在HEKa原代人表皮角质形成细胞培养物(ATCC PCS-200-011)中，在用基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14转染这些细胞前和转染后48小时，治疗性基因(即KRT14基因)的cDNA扩增子积累的图，以便于评价渗入真核细胞的能力和功能性活性，即在mRNA水平上的治疗性基因的表达。
在反应过程中，将扩增子累积的曲线显示在图3中，对应于：
1-在用DNA载体VTvaf17-KRT14转染前，HEKa原代人表皮角质形成细胞培养物中KRT14基因的cDNA，
2-在用DNA载体VTvaf17-KRT14转染后，HEKa原代人表皮角质形成细胞培养物中KRT14基因的cDNA,
3-在用DNA载体VTvaf17-KRT14转染前，HEKa原代人表皮角质形成细胞培养物中B2M基因的cDNA，
4-在用DNA载体VTvaf17-KRT14转染后，HEKa原代人表皮角质形成细胞培养物中B2M基因的cDNA。
以GenBank数据库中以编号为NM 004048.2列出的B2M(Beta-2-微球蛋白)基因为参考基因。
图4
显示在人骨骼肌成肌细胞(HSKM)(Cat.A12555)中，在用基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3转染这些细胞前和转染后48小时，治疗性基因(即LAMB3基因)的cDNA扩增子积累的图，以便于评价渗入真核细胞的能力和功能性活性，即在mRNA水平上的治疗性基因的表达。
在反应过程中，将扩增子累积的曲线显示在图4中，对应于：
1-在用DNA载体VTvaf17-LAMB3转染前，HSKM人骨骼肌成肌细胞中LAMB3基因的cDNA，
2-在用DNA载体VTvaf17-LAMB3转染后，HSKM人骨骼肌成肌细胞中LAMB3基因的cDNA，
3-在用DNA载体VTvaf17-LAMB3转染前，HSKM人骨骼肌成肌细胞中B2M基因的cDNA，
4-在用DNA载体VTvaf17-LAMB3转染后，HSKM人骨骼肌成肌细胞中B2M基因的cDNA。
将GenBank数据库中，编号NM 004048.2下列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因用作参考基因。
图5
显示在正常人原代脐静脉内皮细胞(HUVEC)(PCS-100-010TM)中，在用基因治疗DNA载体VTvaf17-COL7A1转染这些细胞前和转染后48小时，治疗性基因(即COL7A1基因)的cDNA扩增子积累的图，以便于评价渗入真核细胞的能力和功能性活性，即在mRNA水平上的治疗性基因的表达。
在反应过程中，将扩增子累积的曲线显示在图5中，对应于：
1-在用DNA载体VTvaf17-COL7A1转染前，HUVEC人原代脐静脉内皮细胞中COL7A1基因的cDNA，
2-在用DNA载体VTvaf17-COL7A1转染后，HUVEC人原代脐静脉内皮细胞中COL7A1基因的cDNA，
3-在用DNA载体VTvaf17-COL7A1转染前，HUVEC人原代脐静脉内皮细胞中B2M基因cDNA，
4-在用DNA载体VTvaf17-COL7A1转染后，HUVEC人原代脐静脉内皮细胞中B2M基因的cDNA。
以GenBank数据库中以编号为NM 004048.2列出的B2M(Beta-2-微球蛋白)基因为参考基因。
图6
显示在HDFa人原代真皮成纤维细胞(ATCCPCS-201-01)的细胞裂解物中，在用DNA载体VTvaf17-KRT5转染这些细胞后，KRT5蛋白浓度的图，以便于评价功能性活性，即基于细胞裂解物中KRT5蛋白浓度变化的蛋白质水平上的表达。
将以下元件指示在图6中：
培养物A-用无质粒DNA的水性树枝状聚合物溶液(参考)转染的HDFa人原代真皮成纤维细胞培养物，
培养物B-用DNA载体VTvaf17转染的HDFa原代人真皮成纤维细胞培养物，
培养物C-用DNA载体VTvaf17-KRT5转染的HDFa人原代真皮成纤维细胞培养物。
图7
显示在HEKa原代人表皮角质形成细胞(ATCC PCS-200-01)的裂解物中，在用DNA载体VTvaf17-KRT14转染这些细胞后，KRT14蛋白浓度的图，以便于评价功能性活性，即蛋白质水平上的治疗性基因表达以及携带KRT14治疗性基因的基于基因疗法载体VTvaf17的基因疗法DNA载体提高蛋白质表达水平的可能性。
将以下元件指示在图7中：
培养物A-用无质粒DNA的水性树枝状聚合物溶液(参考)转染的HEKa原代人表皮角质形成细胞培养物，
培养物B-用DNA载体VTvaf17转染的HEKa原代人表皮角质形成细胞培养物，
培养物C-用DNA载体VTvaf17-KRT14转染的HEKa原代人表皮角质形成细胞培养物。
图8
显示在人骨骼肌成肌细胞(HSKM)(Cat.A12555)的裂解物中，在用DNA载体VTvaf17-LAMB3转染这些细胞后，LAMB3蛋白浓度的图，以便于评价功能性活性，即蛋白质水平上的治疗性基因表达以及携带LAMB3治疗性基因的基于基因疗法载体VTvaf17的基因疗法DNA载体提高蛋白质表达水平的可能性。
将以下元件指示在图8中：
培养物A-用无质粒DNA的水性树枝状聚合物溶液(参考)转染的HSKM人原代骨骼肌成肌细胞，
培养物B-用DNA载体VTvaf17转染的HSKM人原代骨骼肌成肌细胞，
培养物C-用DNA载体VTvaf17-LAMB3转染的HSKM人原代骨骼肌成肌细胞。
图9
显示在正常人原代脐静脉内皮细胞(HUVEC)(PCS-100-010TM)的细胞裂解物中，用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1转染这些细胞后，COL7A1蛋白浓度的图，以便于评价功能性活性，即治疗基因在蛋白质水平上的表达和携带COL7A1治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1提高蛋白质表达水平的可能性。
将以下元件指示在图19中：
培养物A-用无质粒DNA的水性树枝状聚合物溶液转染(参考)的HUVEC人脐静脉内皮细胞培养物，
培养物B-用DNA载体VTvaf17转染的HUVEC人脐静脉内皮细胞培养物，
培养物C-用DNA载体VTvaf17-COL7A1转染的HUVEC人脐静脉内皮细胞培养物。
图10
显示在将基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1注射到三名患者的皮肤后，这些患者的皮肤生检样本中COL7A1蛋白浓度的图，以便于评价功能性活性，即在蛋白质水平上的治疗性基因的表达以及使用携带COL7A1治疗性基因的基于基因疗法载体VTvaf17的基因疗法DNA载体提高蛋白质表达水平的可能性。
将以下元件指示在图10中：
P1I-在基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1的注射区域中进行的患者P1皮肤生检，
P1II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射区域中进行的患者P1皮肤生检，
P1III-来自完整部位的患者P1皮肤生检，
P2I-在基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1的注射区域中进行的患者P2皮肤生检，
P2II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射区域中进行的患者P2皮肤生检，
P2III-来自完整部位的患者P2皮肤生检，
P3I-在基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1的注射区域中进行的患者P3皮肤生检，
P3II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射区域中进行的患者P3皮肤生检，
P3III-来自完整部位的患者P3皮肤生检。
图11
显示在将基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3注射到三名患者的腓肠肌后，这些患者的腓肠肌生检样本中LAMB3蛋白浓度的图，以便于评价功能性活性，即在蛋白质水平上的治疗性基因的表达以及使用携带LAMB3治疗性基因的基于基因疗法载体VTvaf17的基因疗法DNA载体提高蛋白质表达水平的可能性。
将以下元件指示在图11中：
P1I-在基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3的注射区域中进行的患者P1腓肠肌生检，
P1II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射区域中进行的患者P1腓肠肌生检，
P1III-来自完整部位的患者P1腓肠肌生检，
P2I-在基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3的注射区域中进行的患者P2腓肠肌生检，
P2II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射区域中进行的患者P2腓肠肌生检，
P2III-来自完整部位的患者P2腓肠肌生检，
P3I-在基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3的注射区域中进行的患者P3腓肠肌生检，
P3II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射区域中进行的患者P3腓肠肌生检，
P3III-来自完整部位的患者P3腓肠肌生检。
图12
显示在将基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14注射到三名患者的皮肤后，这些患者的皮肤生检样本中KRT14蛋白浓度的图，以便于评价功能性活性，即在蛋白质水平上的治疗性基因的表达以及使用携带KRT14治疗性基因的基于基因疗法载体VTvaf17的基因疗法DNA载体提高蛋白质表达水平的可能性。
将以下元件指示在图12中：
P1I-在基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14的注射区域中进行的患者P1皮肤生检，
P1II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射区域中进行的患者P1皮肤生检，
P1III-来自完整部位的患者P1皮肤生检，
P2I-在基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14的注射区域中进行的患者P2皮肤生检，
P2II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射区域中进行的患者P2皮肤生检，
P2III-来自完整部位的患者P2皮肤生检，
P3I-在基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14的注射区域中进行的患者P3皮肤生检，
P3II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射区域中进行的患者P3皮肤生检，
P3III-来自完整部位的患者P3皮肤生检。
图13
显示在皮下注射用基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14转染的自体成纤维细胞培养物后，人皮肤生检样本中KRT14蛋白浓度的图，以便于表明通过注射用基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14转染的自体细胞的使用方法。
将以下元件指示在图13中：
P1C-在用基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14转染的患者自体成纤维细胞培养物的注射区域中进行的患者P1皮肤生检，
P1B-在用基因疗法DNA载体VTvaf17转染的患者自体成纤维细胞培养物的注射区域中进行的患者P1皮肤生检，
P1A-来自完整部位的患者P1皮肤生检。
图14
显示在注射以下基因疗法DNA载体：VTvaf17-KRT5、基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14、基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3和基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1的混合物后，三只大鼠皮肤生检样本中以下蛋白质：人KRT5蛋白、人KRT14蛋白、人LAMB3蛋白和人COL7A1蛋白浓度的图，以说明使用基因疗法DNA载体混合物的方法。
将以下元件指示在图14中：
K1I-在基因疗法DNA载体：VTvaf17-KRT5、VTvaf17-KRT14、VTvaf17-LAMB3和VTvaf17-COL7A1的混合物的注射区域中的大鼠K1皮肤生检样本，
K1II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射区域中的大鼠K1皮肤生检样本，
K1III-参考完整部位的大鼠K1皮肤生检样本，
K2I-在基因疗法DNA载体：VTvaf17-KRT5、VTvaf17-KRT14、VTvaf17-LAMB3和VTvaf17-COL7A1的混合物的注射区域中的大鼠K2皮肤生检样本，
K2II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射区域中的大鼠K2皮肤生检样本，
K2III-在参考完整部位的大鼠K2皮肤生检样本，
K3I-在基因疗法DNA载体：VTvaf17-KRT5、VTvaf17-KRT14、VTvaf17-LAMB3和VTvaf17-COL7A1的混合物的注射区域中的大鼠K3皮肤生检样本，
K3II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射区域中的大鼠K3皮肤生检样本，
K3III-参考完整部位的大鼠K3皮肤生检样本。
图15
显示MDBK牛肾上皮细胞(NBL-1)(CCL-22TM)中，在用DNA载体VTvaf17-LAMB3转染这些细胞前和转染后48小时，LAMB3治疗性基因cDNA扩增子积累的图，以便于表明通过在动物中注射基因疗法DNA载体的使用方法。
在反应过程中，将扩增子累积的曲线显示在图15中，对应于：
1-在用基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3转染前，MDBK细胞中LAMB3基因的cDNA，
2-在用基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3转染后，MDBK细胞LAMB3基因的cDNA，
3-在用基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3转染前，MDBK细胞前ACT基因的cDNA，
4-在用基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3转染后，MDBK细胞后ACT基因的cDNA。
将GenBank数据库中编号AH001130.2下列出的公牛/牛肌动蛋白基因(ACT)用作参考基因。
具体实施方式
基于3165bp DNA载体VTvaf17，构建携带人治疗性基因的基因疗法DNA载体，设计为提高人和动物组织中这些治疗性基因的表达水平。产生携带治疗性基因的每种基因疗法DNA载体的方法将治疗性基因的蛋白质编码序列克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17的多接头，所述治疗性基因选自以下基因的组：人KRT5基因(编码KRT5蛋白)、人KRT14基因(编码KRT14蛋白)、人LAMB3基因(编码LAMB3蛋白)和人COL7A1基因(编码COL7A1蛋白)。众所周知，DNA载体渗入真核细胞的能力主要取决于载体的大小。尺寸最小的DNA载体具有更高的渗透能力。因此，优选载体中不存在不承担功能负载，但同时增加载体DNA大小的元件。在携带选自KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1基因的组的治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体的生产过程中，考虑了DNA载体的这些特征，其中载体中没有大的非功能性序列和抗生素抗性基因，除了技术优势和安全使用外，允许携带治疗性基因(选自KRT5、KRT14、LAMB3、和COL7A1基因的组)的所产生的的基因疗法DNA载体VTvaf17的尺寸显著减小。因此，所获得的基因疗法DNA载体渗入真核细胞的能力是由于其长度小所致。
将以下基因疗法DNA载体中的每一种：VTvaf17-KRT5、或VTvaf17-KRT14、或VTvaf17-LAMB3、或VTvaf17-COL7A1如下生产：将来自KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1基因的组的治疗性基因的编码区克隆到DNA载体VTvaf17中，并且分别获得基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5，SEQ ID No.1；或VTvaf17-KRT14，SEQ ID No.2；或VTvaf17-LAMB3，SEQ IDNo.3；或VTvaf17-COL7A1，SEQ ID No.4。通过从生物学正常人组织样本提取总RNA产生KRT5基因(1776bp)、或KRT14基因(1422bp)、或LAMB3基因(3521bp)、或COL7A1基因(8838bp)的编码区。将反转录反应用于人KRT5、KRT14、LAMB3、和COL7A1基因的第一链cDNA的合成。使用出于此目的通过化学合成方法产生的寡核苷酸进行扩增。通过考虑到用于进一步克隆的最佳程序的特异性限制性内切核酸酶切割扩增产物，并且通过位于VTvaf17载体多接头中的BamHI、SalI、EcoRI和HindIII限制位点进行克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17。限制位点的选择是以这样的方式进行的，即克隆片段进入载体VTvaf17表达盒的阅读框，而蛋白质编码序列不包含所选核酸内切酶的限制位点。该领域的专家认识到基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、或VTvaf17-KRT14、或VTvaf17-LAMB3、或VTvaf17-COL7A1产生的方法学实现可以在已知的分子基因克隆的选择框架内变化，并且这些方法包括在本发明的范围内。例如，可以将不同的寡核苷酸序列用于扩增KRT5、或KRT14、或LAMB3、或COL7A1基因，不同的限制性内切核酸酶或实验室技术(例如不依赖于连接的基因克隆)。
基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、或VTvaf17-KRT14、或VTvaf17-LAMB3、或VTvaf17-COL7A1分别具有核苷酸序列SEQ ID No.1、或SEQ ID No.2、或SEQ ID No.3、或SEQID No.4。同时，遗传密码的简并性是本领域专家已知的，并且这意味着本发明的范围还包括核苷酸序列的变体，不同之处在于核苷酸的插入、缺失或替换，它们不导致由治疗性基因编码的多肽序列的变化，和/或不导致VTvaf17载体调控元件的功能性活性的丧失。同时，遗传多态性是本领域专家已知的，并且意味着本发明的范围还包括来自KRT5、KRT14、LAMB3、或COL7A1基因的组的核苷酸序列的变体，所述变体也编码KRT5、KRT14、LAMB3、或COL7A1蛋白的氨基酸序列的不同的变体，它们在生理条件下的其功能性活性上与列出的那些没有区别。
渗入真核细胞并表达功能性活性的能力，即表达所获得的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、或VTvaf17-KRT14、或VTvaf17-LAMB3、或VTvaf17-COL7A1的治疗性基因的能力通过将所获得的载体引入真核细胞，并随后分析特异性mRNA的表达和/或治疗性基因的蛋白质产物得到证实。引入了基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、或VTvaf17-KRT14、或VTvaf17-LAMB3、或VTvaf17-COL7A1的细胞中特异性mRNA的存在显示所获得的载体渗入真核细胞并表达治疗性基因的mRNA的能力。此外，该领域的专家知道mRNA基因的存在是强制性条件，但不是治疗性基因编码的蛋白质翻译的证据。因此，为证实基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、或VTvaf17-KRT14、或VTvaf17-LAMB3、或VTvaf17-COL7A1在引入了基因疗法DNA载体的真核细胞中在蛋白质水平上表达治疗性基因的特性，使用免疫学方法进行由治疗性基因编码的蛋白质浓度的分析。KRT5、或KRT14、或LAMB3、或COL7A1蛋白的存在证实真核细胞中治疗性基因表达的功效，以及使用基于携带治疗性基因(选自KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1基因的组)的基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，增加蛋白质浓度的可能性。因此，为了证实所构建的携带治疗性基因(即KRT5基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、携带治疗性基因(即KRT14基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14、携带治疗性基因(即LAMB3基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3、携带治疗性基因(即COL7A1基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1的表达功效，使用以下方法：
A)实时PCR，即在用基因疗法DNA载体转染不同的人和动物细胞系后，人和动物细胞裂解物中治疗性基因的mRNA累积的变化；
B)酶联免疫吸附测定，即在用基因疗法DNA载体转染不同的人细胞系后，人细胞裂解物或培养基中治疗性蛋白质的定量水平的变化。
C)酶联免疫吸附测定，即在将基因疗法DNA载体注射入这些组织后，人和动物组织生检标本的上清液中治疗性蛋白质的定量水平的变化；
D)酶联免疫吸附测定，即在用基因疗法DNA载体转染的该人的自体细胞注射这些组织后，在人组织生检的上清液中治疗性蛋白质的定量水平的变化。
为了证实使用构建的携带治疗性基因(即KRT5基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、携带治疗性基因(即KRT14基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14、携带治疗性基因(即LAMB3基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3、携带治疗性基因(即COL7A1基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1的可行性，进行以下内容：
A)用基因疗法DNA载体转染不同的人和动物细胞系；
B)将基因疗法DNA载体注射入不同的人和动物组织；
C)将基因疗法DNA载体的混合物注射到动物组织中；
D)将用基因疗法DNA载体转染的自体细胞注射入人组织。
如由基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、或基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14、或基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3、或基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1的核苷酸序列(分别为SEQ ID No.1、或SEQ ID No.2、或SEQ ID No.3、或SEQ ID No.4)的核苷酸序列中缺乏与病毒基因组同源的区域和抗生素抗性基因所证实，由于基因疗法DNA载体中缺少构成病毒基因组核苷酸序列的调控元件并且基因疗法DNA载体中缺少抗生素抗性基因，这些使用方法缺少针对人和动物的基因疗法的潜在风险。
该领域的专家已知，使用基因疗法DNA载体中的抗生素抗性基因，通过在含有选择性抗生素的营养培养基中增加细菌生物质来获得制备量的这些载体。在本发明的框架内，为了确保携带KRT5、或KRT14、或LAMB3或COL7A1治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17的安全使用，使用含有抗生素的选择性营养培养基是不可能的。提出了基于大肠杆菌菌株SCS110-AF获得用于生产这些基因疗法载体的菌株的方法，作为用于获得携带治疗性基因(选自KRT5、KRT14、LAMB3、COL7A1基因的组)的基因疗法DNA载体VTvaf17的技术解决方案，以便于在工业规模上扩大基因疗法载体的生产。大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT5、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT14、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-LAMB3、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1生产的方法涉及大肠杆菌菌株SCS110-AF的感受态细胞的生产，其中使用对于本领域的专家熟知的转化(电穿孔)方法，将基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、或DNA载体VTvaf17-KRT14、或DNA载体VTvaf17-LAMB3、或DNA载体VTvaf17-COL7A1分别注射入这些细胞。将所获得的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT5、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT14、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-LAMB3、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1用于分别生产基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、或VTvaf17-KRT14、或VTvaf17-LAMB3、或VTvaf17-COL7A1，允许使用无抗生素培养基。
为了证实大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT5、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT14、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-LAMB3、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1的构建，进行转化、选择、随后生物质生长、以及提取质粒DNA。
为了证实携带治疗性基因(即KRT5基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、携带治疗性基因(即KRT14基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14、携带治疗性基因(即LAMB3基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3、携带治疗性基因(即COL7A1基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1的可生产性、可构建性和至生产规模的扩大，在工业规模上对各自含有携带治疗性基因(即KRT5、或KRT14、或LAMB3、或COL7A1基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT5、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT14、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-LAMB3、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1进行发酵。
将细菌团的生产扩大至工业规模用于分离携带治疗性基因(选自KRT5、KRT14、LAMB3、和COL7A1基因的组)的基因疗法DNA载体VTvaf17的方法，所述方法涉及在提供合适的生物质累积动态的无抗生素营养培养基中孵育大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT5、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT14、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-LAMB3、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1的种子培养物。在对数生长期达到足够量的生物质后，将细菌培养物转移至工业发酵罐，并然后培养至稳定期，然后提取含有治疗性DNA产物(即基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、或基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14、或基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3、或基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1)的级份，多级过滤，并且通过色谱方法进行纯化。该领域的专家已知，菌株的培养条件、营养培养基的组成(除了无抗生素)、所使用的设备、和DNA纯化方法可以随特定生产线在标准操作程序的框架内变化，但是使用大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT5、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT14、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-LAMB3、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1的扩大、工业生产、和DNA载体的纯化的已知方法落入本发明的范围。
本发明描述的公开内容通过本发明的实施方案的示例来说明。
在以下实施例中解释了本发明的本质。
实施例1.
携带治疗性基因，即KRT5基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5的产生。
将KRT5基因的编码区(1776bp)通过BamHI和HindIII限制位点克隆至3165bp的DNA载体VTvaf17上，构建基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5。从生物学人体组织样本中分离总RNA，然后使用商业试剂盒Mint-2(Evrogen,Russia)进行反转录反应，并使用以下寡核苷酸和市售试剂盒高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增，获得KRT5基因的编码区(1776bp)：
KRT5_FTTTGGATCCACCATGTCTCGCCAGTCAAGTGTGTCCTTC，
KRT5_RAATAAGCTTCTAGCTCTTGAAGCTCTTCCGGGAGG，
通过整合源自不同来源的DNA的六个片段来构建基因疗法DNA载体VTvaf17：
(a)复制起点由具有点突变的可商购质粒pBR322区域的PCR扩增产生；
(b)EF1a启动子区由人基因组DNA的位点的PCR扩增产生；
(c)hGH-TA转录终止子由人基因组DNA位点的PCR扩增产生；
(d)转座子Tn10的RNA-OUT调控位点由寡核苷酸合成；
(e)卡那霉素抗性基因由可商购的人质粒pET-28的位点的PCR扩增产生；
(f)多接头通过使两个合成寡核苷酸退火而产生。
按照制造商的说明，使用市售试剂盒高保真DNA聚合酶(New EnglandBiolabs,USA)进行PCR扩增。这些片段具有重叠的区域，允许它们与随后的PCR扩增合并。使用寡核苷酸Ori-F和EF1-R整合片段(a)和(b)，使用寡核苷酸hGH-F和Kan-R整合片段(c)、(d)和(e)。然后，所产生的片段通过以位点BamHI和NcoI限制性，随后连接来整合。这形成仍然缺少多接头的质粒。为了添加它，通过BamHI和EcoRI位点切割质粒，然后与片段(f)连接。因此，构建4182bp的载体，该载体携带侧翼有SpeI限制位点的卡那霉素抗性基因。然后用SpeI限制位点切割该基因，并将剩余片段与自身连接。这得到3165bp的基因疗法DNA载体VTvaf17，其是重组的并且允许无抗生素选择。
用BamHI和HindIII限制性内切酶(New England Biolabs,USA)将KRT5基因编码区的扩增产物和DNA载体VTvaf17切割。
这得到4929bp的DNA载体VTvaf17-KRT5，其具有核苷酸序列SEQ ID No.1，并且一般结构在图1A中显示。
实施例2.
携带治疗性基因，即KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14的产生。
将KRT14基因编码区(1422bp)通过BamHI和HindIII限制位点克隆至3165bp的DNA载体VTvaf17上，构建基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14。从生物学人体组织样本中分离总RNA，然后使用商业试剂盒Mint-2(Evrogen,Russia)进行反转录反应，并使用以下寡核苷酸和市售试剂盒高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增，获得KRT14基因的编码区(1422bp)：
KRT14_F TTTGGATCCACCATGACCACCTGCAGCCGCCAG，
KRT14_RAATAAGCTTTCAGTTCTTGGTGCGAAGGACCTGC，
扩增产物和DNA载体VTvaf17用限制性内切酶BamHI和HindIII(New EnglandBiolabs,USA)切割。
这得到4575bp的DNA载体VTvaf17-KRT14，其具有核苷酸序列SEQ ID No.2，并且一般结构在图1B中显示。
如实施例1所述构建基因疗法DNA载体VTvaf17。
实施例3.
携带治疗性基因，即人LAMB3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3的产生。
将LAMB3基因编码区(3521bp)通过SalI和EcoRI限制位点克隆至3165bp的DNA载体VTvaf17上，构建基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3。从生物学人体组织样本中分离总RNA，然后使用商业试剂盒Mint-2(Evrogen,Russia)进行反转录反应，并使用以下寡核苷酸和市售试剂盒高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增，获得LAMB3基因编码区(3521bp)：
LAMB3_FTTAGTCGACCACCATGAGACCATTCTTCCTCTTG，
LAMB3_R ATAGAATTCACTTGCAGGTGGCATAGTAGAG，
扩增产物和DNA载体VTvaf17用限制性内切酶SalI和EcoRI(New EnglandBiolabs,USA)切割。
这得到6674bp的DNA载体VTvaf17-LAMB3，其具有核苷酸序列SEQ ID No.3，并且一般结构在图1C中显示。
如实施例1所述构建基因疗法DNA载体VTvaf17。
实施例4.
携带治疗性基因，即COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1的产生。
将COL7A1基因编码区(8838bp)通过SalI和EcoRI限制位点克隆至3165bp的DNA载体VTvaf17上，构建基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1。从生物学人体组织样本中分离总RNA，然后使用商业试剂盒Mint-2(Evrogen)进行反转录反应，并使用以下寡核苷酸和市售试剂盒高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增，获得COL7A1基因编码区(8838bp)：
COL7A1_FATCGTCGACCCATGACGCTGCGGCTTCTGGT，
COL7A1_R ATAGAATTCAGTCCTGGGCAGTACCTGTC；
用限制性内切酶SalI和EcoRI(New England Biolabs,USA)切割扩增产物和DNA载体VTvaf17。
这得到11990bp的DNA载体VTvaf17-COL7A1，其具有核苷酸序列SEQ ID No.4，并且一般结构在图1D中显示。
如实施例1所述构建基因疗法DNA载体VTvaf17。
实施例5.
携带治疗性基因，即KRT5基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能性活性的证据。本实施例还证明使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。
在HDFa原代人真皮成纤维细胞培养物(ATCC PCS-201-01)中，在用携带人KRT5基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5转染后48h，对KRT5治疗性基因的mRNA积累的变化进行评价。通过实时PCR中cDNA扩增子的累积动态测定mRNA的量。
用HDFa原代人真皮成纤维细胞培养物用于评价治疗性KRT5mRNA累积的变化。在标准条件(37℃，5％CO2)下使用无血清成纤维细胞生长试剂盒(PCS-201-040)培养HDFa细胞培养物。培养过程中每48小时更换一次生长培养基。
为达到90％的汇合，在转染程序前24小时以每孔5x104个细胞的量将细胞接种到24孔板中。根据制造商的建议，使用Lipofectamine 3000(Thermfisher Scientificial,USA)进行表达人KRT5基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5的转染。在试管1中，将1μL DNA载体VTvaf17-KRT5溶液(浓度500ng/μL)和1μL试剂P3000加入25μL培养基Opti-MEM(Gibco,USA)。将制备物通过轻微摇动进行混合。在试管2中，将1μL Lipofectamine3000溶液加到25μL培养基Opti-MEM(Gibco,USA)中。将制备物通过轻微摇动进行混合。将来自试管1的内容物加入到试管2的内容物中，混合物在室温下孵育5分钟。将所得溶液以40μl的体积逐滴添加至细胞中。
将用缺少插入的治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染的HDFa细胞(在用缺少插入的治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染之前和之后，KRT5基因的cDNA未显示在图中)用作参考。按上述制备转染用参考载体VTvaf17。
根据制造商的建议，使用Trizol试剂(Invitrogen,USA)进行HDFa细胞总RNA的提取。将1mlTrizol试剂加入含有细胞的孔中，均化，并在65℃下加热5分钟。然后将样本在14000g下离心10分钟，并在65℃下再次加热10分钟。然后加入200μL氯仿，轻轻搅拌混合物，以14000g离心10分钟。然后分离水相，与1/10体积的3M醋酸钠pH 5.2和等体积的异丙醇混合。在-20℃孵育样本10分钟，然后在14000g离心10分钟。沉淀的RNA在1ml 70％乙醇中冲洗，风干，溶于10μL无RNA酶的水中。通过实时PCR评估cDNA扩增子的累积动态测定转染后KRT5mRNA表达的水平。对于针对人KRT5基因特异的cDNA的生产和扩增，使用以下KRT5_SF和KRT5_SR寡核苷酸：
KRT5_SF CGAAGCCGAGTCCTGGTATC，
KRT5_SR TTGGCGCACTGTTCTTGAC
扩增产物长度为162bp。
采用用于实时PCR的SYBR GreenQuantitect RT-PCR试剂盒(Qiagen，USA)进行反转录反应和PCR扩增。反应在20μL的体积中进行，包括：25μL QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master Mix，2.5mM氯化镁，每种引物0.5μm和5μL RNA。对于反应，在以下条件下采用CFX96扩增仪(Bio-Rad,USA)：42℃反转录30min，在98℃变性15min的1个循环，接着是包括94℃变性15s，60℃引物退火30s，72℃延伸30s的40个循环。以GenBank数据库编号为NM004048.2列出的B2M(人β2-微球蛋白)基因用作参考基因。阳性对照包括来自在基质上的PCR的扩增子，所述基质由包含KRT5和B2M基因的cDNA序列的、处于已知浓度的质粒代表。阴性对照包括去离子水。用Bio-Rad CFX Manager 2.1软件(Bio-Rad,USA)进行KRT5和B2M基因cDNA扩增子的累积动态实时定量。源自测定的图在图2中显示。
图2显示由于基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5转染HDFa原代人成纤维细胞培养物，人KRT5基因的特异性mRNA水平大幅提高，证实了所述载体渗入真核细胞并在mRNA水平上表达KRT5基因的能力。本研究结果还证实了利用基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5以便于提高KRT5基因在真核细胞中的表达水平的可行性。
实施例6.
携带治疗性基因，即KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能活性的证据。本实施例还表明使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。
用携带人KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14转染后48小时，在HEKa原代人表皮角质形成细胞培养物(ATCC PCS-200-011)中，对KRT14治疗性基因的mRNA累积的变化进行评价。通过实时PCR中cDNA扩增子的累积动态来确定mRNA的量。
在角质形成细胞生长试剂盒(PCS-200-040TM)中在标准条件(37℃，5％CO2)下培养HEKa原代人表皮角质形成细胞培养物。为达到90％的汇合，在转染程序前24小时，以每孔5x104个细胞的量将细胞接种到24孔板中。Lipofectamine 3000(ThermoFisherScientific,USA)用作转染试剂。根据实施例5中描述的程序，用表达人KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14进行转染。将GenBank数据库中编号为NM004048.2列出的B2M(Beta-2-微球蛋白)基因用作参考基因。将用缺少治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(在用缺少插入的治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染之前和之后，KRT14基因的cDNA未显示在图中)转染的HEKa细胞培养物用作参考。除与实施例5具有不同序列的寡核苷酸外，如实施例5所述进行RNA分离、反转录反应和实时PCR。对于针对人KRT14基因特异的cDNA的扩增，使用以下KRT14_SF和KRT14_SR寡核苷酸：
KRT14_SF TCCAGGAGATGATTGGCAGC，
KRT14_SR GGATGACTGCGATCCAGAGG
扩增产物长度为197bp。
阳性对照包括来自在基质上的PCR的扩增子，所述基质由包含KRT14和B2M基因cDNA序列的、处于已知浓度的质粒代表。阴性对照包括去离子水。用Bio-Rad CFX Manager2.1软件(Bio-Rad,USA)对扩增得到的PCR产物即KRT14和B2M基因cDNA进行实时定量。源自测定的图在图3中显示。
图3显示由于基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14转染HEKa细胞培养物，人KRT14基因的特异性mRNA水平大幅提高，证实了所述载体渗入真核细胞并在mRNA水平上表达KRT14基因的能力。本研究结果还证实了利用基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14提高KRT14基因在真核细胞中的表达水平的可行性。
实施例7.
携带治疗性基因，即LAMB3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能活性的证据。本实施例还表明使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。
用携带人LAMB3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3转染后48小时，在人骨骼肌成肌细胞(Human Skeletal Myoblast,HSKM)(CAT.A12555)中，对LAMB3治疗性基因mRNA累积的变化进行评价。通过实时PCR中cDNA扩增子的累积动态测定mRNA的量。
在Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM)(30-2002TM)中在标准条件(37℃，5％CO2)下培养HSKM人骨骼肌成肌细胞培养物，所述培养基添加了2％马血清(GibcoCat.16050130)。为达到90％汇合，在转染程序前24小时，以每孔5x104个细胞的量将细胞接种到24孔板中，。Lipofectamine3000(ThermoFisher Scientific,USA)用作转染试剂。根据实施例5中描述的程序，用表达人LAMB3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3进行转染。以GenBank数据库中编号为NM004048.2列出的B2M(Beta-2-微球蛋白)基因用作参考基因。将用缺少治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(在用缺少插入的治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染之前和之后，LAMB3基因的cDNA未显示在图中)转染的HSKM细胞培养物用作参考。除与实施例5具有不同序列的寡核苷酸外，如实施例5所述进行RNA分离、反转录反应和实时PCR。对于针对人LAMB3基因特异的cDNA的扩增，使用以下LAMB3_SF和LAMB3_SR寡核苷酸：
LAMB3_SF CAGAGGAGCTGTTTGGGGAG，
LAMB3_SR CCCATTGATGTGGTCACGGA
扩增产物长度为155bp。
阳性对照包括来自在基质上的PCR的扩增子，所述基质由包含LAMB3和B2M基因的cDNA序列的、处于已知浓度的质粒代表。阴性对照包括去离子水。用Bio-Rad CFX Manager2.1软件(Bio-Rad,USA)对扩增得到的PCR产物，即LAMB3和B2M基因cDNA进行实时定量。源自测定的图在图4中显示。
图4显示由于用基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3转染HSKM人骨骼肌成肌细胞培养物，人LAMB3基因的特异性mRNA水平大幅提高，证实了所述载体渗入真核细胞并在mRNA水平上表达LAMB3基因的能力。本研究结果还证实了利用基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3以便于提高LAMB3基因在真核细胞中的表达水平的可行性。
实施例8.
携带治疗性基因，即COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能活性的证据。本实施例还表明使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。
在用携带人COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1转染后48小时，在正常人原代脐静脉内皮细胞(HUVEC)(PCS-100-010TM)中，对COL7A1治疗性基因mRNA累积的变化进行评价。通过实时PCR中cDNA扩增子的累积动态测定mRNA的量。
在标准条件(37℃，5％CO2)下，在添加了内皮细胞生长试剂盒-BBE(PCS-100-040TM)的血管细胞基础培养基(ATCC PCS-100-030)中培养HUVEC人内皮细胞培养物，为达到90％的汇合，在转染前24小时，以每孔5x104个细胞的量将细胞接种到24孔板中。Lipofectamine 3000(ThermoFisher Scientific,USA)用作转染试剂。根据实施例5中描述的程序，用表达人COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1进行转染。将用不携带治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(在用缺少插入的治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染之前和之后，COL7A1基因的cDNA未显示在图中)转染的HUVEC人内皮细胞培养物用作参考。除与实施例5具有不同序列的寡核苷酸外，如实施例5所述进行RNA分离、反转录反应和实时PCR。对于针对人COL7A1基因特异的cDNA的扩增，使用以下COL7A1_SF和COL7A1_SR寡核苷酸：
COL7A1_SFTTTGGATCCACCATGTCTCGCCAGTCAAGTGTGTCCTTC，
COL7A1_SR ATCATTCCACTGGGGCCTG
扩增产物长度为184bp。
阳性对照包括来自在基质上的PCR的扩增子，所述基质由包含COL7A1和B2M基因cDNA序列的、处于已知浓度的质粒代表。以GenBank数据库中编号为NM004048.2列出的B2M(Beta-2-微球蛋白)基因用作参考基因。阴性对照包括去离子水。用Bio-Rad CFX Manager2.1软件(Bio-Rad,USA)对扩增得到的PCR产物，即COL7A1和B2M基因cDNA进行实时定量。源自测定的图在图5中显示。
图5显示由于用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1转染HUVEC人内皮细胞培养物，人COL7A1基因的特异性mRNA水平大幅提高，证实了所述载体渗入真核细胞并在mRNA水平上表达COL7A1基因的能力。呈现的结果还证实了利用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1以便于提高COL7A1基因在真核细胞中的表达水平的可行性。
实施例9.
使用携带KRT5基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5以便于提高哺乳动物细胞中KRT5蛋白表达的功效和可行性的证据。
在用携带人KRT5基因的DNA载体VTvaf17-KRT5转染HDFa人真皮成纤维细胞(ATCCPCS-201-01)后，对这些细胞的裂解物中KRT5蛋白浓度的变化进行评价。
如实施例5所述，培养人真皮成纤维细胞培养物。
为达到90％的汇合，在转染程序前24小时，以每孔5x104个细胞的量将细胞接种到24孔板中。使用第6代Superpect转染试剂(Qiagen,Germany)进行转染。以没有DNA载体的水性树枝状聚合物溶液(A)和缺少KRT5基因cDNA的DNA载体VTvaf17(B)用作参考，并且将携带人KRT5基因的DNA载体VTvaf17-KRT5(C)用作转染剂。根据制造商的程序(QIAGEN，SuperFect Transfection Reagent Handbook,2002)，伴随一些修改，制备DNA-树枝状聚合物复合物。对于在24孔板的1个孔中的细胞转染，将培养基加到溶解在TE缓冲液中的1μgDNA载体中，至终体积为60μL，然后加入5μL SuperFect转染试剂，通过移液5次轻轻混合。将复合物在室温下孵育10-15分钟。然后将培养基从孔取出，将所述孔用1ml PBS缓冲液冲洗。将350μL含10μg/ml庆大霉素的培养基加入至所得到的复合物中，轻轻混合，加入细胞。将细胞与复合物在37℃和5％CO2存在下孵育2-3小时。
然后小心除去培养基，用1ml PBS缓冲液冲洗活细胞阵列。然后，加入含有10μg/ml庆大霉素的培养基，在37℃下，在5％CO2存在下孵育24-48小时。
转染后用PBS冲洗细胞3次，然后向细胞中加入1ml PBS并将细胞进行3次冷冻/融化。然后将悬浮液以15000rpm离心15分钟，收集上清液，并用于治疗性蛋白的定量和测定。
根据制造商的方法，采用人KRT5/CK5/Cytokeratin 5ELISA试剂盒(SandwichELISA)(LifeSpan BioSciences CAT.LS-F8194-1,USA)，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定KRT5蛋白，使用ChemWell Automatic EIA和Chemistry Analyser(Awarency TechnologyInc.,USA)进行光密度检测。
为了测量浓度的数值，使用校正曲线，所述校正曲线使用来自试剂盒，具有已知浓度的KRT5蛋白的参考样本构建。灵敏性至少为15.6pg/ml，测量范围为15.6pg/ml-1000pg/ml。用R-3.0.2进行结果统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。源自测定的图在图6中显示。
图6显示与参考样本相比，用基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5转染HDFa人真皮成纤维细胞导致KRT5蛋白浓度增加，这证实了所述载体渗入真核细胞并在蛋白水平表达KRT5基因的能力。呈现的结果还证实了利用基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5以便于提高真核细胞中KRT5基因的表达水平的可行性。
实施例10.
使用携带KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14以便于提高KRT14蛋白在哺乳动物细胞中的表达的功效和可行性的证据。
用携带人KRT14基因的DNA载体VTvaf17-KRT14转染HEKa原代人表皮角质形成细胞培养物(ATCC PCS-200-01)后，对这些细胞的裂解物中KRT14蛋白浓度的变化进行评价。如实施例6所述培养细胞。
采用第6代Superpect转染试剂(Qiagen,Germany)进行转染。以没有DNA载体的水性树枝状聚合物溶液(A)和缺少KRT14基因cDNA的DNA载体VTvaf17(B)用作参考，并且以携带人KRT14基因的DNA载体VTvaf17-KRT14(C)用作转染剂。根据实施例9中描述的程序，进行DNA树枝状聚合物的制备和HEKa细胞的转染。
转染后用PBS冲洗细胞3次，然后向细胞中加入1ml PBS并将细胞进行3次冷冻/融化。然后将悬浮液在15000rpm离心15分钟，收集上清液，并且用于治疗性蛋白的定量和测定。根据制造商的方法，通过使用人KRT14/CK14/Cytokeratin 14 ELISA试剂盒(SandwichELISA)(LifeSpan BioSciences CAT.LS-F7936,USA)的酶联免疫吸附试验(ELISA)测定KRT14蛋白，使用ChemWell Automatic EIA和Chemistry Analyser(Awarency TechnologyInc.，USA)进行光密度检测。
为了测量浓度的数值，使用校正曲线，所述校正曲线使用来自试剂盒，具有已知浓度的KRT14蛋白的参考样本构建。灵敏性至少为156pg/ml，测量范围为156pg/ml-10000pg/ml。用R-3.0.2进行结果统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。源自测定的图在图7中显示。
图7显示与参考样本相比，用基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14转染HEKa原代人表皮角质形成细胞培养物导致KRT14蛋白浓度增加，证实了载体渗入真核细胞并在蛋白水平表达KRT14基因的能力。本研究结果还证实了利用基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14提高KRT14基因在真核细胞中的表达水平的可行性。
实施例11.
使用携带LAMB3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3以便于提高LAMB3蛋白在哺乳动物细胞中的表达的功效和可行性的证据。
在用携带人LAMB3基因的DNA载体VTvaf17-LAMB3转染人骨骼肌成肌细胞(HSKM)(CAT.A12555)后，对这些细胞的裂解物中LAMB3蛋白浓度的变化进行评价。如实施例7所述培养细胞。
采用第6代Superpect转染试剂(Qiagen,Germany)进行转染。以不含DNA载体的水性树枝状聚合物溶液(A)和缺少LAMB3基因cDNA的DNA载体VTvaf17(B)用作参考，并且将携带人LAMB3基因的DNA载体VTvaf17-LAMB3(C)用作转染剂。根据实施例9中描述的程序，进行DNA树枝状聚合物的制备和HSKM细胞的转染。
转染后用PBS冲洗细胞3次，然后向细胞中加入1ml PBS并将细胞进行3次冷冻/融化。然后将悬浮液在15000rpm离心15分钟，收集上清液，并且用于治疗性蛋白的定量和测定。
根据制造商的方法，使用人LAMB3/Lamininβ3 ELISA试剂盒(Sandwich ELISA)(LifeSpan BioSciences CAT.LS-F33141,USA)对LAMB3蛋白进行酶联免疫吸附试验(ELISA)测定，使用ChemWell Automatic EIA和Chemistry Analyser(AwarencyTechnology Inc.,USA)进行光密度检测。
为了测量浓度的数值，使用校正曲线，所述校正曲线使用来自试剂盒，具有已知浓度的LAMB3蛋白的参考样本构建。灵敏性至少为9.375pg/ml，测量范围为15.625-8000pg/ml。用R-3.0.2进行结果统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。源自测定的图在图8中显示。
图8显示与参考样本相比，用基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3转染HSKM人骨骼肌成肌细胞培养物导致LAMB3蛋白浓度增加，这证实了载体渗入真核细胞并在蛋白水平表达LAMB3基因的能力。本研究结果还证实了利用基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3以便于提高LAMB3基因在真核细胞中的表达水平的可行性。
实施例12.
使用携带COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1以便于提高哺乳动物细胞中COL7A1蛋白表达的功效和可行性的证据。
用携带人COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1转染正常人原代脐静脉内皮细胞(HUVEC)(PCS-100-010TM)后48小时，对这些细胞的裂解物中COL7A1蛋白浓度的变化进行评价。如实施例8所述培养细胞。
采用第6代Superpect转染试剂(Qiagen,Germany)进行转染。以不含DNA载体的水性树枝状聚合物溶液(A)和缺少COL7A1基因cDNA的DNA载体VTvaf17(B)用作参考，并且以携带人COL7A1基因的DNA载体VTvaf17-COL7A1(C)用作转染剂。根据实施例9中描述的方法，进行DNA树枝状聚合物的制备和HUVEC细胞的转染。
转染后，用PBS冲洗细胞3次，然后向细胞中加入1ml PBS并对细胞进行3次冷冻/融化。然后将悬浮液在15000rpm离心15分钟，收集上清液并且用于治疗性蛋白的定量和测定。
根据制造商的方法，采用人COL7A1/Collagen VII ELISA试剂盒(SandwichELISA)(LifeSpan BioSciences CAT.LS-F11164,USA)进行酶联免疫吸附试验(ELISA)测定COL7A1蛋白，使用ChemWell Automatic EIA和Chemistry Analyser(Awarency TechnologyInc.，USA)进行光密度检测。
为了测量浓度的数值，使用校正曲线，所述校正曲线使用来自试剂盒，具有已知浓度的COL7A1蛋白的参考样本构建。灵敏性至少为156pg/ml，测量范围为156pg/ml-10000pg/ml。用R-3.0.2进行结果统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。源自测定的图在图9中显示。
图9显示与参考样本相比，使用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1转染HUVEC原代人内皮细胞培养物导致COL7A1蛋白浓度增加，这证实了载体渗入真核细胞并在蛋白水平表达COL7A1基因的能力。本研究结果还证实了利用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1以便于提高真核细胞中COL7A1基因的表达水平的可行性。
实施例13.
携带COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1以便于提高COL7A1蛋白在人体组织中的表达的功效和可行性的证据。
为了证明携带治疗性基因，即COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1的功效及其使用的可行性，在注射携带人COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1后，对人皮肤中COL7A1蛋白浓度的变化进行评价。
为了分析COL7A1蛋白浓度的变化，将携带COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1注射到三名患者的前臂皮肤，同时注射安慰剂，该安慰剂是缺少COL7A1基因的cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17。
患者1，女性，44岁(P1)；患者2，女性，50岁(P2)；患者3，男，53岁(P3)。采用聚乙烯亚胺转染试剂cGMP级体内-JetPEI(Polyplus Transfection,France)作为转运系统。将含有COL7A1基因cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1和用作安慰剂的不含COL7A1基因cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17溶于无菌的无核酸酶水中。为了获得遗传构建体，根据制造商的建议制备DNA-cGMP级体内-JetPEI复合物。
对于每种遗传构建体，以1mg的量，使用通道方法(其中30G针至2-3mm深度)，注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1。对于每种遗传构建体，基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1的可注射的体积是0.3ml。每个遗传构建体的注射点位于前臂部位的8至10cm间隔处。
在注射基因疗法DNA载体的遗传构建体后，在第2天取生检样本。使用皮肤生检装置Epitheasy 3.5(Medax SRL,Italy)，从注射携带COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1(I)、基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)(II)的部位的患者皮肤处以及完整皮肤(III)取生检样本。生检部位的患者皮肤用无菌生理盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。生检样本大小约为10mm3，重量约11mg。将样本置于含有50mM Tris-HCl、pH7.6、100mM NaCl、1mM EDTA和1mM苯甲基磺酰氟的缓冲溶液中，并匀化以获得匀化的悬浮液。然后将悬浮液在14000g离心10分钟。收集上清液，并且用于用酶联免疫吸附法(ELISA)测定治疗性蛋白。如实施例12所述，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)进行COL7A1蛋白测定，使用ChemWell自动EIA和Chemistry Analyser(Awarency Technology Inc.,USA)进行光密度检测。
根据制造商的方法，使用ChemWell Automatic EIA和Chemical Analysis(Awarence Technology Inc.,USA)进行光密度检测，使用R-3.0.2进行结果的统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。源自测定的图在图10中显示。
图10显示与缺少人COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)注射部位中的COL7A1蛋白浓度相比，在携带人COL7A1治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1的注射部位中所有三个患者皮肤中COL7A1蛋白浓度增加，这表明了基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1的功效，并证实了其使用的可行性(特别是在人体组织中皮内注射基因疗法DNA载体后)。
实施例14.
使用携带LAMB3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3以便于提高LAMB3蛋白在人体组织中的表达的功效和可行性的证据。
为证实携带LAMB3治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3的功效及其使用的可行性，在注射携带治疗性基因，即人LAMB3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3后，对人肌肉组织中LAMB3蛋白浓度的变化进行评价。
为分析LAMB3蛋白浓度的变化，将携带LAMB3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3与转运分子一起注射到三名患者的腓肠肌，同时注射安慰剂与转运分子，所述安慰剂是缺少LAMB3基因cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17。
患者1，女性，40岁(P1)；患者2，女性，43岁(P2)；患者3，男，54岁(P3)。采用聚乙烯亚胺转染试剂cGMP级体内-JetPEI(Polyplus Transfection,France)作为转运系统；根据制造商的建议，进行样本制备。
对于每种遗传构建体，以1mg的量，使用通道方法(其中30G针至约10mm深度)，注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带LAMB3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3。对于每种遗传构建体，基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带LAMB3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3的可注射的体积是0.3ml。每个遗传构建体的注射点位于8至10cm间隔的中间处。
在注射基因疗法DNA载体的遗传构建体后，在第2天取生检样本。使用皮肤生检装置MAGNUM(BARD,USA)，从注射携带LAMB3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3(I)、基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)(II)的部位的患者肌肉组织处和腓肠肌的完整部位(III)取生检样本。将生检部位中的患者皮肤用无菌生理盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。生检样本大小约为20mm3，重量为高达22mg。将样本置于含有50mM Tris-HCl、pH7.6、100mMNaCl、1mM EDTA和1mM苯甲基磺酰氟的缓冲溶液中，并匀化以获得匀化的悬浮液。然后将悬浮液在14000g离心10分钟。收集上清液并用于治疗性蛋白的测定。
使用ChemWell Automatic EIA和Chemistry Analyser(Awarency TechnologyInc.，USA)进行光密度检测，通过实施例11中所述的酶联免疫吸附试验(ELISA)测定LAMB3蛋白。
用R-3.0.2进行结果统计学处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。源自测定的图在图11中显示。
图11显示与缺少人LAMB3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)注射部位中的LAMB3蛋白浓度相比，在携带治疗性基因，即人LAMB3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3注射部位中所有三名患者的腓肠肌中LAMB3蛋白浓度增加，这表明基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3的功效，并证实了其使用的可行性(特别是在人体组织中肌肉内注射基因疗法DNA载体后)。
实施例15.
使用携带KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14以便于提高KRT14蛋白在人体组织中的表达的功效和可行性的证据。
为了证实携带治疗性基因，即KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14的功效及其使用的可行性，在注射携带人KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14后，对人皮肤中KRT14蛋白浓度的变化进行评价。
为了分析KRT14蛋白浓度的变化，将携带KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14注射到三名患者的前臂皮肤，同时注射安慰剂，该安慰剂是缺少KRT14基因cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17。
患者1，女性，39岁(P1)；患者2，男，61岁(P2)；患者3，男，38岁(P3)。采用聚乙烯亚胺转染试剂cGMP级体内-JetPEI(Polyplus Transfection,France)作为转运系统。将含有KRT14基因cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14和用作安慰剂的缺少KRT14基因cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17溶于无菌无核酸酶水中。为了获得遗传构建体，根据制造商的建议制备DNA-cGMP级体内-JetPEI复合物。
对于每种遗传构建体，以1mg的量，使用通道方法(其中30G针至3mm深度)，注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14。对于每种遗传构建体，基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14的可注射的体积是0.3ml。每个遗传构建体的注射点位于前臂部位的8至10cm间隔处。
在注射基因疗法DNA载体的遗传构建体后，在第2天取生检样本。使用皮肤生检装置Epitheasy 3.5(Medax SRL,Italy)，从注射携带KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14(I)、基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)(II)的部位的患者皮肤处以及从完整皮肤(II)取生检样本。将生检部位中的患者皮肤用无菌生理盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。生检样本大小 约为10mm3，重量约11mg。将样本置于含有50mM Tris-HCl、pH7.6、100mMNaCl、1mM EDTA和1mM苯甲基磺酰氟的缓冲溶液中，并匀化以获得匀化悬浮液。然后将悬浮液以14000g离心10分钟。并如实施例10所述，使用酶联免疫吸附法(ELISA)测定治疗性血管生成素蛋白，使用ChemWell Automated EIA和Chemistry Analyser(AwarenessTechnology Inc.,USA)进行光密度检测。
用R-3.0.2进行结果的统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。源自测定的图在图12中显示。
图12显示与缺少人KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射部位中的KRT14蛋白浓度相比，在携带人KRT14治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14的注射部位中所有三名患者皮肤中KRT14蛋白浓度增加，这表明基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14的功效，并证实了其使用的可行性(特别是在人体组织中皮内注射基因疗法DNA载体后)。
实施例16.
通过注射用基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14转染的自体成纤维细胞，携带KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14的功效及其提高人组织中KRT14蛋白的表达水平的使用的可行性的证据。
为证实携带KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14的功效及其使用的可行性，在对患者皮肤中注射用基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14转染的相同患者的自体成纤维细胞培养物后，对患者皮肤中KRT14蛋白浓度的变化进行评价。
将用携带KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14转染的适合的自体成纤维细胞培养物注射到患者的前臂皮肤中，同时注射用不携带KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染的自体成纤维细胞培养物形式的安慰剂。
从患者皮肤生检样本中分离人原代成纤维细胞培养物。使用皮肤生检装置Epitheasy 3.5(Medax SRL,Italy)，从受紫外线保护的区域(即耳后或肘部内侧)的皮肤取生检样本。生检样本为约10mm并且约11mg。将患者的皮肤用无菌生理盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。在37℃，5％CO2的存在下，将原代细胞培养物在含10％胎牛血清和100U/ml氨苄青霉素的DMEM培养基中培养。每2天进行传代和培养基的更换。培养生长的总持续时间不超过25-30天。然后从细胞培养液中取出5x104个细胞的等分试样。将患者的成纤维细胞培养物用携带KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14和安慰剂(即不携带KRT14治疗性基因的VTvaf17载体)转染。
根据制造商的说明，使用阳离子聚合物，如聚乙烯亚胺JETPEI(Polyplustransfection,France)进行转染。将细胞培养72小时，然后注射到患者体内。使用通道方法(其中13mm长的30G针至约3mm的深度)，在前臂中进行用基因疗法DNA载体转染的患者的自体成纤维细胞培养物和用基因疗法DNA载体VTvaf17转染的患者的自体成纤维细胞培养物(作为安慰剂)的注射。在注射的悬浮液中经修饰的自体成纤维细胞的浓度为约5mln细胞/1ml悬浮液，所注射的细胞的剂量不超过15mln。自体成纤维细胞培养物的注射点位于8至10cm间隔处。
在注射用携带治疗性基因，即KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14和安慰剂转染的自体成纤维细胞培养物后，在第4天取生检样本。使用皮肤生检装置Epitheasy3.5(Medax SRL,Italy)，从注射用携带治疗性基因，即KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14转染的自体成纤维细胞培养物(C)、用未携带KRT14治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17的非转染的自体成纤维细胞培养物(安慰剂)(B)的部位的患者皮肤，以及从完整皮肤部位(A)取生检。将生检部位中的患者皮肤用无菌生理盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。生检样本大小约为10mm3，并且重量约11mg。将样本置于含有50mM Tris-HCl、pH7.6、100mM NaCl、1mM EDTA和1mM苯甲基磺酰氟的缓冲溶液中，并匀化以获得匀化的悬浮液。然后将悬浮液在14000g离心10分钟。收集上清液，并用于测定治疗性蛋白，如实施例15中所述的。
源自测定的图在图13中显示。
图13显示与用不携带KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染的自体成纤维细胞培养物(安慰剂)的注射部位的KRT14蛋白浓度相比，用携带KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14转染的自体成纤维细胞培养物的注射部位中患者皮肤的区域中KRT14蛋白的浓度增加，这表明基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14的功效及其用于增加人组织中KRT14表达水平的可行性(特别是在向皮肤中注射用基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14转染的自体成纤维细胞培养物后)。
实施例17.
联合使用携带KRT5基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、携带KRT14基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT14、携带LAMB3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3和携带COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1用于提高哺乳动物组织中KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1蛋白的表达水平的功效和可行性的证据。
在向Wistar大鼠皮肤部位注射基因疗法载体的混合物后，对该部位中的KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1蛋白浓度的变化进行评价。
采用聚乙烯亚胺转染试剂cGMP级体内-JetPEI(Polyplus Transfection,France)作为转运系统。将四种基因疗法DNA载体的等摩尔混合物，以及作为安慰剂的基因疗法DNA载体VTvaf17溶于无菌无核酸酶水中。为了获得基因构建体，根据制造商的建议制备DNA-cGMP级体内-JetPEI复合物。每个遗传构建体(基因疗法DNA载体的混合物和安慰剂)的注射量为0.3ml，DNA总量等于100μg。用胰岛素注射器将溶液注射到大鼠皮肤中，深度为1-1.5mm。
在注射基因疗法DNA载体后第2天，取生检样本。使用皮肤生检装置Epitheasy 3.5(Medax SRL)，从携带基因KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1的四种基因疗法DNA载体的混合物(位点I)、基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)(位点II)的注射部位的动物皮肤上的瘢痕区以及未进行任何操作的类似皮肤部位(位点III)中采集生检样本。生检样本部位用无菌生理盐水初步冲洗，用利多卡因溶液麻醉。生检样本大小约为10mm3，重量约11mg。将每个样本置于含有50mM Tris-HCl、pH7.6、100mM NaCl、1mM EDTA和1mM苯甲基磺酰氟的缓冲溶液中，并匀化以获得匀化的悬浮液。然后将悬浮液在14000g离心10分钟。收集上清液，并用于测定治疗性蛋白，如实施例9(KRT5蛋白的定量)、实施例10(KRT14蛋白的定量)、实施例11(LAMB3蛋白的定量)和实施例12(COL7A1蛋白的定量)中所述的。源自测定的图在图14中显示。
图14表明，与位点II(安慰剂位点)和位点III(完整位点)相比，在注射携带KRT5治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、携带KRT14治疗性基因的治疗DNA载体VTvaf17-KRT14、携带LAMB3治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3、携带COL7A1治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1的混合物的大鼠皮肤位点(位点I)中KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1蛋白浓度增加。获得的结果表明，基因疗法DNA载体的联合使用的功效以及它们用于提高哺乳动物组织中治疗性蛋白的表达水平的可行性。
实施例18.
携带LAMB3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3的功效及其使用以便于提高哺乳动物细胞中LAMB3蛋白的表达水平的可行性的证据。
为证实携带人LAMB3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3的功效，在用携带人LAMB3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3转染后48小时，对MDBK牛肾上皮细胞(NBL-1)(CCL-22TM)中LAMB3治疗性基因mRNA累积的变化进行评价。
在Eagle最低必需培养基(EMEM)(30-2003，TM)中培养MDBK牛肾上皮细胞(NBL-1)，所述培养基添加了10％马血清(30-2040TM)。如实施例7所述，进行携带人LAMB3基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3和不携带人LAMB3基因的DNA载体VTvaf17(参考)的转染、RNA提取、反转录反应、PCR扩增和数据分析。以GenBank数据库中编号AH001130.2列出的公牛/牛肌动蛋白基因(ACT)用作参考基因。阳性对照包括来自在基质上的PCR的扩增子，所述基质由包含LAMB3和ACT基因序列的、处于已知浓度的质粒代表。阴性对照包括去离子水。用Bio-Rad CFX Manager 2.1软件(Bio-Rad,USA)，进行PCR产物(即通过扩增获得的LAMB3和ACT基因cDNA)的实时定量。
源自测定的图在图15中显示。
图15显示由于用基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3转染MDBK牛肾上皮细胞，人LAMB3基因特异性cDNA的水平大幅提高，证实了该载体渗入真核细胞并在mRNA水平表达LAMB3基因的能力。呈现的结果证实利用基因疗法DNA载体VTvaf17-LAMB3以便于提高哺乳动物细胞中LAMB3基因的表达水平的可行性。
实施例19.
携带基因疗法DNA载体的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT5、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT14、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-LAMB3、或携带基因疗法DNA载体的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-Col7A1及其生产方法
构建用于在工业规模上生产携带选自以下基因的组：KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1的治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体的菌株，即分别携带基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、VTvaf17-KRT14、VTvaf17-LAMB3或VTvaf17-COL7A1的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT5、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT14、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-LAMB3、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-LAMB3、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1，供其生产，允许无抗生素选择，所述构建方法涉及制备大肠杆菌菌株SCS110-AF的电感受态细胞，并且用基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、或DNA载体VTvaf17-KRT14、或DNA载体VTvaf17-LAMB3、或DNA载体VTvaf17-COL7A1对这些细胞进行电穿孔。之后，将所述细胞倒入具有选择性培养基的琼脂板(培养皿)，所述选择性培养基含有酵母浸膏、蛋白胨、6％蔗糖、和10μg/ml氯霉素。其中，产生大肠杆菌菌株SCS110-AF以生产基因疗法DNA载体VTvaf17或基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，允许无抗生素阳性选择，这涉及构建含有允许无抗生素阳性选择的转座子Tn10调控元件RNA-IN的64bp线性DNA片段；1422bp果聚糖蔗糖酶基因sacB(其产物确保在含有蔗糖的培养基内进行选择)、选择发生同源重组的菌株克隆需要的763bp氯霉素抗性基因catR和两个同源序列329bp和233bp(确保与基因失活同时的基因recA的区域中的同源重组)，然后通过电穿孔转化大肠杆菌细胞，并且选择在含有10μg/ml氯霉素的培养基中存活的克隆。
用于生产的所获得的菌株按以下保藏号包括于国家生物资源中心(NationalBiological Resource Centre)-俄罗斯国家工业微生物保藏中心(Russian NationalCollection of Industrial Microorganisms)(NBRC RNCIM)，英国的RF和NCIMB专利保藏服务的收藏中：
大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT5-登记在俄罗斯国家工业微生物保藏中心，编号B-13386下，保藏日期：14.12.2018；登录号NCIMB:43310，保藏日期：13.12.2018。
大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT14-登记在俄罗斯国家工业微生物保藏中心，编号B-13345下，保藏日期：22.11.2018；登录号NCIMB:43282，保藏日期：22.11.2018。
实施例20.
用于将携带治疗性基因(选自KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1的组)的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体扩大至工业规模的方法。
为证实基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5(SEQ ID No.1)、VTvaf17-KRT14(SEQ IDNo.2)、VTvaf17-LAMB3(SEQ ID No.3)、VTvaf17-COL7A1(SEQ ID No.4)在工业规模上的可生产性和可构建性，对各自含有携带治疗性基因(即KRT5、或KRT14、或LAMB3、或COL7A1)的基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT5、或SCS110-AF/VTvaf17-KRT14、或SCS110-AF/VTvaf17-LAMB3、或SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1进行大规模发酵。每种大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT5、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT14、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-LAMB3、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1基于大肠杆菌SCS110-AF(Cell and Gene Therapy LLC,United Kingdom)通过如下方法产生，如实施例19所述的：用携带治疗性基因(即KRT5、或KRT14、或LAMB3、或COL7A1)的基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、或VTvaf17-KRT14、或VTvaf17-LAMB3、或VTvaf17-COL7A1对该菌株的感受态细胞进行电穿孔，将转化的细胞在具有选择性培养基的琼脂平板(培养皿)中进一步接种，并且选择个别克隆，所述选择性培养基含有酵母素、蛋白胨和6％的蔗糖。
在10L发酵罐中进行携带基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5的大肠杆菌SCS110-AF/VTvaf17-KRT5的发酵，然后提取基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5。
对于大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT5的发酵，制备含有(每10l的体积)：100g胰蛋白胨和50g酵母浸膏(Becton Dickinson,USA)的培养基；然后将培养基用水稀释至8800ml，并且在121℃下高压蒸汽处理20分钟，并然后添加1200ml 50％(w/v)蔗糖。之后，以100ml的体积，将大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT5的种子培养物接种于培养物烧瓶中。将培养物在30℃下在摇床恒温箱中孵育16小时。将种子培养物转移至Techfors S生物反应器(Infors HT,Switzerland)中，并培养至稳定期。通过在600nm下测量培养物的光密度来控制该过程。将细胞在5,000-10,000g下沉淀30分钟。去除上清液，并将细胞沉淀重悬浮于10％(按体积计)的磷酸盐缓冲盐水中。将细胞以5,000-10,000g再次离心30分钟。去除上清液，将含有20mM TrisCl、1mM EDTA、200g/l蔗糖(pH 8.0)的溶液以1000ml的体积添加至细胞沉淀中，并且将混合物充分搅拌至匀化的悬浮液。然后添加卵溶菌酶溶液，至终浓度为100μg/ml。将混合物在冰上孵育20分钟，同时轻轻搅拌。然后添加2500ml 0.2M NaOH，10g/l十二烷基磺酸钠(SDS)，将混合物在冰上孵育10分钟，同时轻轻搅拌，然后添加3500ml3M乙酸钠、2M乙酸(pH 5-5.5)，并将混合物在冰上孵育10分钟，同时轻轻搅拌。将所得样品以15,000g或更高值离心20-30分钟。将溶液小心倾析，通过粗滤器(滤纸)除去残余的沉淀物。然后，添加RNase A(Sigma,USA)至终浓度为20μg/ml，并且将溶液在室温下孵育过夜持续16小时。然后将溶液以15,000g离心20-30分钟，并通过0.45μm膜过滤器(Millipore,USA)。然后，用100kDa膜(Millipore,USA)进行超滤，并用25mM TrisCl(pH 7.0)的缓冲溶液将混合物稀释至初始体积。这种操作进行了三至四次。将溶液施加到含有250ml DEAESepharose HP(GE,USA)的柱上，用25mM TrisCl(pH 7.0)平衡。上样后，将柱用三倍体积的相同溶液洗涤，并然后使用25mM Tris-HCl(pH 7.0)的线性梯度洗脱基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5，以获得25mM Tris-HCl(pH 7.0)，1M NaCl的溶液，柱体积的五倍。通过测量在260nm处的流出溶液的光密度来控制洗脱过程。将含有基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5的色谱级分结合在一起，并使用Superdex 200(GE,USA)进行凝胶过滤。将柱用磷酸盐缓冲盐水平衡。通过测量在260nm处的流出溶液的光密度来控制洗脱过程，并通过琼脂糖凝胶电泳分析级分。将含有基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5的级分结合在一起，并储存在-20℃下。为评价过程的再生产性，将指定的处理操作重复五次。以类似的方式进行大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT14、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-LAMB3、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1的所有处理操作。
终产物产量的处理再生产性和定量特性证实了基因疗法DNA载体VTvaf17-KRT5、或VTvaf17-KRT14、或VTvaf17-LAMB3、或VTvaf17-COL7A1在工业规模上的生产性和构建性。
因此，所产生的含有治疗性基因的基因疗法DNA载体可用于将其递送至由该基因编码的蛋白质表达减少或不足的人和动物细胞中，从而确保所希望的治疗性效果。
本发明设定的目的，即构建基因疗法DNA载体，以提高KRT5、KRT14、LAMB3、和COL7A1基因的表达水平，结合以下特性：
I)由于用不超过3200bp的载体部分获得的基因疗法载体，增加真核细胞中治疗性基因表达的有效性；
II)由于基因疗法DNA载体中不存在代表病毒基因组核苷酸序列的调控元件和抗生素抗性基因，因此在人类和动物的基因疗法中安全使用的可能性；
III)在工业规模上菌株的可生产性和可构建性；
IV)以及实现用于产生这些基因疗法DNA载体的携带这些基因疗法DNA载体的菌株的构建目的，
对于I-实施例1,2,3,4,5；6；7；8；9；10；11；12；13；14；15；16；17；18；
对于II-实施例1,2,3,4；
对于III和IV-实施例19,20。
工业适用性
以上列出的所有实施例证实了所提议的携带治疗性基因(选自KRT5、KRT14、LAMB3和COL7A1基因的组)以便于提高这些治疗性基因的表达水平的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，携带基因疗法DNA载体的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT5、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-KRT14、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-LAMB3、或携带基因疗法DNA载体的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1，以及其在工业规模上的生产方法的工业实用性。
缩略词表：
VTvaf17：缺少病毒基因组和抗生素抗性标记物序列的基因疗法载体(无病毒-抗生素治疗性载体)
DNA：脱氧核糖核酸
cDNA：互补脱氧核糖核酸
RNA：核糖核酸
mRNA：信使核糖核酸
bp：碱基对
PCR：聚合酶链式反应
ml：毫升，μl：微升
mm3：立方毫米
l：升
μg：微克
mg：毫克
g：克
μM：微摩尔
mM：毫摩尔
min：分钟
s：秒
rpm：每分钟转数
nm：纳米
cm：厘米
mW：毫瓦特
RFU：相对荧光单位
PBS：磷酸盐缓冲盐水
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