阅读说明：本技术 一种PHTrp-Cu络合物及其制备方法、低分子量水凝胶制剂及其制备方法 (PHTrp-Cu complex and preparation method thereof, low-molecular-weight hydrogel preparation and preparation method thereof ) 是由 王玉记 李元明 王彦明 宋松林 贾翌江 桂琳 于 2020-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种PHTrp-Cu络合物及其制备方法、低分子量水凝胶制剂及其制备方法,属于水凝胶技术领域。本发明提供的PHTrp-Cu络合物具有式I所示结构。本发明提供的PHTrp-Cu络合物加入至3,3’-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸低分子量水凝胶中得到低分子量水凝胶制剂,3,3’-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸从层状结构变为纤维网状结构,纤维网状结构通过毛细作用捕获水分子,3,3’-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸的这种微观层面上的变化导致了C18ADPA水凝胶机械强度的增加；而且低分子量水凝胶制剂使创面愈合速度快。(The invention provides a PHTrp-Cu complex and a preparation method thereof, a low-molecular-weight hydrogel preparation and a preparation method thereof, and belongs to the technical field of hydrogels. The PHTrp-Cu complex provided by the invention has a structure shown in a formula I. The PHTrp-Cu complex provided by the invention is added into 3,3' - (octadecyl aza dialkyl) dipropionic acid low molecular weight hydrogel to obtain a low molecular weight hydrogel preparation, the 3,3' - (octadecyl aza dialkyl) dipropionic acid is changed into a fiber network structure from a layered structure, the fiber network structure captures water molecules through capillary action, and the change of the 3,3' - (octadecyl aza dialkyl) dipropionic acid on a microscopic level leads to the increase of the mechanical strength of the C18ADPA hydrogel; and the low molecular weight hydrogel preparation can accelerate the wound healing.)

一种PHTrp-Cu络合物及其制备方法、低分子量水凝胶制剂及 其制备方法

技术领域

本发明涉及水凝胶技术领域，具体涉及一种PHTrp-Cu络合物及其制备方法、低分子量水凝胶制剂及其制备方法。

背景技术

水凝胶具有高形阻力和弯曲度，其三维结构能够抑制药物分子的运动，从而通过调节扩散过程来控制药物释放的速率，因而常用作药物制剂的控释制剂。多种剂型均可以使用水凝胶作为缓释调节剂，例如

一种聚丙烯酸的水凝胶，用于悬浮液、生物黏合剂、固体剂湿法制粒等(参见Avinash H Hosmani,YS Thorat,PV Kasture,etal.Carbopol and its pharmaceutical significance:areview.Pharmaceuticalreviews,4(1),2006)。

低分子量凝胶(LMWG)，也称为分子凝胶，是一种新型凝胶，是由分子量低于3000Da的凝胶通过分子间相互作用自组装形成有序的结构。LMWG与细胞外基质在结构和粘度上有相似之处，广泛应用于组织工程、酶固定化、细胞培养和药物递送等方面。在药物载体方面，LMWG表现出了控释性、生物相容性和可生物降解等优点。Nilsson等使用N-芴甲氧羰基(Fmoc)苯丙氨酸在体内递送双氯芬酸以发挥抗炎作用(Danielle M Raymond,Brittany LAbraham,Takumi Fujita,Matthew J Watrous,Ethan S Toriki,Takahiro Takano,andBradley L Nilsson.Low-molecular-weight supramolecular hydrogels for sustainedand localized in vivo drug delivery.ACS AppliedBioMaterials,2(5):2116-2124,2019)；曹等证明了超分子苯丙氨酸衍生水凝胶在体外实验中释放水杨酸(Shuqin Cao,Xinjian Fu,Ningxia Wang,Hong Wang,and Yajiang Yang.Release behavior ofsalicylic acid in supramolecular hydrogels formed by l-phenylalaninederivatives as hydrogelator.Internationaljournalofpharmaceutics,357(1-2):95-99,2008)；徐等使用帕米膦酸二钠、Fmoc-Leu和Fmoc-Lys组成水凝胶来减轻UO₂ ²⁺的炎症反应和毒性(Zhimou Yang,Keming Xu,Ling Wang,Hongwei Gu,Heng Wei,Mingjie Zhang,and Bing Xu.Self-assembly of small molecules affords multifunctionalsupramolecular hydrogels for topically treating simulated uraniumwounds.Chemicalcommunications,(35):4414-4416,2005)。然而，由于上述凝胶体系的机械稳定性差，使用这些水凝胶在体内进行药物递送时水凝胶易与药物分离。

低分子量凝胶的凝胶化是低分子量凝胶与超分子组分间相互作用达到平衡形成的。目前，常用的超分子组分主要包括冠醚、穴醚、环糊精、杯芳烃、卟啉等大环主体对一些功能小分子，然而上述超分子组分添加到低分子量凝胶中导致低分子量凝胶的机械稳定性差。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提供一种PHTrp-Cu络合物及其制备方法、低分子量水凝胶制剂及其制备方法，本发明提供的PHTrp-Cu络合物加入到低分子量水凝胶后能够提高水凝胶的机械稳定性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种PHTrp-Cu络合物，具有式I所示的结构：

本发明提供了上述技术方案所述PHTrp-Cu络合物的制备方法，包括以下步骤：

在保护气氛下，将L-色氨酸、D-葡萄糖、碱性试剂和混合溶剂混合，进行取代反应，得到取代产物；

将所述取代产物与还原剂混合进行还原反应，得到还原产物；

调节所述还原产物的pH值至1～5，得到PHTrp；

将所述PHTrp、二价铜源、碱性试剂和水混合，进行络合反应，得到PHTrp-Cu络合物。

优选的，所述L-色氨酸和D-葡萄糖的摩尔比为1:(1～10)；

所述L-色氨酸和取代反应用碱性试剂的摩尔比为1:(0.5～2.5)；

所述混合溶剂包括有机溶剂和水，所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇或乙腈；

所述取代反应的温度为45～85℃，时间为4～12h。

优选的，所述还原剂包括硼氢化钠、氢化锂铝和氰基硼氢化钠中的一种或几种；

所述L-色氨酸和还原剂的摩尔比为1:(1～10)；

所述还原反应的温度为70～120℃，时间优选为6～48h。

优选的，所述PHTrp和二价铜源的摩尔比为1:(0.1～4)；

所述络合反应的温度为50～80℃，时间为2～20min。

本发明提供了一种低分子量水凝胶制剂，包括3,3'-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸水凝胶和负载在所述3,3'-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸水凝胶上的PHTrp-Cu络合物；

所述PHTrp-Cu络合物为上述技术方案所述PHTrp-Cu络合物或上述技术方案所述制备方法得到的PHTrp-Cu络合物。

优选的，所述低分子量水凝胶制剂的pH值为3～7；

所述低分子量水凝胶制剂中3,3'-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸的质量浓度为2～10％；

优选的，所述低分子量水凝胶制剂中PHTrp-Cu络合物的质量浓度为1～10％。

本发明提供了上述技术方案所述低分子量水凝胶制剂的制备方法，包括以下步骤：

将3,3'-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸、碱性试剂、PHTrp-Cu络合物和水混合，进行自组装反应，得到低分子量水凝胶制剂。

优选的，所述3,3'-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸和PHTrp-Cu络合物的质量比为1:0.05～0.25；

所述自组装反应的温度为50～70℃，时间为10～30min。

本发明提供了PHTrp-Cu络合物，具有式I所示的结构。本发明提供的PHTrp-Cu络合物作为超分子组分加入至低分子量3,3'-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸水凝胶中，使得3,3'-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸从层状结构变为纤维网状结构，从而提高了低分子量水凝胶的机械性能。

本发明提供的PHTrp-Cu络合物的制备方法，操作简单，适宜工业化生产。

本发明提供了一种低分子量水凝胶制剂，包括3,3'-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸水凝胶和负载在所述3,3'-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸水凝胶上的PHTrp-Cu络合物。在本发明中，3,3'-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸(C18ADPA)具有由双分子层晶体和相互交错的烷基链形成的两种层状结构，层间距分别为4.1nm和3.1nm，这种特殊的层状结构赋予了C18ADPA水凝胶高强度，加入PHTrp-Cu络合物后，PHTrp-Cu络合物与C18ADPA水凝胶之间存在静电相互作用，层间距由4.1nm增大至4.3nm，C18ADPA从层状结构变为纤维网状结构(SAFiN)，SAFiN通过毛细作用捕获水分子，C18ADPA的这种微观层面上的变化导致了C18ADPA水凝胶机械稳定性的增加；而且本发明提供的低分子量水凝胶制剂与生物组织相似，都具有氨基酸和糖，生物相容好，抗菌效果好，使用低分子量水凝胶制剂后，皮肤组织再生过程中胶原沉积较早，创面愈合速度快。

本发明提供的制备方法，包括以下步骤：将3,3'-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸、碱性试剂、PHTrp-Cu络合物和水混合，进行自组装反应，得到低分子量水凝胶制剂。本发明提供的低分子量水凝胶制剂制备方法，操作简单，适宜工业化生产。

附图说明

图1为实施例2制备的PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶和对比例1制备的C18ADPA水凝胶的水凝胶的转变过程图；

图2为实施例2制备的PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶和对比例1制备的C18ADPA水凝胶的频率应变扫描数据图；

图3为实施例2制备的PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶和对比例1制备的C18ADPA水凝胶的DSC图；

图4为实施例2制备的PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶和对比例1制备的C18ADPA水凝胶的cryo-SEM图；

图5为实施例2制备的PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶和对比例1制备的C18ADPA水凝胶的L-XRD图；

图6为实施例2制备的PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶和对比例1制备的C18ADPA水凝胶的FTIR图；

图7为小鼠伤口愈合的过程图；

图8为小鼠伤口愈合率数据图；

图9为小鼠伤口愈合的组学图。

具体实施方式

本发明提供了一种PHTrp-Cu络合物，具有式I所示的结构：

本发明提供了上述技术方案所述PHTrp-Cu络合物的制备方法，包括以下步骤：

在保护气氛下，将L-色氨酸、D-葡萄糖、碱性试剂和混合溶剂混合，进行取代反应，得到取代产物；

将所述取代产物与还原剂混合进行还原反应，得到还原产物；

调节所述还原产物的pH值至1～5，得到PHTrp；

将所述PHTrp、二价铜源、碱性试剂和水混合，进行络合反应，得到PHTrp-Cu络合物。

在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。

本发明在保护气氛下，将L-色氨酸、D-葡萄糖、碱性试剂和混合溶剂混合，进行取代反应，得到取代产物。

在本发明中，所述L-色氨酸和D-葡萄糖的摩尔比优选为1：(1～10)，更优选为1：(2～8)，最优选为1：(5～6)。

在本发明中，所述碱性试剂优选包括NaOH、Na₂CO₃、NaHCO₃、KOH，NaH、K₂CO₃和KHCO₃中的一种或几种，更优选为NaOH、Na₂CO₃、NaHCO₃、KOH、NaH、K₂CO₃或KHCO₃。在本发明中，所述L-色氨酸和碱性试剂的摩尔比优选为1：(1～10)，更优选为1：(2～8)，最优选为1：(4～6)。

在本发明中，所述混合溶剂优选包括有机溶剂和水，所述有机溶剂优选包括甲醇、乙醇、丙醇或乙腈；所述混合溶剂中有机溶剂和水的体积比优选为1：(1～20)，更优选为1：(1～10)，最优选为1:1、1:2、1:3、1:4或1:5。在本发明中，所述碱性试剂的物质的量和混合溶剂的体积之比优选为(1～100)mmol：3mL，更优选为(5～50)mmol：3mL，最优选为10mmol：3mL。

在本发明中，所述混合优选为搅拌混合，本发明对于所述搅拌混合的速度没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可；所述混合的温度优选为室温。在本发明中，所述混合的顺序优选包括将碱性试剂和混合溶剂第一混合，得到碱性试剂溶液；在所述碱性试剂溶液中加入L-色氨酸第二混合，得到混合溶液；在所述混合溶液中加入D-葡萄糖第三混合。本发明对于所述第一混合的时间没有特殊限定，能够将碱性试剂溶解于混合溶剂中即可。在本发明中，所述第二混合的时间优选为10～60min，更优选为20～50min，最优选为30～40min。本发明对于所述第三混合的时间没有特殊限定，能够将L-色氨酸溶解于混合溶液中即可。

在本发明中，所述取代反应的温度优选为45～85℃，更优选为50～80℃，最优选为60～70℃；时间优选为4～12h，更优选为6～10h，最优选为8h。在本发明中，所述取代反应过程中L-色氨酸和D-葡萄糖在碱性试剂作用下发生反应生成席夫碱。

所述取代反应后，本发明优选还包括将所述取代反应的体系冷却至室温，得到取代产物。本发明对于所述冷却的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的冷却方式即可，具体如自然冷却。

所述取代反应后，本发明将所述取代产物与还原剂混合进行还原反应，得到还原产物。

本发明优选将还原剂加入到所述取代产物中。在本发明中，所述还原剂优选包括硼氢化钠、氢化锂铝、氰基硼氢化钠和硼氢化钾中的一种或几种，更优选为硼氢化钠、氢化锂铝、氰基硼氢化钠或硼氢化钾。在本发明中，所述L-色氨酸和还原剂的摩尔比优选为1：(1～10)，更优选为1：(2～6)，最优选为1:3。

在本发明中，所述混合优选为搅拌混合，本发明对于所述搅拌混合的速度和时间没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。

在本发明中，所述还原反应的温度优选为70～120℃，更优选为80～110℃，最优选为90～100℃；时间优选为6～48h，更优选为10～40h，最优选为20～30h。在本发明中，所述还原反应过程中，取代产物席夫碱被还原成C-N单键。

在本发明中，所述还原反应后，本发明优选还包括将所述还原反应的体系冷却至-10～5℃，得到还原产物。本发明对于所述冷却的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的冷却方式即可。在本发明中，所述冷却后的温度进一步优选为-5～2℃，更优选为0℃。

所述还原反应后，本发明调节所述还原产物的pH值至1～5，得到PHTrp。在本发明中，所述pH值进一步优选调节为2～4，更优选为2.5～3。本发明对于所述调节pH值采用的pH值调节剂没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的酸或碱即可，具体如HCl、KHSO₄、NaOH、Na₂CO₃或NaHCO₃。在本发明中，所述调节pH值至1～5的目的是使氨基酸羧基游离。

在本发明中，所述调节pH至1～5后，本发明优选还包括将所得体系进行固液分离除去沉淀，将所得液体组分依次进行浓缩、加入有机溶剂溶解所得浓缩物、二次固液分离除去沉淀，将所得液体组分重复上述固液分离除去沉淀、将所得液体组分依次进行浓缩、加入有机溶剂溶解所得浓缩物、二次固液分离除去沉淀步骤5～6次，将最终所得液体组分浓缩后溶解于水中进行酸性离子交换树脂分离，得到PHTrp。本发明对于所述固液分离、二次固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如过滤。在本发明中，所述浓缩的方式优选为减压浓缩；本发明对于所述减压浓缩的条件没有特殊限定，浓缩至糖浆状即可。在本发明中，所述有机溶剂优选包括甲醇、乙醇、丙醇或乙腈。本发明对于所述水的用量没有特殊限定，能够将浓缩物溶解即可；在本发明的实施例中，所述L-色氨酸的物质的量和水的体积的比优选为1mmol：1mL。在本发明中，所述酸性离子交换树脂优选为721型强酸性阳离子交换树脂。在本发明中，所述酸性离子交换树脂分离采用的洗脱剂优选为碱性溶液，所述碱性溶液优选包括N-甲基吗啉水溶液、三乙胺水溶液、氨水、碳酸铵水溶液或乙二胺水溶液；所述碱性溶液的质量百分浓度优选为1～10％，更优选为2～8％，最优选为3～5％。

得到PHTrp后，本发明将所述PHTrp、二价铜源、碱性试剂和水混合，进行络合反应，得到PHTrp-Cu络合物。

在本发明中，所述二价铜源优选包括氯化铜、硫酸铜、硝酸铜和氢氧化铜中的一种或几种。在本发明中，所述PHTrp和二价铜源的质量比优选为1：(0.1～4)，更优选1：(1～2)，最优选为1:1。

在本发明中，所述碱性试剂优选包括NaOH、Na₂CO₃、NaHCO₃、KOH、NaH、K₂CO₃和KHCO₃中的一种或几种，更优选为NaOH或KOH。在本发明中，所述PHTrp和碱性试剂的摩尔比优选为1：(1～4)，更优选1：(1～2)，最优选为1:1。

在本发明中，所述水优选为蒸馏水或去离子水。在本发明中，所述PHTrp的物质的量和水的体积之比优选为1mmol：(2～20)mL，更优选为1mmol：(5～15)mL，最优选为1mmol：10mL。

在本发明中，所述混合优选为搅拌混合，本发明对于所述搅拌混合的速度没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可；所述混合的温度优选为0～10℃，更优选为5℃；本发明在上述温度条件下进行混合，能够防止氨基酸手型结构发生消旋。在本发明中，所述混合的顺序优选为将PHTrp、二价铜源和水第四混合，在所得混合溶液中加入碱性试剂第五混合。在本发明中，所述第四混合的时间优选为10～30min，更优选为15～25min，最优选为20min。本发明对于所述第五混合的时间没有特殊限定，能够将碱性试剂溶解于混合溶液中即可。

在本发明中，所述络合反应的温度优选为50～80℃，更优选为55～75℃，最优选为60～70℃；时间优选为2～20min，更优选为5～15min，最优选为10min。在本发明中，所述络合反应过程中，羧基与Cu离子发生络合。

所述络合反应后，本发明优选还包括将所述络合反应的体系固液分离，将所得液体组分进行纯化，得到PHTrp-Cu络合物。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如过滤。在本发明中，所述纯化的方式优选为采用分子排阻色谱(Sephadex G10)纯化。在本发明中，所述分子排阻色谱纯化采用的洗脱剂优选为纯水。

本发明提供了一种低分子量水凝胶制剂，包括3,3'-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸水凝胶和负载在所述3,3'-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸水凝胶上的PHTrp-Cu络合物；所述PHTrp-Cu络合物为上述技术方案所述PHTrp-Cu络合物或上述技术方案所述制备方法得到的PHTrp-Cu络合物。

在本发明中，所述低分子量水凝胶制剂的pH值优选为3～7，更优选为4～6，最优选为5。

在本发明中，所述低分子量水凝胶制剂中3,3'-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸的浓度优选为2～10％，更优选为3～8％，最优选为4～6％。

在本发明中，所述低分子量水凝胶制剂中PHTrp-Cu络合物的质量浓度优选为1～10％，更优选为2～8％，最优选为3～5％。

本发明提供了上述技术方案所述低分子量水凝胶制剂的制备方法，包括以下步骤：

将3,3'-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸、碱性试剂、PHTrp-Cu络合物和水混合，进行自组装反应，得到低分子量水凝胶制剂。

在本发明中，所述3,3'-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸结构为：

在本发明中，所述3,3'-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸和PHTrp-Cu络合物的质量比优选为1:0.05～0.25，更优选为1:0.1～0.2，最优选为1:0.15～0.2。

在本发明中，所述碱性试剂优选包括NaOH、Na₂CO₃、NaHCO₃、KOH、NaH、K₂CO₃和KHCO₃中的一种或几种，更优选为NaOH或KOH。在本发明中，所述3,3'-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸和碱性试剂的质量比优选为1：(0.05～0.5)，更优选为1：(0.1～0.4)，最优选为1：(0.2～0.3)。

在本发明中，所述水优选为蒸馏水或去离子水。在本发明中，所述PHTrp-Cu络合物的质量和水的体积之比优选为(2～10)g：1L，更优选为(4～8)g：1L，最优选为(5～6)g：1L。

在本发明中，所述混合优选为搅拌混合，本发明对于所述搅拌混合的速度和时间没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。在本发明中，所述混合的顺序优选为将PHTrp-Cu络合物和水第六混合，得到PHTrp-Cu水溶液；将3,3'-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸、碱性试剂和所述PHTrp-Cu水溶液第七混合。本发明中对于所述第六混合的时间没有特殊限定，能够将PHTrp-Cu络合物溶解于水中即可。在本发明中，所述第七混合的温度优选为50～100℃，更优选为60～90℃，最优选为70～80℃；本发明对于所述第七混合时间没有特殊限定，混合后的体系呈现透明状即可。在本发明中，所述第七混合过程中所述PHTrp-Cu水溶液充分溶解。

在本发明中，所述混合后，本发明优选还包括将所述混合后的体系的pH值调节值3～7。在本发明中，所述pH值进一步优选调节为4～6，更优选为5。本发明对于所述调节pH值采用的pH值调节剂没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的酸或碱即可，具体如HCl、KHSO₄、NaOH、Na₂CO₃、NaHCO₃、KOH、NaH、K₂CO₃或KHCO₃。在本发明中，所述调节pH值至3～7的目的是接近中性，毒性小，利于给药。

在本发明中，所述自组装反应的温度优选为40～80℃，更优选为50～70℃，最优选为60℃；时间优选为10～90min，更优选为30～70min，最优选为50～60min。在本发明中，所述自组装反应过程中形成性质均一，无不溶颗粒的凝胶。

所述自组装反应后，本发明优选还包括将所述自组装反应的体系冷却至室温，得到低分子量水凝胶制剂。

在本发明中，所述冷却的方式优选为静置冷却。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)N-(2,3,4,5,6-五羟基己基)-L-色氨酸(PHTrp)的制备

在氩气保护下，将0.40g(10mmol)氢氧化钠溶于3mL甲醇/水溶液(甲醇和水体积比＝1:1)中，加入2.04g(10mmol)L-色氨酸(L-Trp)，在室温条件下搅拌混合20min，加入1.80g(10mmol)D-葡萄糖搅拌至D-葡萄糖完全溶解，然后在55℃条件下取代反应6h，加入1.62g(30mmol)硼氢化钠还原反应反应96h，将所得反应将反应液冷却至0℃，用盐酸调节pH值至2.5，过滤除去沉淀，将滤液进行减压浓缩，将所得浓缩物用无水乙醇溶解，再次过滤除去滤渣，重复5次，将所得浓缩物溶解于10mL水中，装载到酸性离子交换树脂柱上，用3wt％的N-甲基吗啉水溶液进行洗脱，得到PHTrp(白色粉末，701mg，产率为19％，纯度98％)。

PHTrp的结构表征：PHTrp的熔点(Mp)为206-207℃；[α]_D ²⁰＝+10.0(C＝1.6,H₂O)；IR(KBr):3407,3353,3095,2968,2916,1617,1596,1400,1355,1080,1042,742,675,534cm^-1；ESI(+)/FT-MS(m/e):369.15620[M+H]⁺；¹H NMR(300MHz,D₂O):δ＝7.22(d,J＝7.5Hz,1H),7.20(d,J＝7.5Hz,1H),7.16(t,J＝7.8Hz,1H),7.14(t,J＝7.8Hz,1H),6.92(s,1H),4.16(m,J＝4.8Hz,1H),3.90(t,J＝5.1Hz,1H),3.85(m,J＝5.1Hz,1H),3.83(m,J＝5.1Hz,1H),3.77(m,J＝3.9Hz,1H),3.71(d,J＝5.1Hz,2H),3.27(dd,J₁＝3.6Hz,J₂＝12.9Hz,1H),3.20(dd,J₁＝9.3Hz,J₂＝12.9Hz,1H),2.93(d,J＝4.9Hz,2H)。

(2)PHTrp-Cu络合物的制备

在5℃条件下，将368mg(1.0mmol)PHTrp和170.5mg(1.0mmol)CuCl₂·2H₂O和10mL水中搅拌混合20min，加入40mg(1.0mmol)NaOH混合均匀，在60℃条件下络合反应10min，然后将所得反应液过滤，所得滤液通过分子排阻色谱(Sephadex G10)进行纯化，洗脱剂为纯水，得到PHTrp-Cu络合物(502mg，产率为92％，纯度为95％)。

PHTrp的结构表征：ESI(-)/FT-MS(m/e):500.01675；[α]_D ²⁰＝+18.5(C＝1.0,H₂O)；¹HNMR(500MHz,D₂O)δ＝7.23(d,J＝7.5Hz,1H),7.21(d,J＝7.5Hz,1H),7.18(t,J＝7.5Hz,1H),7.15(t,J＝7.5Hz,1H),6.93(s,1H),4.07(m,1H),3.83(t,J＝5.0Hz,1H),3.75(m,J＝5.0Hz,1H),3.73(m,J＝5.0Hz,1H),3.67(m,J＝3.5Hz,1H),3.61(d,J＝5.0Hz,2H),3.31(dd,J₁＝3.5Hz,J₂＝12.5Hz,1H),3.21(dd,J₁＝9.0Hz,J₂＝12.5Hz,1H),2.89(d,J＝5.0Hz,2H)。

实施例2

将0.025g实施例1制备的PHTrp-Cu络合物溶解于5mL水中，得到PHTrp-Cu水溶液，将0.2g C18ADPA和0.04g NaOH溶解在所述PHTrp-Cu水溶液中，加热到70℃至溶液透明，调节pH值至5，在60℃条件下自组装反应30min，静置冷却至室温，得到低分子量水凝胶制剂(简写为PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶)，PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶中，C18ADPA的浓度为4g/100mL，PHTrp-Cu络合物的浓度为0.5g/100mL。

对比例1

将0.2g C18ADPA(0.2g)和0.04gNaOH溶解在5mL水中，加热到70℃至溶液透明，调节pH值至5，在50℃条件下加热30min，静置冷却至室温，得到3,3'-(十八烷基氮杂二烷基)二丙酸水凝胶(C18ADPA水凝胶)，C18ADPA水凝胶中C18ADPA的含量为4g/100mL。

性能测试

(1)对比例1制备的C18ADPA水凝胶在50℃时呈半透明，在25℃时是浑浊状态。实施例2制备的PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶在不同时间下的状态如图1所示，其中，12h处的inversing为放置12h后的倒置图。由图1可知，PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶表现出与铜水合物蓝色溶液相同的光散射行为，PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶的形成非常快迅速，自组装反应后在室温条件下静置冷却过程中30min内就可以形成水凝胶。

(2)流变学测试

用TAdhr1流变仪(TAinstrument GmbH，Newark)测量实施例2制备的PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶和对比例1制备的C18ADPA水凝胶的弹性模量(G')和粘性模量(G”)，其平板直径为40mm，默认gap值为1mm；通过振荡剪切实验测定，在线性粘弹性区域内，进行频率扫描测试，频率范围为0.5～100rad/s，测试结果如图2所示所示。由图2可知，在C18ADPA水凝胶中加入0.5g/mL的PHTrp-Cu后，其储能模量G'和损耗模量G"提高了近1个数量级，表明PHTrp-Cu分子融入C18ADPA水凝胶结构中后提高了水凝胶的机械强度。

(3)差示扫描量热(DSC)测试

使用TA-dscq2000(TAinstrument GmbH,Newark)仪器进行DSC测量，分别将20mg实施例2制备的PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶和对比例1制备的C18ADPA水凝胶的密封在铝盘中，扫描温度范围为15～65℃，N₂氛围下，加热速率为2℃/min，记录DSC热图，如图3所示，其中实线为PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶，虚线为C18ADPA水凝胶。由图3可知，C18ADPA水凝胶在温度为43.3℃(T_g)时出现了凝胶-凝胶的转变，在温度为48.8℃(T_m)处出现额外的吸热峰；而PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶中的对应峰转变成了更高的温度，分别为47.6℃(峰1)和51.4℃(峰2)，说明，PHTrp-Cu与C18ADPA水凝胶有相互作用，发生了自组装；PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶的温度与xerogel干凝胶的49.5℃接近，是由于烷基链的熔化带来的(T_m)；除了T_g和T_m外，PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶在56.6℃出现的另一个吸热峰(峰3)，这是由于PHTrp-Cu与C18ADPA水凝胶结构的静电相互作用造成的。

(4)冷冻扫描电子显微镜(cryo-SEM)测试

采用超低温扫描电镜高压冷冻法研究了水凝胶的形态，防止或最大限度地减少了冰晶形成对水凝胶结构的破坏。分别将5μL实施例2制备的PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶和对比例1制备的C18ADPA水凝胶放置12h后装入低温标本盒中，转移到液氮槽中，直至液氮变沸腾，然后转移液氮槽立即抽真空，样品升温至-100℃，样品表面进行冻干30min，在-146℃、3kV或5kV的加速电压下进行测试，用分析模式和背散射电子信号进行成像，测试结果如图4所示，其中，(a)为C18ADPA水凝胶，内插图为C18ADPA水凝胶实物图；(b)为PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶，内插图为PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶实物图。由图4可知，C18ADPA水凝胶的三维结构及在开放空间内的液体中相互连接并包围的层状结构；加入PHTrp-Cu络合物后，C18ADPA水凝胶的结构发生明显变化，由完整的层状结构变成纤维网状结构(SAFiN)，SAFiN通过毛细作用捕获水分子，加入PHTrp-Cu络合物后C18ADPA水凝胶的这种微观层面上的变化导致了水凝胶的机械强度增加。

(5)低角度X射线衍射(L-XRD)测试

用BrukerD8 advance衍射仪对实施例2制备的PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶和对比例1制备的C18ADPA水凝胶样品进行XRD测量，X射线源是Cu-α，其波长为0.15406nm，样品的衍射角范围为1～10°，测试结果如图5所示。由图5可知，C18ADPA水凝胶存在两种薄层状结构(图中“1”和“2”)，层状结构1的d间距为d₁＝4.1nm，这与十八烷基铵晶体的片状双分子层结晶的反射(001)中观察到的d-间距相等，因此，与十八烷基胺晶体相似，层状结构1是由极性和非极性组成的双分子层晶体；层状结构2的d间距d₂＝3.1nm，在与xerogel干凝胶层状结构d-间距(d＝3.6nm)非常接近的位置可观察到一个峰，表明其存在一种由烷基链相互交错形成的片层结构。PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶仍然保留层状结构作为SAFiN的结构单元，与C18ADPA水凝胶相似，可观察到两个层状结构，但两个层状结构的d间距都增大了，层状结构1排列紧凑，d-间距为4.3nm；烷基链相互交错形成的层状结构2，d-间距为3.1nm。L-XRD结果表明，虽然加入PHTrp-Cu后水凝胶的形态发生了变化，但从微观上看，其基本的构建结构仍然是片状结构，这两种层状结构与DSC分析结果非常吻合，由于两个层状结构是由双分子层晶体和相互交错的烷基链形成的，因此层状结构1是与T_m的吸收峰相对应，层状结构2与T_g吸热峰相对应。

(6)傅立叶变换红外光谱(FTIR)测试

用Thermo fisher Nicole 6700FTIR光谱仪对实施例2制备的PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶和对比例1制备的C18ADPA水凝胶进行FTIR测量，用KBr压片法制备样品，波数扫描范围为4000～700cm^-1，测试结果如图6所示，其中，S代表对称，AS代表不对称。由图6可知，FTIR光谱分为两部分，红外指纹扫描范围为2200～700cm^-1，为了更好的识别所有的峰，使用比较小的透光率；功能区(4000～2200cm^-1)：PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶中糖的-OH伸缩振动吸收在3267cm^-1处，峰比较窄，说明-OH处于非极性环境。C18ADPA是一种两性离子表面活性剂，在头部基团，酸性基团(-COOH)和弱碱性基团(叔胺)可以发生反应形成复合盐，在C18ADPA水凝胶中，羧酸：胺2：1复合物的光谱条带显示形成了该复合物；2:1络合物的形成表明反应发生。对于C18ADPA水凝胶，其特征峰是1733cm^-1为ν(C＝O)出峰，1183cm^-1处为ν(C-O)出峰，1391cm^-1处为ν_s(CO₂ ^-)出峰，1620cm^-1处为ν_As(CO₂ ^-)。加入PHTrp-Cu络合物后，观察到3个变化：(1)在1733cm^-1处的ν(C＝O)峰强度明显降低，(2)ν_As(CO2-)的出峰移至1592cm^-1，(3)在1120cm^-1处出现了ν(C-O)峰；而且1183cm^-1的ν(C-O)的峰强度相对较小了。基于以上结果，推测C18ADPA水凝胶头部基团之间相互作用形成的胺：羧酸个数比＝1:2复合物，在加入PHTrp-Cu后变成了1:1复合物。三个基团(胺基、羧酸基和羟基)在2:1络合物内排列的紧凑型表明，与1:1络合物内基团相比，基团的有效面积更小，这些促使凝胶体系在加入PHTrp-Cu后采用了更高的曲率进行自组装，形成了SAFiN结构。

(7)动物实验

实验用健康雄性ICR小鼠购自北京大学动物中心，鼠笼使用铁丝笼盖，用灭菌木屑作为垫料，饲养温度为20～25℃，小鼠自由饮食饮水，腹腔注射20％乌拉坦溶液对小鼠进行麻醉，每只小鼠体重约20g，注射麻醉剂体积为0.14mL，用电动除毛器将老鼠背部的毛发去除，用食指和拇指提起背部皮肤，在中线处进行折叠，形成一个三明治状的皮肤褶。将动物置于侧卧位，按下5mm直径活检钻孔机，将表层皮肤完全去除，形成对称的创面。每天对创面进行评估和拍照，直到病灶完全闭合。所有程序经首都医科大学伦理委员会批准，委员会保证，动物的福利是按照《动物福利法》的要求和美国国立卫生研究院关于实验室动物的护理和使用指南进行。

小鼠随机分为四组，每组不少于六只，第I组(对照组)是未接受任何治疗的组；第II组(基质组)用对比例1制备的C18ADPA水凝胶进行治疗；第III组(水凝胶组)用实施例2制备的PHTrp-Cu/C18ADPA水凝胶进行治疗；第IV组(凡士林组)采用载有PHTrp-Cu络合物的凡士林进行治疗，其中，PHTrp-Cu络合物的浓度与实施例2相同。

伤口愈合百分比(PWC)是根据原始伤口大小愈合的百分比进行计算的，伤口面积用游标卡尺测量计算(参见Tzu-Wei Wang,Jui-Sheng Sun,Hsi-Chin Wu,Yang-HweiTsuang,Wen-Hsi Wang,andFeng-Huei Lin.The effectof gelatin-chondroitinsulfate-hyaluronic acid skin substitute onwoundhealing inscidmice.Biomaterials,27(33):5689-5697,2006)，PWC是根据初始伤口面积(A₀)和第n天伤口面积(A_n)计算的。PWC的公式计算如式1所示：

PWC＝(A₀-A_n)/A₀×100％ (式1)。

动物实验遵循随机、双盲原则，数据以均数±标准差表示。根据预实验结果确定各组的动物数量为12只，每只动物每天伤口处涂抹药物1.5mL。所有伤口愈合实验数据的统计方法采用student’s t-test检验。当p<0.05时，差异被认为具有统计学意义。术后第0、2、5和8天的伤口愈合的过程如图7所示，手术当天的伤口直径为5mm。术后第0、2、3、5和7天的伤口愈合率数据图如图8所示。

由图7可知，实施例2制备的低分子量水凝胶制剂能够加速伤口修复，第III组和第IV组实验动物分别使用含有相同剂量的PHTrp-Cu络合物(57±2mg)水凝胶和凡士林膏进行治疗(每天1次)。根据预实验结果来确定小鼠的数量、剂量、创面面积和实验持续的时间。术后第1天观察到伤口区域已经开始收缩，大部分创面在第7～8天封闭，此时遗留面积很小且难以精确测量；由于环境和药物制剂并不是无菌的，在手术后的第2天观察到很小面积的红肿。

由图8可知，从第2天开始，水凝胶组的创面面积比其他组明显变小，凝胶组和凡士林组的伤口愈合比其他组快，在第8天，这两组伤口面积已缩小80～88％，愈合顺序为:水凝胶组>凡士林组>基质组>对照组。通过进行ANOVA分析，各组结果均有统计学差异。

组织学研究：收集第2天和第8天的皮肤组织，组织样品用10％的***溶液进行固定，依次用50％、75％、90％和100％的酒精溶液进行脱水，二甲苯清洗后石蜡包埋，然后对组织进行苏木精-伊红(H&E)染色(H&E)(参见Raija Tammi,Sanna Pasonen-Seppanen,Elina Kolehmainen,and Markku Tammi.Hyaluronan synthase induction andhyaluronan accumulation in mouse epidermis following skin injury.JournalofInvestigative Dermatology,124(5):898-905,2005)，术后第2天和第8天对小鼠伤口愈合处皮肤组织进行组织学分析，结果如图9所示。

由图9可知，第2天的数据中，观察到第I组动物的真皮和伤口旁边的位置出现了水肿和组织间隙变大现象，皮肤边缘是健康的，且伤口深入到了真皮表面，伤口的表层有一层薄薄的外壳，第2天就可以看到胶原纤维；第II组仍以水肿为最主要的特征，但水肿程度低于第I组，在上表皮层也可见了结痂，水肿和纤维蛋白束十分明显；第III组，水肿和纤维明显消失，间质层和真皮能观察到更多的单核细胞，伤口边缘和邻近的健康皮肤清晰可见。第IV组伤口广泛结痂，边界清晰，伤口延伸到真皮层表面，与其他组相比，第IV组的毛囊明显增多。第8天的数据中能够看到，第I组伤口广泛结痂，边界清晰，胶原纤维很厚，容易形成不规则的纤维束，随处可见结痂现象；第II组伤口的胶原纤维数量较少，伤口看起来基本愈合，但与邻近未受损的皮肤明显不同，炎症仍是最主要的特征，但水肿较少，成纤维细胞和新生血管很明显；第III组伤口几乎完全愈合，角质细胞层、成纤维细胞和内皮细胞构成了修复组织不可分割的部分，伤口处的胶原纤维组织已经恢复好；对于第IV组，与第2天相比，伤口已经收缩，真皮组织已经恢复好，与相邻的健康真皮相比，伤口部位真皮胶原密度较低，由于胶原蛋白束排列整齐，健康组织的染色更明显地呈***。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。