阅读说明：本技术 具有抗癌活性的6-溴代下箴刺桐碱及其制备方法和应用 (6-bromohypaphorine with anticancer activity and preparation method and application thereof ) 是由 戴雨霖 郑飞 越皓 于 2020-04-01 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种具有抗癌活性的6-溴代下箴刺桐碱及其制备方法和应用,属于化合物制备方法领域。该6-溴代下箴刺桐碱的分子式是C<Sub>14</Sub>H<Sub>17</Sub>BrN<Sub>2</Sub>O<Sub>2</Sub>,化学式如式1所示。本发明还提供一种具有抗癌活性的6-溴代下箴刺桐碱的制备方法。本发明还提供上述6-溴代下箴刺桐碱在制备抗癌药物方面的应用。本发明的6-溴代下箴刺桐碱是首次从红仿刺参中提取出来的,该提取方法简单、产率大、纯度高,易于产业化,同时得到的化合物可以应用在制备抗癌药物上,尤其对肺癌效果显著。<Image he="273" wi="700" file="DDA0002434770320000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention provides 6-bromohypaphorine with anticancer activity and a preparation method and application thereof, belonging to the field of compound preparation methods. The molecular formula of the 6-bromohypaphorine is C 14 H 17 BrN 2 O 2 The chemical formula is shown as formula 1. The invention also provides a preparation method of 6-bromohypaphorine with anticancer activity. The invention also provides the application of the 6-bromohypaphorine in preparing anti-cancer drugs. The 6-bromohypaphorine is extracted from the red apostichopus japonicus for the first time, the extraction method is simple, the yield is high, the purity is high, the industrialization is easy, and the obtained compound can be applied to the preparation of anti-cancer drugs, and particularly has obvious effect on lung cancer.)

具有抗癌活性的6-溴代下箴刺桐碱及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于化合物制备方法领域，具体涉及一种具有抗癌活性的6-溴代下箴刺桐碱及其制备方法和应用。

背景技术

海洋生物利用自身分泌的代谢产物作为抵御敌人进攻的工具，因此一些海洋次级代谢产物具有很好的抗癌效果。仿刺参(Apostichopus japonicus)属于无脊椎动物，主要分布东亚地区，尤其是中国黄海海域。中医药认为仿刺参全身入药，是上等滋补材料。现代研究认为仿刺参具有抗癌、抗真菌、抗炎、益智等功效。

国内外最新研究表明，从海参中提取分离出化合物百余种，其中皂苷类、蛋白类和多糖类含量较多并且活性明显。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗癌活性的6-溴代下箴刺桐碱及其制备方法和应用，该化合物具有抗癌活性。

本发明首先提供一种具有抗癌活性的6-溴代下箴刺桐碱，分子式是C₁₄H₁₇BrN₂O₂，化学式如式1所示：

本发明还提供一种具有抗癌活性的6-溴代下箴刺桐碱的制备方法，该方法包括：

步骤一：原料收集处理

将红仿刺参用清水洗净，保留内脏，冻干，粉碎，样品，得到粉碎样品；

步骤二：萃取分离

采用乙醇溶液对步骤一的粉粹样品加热震摇提取，减压回收浸膏，用正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次进行萃取，样品溶液和萃取试剂的体积比为1:(2-3)，每个萃取液萃取三次，合并萃取液，正丁醇萃取获得的组分在正相制备薄层板分离，流动相为氯仿、甲醇和水，收集的组分比移值在0.06-0.10之间；

步骤三：富集纯化

薄层板分离的组分在反相制备液相富集纯化6-溴代下箴刺桐碱，流动相是超纯水和乙腈溶液，流动相的梯度是0-30min，水和乙腈体积比例分别是50％和50％，30-40min，水和乙腈比例分别是90％和10％，ODS的制备色谱柱的尺寸是10mm内径，250mm长度，5um粒径，制备液相的流速是2mL/min，在紫外灯254纳米下，6-溴代下箴刺桐碱在25.63分钟流出。

优选的是，所述步骤一粉碎后过四到六号筛，得到粉碎样品。

优选的是，所述的步骤二乙醇溶液的浓度为70-95％。

优选的是，所述的步骤二中加热温度为40-50℃，提取时间为8-12h。

优选的是，所述的步骤二中氯仿、甲醇和水的体积比为10:1:(0.1-0.3)。

本发明还提供上述6-溴代下箴刺桐碱在制备抗癌药物方面的应用。

优选的是，所述的抗癌药物为肺癌药物。

本发明的有益效果

本发明提供一种具有抗癌活性的6-溴代下箴刺桐碱及其制备方法和应用，该6-溴代下箴刺桐碱是首次从红仿刺参中提取出来的，该提取方法简单、产率大、纯度高，易于产业化，同时得到的化合物可以应用在制备抗癌药物上，尤其对肺癌效果显著。

附图说明

图1为本发明实施例1制备得到的6-溴代下箴刺桐碱的COSY谱图；

图2为本发明实施例1制备得到的6-溴代下箴刺桐碱的HMBC谱图；

图3为本发明实施例1制备得到的6-溴代下箴刺桐碱的HSQC谱图；

图4为本发明实施例3中6-溴代下箴刺桐碱对正常细胞和五种癌细胞细胞存活率图；

图5为本发明实施例3中吖啶橙-溴化乙锭和Hoechst 33342的荧光显微照片。

图6为本发明实施例3的电泳图。

具体实施方式

本发明首先提供一种具有抗癌活性的6-溴代下箴刺桐碱，分子式是C₁₄H₁₇BrN₂O₂，为白色无定型粉末，化学式如式1所示：

本发明还提供一种具有抗癌活性的6-溴代下箴刺桐碱的制备方法，该方法包括：

步骤一：原料收集处理

将红仿刺参用清水洗净，保留内脏，冻干至粉末完全干燥，粉碎，样品优选过四到六号筛，得到粉碎样品；所述的红仿刺参优选采用春季采集的黄海海域新鲜红仿刺参(Apostichopus japonicus)；

步骤二：萃取分离

采用乙醇溶液对步骤一的粉粹样品加热，摇床震摇提取，所述的乙醇溶液的浓度优选为70-95％(v/v)，加热温度优选为40-50℃，所述的提取时间优选为8-12h，减压回收浸膏，用正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次进行萃取，样品溶液和萃取试剂的体积比是1:(2-3)，每个萃取液萃取三次，合并萃取液，正丁醇萃取获得的组分在正相制备薄层板分离，流动相为氯仿、甲醇和水，氯仿、甲醇和水的体积比优选为10:1:(0.1-0.3)，收集的组分比移值在0.06-0.10之间；

步骤三：富集纯化

薄层板分离的组分在反相制备液相富集纯化6-溴代下箴刺桐碱，流动相是超纯水和乙腈溶液，流动相的梯度是0-30min，水和乙腈体积比例分别是50％和50％，30-40min，水和乙腈比例分别是90％和10％，ODS的制备色谱柱的尺寸是10mm内径，250mm长度，5um粒径，制备液相的流速是2mL/min，在紫外灯254纳米下，6-溴代下箴刺桐碱在25.63分钟流出。

本发明还提供上述6-溴代下箴刺桐碱在制备抗癌药物方面的应用。所述的抗癌药物优选为肺癌药物。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，实施例中涉及到的原料均为商购获得。

实施例1

具有抗癌活性的6-溴代下箴刺桐碱制备方法，包括如下步骤：

(1)收集2月韩国济州岛黄海海域新鲜红仿刺参，处死，清水洗净，保留内脏，在冻干至完全干燥，粉碎样品过四号筛；

(2)萃取分离：采用70％(v/v)乙醇溶液对样品在40℃下加热震摇提取8小时，减压回收浸膏，用正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇不同极性有机溶剂依次萃取，样品溶液和萃取试剂的体积比是1:2，每个萃取液萃取三次，合并萃取液。正丁醇萃取获得的组分在正相制备薄层板分离，流动相是氯仿、甲醇、水，体积比为10:1:0.1，收集的组分比移值在0.06周围。

(3)富集纯化：薄层板分离的组分在反相制备液相富集纯化6-溴代下箴刺桐碱。流动相是超纯水和乙腈溶液，流动相的梯度是0到30分钟，水和乙腈比例分别是50％和50％，30到40分钟，水和乙腈比例分别是90％和10％。ODS的制备色谱柱的尺寸是10mm内径，250mm长度，5um粒径，制备液相的流速是2mL/min，在紫外灯254纳米下，6-溴代下箴刺桐碱在25.63分钟流出。

实施例1制备的化合物6-溴代下箴刺桐碱的化学结构经过UV、¹HNMR、¹³CNMR、COSY、HMBC、HSQC、ESI-MS等现代分析技术的鉴定并具有以下理化常数和特征：

C₁₄H₁₇BrN₂O₂，不定型白色粉末，ESI-MS：m/z：649.1017[2M+H]⁺(C₂₈H₃₅O₄N₄ ⁷⁹Br₂，649.1020)，m/z：347.0368[M+Na]⁺(C₁₄H₁₇O₂N₂ ⁷⁹BrNa，347.0366)。¹H和¹³C NMR的测试参数是900MHz,CD₃OD，谱图数据如表1所示：

表1

COSY图谱、HMBC图谱、HSQC图谱分别如图1、2、3所示。

实施例2

具有抗癌活性的6-溴代下箴刺桐碱制备方法，包括如下步骤：

(1)收集5月韩国济州岛黄海海域新鲜红仿刺参，处死，清水洗净，保留内脏，40℃烘箱烘干至完全干燥，粉碎的样品过六号筛；

(2)萃取分离：采用90％(v/v)乙醇溶液对样品50℃下加热摇床震摇提取12小时，减压回收浸膏。用乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇不同极性有机溶剂依次萃取，样品溶液和萃取试剂的体积比是1:3，每个萃取液萃取三次，合并萃取液。正丁醇萃取获得的组分在正相制备薄层板分离，流动相是氯仿、甲醇、水，体积比为10:1:0.3，收集的组分比移值在0.1附近。

(3)富集纯化：薄层板分离的组分在反相制备液相富集纯化6-溴代下箴刺桐碱。流动相是超纯水和乙腈溶液，流动相的梯度是0到30分钟，水和乙腈比例分别是50％和50％，30到40分钟，水和乙腈比例分别是90％和10％。ODS的制备色谱柱的尺寸是10mm内径，250mm长度，5um粒径，制备液相的流速是2mL/min，在紫外灯254纳米下，6-溴代下箴刺桐碱在25.63分钟流出。

实施例3

6-溴代下箴刺桐碱对癌细胞的筛选和肺癌细胞A549的体外抑制癌细胞活性作用

(1)用人乳腺癌MCF-7、人肝癌Hep3B、鼠皮肤黑色素瘤B16F10、人结肠癌HT-29、人肺癌A549的多种癌细胞和正常猴肾细胞Vero进行6-溴代下箴刺桐碱的抗癌活性筛选。胰蛋白酶消化，接种在96孔板中，细胞密度(1×10⁵细胞/mL)，培养24小时后，在细胞中加入不同浓度的6-溴代下箴刺桐碱(32.5、75、150μM)，孵育24小时后进行细胞存活率检测。如图4所示，图4为6-溴代下箴刺桐碱对正常细胞和五种癌细胞细胞存活率图，图4说明，其中肺癌细胞A549的IC₅₀是197.1±7.4μM，表明6-溴代下箴刺桐碱抗肺癌活性最好。

(2)凋亡小体染色实验

用吖啶橙-溴化乙锭染色法和Hoechst 33342染色法检测凋亡和坏死细胞的周期。将A549细胞密度(1×10⁵细胞/mL)接种于24孔培养板中，不同浓度的6-溴代下箴刺桐碱(32.5、75、150μM)进行加样。培养24小时后，细胞加入吖啶橙溴化乙锭(100μg/mL)或Hoechst 33342(1mg/mL)。在黑暗中染色10分钟后用PBS冲洗两次。在荧光显微镜下观察细胞。如图5所示，图5为吖啶橙-溴化乙锭和Hoechst 33342的荧光显微照片。其中，图A代表空白和6-溴代下箴刺桐碱的浓度分别为32.5、75、150μM的吖啶橙-溴化乙锭染色图，图B代表空白和6-溴代下箴刺桐碱的浓度分别为32.5、75、150μM的Hoechst 33342染色图。由图5可知，随着6-溴代下箴刺桐碱的浓度增加，凋亡的肺癌细胞A549逐渐增多，说明6-溴代下箴刺桐碱具有较强的促进肺癌细胞凋亡的作用。

(4)免疫组化分析

6-溴代下箴刺桐碱诱导癌细胞凋亡的作用呈时间和剂量依赖性。A549细胞(2×10⁵细胞/mL)接种于细胞培养板中。样品处理按细胞存活率所述进行。细胞孵育结束后，收集细胞，在裂解缓冲液中连续均质，并通过离心(12000x g，20min)，取上清。用蛋白试剂盒测定含有蛋白质的上清液。将50μg蛋白质与裂解缓冲液混合后装入聚丙烯酰胺凝胶中。蛋白带被电泳分离，转移到硝化纤维素膜上，在5％脱脂牛奶中封闭，并培养2小时。然后用一级和二级抗体培养膜。使用化学发光基质产生信号。结果如图6所示，6-溴代下箴刺桐碱能够调节肺癌细胞的凋亡因子，如Bax,Bcl-xL和caspase-3。这显示6-溴代下箴刺桐碱具有较强的抗癌活性。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同限定。