阅读说明：本技术 一种脐带标本的保存方法 (Preservation method of umbilical cord specimen ) 是由 魏伟 嵐山芮 许超 于 2020-06-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种脐带标本的保存方法。本发明首次提出了硝酸甘油在脐带标本保存中的应用。本发明的脐带标本保存方法可以实现在常温下保存,大大降低了对库存、运输、交接条件的要求,可节约成本；同时能有效抑制细菌污染,维持脐带中间充质干细胞的生物活性,可为临床和基础研究提供高质量的生物资源。(The invention discloses a preservation method of an umbilical cord specimen. The invention provides the application of nitroglycerin in the preservation of an umbilical cord specimen for the first time. The umbilical cord specimen preservation method can realize preservation at normal temperature, greatly reduces the requirements on the conditions of inventory, transportation and handover, and can save the cost; meanwhile, the method can effectively inhibit bacterial pollution, maintain the biological activity of the mesenchymal stem cells in the umbilical cord, and provide high-quality biological resources for clinical and basic research.)

一种脐带标本的保存方法

技术领域

本发明属于生物标本采集和保存技术领域，具体涉及一种脐带标本的保存方法。

背景技术

脐带为分娩废弃组织，其间充质干细胞含量丰富，无需创伤性穿刺，较骨髓来源间充质干细胞扩增能力更强，成为近来间充质干细胞研究的重要来源之一。但是，在日常脐带干细胞库的工作中由于分娩方式、医护人员采集方法不当容易导致脐带标本细菌污染，造成珍贵资源的浪费。

为了避免污染,采集液中需要加入青霉素和链霉素双抗。但是，双抗对温度较为敏感，需-20℃冷冻保存，短期保存也要放进冷藏层，操作起来不方便，很容易成分降解，影响抑菌效果。因此，亟需研究出一种简便、有效的脐带标本采集和保存方法。

***(C₃H₅N₃O₉，三***酯)是一种无色或黄色的油状透明液体，其化学式结构式为主要是用来治疗和预防心绞痛，是作为血管扩张药物，也可以用来治疗充血性的心力衰竭。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供***在脐带标本保存中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种脐带标本的保存方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

***在脐带标本保存中的应用。

一种脐带标本的保存方法，胎儿娩出后，采集脐带，酒精消毒，洗净，放入装有***和生理盐水混合液的容器中，密封，置于2～15℃下保存至运达指定目的地为止。

所述的采集脐带的时间优选为胎儿娩出后30秒内。

所述的***与生理盐水的配比优选为体积比0.2～2：100；更优选为1：100。

所述的生理盐水是指医用氯化钠注射液，即0.9％的氯化钠水溶液。

所述的酒精消毒的时间优选为0.5～2分钟；更优先为1分钟。

所述的洗净所用的试剂优选为生理盐水。

所述的保存的时间优选小于24小时；更优选为小于19小时。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明首次提出了***在脐带标本保存中的应用。本发明的脐带标本保存方法可以实现在常温下保存，大大降低了对库存、运输、交接条件的要求，可节约成本；同时能有效抑制细菌污染，维持脐带中间充质干细胞的生物活性，可为临床和基础研究提供高质量的生物资源。

附图说明

图1为传代后培养第2天细胞状态示意图。

图2为流式细胞仪检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所使用的原料、助剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场购买等商业途径得到的原料、助剂。

实施例1脐带标本采集液的制备

(1)取1ml***，加入100ml生理盐水(医用氯化钠注射液，0.9％的氯化钠水溶液)，混匀，即得到***浓度为1％(V/V)的脐带采集液。

(2)取0.5ml***，加入100ml生理盐水，混匀，即得到***浓度为0.5％(V/V)的脐带采集液。

(3)取2ml***，加入100ml生理盐水，混匀，即得到***浓度为2％(V/V)的脐带采集液。

实施例2抑菌实验

一、白色念珠菌：

(1)取白色念珠菌(ATCC 10231，购于Microbiologics公司KWIK-STIK系类)，根据其说明书将菌种接种到沙门氏葡萄糖琼脂培养板上，25℃环境下培养5天，将白色念珠菌挑选出来，接种到斜面培养物上，进行增菌培养。

将试验菌24h斜面培养物用PBS洗下，制成菌悬液(要求的浓度为：用100μl滴于5ml样液内，回收菌数为6.5×10⁴cfu/ml)；取被试样液(实施例1得到的***浓度为1％的脐带采集液)5ml和对照样液(PBS)5ml各四管。

(2)取上述菌悬液，分别在每个被试样液和对照样液内滴加100μl，均匀混合，开始计时，作用2min、5min、10min、20min，分别吸取样液0.5ml投入含5ml PBS的试管内，充分混匀，作适当稀释，然后取其中2个～3个稀释度，分别吸取0.5ml，置于2个平皿，用凉至40℃～45℃的沙门氏葡萄糖琼脂培养基15ml作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板。

(3)所有试验样本和对照样本均在35℃±2℃培养48h，观察最终结果。试验重复三次，按照如下公式计算抑菌率，结果如下表1所示：

抑菌率X＝(A₀-A₁)/A₀×100％；

A₀表示对照组的平均菌落数，单位为cfu/ml；

A₁表示实验组平均菌落数，单位为cfu/ml；

表1白色念珠菌抑菌试验

二、大肠杆菌：

(1)取大肠杆菌(ATCC 8099，购于Microbiologics公司KWIK-STIK系类)，根据其说明书将菌种接种到胰蛋白胨大豆琼脂培养板上，35℃环境下培养48h，将大肠杆菌挑选出来，接种到斜面培养物上，进行增菌培养。

将试验菌24h斜面培养物用PBS洗下，制成菌悬液(要求的浓度为：用100μl滴于5ml样液内，回收菌数为6.5×10⁴cfu/ml)；取被试样液(实施例1得到的***浓度为1％的脐带采集液)5ml和对照样液(PBS)5ml各四管。

(2)取上述菌悬液，分别在每个被试样液和对照样液内滴加100μl，均匀混合，开始计时，作用2min、5min、10min、20min，分别吸取样液0.5ml投入含5ml PBS的试管内，充分混匀，作适当稀释，然后取其中2个～3个稀释度，分别吸取0.5ml，置于2个平皿，用凉至40℃～45℃的营养琼脂培养基15ml作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板。

(3)所有试验样本和对照样本均在35℃±2℃培养48h，观察最终结果。试验重复三次，按照如下公式计算抑菌率，结果如下表1所示：

抑菌率X＝(A₀-A₁)/A₀×100％；

A₀表示对照组的平均菌落数，单位为cfu/ml；

A₁表示实验组平均菌落数，单位为cfu/ml；

表2大肠杆菌抑菌试验

三、金黄色葡萄球菌：

(1)取金黄色葡萄球菌(ATCC 6538，购于Microbiologics公司KWIK-STIK系类)，根据其说明书将菌种接种到胰蛋白胨大豆琼脂培养板上，25℃环境下培养5天，将白色念珠菌挑选出来，接种到斜面培养物上，进行增菌培养。

将试验菌24h斜面培养物用PBS洗下，制成菌悬液(要求的浓度为：用100μl滴于5ml样液内，回收菌数为6.5×10⁴cfu/ml)；取被试样液(5ml)和对照样液(5ml)各四管。

(2)取上述菌悬液，分别在每个被试样液和对照样液内滴加100μl，均匀混合，开始计时，作用2min、5min、10min、20min，分别吸取样液0.5ml投入含5ml PBS的试管内，充分混匀，作适当稀释，然后取其中2个～3个稀释度，分别吸取0.5ml，置于2个平皿，用凉至40℃～45℃的营养琼脂培养基15ml作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板。

(3)所有试验样本和对照样本均在35℃±2℃培养48h，观察最终结果。试验重复三次，按照如下公式计算抑菌率，结果如下表1所示：

抑菌率X＝(A₀-A₁)/A₀×100％；

A₀表示对照组的平均菌落数，单位为cfu/ml；

A₁表示实验组平均菌落数，单位为cfu/ml；

表3金黄色葡萄球菌试验

实施例3脐带标本的采集和污染率检测

经同意采集广东省妇幼保健院健康产妇分娩的胎儿的脐带，胎儿娩出后30秒钟内，按手术常规结扎脐带后剪断采集，将采集的脐带放入装有医用酒精的消毒瓶中，浸泡1分钟，再用生理盐水将脐带洗净，放入装有实施例1制备得到的脐带采集液的脐带采集瓶中，密封，置于标本运输箱中，温度2～15℃条件下，运回公司，运输时间小于24小时。对采集的脐带进行污染率统计，结果如表4所示。从统计结果来看，采集的脐带均没有被污染。可见，将***应用在脐带标本采集中可以避免脐带采集过程中发生细菌污染。

表4标本污染情况统计

序号	运输时间	污染情况	保存液
				1	18	否	1％***
2	19	否	1％***
				3	16	否	1％***
4	11	否	1％***
				5	10	否	1％***
6	8	否	1％***

实施例4脐带间充质干细胞的制备和活性检测

脐带标本运回公司后，通过组织块贴壁法制备间充质干细胞，具体操作如下：

(1)取脐带标本，用生理盐水清洗，至无血色，剪成小段，放入空的培养皿中，用组织镊将脐带撕开，剥离两条动脉血管，撕下分布在血管周围的华尔通氏胶。将分离出来的华尔通氏胶放入50ml离心管中，加入2ml培养基(LONZA 12-725F间充质干细胞无血清培养基，用剪刀将华尔通氏胶剪成1mm³大小的碎块，再加入6ml培养基，混匀后均匀放入6个T25的培养瓶中；

(2)将T25培养瓶放入培养箱中，37℃、5％CO₂培养；

(3)培养5天后，细胞长出，全量换液；

(4)培养14天后，细胞密度达到80％左右，进行传代培养，传代比例1:3；

(5)传代培养第2天，倒置显微镜下观察细胞的状态，结果如图1所示。

(6)培养3天后，流式细胞仪检测各组样本CD90、CD105、CD73、CD34和CD45表达情况，结果如图2所示。结果显示，经过本发明采集方法获得的脐带标本可以很好的长出细胞，细胞生物活性好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。