一种含有脂肪酸的多肽脂质体及其制备方法
阅读说明：本技术 一种含有脂肪酸的多肽脂质体及其制备方法 (Polypeptide liposome containing fatty acid and preparation method thereof ) 是由 张大勇 毕永贤 杜雨涵 周浩淼 李�昊 刘金俊 朱秀洁 于 2021-06-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种含有脂肪酸的多肽脂质体及其制备方法,其多肽脂质体,包括油相和水相,油相包括以下原料：氢化卵磷脂、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸和辛酸/癸酸甘油三酯；水相包括以下重量份数的原料：乙酰基六肽-8、乙酰基二肽-1鲸蜡酯、棕榈酰三肽-5、十四烷基氨基丁酰缬氨酰胺基丁酸脲三氟乙酸盐、甘油、丁二醇和水。其多肽脂质体的制备方法包括将油相原料混合、加热、融解,得油相,将水相原料混合、加热、融解,得水相,然后将油相和水相混合均质,得含有脂肪酸的多肽脂质体。本发明具有提高脂质体的皮肤渗透能力、全方位发挥协同增效的特点。(The invention discloses a polypeptide liposome containing fatty acid and a preparation method thereof, wherein the polypeptide liposome comprises an oil phase and a water phase, and the oil phase comprises the following raw materials: hydrogenated lecithin, palmitic acid, stearic acid, behenic acid and caprylic/capric triglyceride; the water phase comprises the following raw materials in parts by weight: acetyl hexapeptide-8, acetyl dipeptide-1 cetyl esters, palmitoyl tripeptide-5, tetradecyl aminobutyroylvalinamide butyric urea trifluoroacetate, glycerol, butylene glycol and water. The preparation method of the polypeptide liposome comprises mixing, heating and melting the oil phase raw materials to obtain oil phase, mixing, heating and melting the water phase raw materials to obtain water phase, and mixing and homogenizing the oil phase and the water phase to obtain the polypeptide liposome containing fatty acid. The invention has the characteristics of improving the skin permeability of the liposome and giving full play to the synergy.)
技术领域
本发明涉及一种多肽脂质体，特别是一种含有脂肪酸的多肽脂质体及其制备方法。
背景技术
皮肤皱纹是内源性和外源性因素共同作用导致的。其中外源性因素包括紫外线辐射、烟雾以及有害化学物质等，它们与皮肤接触产生的活性氧自由基(ROS)会直接损伤皮肤细胞的DNA和细胞外基质的胶原蛋白、弹性蛋白或粘多糖分子，使皮肤变薄、表皮和真皮的基底膜受损、细胞的数量和供血血管数量减少，导致皮肤皱纹的产生；内源性因素是由于随着年龄的增长，表皮角质层中的保湿因子不断减少、皮肤水合能力下降、同时皮肤中的蛋白多糖和透明质酸浓度降低，皮肤真皮层中水分减少，真皮成纤维细胞活性降低，合成胶原蛋白的能力下降，导致皮肤干燥，皮肤弹性减弱，最后产生皱纹。
肽是蛋白质片段，结构介于氨基酸和蛋白质之间。一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基可以缩合成肽，形成的酰胺基在蛋白质化学中称为肽键。通常由两个氨基酸分子脱水缩合而成化合物的叫做二肽，由三个氨基酸缩合而成叫三肽，依次类推为：四肽、五肽等。肽具有特殊生理活性作用，它能上调细胞的增长因子，刺激血管生成、肉芽组织的生长和胶原蛋白的合成，能在本质上改善皮肤的一系列问题。
脂质体(liposome)是指将有效成分包封于类脂质双分子层内而形成的微型球状载体。其中水溶性成分可包裹在磷脂的内水相，脂溶性成分可包裹在磷脂双分子层间。脂质体是具有双层膜的封闭式粒子，自身聚集性脂类分子包封药物及有效成分，根据其粒径和结构可分为大单室脂质体、小单室脂质体和多室脂质体。
现有的单一机制所开发的抗衰脂质体产品，其脂质体容易粘附在角质细胞壁内部，破坏脂质双层结构，导致药物泄漏，因此脂质体在药物转运方面存在困难，而且抗衰脂质体产品只能够发挥一定的抗衰功效，效果比较单一、不明显。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种含有脂肪酸的多肽脂质体及其制备方法。本发明具有提高脂质体的皮肤渗透能力、全方位发挥协同增效的特点。
本发明的技术方案：一种含有脂肪酸的多肽脂质体，包括油相和水相，油相包括以下原料：氢化卵磷脂、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸和辛酸/癸酸甘油三酯；水相包括以下重量份数的原料：乙酰基六肽-8、乙酰基二肽-1鲸蜡酯、棕榈酰三肽-5、十四烷基氨基丁酰缬氨酰胺基丁酸脲三氟乙酸盐、甘油、丁二醇和水。
前述的一种含有脂肪酸的多肽脂质体中，所述氢化卵磷脂的PC含量为50％-75％。
前述的一种含有脂肪酸的多肽脂质体中，包括油相和水相，油相包括以下重量份数的原料：2-8份氢化卵磷脂、0.05-1份棕榈酸、0.2-0.8份硬脂酸、0.05-1份山嵛酸和15-25份辛酸/癸酸甘油三酯；水相包括以下重量份数的原料：0.05-1份乙酰基六肽-8、0.05-1份乙酰基二肽-1鲸蜡酯、0.05-1份棕榈酰三肽-5、0.05-1份十四烷基氨基丁酰缬氨酰胺基丁酸脲三氟乙酸盐、10-30份甘油、5-15份丁二醇和39.5-43.3份水。
前述的一种含有脂肪酸的多肽脂质体中，包括油相和水相，油相包括以下重量份数的原料：5份氢化卵磷脂、0.5份棕榈酸、0.5份硬脂酸、0.5份山嵛酸和20份辛酸/癸酸甘油三酯；水相包括以下重量份数的原料：0.2份乙酰基六肽-8、0.3份乙酰基二肽-1鲸蜡酯、0.2份棕榈酰三肽-5、0.4份十四烷基氨基丁酰缬氨酰胺基丁酸脲三氟乙酸盐、20份甘油、10份丁二醇和40份水。
上述的含有脂肪酸的多肽脂质体的制备方法，包括以下操作步骤：
S1、取氢化卵磷脂、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸、辛酸/癸酸甘油三酯混合，加热至65-85℃搅拌溶解0.5-2h，即得到油相；
S2、取乙酰基六肽-8、乙酰基二肽-1鲸蜡酯、棕榈酰三肽-5、十四烷基氨基丁酰缬氨酰胺基丁酸脲三氟乙酸盐、甘油、丁二醇、水混合，加热至60-90℃搅拌溶解0.5-2小时，即得到水相。
S3、将油相加入到水相中，搅拌0.8-1.5h，然后高压均质，即得到含有脂肪酸的多肽脂质体。
前述的含有脂肪酸的多肽脂质体的制备方法中，包括以下操作步骤：
S1、取氢化卵磷脂、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸、辛酸/癸酸甘油三酯混合，加热至70℃搅拌溶解1h，即得到油相；
S2、取乙酰基六肽-8、乙酰基二肽-1鲸蜡酯、棕榈酰三肽-5、十四烷基氨基丁酰缬氨酰胺基丁酸脲三氟乙酸盐、甘油、丁二醇、水混合，加热至70℃搅拌溶解1小时，即得到水相。
S3、将油相加入到水相中，搅拌1h，然后高压均质，即得到含有脂肪酸的多肽脂质体。
前述的含有脂肪酸的多肽脂质体的制备方法中，所述步骤S3中，高压均质的压力为500-1500bar，均质循环3-8次。
前述的含有脂肪酸的多肽脂质体的制备方法中，所述步骤S3中高压均质的压力为1000bar，均质循环5次。
与现有技术相比，本发明的多肽组合物，通过不同活性肽的复配，作用于不同靶点，全方位发挥协同增效作用，可以实现优异的抗皱、紧致皮肤、细致毛孔、提升皮肤光泽等作用。
其中乙酰基六肽-8通过抑制SASPS衰老诱导因子和SNARE复合物的形成，抑制表情肌收缩,减轻皱纹；乙酰基二肽-1鲸蜡酯通过激发弹性蛋白的合成，并且有利于结合优质的弹性纤维结构，从而实现提升面部轮廓，对抗皮肤下垂；棕榈酰三肽-5模拟了人体自身的机理，通过TGF-β生产胶原蛋白，同时通过抑制MMP来保护胶原蛋白免受降解，达到抗皱的效果；十四烷基氨基丁酰缬氨酰胺基丁酸脲三氟乙酸盐通过刺激葡糖胺聚糖生物合成，显著增加透明质酸的合成，通过增加核心蛋白聚糖和基膜聚糖的水平，强化胶原蛋白纤维，从而实现提升皮肤的紧致度的效果。四种多肽通过不同的作用靶点，促进蛋白的合成、保护蛋白降解、抑制肌肉收缩、紧致抗皱、提升轮廓，从而实现全方位紧致抗皱的效果。与此同时，四种多肽协同作用还可以实现明显得提升皮肤光泽度、平滑肌肤和收缩毛孔的功效。
本发明的多肽脂质体的制备方法，制备简单、成本低，可产业化应用，在脂质体中加入脂肪酸，设计了可变形的脂质体，改变脂质双分子层的流动性，使得脂质体不易粘附在角质细胞壁内部，脂质双层结构稳定，药物不易泄漏，增强脂质体通过角质层间孔隙的能力，提高多肽脂质体的皮肤渗透能力和透皮吸收性，有效增加多肽的透皮深度。
该种方法制备所得的多肽脂质体粒径均匀，稳定性好，对多肽的包裹稳定性好，脂肪酸的加入可以增加多肽的透皮吸收的效果，多肽组合物具有协同增效作用，可以实现优异的抗皱、紧致皮肤的作用。
因此，本发明具有提高脂质体的皮肤渗透能力、全方位发挥协同增效的特点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
实施例1：
一种含有脂肪酸的多肽脂质体，包括油相和水相，油相包括以下重量份数的原料：2-8份氢化卵磷脂、0.05-1份棕榈酸、0.2-0.8份硬脂酸、0.05-1份山嵛酸和15-25份辛酸/癸酸甘油三酯；水相包括以下重量份数的原料：0.05-1份乙酰基六肽-8、0.05-1份乙酰基二肽-1鲸蜡酯、0.05-1份棕榈酰三肽-5、0.05-1份十四烷基氨基丁酰缬氨酰胺基丁酸脲三氟乙酸盐、10-30份甘油、5-15份丁二醇和39.5-43.3份水。
所述氢化卵磷脂的PC含量为50-75％。
其多肽脂质体的制备方法包括以下操作步骤：
S1、取氢化卵磷脂、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸、辛酸/癸酸甘油三酯混合，加热至65-85℃搅拌溶解0.5-2h，即得到油相；
S2、取乙酰基六肽-8、乙酰基二肽-1鲸蜡酯、棕榈酰三肽-5、十四烷基氨基丁酰缬氨酰胺基丁酸脲三氟乙酸盐、甘油、丁二醇、水混合，加热至60-90℃搅拌溶解0.5-2小时，即得到水相。
S3、将油相加入到水相中，搅拌0.8-1.5h，然后高压均质，压力为500-1500bar，均质循环3-8次，即得到含有脂肪酸的多肽脂质体。
实施例2：
一种含有脂肪酸的多肽脂质体，包括油相和水相，油相包括以下重量份数的原料：2份氢化卵磷脂、0.05份棕榈酸、0.2份硬脂酸、0.05份山嵛酸和15份辛酸/癸酸甘油三酯；水相包括以下重量份数的原料：0.05份乙酰基六肽-8、0.05份乙酰基二肽-1鲸蜡酯、0.05份棕榈酰三肽-5、0.05份十四烷基氨基丁酰缬氨酰胺基丁酸脲三氟乙酸盐、10份甘油、5份丁二醇和39.5份水。
所述氢化卵磷脂的PC含量为50％。
其多肽脂质体的制备方法包括以下操作步骤：
S1、取氢化卵磷脂、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸、辛酸/癸酸甘油三酯混合，加热至65℃搅拌溶解2h，即得到油相；
S2、取乙酰基六肽-8、乙酰基二肽-1鲸蜡酯、棕榈酰三肽-5、十四烷基氨基丁酰缬氨酰胺基丁酸脲三氟乙酸盐、甘油、丁二醇、水混合，加热至60℃搅拌溶解2小时，即得到水相。
S3、将油相加入到水相中，搅拌1.5h，然后高压均质，压力为1500bar，均质循环3次，即得到含有脂肪酸的多肽脂质体。
实施例3：
一种含有脂肪酸的多肽脂质体，包括油相和水相，油相包括以下重量份数的原料：8份氢化卵磷脂、1份棕榈酸、0.8份硬脂酸、1份山嵛酸和25份辛酸/癸酸甘油三酯；水相包括以下重量份数的原料：1份乙酰基六肽-8、1份乙酰基二肽-1鲸蜡酯、1份棕榈酰三肽-5、1份十四烷基氨基丁酰缬氨酰胺基丁酸脲三氟乙酸盐、30份甘油、15份丁二醇和43.3份水。
所述氢化卵磷脂的PC含量为60％。
其多肽脂质体的制备方法包括以下操作步骤：
S1、取氢化卵磷脂、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸、辛酸/癸酸甘油三酯混合，加热至85℃搅拌溶解0.5h，即得到油相；
S2、取乙酰基六肽-8、乙酰基二肽-1鲸蜡酯、棕榈酰三肽-5、十四烷基氨基丁酰缬氨酰胺基丁酸脲三氟乙酸盐、甘油、丁二醇、水混合，加热至90℃搅拌溶解0.5小时，即得到水相。
S3、将油相加入到水相中，搅拌0.8h，然后高压均质，压力为500bar，均质循环8次，即得到含有脂肪酸的多肽脂质体。
实施例4：
一种含有脂肪酸的多肽脂质体，包括油相和水相，油相包括以下重量份数的原料：5份氢化卵磷脂、0.5份棕榈酸、0.5份硬脂酸、0.5份山嵛酸和20份辛酸/癸酸甘油三酯；水相包括以下重量份数的原料：0.2份乙酰基六肽-8、0.3份乙酰基二肽-1鲸蜡酯、0.2份棕榈酰三肽-5、0.4份十四烷基氨基丁酰缬氨酰胺基丁酸脲三氟乙酸盐、20份甘油、10份丁二醇和40份水。
所述氢化卵磷脂的PC含量为75％。
其多肽脂质体的制备方法包括以下操作步骤：
S1、取氢化卵磷脂、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸、辛酸/癸酸甘油三酯混合，加热至70℃搅拌溶解1h，即得到油相；
S2、取乙酰基六肽-8、乙酰基二肽-1鲸蜡酯、棕榈酰三肽-5、十四烷基氨基丁酰缬氨酰胺基丁酸脲三氟乙酸盐、甘油、丁二醇、水混合，加热至70℃搅拌溶解1小时，即得到水相。
S3、将油相加入到水相中，搅拌1h，然后高压均质，压力为1000bar，均质循环5次，即得到含有脂肪酸的多肽脂质体。
一、性能测试：
取实施例4的多肽脂质体作为实验例，对比例A中不含脂肪酸，其余原料与实验例一致，对比例1-4中多肽原料与实验例不同，其余原料与实验例一致。实验例和对比例中的多肽原料和含量如表1所示。
表1实验例和对比例的多肽原料成分表
1)脂质体稳定性
取实验例，用激光粒度仪测定多肽脂质体的粒径分布和PDI。测定结果得知，脂质体的粒径为80-150nm，PDI为0.17-0.25，4℃下放置30天后，粒径为85-160nm，PDI为0.18-0.25。由此可知，本发明制备的多肽脂质体粒径均匀、稳定性好。
2)多肽包裹稳定性
取实验例和对比例A分别溶解于去离子水中，室温条件下密封放置，于放置0、7、14、30、60天后测其溶液中多肽的泄漏量。测得结果得知，实验例60天后多肽的泄漏率为5％，对比例A60天后多肽的泄漏率为32％。由此可知，本发明制备的多肽脂质体，多肽包裹稳定性更好。
3)透皮吸收性能
用剃刀将健康大鼠背部表面的毛发刮除，并通过手术将皮肤全层去除。用异丙醇擦拭真皮侧，清除残留的粘着的皮下脂肪。随后用PBS(pH＝7.4)反复冲洗皮肤，用铝箔包好，-20℃保存备用。将老鼠皮肤固定在Franz扩散池上，有效渗透面积为1.766cm2，接收池中注入15mLPBS缓冲液，水浴温度为37℃。
分别取实验例和对比例A于扩散池，密封。开启磁力搅拌器时计时，分别于0.5、1、2、4、6、8、12、16和24h后取样1.0mL。取样后，及时补充等体积的恒温PBS液。样品以10000r/min离心15min后，取上清液，测定样品中多肽的含量，然后计算累积透过量。
测得结果得知，实验例的24h累积透过量为：330μg/cm2；
对比例A的24h累积透过量为：160μg/cm2。
由上述结果可知，本发明制备的多肽脂质体，有效物透皮性能有显著提高。
4)多肽协同作用
将年轻捐献者(25至39岁)和老年捐献者(52至63岁)的皮肤活检切成小块，老年捐献者的皮肤活检在浓度为5％的实验例和对比例的培养基下培养40小时，并分别以年轻捐献者(25至39岁)和老年捐献者(52至63岁)的皮肤活检在不含实验例，也不含对比例的普通培养基下培养40小时，作为年轻对照和衰老对照。将培养基的样品通过拉伸测试来测定杨氏模量，测得结果如表2所示。
表2杨氏模量测定表
由上述实验结果可知，本发明组合物的抗衰老性能更好。
二、人体实验：
选取女性受试者60名，年龄为40-60岁，随机分为2组，分别为实验组和对照组。实验组一天涂抹两次实验例面霜，对照组一天涂抹两次对照组面霜。实验例面霜含10％实验例的多肽脂质体，对照组面霜不含多肽脂质体，其余成分相同。
通过分光光度法测量皮肤光泽度：初始测量一次，2周、4周后分别再测量一次。2周后：实验组的皮肤光泽度较初始增加8.9％，对照组的皮肤光泽度较初始增加1.9％；4周后：实验组的皮肤光泽度较初始增加18.7％，对照组的皮肤光泽度较初始增加2.4％。
通过VISIA-CR皮肤图像分析毛孔：初始测量一次，2周、4周后分别再测量一次。2周后：实验组的毛孔较初始减少6.5％，对照组的毛孔较初始减少2.3％；四周后：实验组的毛孔较初始减少13.8％，对照组的毛孔较初始减少3.7％。
通过VisioScan VC20 Plus分析皮肤粗糙度SEr：初始测量一次，2周、4周后分别再测量一次。2周后：实验组的皮肤粗糙度SEr较初始减少8.9％，对照组的皮肤粗糙度SEr较初始减少3.4％；四周后：实验组的皮肤粗糙度SEr较初始减少19.8％，对照组的皮肤粗糙度SEr较初始减少6.7％。
由上述实验结果可知，本发明组合物能够更好地紧致皮肤，并且可以提升皮肤光泽度、细致毛孔。
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