血液灌流用抗炎吸附剂及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 血液灌流用抗炎吸附剂及其制备方法与应用 (Anti-inflammatory adsorbent for blood perfusion and preparation method and application thereof ) 是由 王永健 于奡 黄晓龙 宋霖 于 2021-06-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种血液灌流用抗炎吸附剂及其制备方法与应用,尤其涉及一种血液灌流用的PBMC吸附剂的制备方法。其中血液灌流用抗炎吸附剂由作为吸附剂载体的高分子和利用化学键偶联固定在载体表面上的可与外周血单个核细胞(PBMC)特异性结合的配体—黄芪多糖(APS)共同构成。再利用血液灌流的技术手段成功构建出了PBMC细胞捕获系统,该系统对PBMC吸附效果好,可有效降低炎症因子的产生,缓解炎症发展,同时具有安全性高,成本低等优点,对于尿毒症、脓毒血症等炎性疾病的治疗有广阔的应用前景。该吸附剂也可用于PBMC的分离检测。(The invention relates to an anti-inflammatory adsorbent for blood perfusion, a preparation method and application thereof, in particular to a preparation method of a PBMC adsorbent for blood perfusion. The anti-inflammatory adsorbent for blood perfusion comprises macromolecules as adsorbent carrier and Astragalus Polysaccharide (APS) which is a ligand capable of being specifically combined with Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) and is fixed on the surface of the carrier by chemical bond coupling. The PBMC cell capturing system is successfully constructed by utilizing a blood perfusion technical means, has a good PBMC adsorption effect, can effectively reduce the generation of inflammatory factors and relieve the development of inflammation, has the advantages of high safety, low cost and the like, and has a wide application prospect in the treatment of inflammatory diseases such as uremia, sepsis and the like. The adsorbent can also be used for PBMC separation detection.)
技术领域
本发明涉及一种血液灌流用抗炎吸附剂及其制备方法与应用，尤其涉及一种血液灌流用的PBMC吸附剂的制备方法。
背景技术
脓毒症（sepsis）是感染、烧/创伤、休克等急危重患者的严重并发症。随着危重病监护救治技术的进步，脓毒症患者病死率虽然已显著下降，但仍高达20%。脓毒症是由一些炎性、免疫细胞和他们衍生的多种炎性介质、细胞因子、氧自由基和凝血物质等参与的具有网络特征且错综复杂的生理-病理反应过程。脓毒血症的明显特征就是患者体内的内毒素水平较正常人相比会激增，这种现象会进一步的影响到机体内的炎症细胞因子水平。炎症细胞因子在人体内存在水平的高低在一定程度上影响着脓毒血症的发展走向，决定患者的症状是否会进一步恶化。Th1/Th2细胞分泌的细胞因子TNF-α、IL-1α、IL-6和IL-8等内源性细胞调节因子是激活细胞因子级联反应的主要初级细胞因子，是细胞因子爆发的中心，因此如能有效的控制上述因子的产生，则有利于降低脓毒症的病死率。
外周血单个核细胞（Peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）作为外周血液系统里所有细胞中只含有单一细胞核的一类细胞，囊括了单核细胞以及淋巴细胞。具体来说包括淋巴细胞（T、B、NK）、单核细胞和树突状细胞。CD4+T细胞（约占PBMC的25-60%）和CD8+T细胞（约占PBMC的5-30%）共同构成CD3+T细胞。以上的两种构成细胞可以再细分为初始T细胞（幼稚T细胞）、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞和效应T细胞。CD4+T细胞学名为辅助性T细胞，它的不同的功能亚群的区分是参考细胞因子表达的不同来确立的，主要有调节性T细胞、Th1、Th2、Th17、Th9、Tr1等亚群，这些细胞在不同生理或病理释放炎症因子是炎症因子的主要来源，因此控制PBMC细胞的数量能有效控制炎症因子的产生以缓解炎症的爆发。
黄芪多糖（Astragalus polysaccharide，APS)是豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根经提取、浓缩、纯化而成的水溶性杂多糖，分子式为：C10H7ClN2O2S，淡黄色，粉末细腻，均匀无杂质，具引湿性。黄芪多糖由己糖醛酸、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等组成，可作为免疫促进剂或调节剂，同时具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗应激、抗氧化等作用。自从APS的多种功效被逐渐发现后，针对APS的研究就越来越得到人们的广泛关注，一些研究成果也极大的推动了医疗领域的相关进展，比如其在调节人体免疫系统功能方面的重要作用：对于腹腔巨噬细胞、B淋巴细胞和NK细胞在机体内的活性有极大的提升效果；对于IL-2、TNF及INF这些免疫因子的分泌以及发挥作用起着不错的调控效果，通过对APS的进一步研究，发现其也可作为一种靶向PBMC上一些基团特异性靶向细胞。
血液灌流（HP）是一种以体外的灌流吸附装置为核心的技术，简而言之HP的所有工作组建均建立在体外，它的主要效用是利用恒流泵等装置将患者的血液送入外界的吸附装置中，在流经吸附装置后该设备会将血液中存在的一些有毒物质与代谢废物捕获并扣留，进而实现对于人体血液环境的一种净化与治疗。HP主要用于抢救药物和毒物中毒患者，同时对于感染性疾病、尿毒症等领域，均取得不错的进展。血液灌流技术的发展为一些疑难杂症的治疗提供了崭新的途径，其未来的发展令人期待。
中国专利CN108855003B公开了一种用于清除血液中炎性因子的免疫吸附剂及其制备方法，依据炎性因子如IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-8的抗原表位及与其相对应的受体之间的多种分子间作用力，通过计算机辅助药物设计方法，设计了具有选择性的5-18个氨基酸的小分子多肽的亲和配基，具体以乙酸乙烯酯-三烯丙基异氰脲酸酯为基本骨架，以乙酸乙酯和烷烃混合物为致孔剂，以过氧化苯甲酰为引发剂的合成树脂为载体，经过醇解活化后接枝小分子多肽，得到小分子配基免疫吸附剂，而不吸附大分子蛋白等。该免疫吸附剂为清除患者体内过量的致病性炎症因子提供了一种新的治疗方法。
CN108855003A公开了一种可穿戴的血液灌流装置，装置包括筒体，筒体包含吸附介质，吸附介质是在其表面上具有至少一种多糖吸附剂的高表面积的固体基质，所述多糖吸附剂具有针对毒素和/或病原体的结合亲和力或结合部位，以使得当流动的血液与所述吸附介质接触时，毒素和/或病原体结合至多糖吸附剂上的结合部位并且从血液分离出。所述的多糖吸附剂为肝素、硫酸乙酰肝素、透明质酸、唾液酸、含甘露糖序列的糖类、壳聚糖、和其组合。
综上一种血液灌流用的外周血单个核细胞吸附剂的开发是极其有必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的血液灌流用抗炎吸附剂及其制备方法与应用，可以解决现有技术存在的问题。本发明所提供的血液灌流用的抗炎吸附剂对PBMC具有较强的特异性吸附性，能够特异性吸附PBMC，极大的提高PBMC的捕获效率以及特异性捕获的精确度，使PBMC的分离更加简单易行。
本发明提供的一种新的血液灌流用抗炎吸附剂包括作为吸附剂载体的高分子和与PBMC特异性结合的APS配基，APS配基利用化学键偶联固定在所述吸附剂载体表面。
高分子为聚乙烯醇-三烯丙基异氰脲酸酯共聚物微球、聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、球形纤维素、琼脂糖、葡聚糖或壳聚糖。
所述的APS与高分子载体是通过共价键直接相连或通过连接臂连接，结合效率为61.9%。
所述的吸附剂的形状为球状，粒径为100-1500μm。优选700-1300μm，比表面积为5.7967 m2/g；孔容0.000294cm³/g 、平均孔径4.2653 nm。
本发明提供的上述血液灌流用的抗炎吸附剂的制备方法包括的步骤：
1）按计量的将单体乙酸乙烯酯，交联剂三烯丙基异氰脲酸酯，致孔剂偶氮二异丁腈,搅拌混合均匀。
2）在上述溶液中加入聚乙烯醇，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，次甲基蓝溶液和羟基磷灰石混合水溶液。将混合液充分搅拌，升温至60-65℃，反应2-4小时。后升温70-75℃，并在此温度下再保持3-4小时以完成聚合。
3）过滤所得的聚乙酸乙烯酯-三烯丙基异氰脲酸酯共聚物微球，用蒸馏水洗涤后再用丙酮萃取，最后在40-45℃真空干燥，即得聚乙烯醇-三烯丙基异氰脲酸酯共聚物小球。
4）将上述聚合物小球加入到氢氧化钠的甲醇溶液中进行酯交换，反应40-48小时后用甲醇充分洗涤，抽滤除去甲醇，即得到表面具有大量羟基的聚乙烯醇-三烯丙基异氰脲酸酯共聚物小球。
5）在APS的DMSO溶液中加入CDI（N,N'-羰基二咪唑 ，1,1'-Carbonyldiimidazole），再加入乙二胺，并在室温下剧烈搅拌2-3h，反应液用透析袋（截留分子量8000）在去离子水中室温搅拌透析，然后使用真空冻干机将透析袋内液体冻干（-50℃），获得阳离子化的APS。
6）将步骤4）聚合物小球和步骤5）的阳离子化APS于加入无水DMSO中，离心0.5-1h，再加入3％（wt）的氢氧化钠溶液，继续震荡15-20h。
7）将反应完成的微球分别用DMSO和去离子水清洗干净,即得吸附剂。
本发明提供了一种新的血液灌流用抗炎吸附剂在清除PBMC中的应用，和/或抗炎及PBMC增多所引起的疾病中的应用。应用还包括在分离提取PBMC中的应用；和/或，PBMC检测中的应用。
本发明提供了一种血液灌流用抗炎吸附剂及其制备和应用具有以下突出的特点：
1）血液灌流用抗炎吸附剂由作为吸附剂载体的高分子和利用化学键偶联固定在载体表面上的可与外周血单个核细胞特异性结合的配体—黄芪多糖（APS）共同构成。
2）构建出了PBMC细胞捕获系统，针对构建出的抗炎吸附剂进行了静态吸附实验、吸附条件的筛选、吸附效率的测定等检测，确定了在实际血液灌流情况下的各项灌流条件，并在该条件基础上测定了该吸附体系在体外模拟血液灌流条件下的对PBMC特异性吸附情况。
3）本发明抗炎吸附剂作为填充物的吸附柱在进行血液灌流实验应用中，构建的吸附剂对PBMC细胞具有较高的吸附效率（高于68%）、吸附特异性（高于65%）和PBMC细胞的回收效率（高于60%），对于未来利用自体PBMC细胞进行一些疾病的治疗十分关键。该系统对PBMC吸附效果好，可有效降低炎症因子的产生，缓解炎症发展，同时具有安全性高，成本低等优点，对于尿毒症、脓毒血症等炎性疾病的治疗有广阔的应用前景。
4）本发明抗炎吸附剂也可用于PBMC的分离检测。
5）吸附剂的理化性质及生物相容性检测表明，吸附剂的机械强度较高，血液相容性良好，对溶血活性和血液成分的影响很小。
附图说明
图1为采用扫描电子显微镜（SEM）对制备的高分子载体和吸附剂进行检测的SEM图像。
图2为高分子载体和吸附剂的元素分析结果。
图3为高分子载体和吸附剂的细胞毒性实验测试结果。
图4为静态吸附实验中吸附剂对PBMC的吸附实验结果。
图5为吸附剂对PBMC的特异性吸附实验结果。
图6为采用扫描电子显微镜对制备的高分子载体和吸附剂在灌流实验后的表征测试结果图。
图7为灌流实验中吸附剂对PBMC的吸附实验结果。
图8为灌流实验中吸附剂对PBMC的特异性吸附实验结果。
具体实施方式
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。本领域的技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助支持本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的材料、试剂与设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
本发明血液灌流用的PBMC细胞吸附剂的制备方法包括以下步骤：
将67.6mL乙酸乙烯酯，27g三烯丙基异氰脲酸酯，2.28g偶氮二异丁腈,搅拌混合均匀。
在上述溶液中加入500mL的含2％（w/v）聚乙烯醇，1.5％（w/v）磷酸氢二钠，0.05％（w/v）磷酸二氢钠，15ml 0.1%的次甲基蓝溶液和2g羟基磷灰石混合水溶液。将混合液以适当的速度搅拌，升温至65℃，反应3小时。后升温75℃，并在此温度下再保持3小时以完成聚合。
过滤所得的聚乙酸乙烯酯-三烯丙基异氰脲酸酯共聚物微球，用蒸馏水洗涤后再用丙酮萃取，最后在45℃真空干燥，即得聚乙烯醇-三烯丙基异氰脲酸酯共聚物小球。
将上述聚合物小球加入到1.5L的3％（wt）氢氧化钠甲醇溶液中进行酯交换，反应48小时后用甲醇充分洗涤。抽滤除去甲醇，即得到表面具有大量羟基的聚乙烯醇-三烯丙基异氰脲酸酯共聚物小球。
实施例2
准确称取100mg的APS（上海源叶生物），溶解到10mlDMSO中。在上述DMSO溶液中加入300mg的CDI。
再在上述溶液中加入1ml乙二胺，并在室温下剧烈搅拌2h。后将反应液用透析袋（截留分子量为8000）在去离子水中室温搅拌透析，然后使用真空冻干机将透析袋内液体冻干，获得阳离子化的APS。
实施例3
准确称取1g聚合物小球和2mg阳离子化APS于10ml无水DMSO中，在50ml离心管中震荡混匀一小时后加入5ml 3mol/L的氢氧化钠溶液，继续震荡18h。
将反应完成的微球分别用DMSO和去离子水清洗,即得吸附剂。粒径为700-1300μm。
应用效果测试结果：
以实施例1-3中所获得的血液灌流用的吸附剂进行应用效果测试和评价：
图1为采用扫描电子显微镜（SEM）对制备的高分子载体和吸附剂进行检测，由图1中（a）可以清楚的观察到合成的高分子载体的表面形貌比较光滑平整，整个微球体形状规则近乎于完全的球体，没有机械损伤的痕迹。图1中（b）中显示的是上述制备的吸附剂，可以看到与高分子载体相比没有明显变化，整个球体外观圆润，无明显的机械损伤，不存在连接配基后微球破损的问题。这个现象也证明了配基与微球的连接方案是可行的。
图2为载体和吸附剂的元素分析结果，利用元素分析仪对载体和吸附剂进行元素分析。如图2所示C元素与H元素的含量没有明显的变化，而氮元素的含量由8.92%升高到了15.37%，由此可知阳离子化APS成功的与载体结合，其结合效率为61.9%，结合率较高。
图3为细胞毒性实验测试（MTT）结果，进行细胞毒性实验分别得出了载体、吸附剂以及对照组对MCF-7、Hela和PC-3三种肿瘤细胞的细胞毒性实验，实验结果可以看出，所有处理组的细胞活力都保持在85%以上，根据生物材料评价标准，可以认为我们合成的材料具有良好的生物相容性。
图4为吸附剂对PBMC的静态非特异性吸附的实验情况，具体操作为：分别取载体和吸附剂分成6组，每组每种微球各5g，置于细胞培养皿中。各取5ml含20万PBMC细胞（已预先使用CFSE染料染色）的PBS缓冲液分别加入培养皿中，将皿置于摇床中37℃、100rpm进行震荡吸附实验，在实验进行的过程中，每间隔半个小时取出放置不同种微球的两组培养皿，将微球完全洗涤取出后将皿中的液体完全转移至10ml离心管中，1000rpm，5min离心处理后细胞计数得出皿中剩余的PBMC细胞数，进而计算出该段时间内微球对于PBMC细胞的静态吸附效率，直至3h后结束实验。由图4可知随着吸附时间的增加，PVA-APS微球吸附PBMC的吸附率在上升，0.5-2.0h左右的吸附效率增长最快，在1h左右时吸附效率达到了40%左右，在2h后微球吸附PBMC的效率达到70%，之后不再增加，保持在这个数值左右直至3h的实验时间结束。而对照组在1h内对PBMC细胞的吸附效率为14.8%，在之后随时间推移没有明显变化。由此可知，载体对于PBMC细胞只存在少量的物理吸附作用，而吸附剂对于PBMC细胞的吸附效果较为明显。
图5为吸附剂对PBMC的静态特异性吸附的实验情况，具体操作为：分别取载体和吸附剂分成6组，每组每种微球各5g，置于细胞培养皿中。各取100万PBMC细胞（已预先使用CFSE染料染色）分别加入到5ml含有600万背景细胞（乳腺癌细胞MCF-7）的PBS溶液中，然后加入培养皿中，将皿置于摇床中37℃、100rpm进行震荡吸附实验。在实验进行的过程中，每间隔半个小时取出放置不同种微球的两组培养皿，将微球完全洗涤取出后将皿中的液体完全转移至10ml离心管中，1000rpm，5min离心处理后细胞计数得出皿中剩余的PBMC细胞数，进而计算出该段时间内微球对于PBMC细胞的静态吸附效率，直至3h后结束实验。由图5可知随着吸附时间的增加，吸附剂吸附PBMC的吸附率在上升，0.5-2.0h左右的吸附效率增长最快，在1h左右时吸附效率达到了38%左右，在2h后微球吸附PBMC的效率达到70%，之后不再增加，保持在这个数值直至3h的实验时间结束。而对照组在1h内对PBMC细胞的吸附效率为6.4%，在之后随时间推移没有明显变化，直至实验结束其吸附效率为6.9%。由此可知，载体对于PBMC细胞只存在少量的物理吸附作用，而吸附剂对于PBMC细胞的特异性吸附效果较为明显，其他细胞的存在不影响微球对PBMC的吸附能力。
图6为采用扫描电子显微镜对制备的载体和吸附剂在灌流实验后的表征测试结果。如图6所示，从左至右a1-a4依次是不同放大倍数下的细胞黏附在吸附剂上的情况，b1-b4依次是不同放大倍数下的细胞黏附在载体上的情况。从图中可以清楚的观察到PBMC细胞聚集成细胞团黏附在吸附剂的表面，其表观黏附现象十分明显，黏附的部位分布的较为均一。能够直接证明吸附剂微球对于PBMC细胞的特异性吸附效果。对比未连接APS基团的载体微球，两者差异明显，载体微球上没有PBMC细胞黏附的情况出现，整个球体表面无异物，这也证实了吸附剂吸附PBMC细胞是由于APS与细胞的特异性结合造成的。
图7为吸附剂对PBMC细胞灌流实验后非特异性吸附实验结果，此实验具体操作为：将预先准备好的PBMC细胞样本分别加入到5mlPBS溶液、无血清培养基、完全培养基或血浆中，然后使用高分子载体和吸附剂分别填充的吸附柱进行血液灌流实验，灌流后离心重悬，然后用流式细胞仪进行计数，计算不同介质下的吸附效率。由图可看出四种灌流液体环境下吸附载体对细胞的吸附效率均在68%以上，在PBS缓冲液体系中的灌流效率更是达到了78.6%，对照组的PVA微球吸附效率则是稳定在18%以下。表明该吸附剂的非特异性吸附效率处于相对较好的水平。
图8为PBMC吸附剂对PBMC细胞灌流实验后特异性吸附实验结果，此实验具体操作为：将预先准备好的PBMC细胞样本分别加入到5ml含有600万背景细胞（乳腺癌细胞MCF-7）的PBS溶液、无血清培养基、完全培养基或血浆中，然后使用上述制备的PVA微球以及 PVA-APS微球分别填充的吸附柱进行血液灌流实验，灌流后离心重悬，然后用流式细胞仪进行计数，计算不同介质下的吸附效率。由图可知四种灌流液体环境下吸附剂微球对细胞的吸附效率均在65%以上，对照组的PVA微球吸附效率则是稳定在14%左右。表明该吸附剂的特异性吸附效率处于相对较好的水平。
最后应说明的是：以上实施例仅用于本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的技术人员依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或等同替换，这些并未脱离本发明的精神和范围的任何修改或等同替换，均在申请的保护范围之内。