阅读说明：本技术 效应因子RxLR129113表达的效应蛋白在促进植物生长方面的应用 (Application of effector protein expressed by effector factor RxLR129113 in promoting plant growth ) 是由 张修国 朱春原 李京 高克祥 李壮 于 2020-05-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及植物培育技术领域,具体公开了效应因子RxLR129113表达的效应蛋白在促进植物生长方面的应用。本发明通过对效应因子RxLR129113表达的效应蛋白的深入研究,将植物种子浸泡到含有效应蛋白的溶液中,欣喜地发现了其在促进植物种子萌发和幼芽生长方面具有显著的积极作用,并发现将含有效应蛋白的溶液加入至植物育苗基质中,能激发植物根系的生长与发育,进而促进幼苗的发育壮大。(The invention relates to the technical field of plant cultivation, and particularly discloses application of an effector protein expressed by an effector factor RxLR129113 in promoting plant growth. According to the invention, through deep research on effector protein expressed by an effector factor RxLR129113, plant seeds are soaked in the solution containing the effector protein, so that the obvious positive effect on promoting the germination of the plant seeds and the growth of sprouts is discovered at a happy place, and the growth and development of plant root systems can be stimulated by adding the solution containing the effector protein into a plant seedling raising substrate, thereby promoting the growth and development of seedlings.)

效应因子RxLR129113表达的效应蛋白在促进植物生长方面的 应用

技术领域

本发明涉及植物培育技术领域，具体地说，涉及效应因子RxLR129113表达的效应蛋白在促进植物生长方面的应用。

背景技术

人们长期依赖化学肥料来促进植物生长、提高产量的同时也带来了一些问题。如：(1)引起水中氮、磷含量的增加，使河川、湖泊、内海富营养化，导致藻类过度繁殖，水质恶化，鱼类及其他水生生物大量死亡；(2)长期过量而单纯施用化学肥料，会使土壤酸化。土壤溶液中和土壤微团上有机、无机复合体的铵离子量增加，土壤结构破坏，土壤板结，并直接影响农业生产成本和作物的产量；(3)使食品、饲料和饮用水中有毒成分增加，使用化肥地区的井水及河水中氮化合物含量增加，甚至超过饮用水标准；(4)土壤微生物区系遭到破坏。过量施用化肥，尤其是氮肥对微生物具有杀伤作用和抑制作用，长期施用，大量的微生物死亡，土壤微生物区系发生变化，许多有益微生物从优势种群变为次要种群，作物易发生各类病害。

根系作为植物的一个重要的吸收、合成、固定和支持器官，在作物的生长发育过程中起着重要的作用，健壮的根系能够为植物生长提供充足的养分和水分，是植物高产的基础。目前，国际上己将根系研究作为进一步提高农作物生产力的一个极具潜力的基础性科研课题。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的之一是提供效应因子RxLR129113表达的效应蛋白在促进植物生长发育方面的新用途。

本发明的目的之二是提供一种促进植物种子萌发或幼芽生长，以及促进植物根系生长或幼苗发育的方法。

需要说明的是，本发明中所述的效应因子RxLR129113已在公开号为CN110878315A(公开日为2020年03月13日)的中国专利申请文本被记载，本发明不再对其核苷酸序列及所表达的效应蛋白的氨基酸序列做赘述。

本发明所提供的技术方案具体如下：

第一方面，本发明提供效应因子RxLR129113表达的效应蛋白在促进植物生长方面的应用。

所述应用为以下任一方面的应用：

(1)促进植物种子萌发；

(2)促进植物幼芽生长；

(3)促进植物根系生长；

(4)促进植物幼苗发育。

更为具体地，通过利用含有所述效应蛋白的溶液浸泡植物种子，促进种子萌发及幼芽生长；或通过将含有所述效应蛋白的溶液施加到植物育苗基质中，促进植物根系生长及幼苗发育。

可选地，本发明所述的植物为双子叶植物，优选为堇菜目的植物，进一步优选为葫芦科(Cucurbitaceae)植物，更进一步优选为黄瓜属(Cucumis)植物。

本发明通过试验发现了效应因子RxLR129113表达的效应蛋白在促进黄瓜(Cucumis sativus)种子萌发、幼芽生长、根系生长、幼苗发育等方面具有显著的积极效果。进而推知，与黄瓜具有较近亲缘关系的黄瓜属植物，例如小马泡(Cucumis bisexualis)、野黄瓜(Cucumis hystrix Chakr)、甜瓜(Cucumis melo L.)，及其变种例如薄皮甜瓜(Cucumis melo L.var.chinensis Pangalo)等也可利用上述效应蛋白而得到生长发育方面的促进。

进一步地，所述效应蛋白可通过基因重组手段构建含有效应因子RxLR129113的基因工程菌，对所述效应因子进行诱导表达，获得所述效应蛋白。

第二方面，本发明提供一种促进植物种子萌发或幼芽生长的方法，利用含有效应因子RxLR129113表达的效应蛋白的溶液浸泡植物种子。

以及，一种促进植物根系生长或幼苗发育的方法，在育苗基质中加入效应因子RxLR129113表达的效应蛋白，并将植物幼苗置于基质中进行培育，促进其根系生长，使幼苗发育的更为健壮。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到

具体实施方式

。

本发明的有益效果在于：

本发明通过对效应因子RxLR129113表达的效应蛋白进行深入研究，将植物种子浸泡到含有效应蛋白的溶液中，欣喜地发现了其在促进植物种子萌发和幼芽生长方面所具有的积极作用，并发现含有效应蛋白的溶液加入到育苗基质中，能激发植物根系的生长，进而促进幼苗的发育壮大。

本发明是在在先发明的基础上，对效应因子RxLR129113的功能所进行的扩展研究。不仅拓宽了该效应因子的应用范围，还为植物培育技术提供了新的启发和解决方案。

附图说明

图1为本发明实施例1中的pET28a载体图谱；

图2为本发明实施例1中RxLR129113基因PCR扩增结果；其中，M：DNA Marker，1-4：RxLR129113基因的PCR扩增条带；

图3为本发明实施例1中RxLR129113试表达的SDS-PAGE胶分析；其中，M：Proteinmarker；1-2：IPTG诱导RxLR129113蛋白表达；

图4为本发明实施例1中RxLR129113蛋白溶液对黄瓜种子萌发的幼芽长势影响。

图5为本发明实施例1中添加RxLR129113蛋白溶液的育苗基质对2叶期黄瓜幼苗长势的影响。

图6为本发明实施例1中添加RxLR129113蛋白溶液的育苗基质对4～5叶期黄瓜幼苗长势的影响。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1.辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)效应分子RxLR129113基因克隆测序

1.1辣椒疫霉菌株强致病辣椒疫霉菌株SD33保存于山东农业大学蔬菜病虫生物学重点实验室保存。

1.2辣椒疫霉菌株SD33的RNA提取及反转录cDNA

实验室保存的强致病菌株SD33使用V8平板在28℃恒温培养箱进行培养。

1.2.1 RNA提取步骤如下：

1)磨样：使用液氮预冷的研钵研磨辣椒疫霉SD33菌丝至粉末状；

2)匀浆：取1g菌丝研磨粉末加10mL的Trizol，电动涡旋仪充分匀浆2min后，室温静置3-5min使其充***解；

3)4℃下转速12000rpm离心10min，吸上清弃沉淀；

4)200μL氯仿/mL Trizol加氯仿，震荡混匀(禁用涡旋震荡仪)后，25℃静置15min，4℃下转速13000rpm离心15min；

5)吸取上层水相至新离心管中，弃下层酚相，勿吸中间界面，酚相用来提取蛋白；

6)500μL异丙醇加入1mL Trizol进行颠倒，室温放置5-10min；

7)温度4℃、12000rpm转速离心10min，舍上清；

8)按1mL 5％Ethanol/mL Trizol比例加入无水乙醇，温和颠倒，温度4℃、转速8000rpm离心5min，尽量去除上清；

9)室温静置晾干或烘干5-10min，除去乙醇，RNA样品切勿过于干燥，否则溶解困难；

10)使用50μL H₂O、TE buffer或0.5％SDS溶解，溶剂经DEPC处理并高压灭菌121℃，30min；

11)使用紫外分光光度计测OD₆₀₀，A₂₆₀/A₂₈₀ 1.8～2.0，A₂₆₀/A₂₃₀1.8～2.2，说明污染可忽略，成功。

1.2.2 RNA反转录合成cDNA，说明书流程如下：

1)RNA反转录去RNase离心管配制PCR体系，配制体系见表1。

表1.RT-PCR反应体系

配好后吸打混匀，离心后放置于冰上。

2)50℃孵育15min后，85℃孵育2min，其产物立刻用于PCR反应，或在-20℃保存，半年内可继续使用；长期保存建议分装后放置于-80℃冰柜内存放，cDNA应避免反复冻融。

1.3RxLR129113基因PCR克隆引物设计

根据辣椒疫霉全基因组https://genome.jgi.doe.gov/portal/中RxLR129113基因序列(去信号肽序列)和重组载体pET28a两个酶切位点NcoI和XhoI设计一对特异引物：

上游引物RxLR129113F：

5’-CATGCCATGGTGGTGCCAGCAAAAGCCCAAT-3’；

下游引物RxLR129113R：

5’-CCGCTCGAGACCATTTCTCGCCGCCTTGT-3’。

为了后期RxLR129113蛋白纯化，确保pET28a载体C-端his标签正常翻译，去掉RxLR129113的终止密码子。该特异引物对由青岛擎科生物有限合成。

pET28a载体图谱如图1所示。

1.4PCR扩增目的基因RxLR129113

通过聚合酶链式反应从cDNA中扩增目的片段，PCR反应体系见表2。

表2.RxLR129113基因PCR扩增体系

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，扩增条带为1200bp左右，与目的基因条带大小基本一致。PCR扩增目的基因片段利用胶回收试剂盒(DNA回收试剂盒)回收，回收产物可在-20℃下短期保存备用。目的RxLR129113基因PCR扩增结果见图2。

2.重组载体构建

2.1目的基因和载体双酶切

将RxLR129113基因PCR扩增胶回收产物和载体pET28a分别用酶1(NcoI)和酶2(XhoI)进行双酶切，37℃水浴2～3h，双酶切反应体系见表3。将酶切之后的RxLR129113和载体pET-28a用胶回收试剂盒进行回收。

表3.RxLR129113和载体pET28a双酶切反应体系

2.2目的基因RxLR129113连接至载体pET-28a

将酶切的RxLR129113基因DNA片段与载体pET-28a回收后，用Solution I在16℃下连接3h，连接体系见表4。

表4.RxLR129113连接至载体pET-28a反应体系

2.3pET-28a重组载体转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态

1)取50μL DH5α感受态细胞冰浴融化，加入连接产物，轻轻混匀，冰浴30min；

2)42℃水浴热激90s，然后快速将离心管冰浴2min；

3)在超净台，每个离心管加入500μL无菌LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm振荡培养45～60min，确保宿主菌完全复苏；

4)在常温离心机8000rpm离心1min，弃掉部分上清，用移液器菌体重悬，混匀后涂布至LB琼脂培养基(含相应抗生素)，然后在37℃培养箱中倒置培养12h～16h。

2.4重组载体pET28a鉴定

待上述制备的感受态细胞在平板上长出菌斑后，在2mL离心管中加入1.2mL无菌LB液体培养基(含相应抗生素)，挑取已长出的单菌落置于含LB液体培养基离心管中，37℃振荡培养5～6h，作为菌液PCR模板，适时进行菌液PCR鉴定，菌液PCR反应体系见表5。

表5.重组载体pET28a菌液PCR反应体系

菌液PCR反应样品进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，有PCR扩增结果的视为阳性样品，取阳性样品菌液400μL送青岛擎科生物有限公司测序，测序结果用DNAman软件与基因组序列比对分析，取测序结果正确的菌液840μL，加入50％灭菌甘油160μL后，置于-20℃冰柜中保存，另取测序结果正确的菌液提取质粒，置于-20℃冰柜中保存待用，质粒提取参照CWBIO高纯度质粒小提试剂盒说明书进行。

3.RxLR129113重组蛋白表达

3.1RxLR129113重组蛋白的试表达

1)将测序正确的pET28a重组质粒转化至E.coli Rosetta(DE3)菌株中，常温离心机8000rpm离心1min，弃掉部分上清，用移液器菌体重悬，混匀后涂布至LB琼脂平板培养基(含相应抗生素)，然后在37℃培养箱中倒置培养12h～16h；

2)挑取单个菌班接种于盛有1.5mL的LB液体培养基(加Kan抗性)离心管中，于37℃下180rpm振荡培养6h；

3)取1mL振荡培养液接种于盛有1.5mL的LB液体培养基(加Kan抗性)培养至OD600＝0.6～0.8，并取1mL菌液，作为诱导前对照；

4)诱导菌液和对照菌液分别加入不同浓度的诱导剂(IPTG)，37℃180rpm诱导3h；

5)诱导后，各取1mL菌液，与对照同时12000rpm离心1min；弃上清，分别加入40μL 2×Binding Buffer重悬混匀，然后加入40μL2×Loading Buffer混匀；

6)取样品煮沸15min后，其中间隔5min振荡1次，共振荡2次，SDS-PAGE电泳上样前12000rpm离心1min；

7)取20μL样品进行SDS-PAGE电泳，观察目的蛋白表达情况，确定诱导剂(IPTG)适宜浓度为0.5mM；

8)取表达目的蛋白菌液840μL，加入50％灭菌甘油160μL混匀混合后，装至灭菌冻存管中，于-20℃冰柜中保存。

然后利用SDS-PAGE电泳技术检测目的蛋白表达情况，SDS-PAGE电泳结果表明，与对照相比，pET-28a-RxLR129113蛋白经适宜浓度诱导剂(IPTG)诱导处理后，诱导RxLR129113表达出分子量为50KDa条带的蛋白，其分子量大小与PcRxLR129113预测分子量大小一致，由此pET-28a-RxLR129113蛋白原核表达系统构建成功，结果见图3。

3.2 RxLR129113重组蛋白的大量表达

1)对已保存的表达量较高的菌株进行活化，按1:100比例接种至含50mg/mL Kan的1L LB液体培养基中37℃180rpm振荡培养3～4h，使其OD₆₀₀＝0.6～0.8；

2)提前确保摇床降温至16℃，加入终浓度为0.5mM的诱导剂(IPTG)，16℃条件下120rpm过夜诱导16～21h，确保OD值为(1.8～2.0)，诱导至16h开始使用紫外分光光度计监测OD值，每隔1h监测1次。

OD值：表示被检测蛋白吸收的光密度，1OD相当于大肠杆菌浓度≈10⁸～10⁹菌体/mL。

4.RxLR129113蛋白促进黄瓜种子萌发幼芽长势及幼苗根系长势

4.1RxLR129113蛋白促进黄瓜种子萌发幼芽长势

将黄瓜种子先用55℃温水浸种处理5～8min，用无菌水将诱导制备的RxLR129113蛋白(OD值为1.8～2.0)稀释2～3倍后，利用稀释的蛋白溶液浸泡黄瓜种子5min，同时使用LB液体培养基作对照处理(CK)，然后按照常规技术进行催芽处理。

处理后2天的黄瓜种子萌发幼芽生长对比见图4，经RxLR129113蛋白处理的30粒黄瓜种子萌发的幼芽长度平均长度为2.3cm，而对照处理的30粒黄瓜种子幼芽长度平均长度仅为1.6cm，前者较后者平均长度增加了0.7cm，可见RxLR129113蛋白溶液可明显的促进黄瓜种子萌发的幼芽生长。

4.2RxLR129113蛋白溶液促进黄瓜幼苗根系长势

利用无菌水将OD值为1.8～2.0的RxLR129113蛋白溶液稀释2～3倍，在育苗前，将蛋白稀释溶液混施于黄瓜育苗基质中，作为蛋白处理组，蛋白稀释溶液的使用量为蛋白稀释溶液:育苗基质＝100mL/100kg；将LB液体培养基以相同比例加入黄瓜育苗基质中，作为对照组(CK)。

将长势相同的黄瓜幼芽分别随机种植在上述添加有蛋白稀释溶液和LB液体培养基的黄瓜育苗基质中。

在黄瓜幼苗生长到2叶期和4～5叶期时，分别比较不同黄瓜育苗基质中幼苗的根系生长情况及幼苗状态，结果如图5和图6所示。

图5显示，经蛋白处理的黄瓜幼苗2叶期，幼根平均长度为3.6cm(统计15株幼苗根系)，而对照(LB培养基)处理的黄瓜幼苗2叶期，幼根平均长度为2.2cm(统计15株幼苗根系)，前者较后者幼根平均长度增长1.4cm。且事实上，蛋白处理组的幼苗在8-10天即发育至2叶期，而对照处理的幼苗在14天才发育至2叶期。

图6显示，经蛋白处理的黄瓜幼苗4～5叶期，幼根平均长度为6.5cm(统计15株幼苗根系)，而对照CK(LB培养基)处理的黄瓜幼苗4-5叶期，幼根平均长度为4.2cm(统计15株幼苗根系)，前者较后者幼根平均长度增长2.3cm。且事实上，蛋白处理组的幼苗在14-17天即发育至4叶期，而对照处理的幼苗在21-23天才发育至4叶期。

由此可见，RxLR129113蛋白可明显促进黄瓜幼苗的根系生长与幼苗发育。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。