阅读说明：本技术 一种腺苷一磷酸在促进动物采食和/或改善肉质中的应用 (Application of adenosine monophosphate in promoting animal feeding and/or improving meat quality ) 是由 谭成全 李佳颖 印遇龙 邓*** 邓铭 杨芸瑜 于 2020-08-11 设计创作，主要内容包括：本发明属于食品及饲料技术领域,具体涉及一种腺苷一磷酸在促进动物采食和/或改善肉质中的应用。本发明研究发现腺苷一磷酸可通过诱食缩短小鼠采食间隔时间,增加小鼠对可口食物的偏好性提高采食量,另一方面,腺苷一磷酸可显著增加小鼠下丘脑的促采食神经元AgRP蛋白水平,而对抑采食神经元POMC蛋白水平无明显影响,进而调控机体采食行为；同时通过试验发现腺苷一磷酸能够改善小鼠体成分和显著提高小鼠能量代谢,增加肌肉含量,降低脂肪含量,降低血清中的支链氨基酸含量,增加肌肉中风味氨基酸的含量,说明腺苷一磷酸能够增加机体肌肉含量改善肉品质。本发明为促进采食及改善肉质方面提供了一种新的方式。(The invention belongs to the technical field of food and feed, and particularly relates to application of adenosine monophosphate to promotion of animal feeding and/or improvement of meat quality. The research of the invention finds that adenosine monophosphate can shorten the interval time of mouse feeding by food calling and increase the preference of the mouse to delicious food to improve the feeding amount, on the other hand, adenosine monophosphate can obviously increase the level of the feeding promoting neuron AgRP protein of the hypothalamus of the mouse, but has no obvious influence on the level of the feeding inhibiting neuron POMC protein, thereby regulating and controlling the feeding behavior of the organism; meanwhile, experiments show that adenosine monophosphate can improve the body components of mice, remarkably improve the energy metabolism of the mice, increase the muscle content, reduce the fat content, reduce the branched chain amino acid content in serum and increase the content of flavor amino acid in muscles, and therefore the adenosine monophosphate can increase the muscle content of organisms and improve the meat quality. The invention provides a new way for promoting food intake and improving meat quality.)

一种腺苷一磷酸在促进动物采食和/或改善肉质中的应用

技术领域

本发明属于食品及饲料技术领域，具体涉及一种腺苷一磷酸在促进动物采食和/或改善肉质中的应用。

背景技术

采食是动物获取营养以供维持生命活动和促进生长发育的根本。在畜牧生产中，饲料、环境、管理及疾病等因素均会影响动物的采食量。下丘脑食欲调节神经元分泌的AgRP、POMC等神经元能够调控动物的采食行为。

广东、广西处于热带季雨林地区，高温高湿是其夏季最典型的天气气候特征，这严重降低了育肥后期生猪的采食量，影响生猪的生长发育。生猪出栏前长期食欲不佳不仅会降低上市体重，还有可能由于严重的高温应激出现PSE肉，降低猪肉品质，肉质嫩度降低，口感差，不被消费者接受甚至造成严重的经济损失。

猪肉中的天冬氨酸、谷氨酸等主要风味氨基酸，与肉的风味有直接的关系，其是形成鲜味物质的重要前提物质之一，决定着猪肉质风味，是保障猪肉品质的前提。

腺苷一磷酸(AMP)具有改善胰岛素抵抗和葡萄糖代谢受损等功效，然而关于腺苷一磷酸对调节哺乳动物采食及改善肉质方面的研究尚未见详细报道。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种腺苷一磷酸在促进动物采食和/或改善肉质中的应用，以达到增加机体采食量、改善肉质的目的。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种腺苷一磷酸在促进动物采食和/或改善肉质中的应用；

所述的腺苷一磷酸促进动物采食为增加动物累积采食量；

所述的腺苷一磷酸在缩短动物采食间隔时间、提高小鼠夜晚和全天采食量中的应用；

所述的腺苷一磷酸在增加动物能量代谢中的应用；

所述的腺苷一磷酸在促进下丘脑促食欲神经元AgRP蛋白表达的应用；

所述的腺苷一磷酸在改善动物体成分、增加肌肉含量和降低脂肪含量中的应用；

所述的腺苷一磷酸在降低动物血清支链氨基酸含量中的应用；

所述的腺苷一磷酸在增加动物肌肉中风味氨基酸含量、提高肉品质中的应用；

一种增加采食量和/或改善肉质的产品，包含腺苷一磷酸；

优选地，所述产品包括食品、药品、保健品等；

一种增加采食量和/或改善肉质的饲料，包含腺苷一磷酸，其中，每一千克饲料中腺苷一磷酸的添加量为1g；

发明人通过动物饲养试验，发现在鼠料中添加腺苷一磷酸能够显著提高小鼠的食欲，缩短小鼠的采食间隔时间，提高小鼠下丘脑促采食神经元AgRP的蛋白表达水平，从而提高小鼠的累积采食量。

发明人以4周龄C57BL/6J小鼠为研究对象，以剂量为0.1％的腺苷一磷酸鼠料供小鼠自由采食，以探究腺苷一磷酸对小鼠采食指标和氨基酸含量的影响。经试验表明：腺苷一磷酸能够缩短小鼠采食间隔时间，显著提高小鼠下丘脑促采食神经元AgRP的蛋白表达水平，而对抑采食神经元POMC蛋白表达量无明显影响。同时，腺苷一磷酸能够改善小鼠体成分，增加能量代谢，降低血清支链氨基酸含量，增加肌肉中风味氨基酸含量，进而增加小鼠肌肉含量和降低脂肪含量。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过试验发现，腺苷一磷酸能够显著提高机体食欲、改善机体肉质，提供了腺苷一磷酸的一种新应用，为增加机体采食量、改善肉质提供了一种新的方式，且腺苷一磷酸是生物体内重要的能源物质的前体之一，具有很好的推广应用前景。

附图说明

图1是腺苷一磷酸对小鼠采食量和体重的影响图；其中，AMP代表“腺苷一磷酸”，A：累积采食量(Cumulative feed intake)检测结果，B：体重(Body weight)检测结果。

图2是腺苷一磷酸对小鼠餐模式的影响图；其中，Day代表“白天”，Night代表“夜晚”，Total代表“全天”，A：每餐采食量(Meal size)检测结果，B：采食餐数(Number ofmeals)检测结果，C：采食量(Food intake)检测结果，D：采食持续时间(Mean mealduration)检测结果，E：采食间隔时间(Mean intermeal bout length)检测结果。

图3是腺苷一磷酸对小鼠能量代谢的影响图；其中，A：最低能量消耗(MinimumEE)，B：最高能量消耗(Maximum EE)，C：平均能量消耗(EE)，D：二氧化碳释放量(VCO2)，E：氧气消耗量(VO2)，F：呼吸熵(RQ)，其中CDEF右上角图分别为EE，VCO2，VO2和RQ昼夜节律折线图。

图4是腺苷一磷酸对小鼠下丘脑食欲相关蛋白表达量的影响图；其中，AgRP代表“刺鼠相关蛋白”，POMC代表“阿片-促黑素细胞皮质素原”，β-actin代表“肌动蛋白”，A：AgRP的免疫印迹，B：AgRP的表达统计，C：POMC的免疫印迹，D：POMC的表达统计。

图5是腺苷一磷酸及腺苷的代谢动力学曲线图；其中，Adenosine代表“腺苷”，A：灌胃后不同时间血清中AMP的含量，B：灌胃后不同时间血清中腺苷的含量。

图6是腺苷一磷酸对小鼠体成分的影响图；其中，Body mass代表“体成分含量”，lean mass代表“瘦肉含量”，fat mass代表“脂肪含量”。

图7是腺苷一磷酸对小鼠血清和肌肉中氨基酸含量的影响图；其中，Amino acids代表“氨基酸”，Serum代表“血清”，Tibialis anterior muscle代表“胫骨前肌”，A：血清中氨基酸的含量，B：胫骨前肌中氨基酸的含量。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1腺苷一磷酸对小鼠采食量的影响

1、0.1％腺苷一磷酸鼠料制备方法

(1)每1kg基础日粮(具体组成见表1，其中，碳水化合物含量＝58％，蛋白含量＝18％，脂肪含量＝4.5％)称量1g腺苷一磷酸；

表1小鼠基础日粮的组成及含量

(2)将腺苷一磷酸逐级加入粉料基础日粮中，逐级混匀，得到日粮粉料；

(3)在混匀后的日粮粉料中加入双蒸水，制成适宜大小的圆柱条，烘干备用，得到0.1％腺苷一磷酸鼠料。

2、小鼠分组和处理

将购自广东省医学实验动物中心的3周龄C57BL/6J雄鼠单笼饲养，自由采食和饮水；每天光照与黑暗各12小时，环境温度控制在22℃～24℃，湿度在55％～65％。预饲喂维持日粮(市购)1周后，根据体重随机分为两组，空白对照组饲喂普通日粮，试验组采食0.1％腺苷一磷酸鼠料(表2)。每3天更换饮水，每天测量其采食量，早上8:30称量并详细记录初始给料重和余料重(收集笼架上和掉落笼中的碎料共同称重)，使用差量法将初始给料重减去余料重，计算累积采食量，每周测量其体重，饲喂四周。

表2试验设置组别及处理方法

组别	处理
		空白对照组	普通日粮
试验组	普通日粮+0.1％腺苷一磷酸

3、组织采样

试验结束当天进行样品采集。试验采用眼球取血法进行，用1.5mL离心管收集血液，静置待血液凝固后，以4℃、3000rpm离心15分钟，收集血清，-20℃冰箱保存备用。采血完毕后颈椎脱臼处死小鼠，采集小鼠下丘脑和胫骨前肌放入离心管且投入装有液氮的容器中。采样结束后转移品至-80℃冰箱中，保存备用。

4、试验结果

试验结果如图1所示，从图1可以看出，在小鼠日粮中添加0.1％腺苷一磷酸后，显著提高了小鼠试验周期内的累积采食量，表明腺苷一磷酸具有明显的促进小鼠采食的作用。

实施例2腺苷一磷酸对小鼠餐模式的影响

1、0.1％腺苷一磷酸鼠料制备方法

同实施例1；

2、小鼠分组

同实施例1；

3、试验处理方法

小鼠按照上述分组饲喂三周后，每组随机选择小鼠放入Promethion小鼠代谢笼测定仪(Sable Systems International)中，自由饮水和采食，待适应24h后开始正式测定，测定指标包括：餐模式参数(包括采食量，每餐采食量，每餐采食持续时间，采食次数以及采食间隔时间。每餐定义为：摄食时间大于5s，每餐采食量需大于0.02g，采食间隔需大于5min)。

4、试验结果

试验结果如图2所示，在小鼠日粮中添加0.1％腺苷一磷酸后，有缩短小鼠夜晚采食间隔时间的趋势，有提高小鼠夜晚和全天采食量的趋势。

实施例3腺苷一磷酸对小鼠能量代谢的影响

1、0.1％腺苷一磷酸鼠料制备方法

同实施例1；

2、小鼠分组

同实施例1；

3、试验处理方法

小鼠按照上述分组饲喂三周后，每组随机选择小鼠放入Promethion小鼠代谢笼测定仪(Sable Systems International)中，自由饮水和采食，待适应24h后开始正式测定，测定指标包括：最低能量消耗、最高能量消耗、平均能量消耗、二氧化碳释放量、氧气消耗量、呼吸熵。

4、试验结果

试验结果如图3所示，从图中可以看出：在小鼠日粮中添加0.1％腺苷一磷酸后，0.1％腺苷一磷酸显著提高了小鼠的能量代谢，特别是最低能耗和白天、全天的平均能耗，结果表明腺苷一磷酸能够促进小鼠的能量代谢。

实施例4腺苷一磷酸对小鼠下丘脑食欲相关蛋白表达量的影响

1、试验方法

将实施例1中采集的小鼠下丘脑样品进行常规Western Blot试验，研究腺苷一磷酸对小鼠下丘脑食欲相关蛋白表达量的影响。

2、试验结果

如图4所示，从图中可以看出：在小鼠日粮中添加0.1％腺苷一磷酸后，能够显著提高小鼠下丘脑的AgRP蛋白表达量，对抑采食基因POMC蛋白表达量无显著影响，说明腺苷一磷酸能够提高小鼠的食欲。

实施例5腺苷一磷酸和腺苷的代谢动力学曲线

1、0.1％腺苷一磷酸悬浊液的制备方法

(1)每1mL PBS称量18mg腺苷一磷酸；

(2)将腺苷一磷酸倒入PBS中，在磁力搅拌器上搅拌30分钟。

2、试验方法

将小鼠单笼饲养，自由采食和饮水，每天光照与黑暗各12小时，环境温度控制在22℃～24℃，湿度在55％～65％。预饲喂维持日粮1周后，根据体重随机分为五组，均灌胃200μL的0.1％腺苷一磷酸悬浊液(配液浓度为18mg/mL)，分别在灌胃0、15、30、60、120min后，采用眼球取血法进行，用1.5mL离心管收集血液，静置待血液凝固后，以4℃3000rpm离心15分钟，收集血清，-20℃冰箱保存备用。采用液相色谱-质谱联用技术用于后续血中腺苷一磷酸和腺苷含量分析。

2、试验结果

如图5所示，从图中可以看出：灌胃0.1％腺苷一磷酸悬浊液(即灌胃0.1％是与日粮添加0.1％浓度一致)60min内血清中的腺苷一磷酸和腺苷含量逐渐达到最高，且随后随之下降，结果表明腺苷一磷酸能快速的吸收入血，并被其它组织代谢和利用。

实施例6腺苷一磷酸对小鼠体成分的影响

1、0.1％腺苷一磷酸鼠料制备方法

同实施例1；

2、小鼠分组和处理

同实施例1；

3、试验处理方法

小鼠按照空白对照组和试验组分组饲喂四周后，试验结束前采用QMR清醒小动物体成分分析仪测定小鼠的体成分(包括体脂和瘦肉含量)。

4、试验结果

如图6所示，从图6可以看出：在小鼠日粮中添加0.1％腺苷一磷酸后，显著降低了小鼠脂肪含量并提高了瘦肉含量，结果说明腺苷一磷酸具有降脂增肌的作用。

实施例7腺苷一磷酸对小鼠血清和肌肉中氨基酸含量的影响

1、试验方法

采用液相色谱-质谱联用技术检测实施例1采集的小鼠血清和胫骨前肌中的氨基酸含量。血清和胫骨前肌中AMP和氨基酸的测定方法参照(Shi Y,Tse S,Rago B,etal.Quantification of fumarate and investigation of endogenous and exogenousfumarate stability in rat plasma by LC-MS/MS.[J].Bioanalysis,2016,8(7):661-675.)，详细步骤如下：

①血样前处理：

(1)血清解冻后在涡旋仪上涡旋混匀2min；

(2)取100μL血清于1.5mL EP管中，加500μL甲醇/乙腈(1:1)，涡旋2min除去蛋白；

(3)在超声波清洗机中加入冰温度降至4℃，超声10min，14500rpm、4℃离心15min；

(4)重新准备一套1.5mL EP管，取上清400μL置于新EP管中，使用真空浓缩机70℃真空抽1.5h，常温下氮吹15～20min；

(5)吹干后，在EP管中加入200μL 50％(V/V)甲醇水复溶，涡旋2min，水浴超声10min，14500rpm、4℃离心15min；

(6)使用安装0.22μm的有机过滤器的1mL注射器，转移上清到带内衬管的进样瓶中(液体高度>1.0mL)；

(7)轻敲瓶底将内衬管底部的气泡敲出，随后盖上瓶盖，样品4℃保存，2天内上机。

②胫骨前肌前处理：

(1)在液氮中取组织样40mg(质量偏差小于10％)置于带磁珠的2mL离心管；

(2)在管中加入400μL超纯水，组织匀浆频率30次/秒，2min，重复三次；

(3)取200μL匀浆液置于新1.5mL EP管中，加入800μL MeOH甲醇/ACN乙腈(v:v，1:1)。

(4)涡旋30s，在超声波清洗机中加入冰温度降至4℃，超声10min；

(5)样品置于-20℃孵育1h，14500rpm、4℃离心15min；

(6)取上清1000μL，使用真空浓缩机真空抽1.5h，常温下氮吹15～20min；

(7)吹干后，在EP管中加入200μL 50％(V/V)甲醇水复溶，涡旋30s，水浴超声10min，14500rpm、4℃离心15min；

(8)使用安装0.22μm的有机过滤器的1mL注射器，转移上清到带内衬管的进样瓶中(液体高度>1.0mL)；

(9)轻敲瓶底将内衬管底部的气泡敲出，随后盖上瓶盖，样品4℃保存，2天内上机。

③标准曲线

精确称取1.000mg标品，使用50％(V/V)甲醇水溶解并定容至10mL，得到初始浓度为100μg/mL待测标准品溶液。随后使用50％(V/V)甲醇水稀释，得到7个浓度梯度，分别是100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、100pg/mL；每个浓度梯度取1mL，使用安装0.22μm的有机过滤器的1mL注射器，转移上清到无内衬管的进样瓶中(液体高度>1.0mL)，上机，得到待测标品的标准曲线。

④液相色谱和质谱条件

色谱分离柱为C18 Hypersil Gold(100mm×2.1mm,1.9μm)，流动相A：0.1％甲酸(FA)+超纯水；B：乙腈(AC)，流速设置为0.2mL/min，洗脱梯度为：0-7min，5％-50％B；7-8min，50％-75％B；8-9min，75-80％B；9-11min，80-90％B；11-15min，90％-95％B；15-20min，95％-5％B。进样量2μL。质谱条件：ESI离子源，采用正离子扫描模式；喷雾电压：4000(+)，3000(-)；雾化气为鞘气(N2>95％)，压力30bar；辅助气压力10bar；传输毛细管温度为320℃。采用全扫描(Full scan)模式，扫描质荷比范围为100-1000m/z，分辨率35000；数据依赖二级扫描(ddms2)，分辨率17500，高能碰撞诱导电压设为NCE模式(10,30,50)。

2、试验结果

如图7所示，在小鼠日粮中添加0.1％腺苷一磷酸后，显著降低了血清中支链氨基酸等的含量，显著提高了胫骨前肌中风味氨基酸Asp的含量，结果说明腺苷一磷酸具有增肌改善肉质的作用。

本发明研究发现腺苷一磷酸可通过诱食缩短小鼠采食间隔时间，增加小鼠对可口食物的偏好性提高采食量，另一方面，腺苷一磷酸可显著增加小鼠下丘脑的促采食神经元AgRP蛋白水平，而对抑采食神经元POMC蛋白水平无明显影响，进而调控机体采食行为；同时通过试验发现腺苷一磷酸能够改善小鼠体成分和显著提高小鼠能量代谢，增加肌肉含量，降低脂肪含量，降低血清中的支链氨基酸含量，增加肌肉中风味氨基酸的含量，说明腺苷一磷酸能够增加机体肌肉含量改善肉品质。本发明为促进采食及改善肉质方面提供了一种新的方式，且腺苷一磷酸是生物体内重要的能源物质的前体之一，具有很好的推广应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。