阅读说明：本技术 一种含多糖和鱼骨钙的休闲食品及其制备方法 (Leisure food containing polysaccharide and fishbone calcium and preparation method thereof ) 是由 朱蓓薇 董秀萍 宋爽 谢伊莎 秦磊 祁立波 温成荣 启航 姜鹏飞 刘玉欣 于 2020-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种含多糖和鱼骨钙的休闲食品及其制备方法,属于食品加工技术领域。本发明提供了一种休闲食品,此休闲食品中添加有岩藻多糖和/或海参多糖,由于岩藻多糖和/或海参多糖均能够显著抑制新冠病毒对细胞的感染,并且,岩藻多糖和/或海参多糖在休闲食品的加工过程中未经高温处理(真空冷冻干燥),活性不会受到影响,因此,此休闲食品也可预防和治疗新型冠状病毒感染。(The invention discloses a leisure food containing polysaccharide and fishbone calcium and a preparation method thereof, belonging to the technical field of food processing. The invention provides a leisure food, which is added with fucoidin and/or sea cucumber polysaccharide, wherein the fucoidin and/or the sea cucumber polysaccharide can obviously inhibit the infection of new coronavirus to cells, and the activity of the fucoidin and/or the sea cucumber polysaccharide is not influenced by high-temperature treatment (vacuum freeze drying) in the processing process of the leisure food, so that the leisure food can also prevent and treat the infection of the new coronavirus.)

一种含多糖和鱼骨钙的休闲食品及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种含多糖和鱼骨钙的休闲食品及其制备方法，属于食品加工技术领域。

背景技术

新型冠状病毒(2019-nCoV)，正式分类命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)，简称新冠病毒(novel coronavirus)。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。因此，急需研发可预防和治疗新型冠状病毒感染的产品。

水产品加工是我国渔业经济的主要来源，水产品加工过程中会产生大量鱼头、鱼骨等加工废弃物，其中，鱼骨含有大量的Ca、Fe、Zn、Mg、P及胶原成分极具营养价值，极具开发利用的价值。

随着经济的发展与人民生活水平的提高，人们对休闲食品的需求也日益旺盛。在传统休闲食品的基础上，添加生物活性物质和营养物质以赋予休闲食品一些益生功能和更丰富的营养，有利于满足消费者对休闲食品高品质、高营养的需求，具有广阔的市场前景。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种以鱼骨为原料的，可预防和治疗新型冠状病毒感染的休闲食品。

[技术方案]

为解决本发明的技术问题，本发明提供了一种制备含多糖和鱼骨钙的休闲食品的方法，所述方法为在制备休闲食品的过程中添加活性物质；所述活性物质为岩藻多糖和/或海参多糖。

在本发明的一种实施方式中，所述休闲食品为冻干休闲食品。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为取鱼骨，将鱼骨浸泡于酵母溶液中去腥后清洗干净，得到去腥鱼骨；将去腥鱼骨经蒸煮、微波处理、烘干、粉碎，得到鱼骨粉；将水果和/或蔬菜漂烫后进行研磨，得到果蔬泥；将鱼骨粉、果蔬泥、活性物质、糖和麦芽糊精混合，得到混合物；将混合物经成型、干燥，得到休闲食品。

在本发明的一种实施方式中，所述鱼骨为罗非鱼鱼骨、鲅鱼鱼骨、鮰鱼鱼骨和/或金枪鱼鱼骨。

在本发明的一种实施方式中，所述酵母溶液由活性干酵母粉与水混合而得。

在本发明的一种实施方式中，所述酵母溶液中，活性干酵母粉的浓度为5～25g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述酵母溶液与鱼骨的质量比为5～15:1。

在本发明的一种实施方式中，所述浸泡的时间为0.5～2.5h。

在本发明的一种实施方式中，所述蒸煮为高压蒸煮。

在本发明的一种实施方式中，所述高压蒸煮的压力为0.1～0.16MPa、温度为121～126℃、时间为25～50min。

在本发明的一种实施方式中，所述微波处理为使用微波炉进行微波处理。

在本发明的一种实施方式中，所述微波处理的功率为300～1300W、时间为30～200s。

在本发明的一种实施方式中，所述烘干为使用烘箱进行烘干。

在本发明的一种实施方式中，所述烘干的温度为80～90℃、时间为2～4h。

在本发明的一种实施方式中，所述粉碎为使用超微粉碎机进行超微粉碎。

在本发明的一种实施方式中，所述超微粉碎的时间为1～5h。

在本发明的一种实施方式中，所述鱼骨粉的粒径为不小于100目。

在本发明的一种实施方式中，所述水果为苹果和/或梨。

在本发明的一种实施方式中，所述蔬菜为胡萝卜、南瓜、紫薯、红薯、玉米和/或番茄。

在本发明的一种实施方式中，所述漂烫为将水果和/或蔬菜添加至烫漂液中，于85～98℃处理2～5min；所述烫漂液为异抗坏血酸钠溶液；所述异抗坏血酸钠溶液中，异抗坏血酸钠的质量占水果和/或蔬菜总质量的0.1～1％。

在本发明的一种实施方式中，所述研磨为用胶体磨进行研磨。

在本发明的一种实施方式中，所述果蔬泥的粒度为5μm。

在本发明的一种实施方式中，所述鱼骨粉、果蔬泥、活性物质、糖和麦芽糊精的质量比为0.25～0.5kg:1kg:4～1000mg:0.1～0.2kg:0.1～0.5kg。

在本发明的一种实施方式中，所述糖为蔗糖、果糖、乳糖和或木糖醇。

在本发明的一种实施方式中，所述成型为使用成型设备或成型模具进行成型。

在本发明的一种实施方式中，所述干燥为真空冷冻干燥。

本发明还提供了一种含多糖和鱼骨钙的休闲食品，所述休闲食品为使用上述方法制备而得。

在本发明的一种实施方式中，所述休闲食品为冻干休闲食品。

[有益效果]

(1)本发明提供了一种休闲食品，此休闲食品中添加有岩藻多糖和/或海参多糖，由于岩藻多糖和/或海参多糖均能够显著抑制新冠病毒对细胞的感染，并且，岩藻多糖和/或海参多糖在休闲食品的加工过程中未经高温处理(真空冷冻干燥)，活性不会受到影响，因此，此休闲食品也可预防和治疗新型冠状病毒感染。

(2)本发明提供了一种休闲食品，此休闲食品中添加有鱼骨废弃物制备而得的鱼骨粉，因此，此休闲食品富含鱼骨钙。

(3)本发明提供了一种休闲食品，此休闲食品使用了水产品加工产生的鱼骨废弃物，减少了资源浪费，提高了原料的利用价值。

(4)本发明提供了一种休闲食品，此休闲食品在制备过程中使用了高压蒸煮与微波联合的加工工艺对鱼骨进行熟化，大大提高了鱼骨的酥脆度与风味。

(5)本发明提供了一种休闲食品，此休闲食品在制备过程中使用了真空干燥工艺，有效避免了休闲食品中营养物质的流失。

附图说明

图1：不同浓度的泡叶藻岩藻多糖对新冠病毒的抑制作用，横坐标：泡叶藻岩藻多糖的浓度，纵坐标：感染细胞率(％)＝进入细胞的病毒数量/总病毒数量×100。

图2：将SARS-CoV-2病毒与不同浓度的岩藻多糖混合处理后的细胞免疫荧光图。岩藻多糖的浓度为500、250、125、62.5、31.3、15.6μg/mL。阴性对照为空白培养基。

图3：将SARS-CoV-2病毒与不同浓度的海参多糖的混合处理后的细胞免疫荧光图。海参多糖的终浓度为500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9μg/mL。阴性对照为空白培养基。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的酵母购自安琪酵母股份有限公司；下述实施例中涉及的蔗糖购自上海甘源实业有限公司；下述实施例中涉及的麦芽糊精购自山西莱克生物科技有限公司；下述实施例中涉及的异抗坏血酸钠购自河北润步生物科技有限公司；下述实施例中涉及的鱼骨购自大连市海鲜市场；下述实施例中涉及的苹果、胡萝卜、南瓜购自大连市乐购超市。

实施例1-1：制备泡叶藻(褐藻)岩藻多糖

泡叶藻岩藻多糖的制备方法如下：

S1、将泡叶藻(Ascophyllum nodosum)洗净、沥干、自然风干、粉碎并过80目筛，得泡叶藻粉A；

S2、将步骤S1所述泡叶藻粉A置于25℃无水乙醇中浸泡4h，纱布过滤取沉淀A，将所述沉淀A置于25℃无水乙醇中搅拌4h，纱布过滤取沉淀B，将所述沉淀B置于25℃无水乙醇中浸泡4h，纱布过滤取沉淀C室温晾干，从而除去脂类及脂溶性小分子，得泡叶藻粉B；其中，所述泡叶藻粉A、沉淀B和本步骤所述无水乙醇的重量体积比均为1:4g/mL；

S3、取步骤S2所述泡叶藻粉B，加入pH＝5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶，搅拌混匀，50℃水浴振荡酶解4h，使岩藻多糖解离，后加热至98℃，保持10分钟以钝化酶活，所得混合物于4500r/min室温离心15min，取上清液；其中，所述泡叶藻粉B和所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的重量体积比为1:30g/mL；所述泡叶藻粉B、纤维素酶(比酶活100units/mg)、果胶酶(比酶活50units/mg)和木瓜蛋白酶(比酶活2units/mg)的重量比为12500:42:6:6；

S4、向步骤S3所述上清液中边搅拌边加入过量的CaCl₂，于4500r/min室温离心15min，将褐藻胶沉淀除去，取上清液；使用的步骤S3的上清液和CaCl₂体积重量比是20:1mL/g；

S5、向步骤S4所述上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，使岩藻多糖沉淀，将所得混合物在4500r/min室温离心15min收集沉淀，将沉淀溶解于3mol/L CaCl₂溶液中，再加无水乙醇，4℃放置24h，使岩藻多糖沉淀，4500r/min、4℃离心15min，收集沉淀；使用的步骤S4的上清液和CTAB体积重量比是50:1mL/g；所述沉淀和所述3mol/L CaCl₂溶液的重量体积比是1:3g/mL；所述CaCl₂溶液和所述无水乙醇的体积比为2:3；

S6、将步骤S5所述沉淀用体积分数为80％的乙醇洗涤3次，再使用体积分数为95％乙醇洗沉淀3次，室温晾干，超纯水溶解，使用分子量3500Da的透析袋自来水流水透析24h，然后使用超纯水作为透析液透析48h，除去岩藻多糖中含有的氯化钙及其它盐离子，其中每2h换透析液，在真空度为1pa和温度为-60℃的条件下冻干72h，得到泡叶藻岩藻多糖(ANP)；所述沉淀和所述体积分数为80％的乙醇溶液的重量体积比是1:3g/mL；所述沉淀和所述体积分数为95％的乙醇溶液的重量体积比是1:3g/mL；所述沉淀和所述超纯水的重量体积比是1:150g/mL。

本实施例还可以包括溶液配制、超纯水的制备等前处理步骤。

实施例1-2：确定实施例1-1所制备的泡叶藻岩藻多糖的结构特性和组成

具体方法如下：

采用明胶比浊法进行泡叶藻岩藻多糖硫酸基含量的测定；

采用BCA法进行泡叶藻岩藻多糖蛋白含量的测定；

采用间羟基联苯法进行泡叶藻岩藻多糖糖醛酸含量的测定；

采用苯酚硫酸法进行泡叶藻岩藻多糖总糖含量的测定；

采用凝胶渗透色谱法进行泡叶藻岩藻多糖分子量的测定；

采用高效液相色谱+PMP衍生化法进行泡叶藻岩藻多糖单糖组成的测定；

采用傅里叶红外光谱法进行泡叶藻岩藻多糖官能团的测定。

结果表明，泡叶藻岩藻多糖的分子量为490kDa；糖醛酸含量为2.9～3.2％；蛋白含量为3.8～4.0％；硫酸基含量为28～30％；总糖含量为54％；所述褐藻岩藻多糖的单糖组成为：摩尔比为6.5:1.1:1的岩藻糖、甘露糖和半乳糖；官能团包括羟基、羧基和硫酸基等官能团。

实施例1-3：验证泡叶藻岩藻多糖阻止SARS-CoV-2病毒侵入机体细胞的用途

将编码HCoV-19刺突蛋白的基因的全长序列克隆到pCAGGS载体用于假病毒的生产，所得到的重组载体称为pCAGGS-HCoV-19-S。通过DNA测序确认pCAGGS-HCoV-19-S构建成功。将pCAGGS-HCoV-19-S和pNL4-3的质粒共转染到HEK 293T细胞，培养48h后，收集含有SARS-CoV-2假病毒模型的上清液，并通过感染Huh7细胞确定假病毒的50％组织细胞感染量(TCID₅₀)。

使用该SARS-CoV-2假病毒模型评价泡叶藻岩藻多糖的抗新型冠状病毒的作用，具体步骤如下：

(1)选择生长状态良好的Huh7细胞，胰酶消化后，96孔铺板，培养过夜，至18-24h时细胞达到80-100％；

(2)每孔100TCID₅₀假病毒，与含有泡叶藻岩藻多糖的无血清培养基混合，混合后泡叶藻岩藻多糖的终浓度为0.01mg/mL、0.1mg/mL和1mg/mL，37℃孵育30min。EK1肽作为阳性对照，空白无血清培养基作为阴性对照。

(3)以PBS洗涤Huh7细胞去除血清后，用3倍倍比稀释病毒与泡叶藻岩藻多糖的混合物感染Huh7细胞，每个孔100μL，每个样品设置三个平行孔，4-6h后，补加含有5％FBS血清的培养基100μL。

(4)48h测定Luciferase值。参考Promega公司Luciferase Assay SystemProtocol或Dual Luciferase Reporter Assay System Protocol。具体操作：倒扣96孔板，用PBS洗2遍，确保吸干PBS，然后加入30μL的裂解液，常温裂解30min，吸出10μL于白板上，底物50μL，测定luciferase值。

如下表1所示，泡叶藻岩藻多糖在浓度为0.01mg/mL、0.1mg/mL和1mg/mL时，都能够有效的抑制SARS-CoV-2病毒感染细胞。

表1不同浓度下的泡叶藻岩藻多糖对SARS-CoV-2病毒感染细胞的抑制作用

又进一步采用相同实验方法检测了多个浓度的泡叶藻岩藻多糖对新冠病毒的抑制作用，计算了IC50值。结果如图1所示，泡叶藻岩藻多糖抑制新冠病毒的IC50为0.327mg/mL。

而且，由于所使用的模型为仅具有S蛋白的SARS-CoV-2假病毒，可以推出泡叶藻岩藻多糖的作用靶点为S蛋白。

实施例1-4：购买的商品化岩藻多糖的组成分析与抗新冠病毒研究

参考中华人民共和国水产行业标准SC/T 3404-2012，测得青岛明月海藻集团有限公司的商品化岩藻多糖中硫酸基含量为28.5±0.1％，总糖含量为63.2±2.6％，岩藻糖含量为36.9±3.8％。

将SARS-CoV-2真病毒(来源于第二军医大学)和岩藻多糖用含有5％胎牛血清的DMEM培养基混匀，37℃放置1h，加入提前12h接种Vero E6细胞的96孔板(加入以前吸除原细胞培养液)，培养24h，然后用免疫荧光检测病毒蛋白，DAPI染色细胞核。采用免疫荧光显微镜观测了终浓度为500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8μg/mL的岩藻多糖对病毒的抑制作用，结果如图2所示，在浓度范围15.6～500μg/mL浓度范围内，岩藻多糖均能够显著抑制新冠病毒对细胞的感染。

实施例2-1：制备海参多糖的方法

具体方法如下：

将海参(刺参，Stichopusjaponicus)洗净、水煮、沥干、剪成小块，然后冻干。将冻干样品置于4℃丙酮中浸泡24h，室温下晾干。以1g冻干样品为例，加入30mL 0.1mol/L乙酸钠缓冲溶液(pH 6.0)、100mg木瓜蛋白酶(比酶活2units/mg)、48mg乙二胺四乙酸和18mg半胱氨酸，涡旋混合，于60℃水浴振荡酶解24h，将反应混合物离心(6000g，15min，室温)，取上清液。向上清液中加入1.6mL 10％氯化十六烷基吡啶溶液，室温下放置24h后，离心(8000g，15min，室温)取沉淀。将沉淀溶解于15mL 3mol/LNaCl-乙醇(100：15v/v))溶液中，再加入30mL 95％乙醇溶液，4℃放置24h，离心(8000g，15min，室温)取沉淀。将沉淀用10mL 80％乙醇洗2至3次后，再用10mL 95％乙醇洗2至3次，室温晾干，蒸馏水溶解，用透析袋(3500Da)进行除盐，冻干，得海参多糖。

本实施例还可以包括溶液配制、超纯水的制备等前处理步骤。

实施例2-2：确定实施例2-1所制备的海参多糖的结构特性和组成

具体方法如下：

采用¹H NMR进行海参多糖结构特性和纯度检测；

采用凝胶渗透色谱法进行海参多糖分子量检测；

采用明胶比浊法进行海参多糖硫酸根含量检测；

采用高效液相色谱+PMP衍生化法进行海参多糖单糖组成检测；

采用傅里叶红外进行海参多糖官能团检测。

结果表明，海参多糖含有岩藻聚糖硫酸酯和岩藻糖基化硫酸软骨素，岩藻聚糖硫酸酯分子量＞670kDa，岩藻糖基化硫酸软骨素的分子量＞179kDa；硫酸根含量为26-28％；岩藻糖、葡萄糖醛酸和氨基半乳糖的摩尔比为9:0.8:1。

实施例2-3：使用假病毒模型评价海参多糖的抗新型冠状病毒的作用

将编码HCoV-19刺突蛋白的基因的全长序列克隆到pCAGGS载体用于假病毒的生产，构建得到的重组载体称为pCAGGS-HCoV-19-S。通过DNA测序确认pCAGGS-HCoV-19-S构建成功。将pCAGGS-HCoV-19-S和pNL4-3质粒共转染到HEK 293T细胞，培养48h后，收集含有SARS-CoV-2假病毒的上清液，并通过感染Huh7细胞确定假病毒的50％组织细胞感染量(TCID₅₀)。

使用该SARS-CoV-2假病毒模型评价海参多糖的抗新型冠状病毒的作用，具体步骤如下：

(1)选择生长状态良好的Huh7细胞，胰酶消化后，96孔铺板，培养过夜，至18-24h时细胞达到80-100％；

(2)每孔100TCID₅₀假病毒，与含有海参多糖的无血清培养基混合，混合后海参多糖的终浓度为0.01mg/mL、0.1mg/mL和1mg/mL，于37℃孵育30min。EK1肽作为阳性对照，空白无血清培养基作为阴性对照。

(3)以PBS洗涤Huh7细胞去除血清后，用3倍倍比稀释病毒与海参多糖的混合物并感染Huh7细胞，每个孔100μL，每个样品设置三个平行孔，4-6h后，补加含有5％FBS血清的培养基100μL。

(4)48h测定Luciferase值。参考Promega公司LuciferaseAssay System Protocol或Dual Luciferase ReporterAssay System Protocol。具体操作：倒扣96孔板，用PBS洗2遍，确保吸干PBS，然后加入30μL的裂解液，常温裂解30min，吸出10μL于白板上，底物50μL，测定luciferase值，结果如下表2所示。

如下表2所示，海参多糖终浓度为0.1mg/mL和1mg/mL时，都能够有效的抑制SARS-CoV-2病毒进入细胞。而且由于所使用的模型为具有S蛋白的SARS-CoV-2假病毒，可以推出海参多糖的作用靶点为S蛋白。

表2不同浓度下的海参多糖对SARS-CoV-2病毒感染细胞的抑制作用

实施例2-4：海参多糖对duSARS-CoV-2真病毒的作用

SARS-CoV-2真病毒(来源于第二军医大学)和海参多糖用含有5％胎牛血清的DMEM培养基混匀，使海参多糖的终浓度为500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9μg/mL，37℃放置1h，加入提前12h接种Vero E6细胞的96孔板(加入以前吸除原细胞培养液)，培养24h，然后用免疫荧光检测病毒蛋白，DAPI染色细胞核。用免疫荧光显微镜观测了500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9μg/mL八个浓度梯度的海参多糖对病毒的抑制作用，结果如图3所示，在500～3.9μg/mL浓度范围内，海参多糖均能够显著抑制新冠病毒对细胞的感染。

实施例3-1：休闲食品的制备

包括如下步骤：

取鲅鱼鱼骨，去除鱼骨上的碎肉及血污后流水清洗3次，得到预处理后的鱼骨；将鱼骨浸泡于酵母溶液中去腥后用清水冲洗3次，得到去腥鱼骨；将去腥鱼骨先用高压锅进行高压蒸煮，然后用微波炉进行微波处理，再用烘箱进行烘干，接着用超微粉碎机进行粉碎，最后过100目筛，取筛下物，得到鱼骨粉；将苹果、胡萝卜和南瓜挑拣去除杂质，清洗干净，取可食用部分漂烫后用胶体磨研磨至粒度为5μm，得到果蔬泥；将鱼骨粉、果蔬泥、活性物质、蔗糖和麦芽糊精混合，得到混合物；将混合物先用成型设备或成型模具进行成型，然后进行真空冷冻干燥，得到休闲食品；

其中，所述酵母溶液由活性干酵母粉与水混合而得；所述酵母溶液中，活性干酵母粉的浓度为15g/L；所述酵母溶液与鱼骨的质量比为10:1；所述浸泡的时间为2h；所述高压蒸煮的压力为0.15MPa、温度为126℃、时间为35min；所述微波处理的功率为462W、时间为60s；所述烘干的温度为85℃、时间为2h；所述超微粉碎的时间为3h；所述漂烫为将可食用部分添加至烫漂液中，于90℃处理4min；所述烫漂液为异抗坏血酸钠溶液；所述异抗坏血酸钠溶液中，异抗坏血酸钠的质量占可食用部分总质量的0.5％；所述鱼骨粉、果蔬泥、活性物质、蔗糖和麦芽糊精的质量比为0.3kg:1kg:300mg:0.15kg:0.2kg；所述活性物质为岩藻多糖和/或海参多糖(岩藻多糖购自青岛明月海藻集团有限公司，海参多糖的制备方法见实施例2-1)。

此休闲食品中添加有岩藻多糖和/或海参多糖，由于岩藻多糖和/或海参多糖均能够显著抑制新冠病毒对细胞的感染，并且，岩藻多糖和/或海参多糖在休闲食品的加工过程中未经高温处理(真空冷冻干燥)，活性不会受到影响，因此，此休闲食品也可预防和治疗新型冠状病毒感染。

此休闲食品中添加有鱼骨废弃物制备而得的鱼骨粉，因此，此休闲食品富含鱼骨钙。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。