阅读说明：本技术 一种二噁英抗体及其制备方法与应用 (Dioxin antibody and preparation method and application thereof ) 是由 苏晓鸥 王培龙 刘建龙 吴文娟 张维 王瑞国 于 2020-06-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种二噁英抗体及其制备方法与应用。本发明基于免疫学原理,设计、合成小分子半抗原,与载体蛋白偶联,制备有效人工抗原,通过免疫动物制备针对二噁英类小分子化合物的高特异性和高亲和力抗体。利用抗原抗体的特异性免疫反应和易被检测识别的标记物的放大作用,定量的检测样本中痕量二噁英类小分子目标分析物,具有特异性好、灵敏度高、准确、快速、方便、廉价等特点。(The invention discloses a dioxin antibody and a preparation method and application thereof. Based on the immunological principle, the invention designs and synthesizes micromolecular hapten, couples with carrier protein to prepare effective artificial antigen, and prepares high specificity and high affinity antibody aiming at dioxin micromolecular compounds through immune animals. The specific immunoreaction of the antigen antibody and the amplification of the easily detected and identified marker are utilized to quantitatively detect trace dioxin small molecular target analytes in the sample, and the method has the characteristics of good specificity, high sensitivity, accuracy, rapidness, convenience, low price and the like.)

一种二噁英抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于快速检测领域，涉及一种二噁英抗体及其制备方法与应用。

背景技术

近年来，环境污染事件已经成为公众和政府关注的社会热点之一。在众多的环境污染物中，持久性有机污染物尤其受到人们的关注.其中二噁英是因其具有非常大的潜在毒性引起关注。实验证明它们可以损害多种器官和系统。二噁英一旦进入人体，就会长久驻留，因为其本身具有化学稳定性并易于被脂肪组织吸收，并从此长期积蓄在体内。它们在体内的半衰期估计为7至11年。在环境中，二噁英容易聚积在食物链中。且动物在食物链中的位置越高，二噁英聚积的程度就越高。

二噁英的化学名为：2,3,7,8-四氯二苯并对二噁英(TCDD)。其名称“二噁英”通常用来指结构和化学性质相关的多氯二苯二噁英(PCDDs)和多氯二苯并呋喃(PCDFs)。某些类二噁英多氯联苯(PCBs)具有相似毒性，归在“二噁英”名下。大约有419种类似二噁英的化合物被确定，但其中只有近30种被认为具有相当的毒性，以TCDD的毒性最大，是典型的持久性有机污染物，普遍存在于土壤、水、大气以及食品和饲料中。

大量的流行病学研究表明，在人体组织、母乳和血清中存在低浓度的二噁英类物质。现在，高分比气相色谱和高分辨质谱(HRGC-HRMS)是用来测定介质中的二噁英类物质的“金标准”，但是这种分析方法耗时、成本昂贵、需要专业技术人员在专业实验室进行，不利于大规模样品的筛查性分析。而免疫学检测方法操作简单、快速、灵敏，可同时检测多数样品，是理想的快速筛选手段。

为满足大批量环境、食品、卫生领域样品的分析，一些较为简便快速的方法有待开发，尤以快速生物检测研究发展较为活跃.由于酶联免疫方法中使用的抗体能对二噁英类污染物产生特异性识别，因此被用来作为二噁英类的筛查性分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种二噁英抗体及其制备方法与应用。鉴于土壤、水、大气以及食品和饲料中二噁英含量测试方法的缺陷，本发明依靠免疫学基本原理和检测分析技术手段，设计合成了小分子半抗原，并与载体蛋白偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物的特异性抗体，解决了传统利用HRGC-HRMS测定介质中的二噁英类物质的成本高、灵敏度低、效率低等问题。该方法能够快速检测二噁英类物质。

本发明要求保护式I所示半抗原化合物，

本发明提供的制备式I所示半抗原化合物的方法，包括：

1)将2-羟基-3,7,8-三氯二苯并-4-二噁英与有机溶剂混匀后，加入4-溴丁酸乙酯在温度为50℃～70℃的条件下反应6～12小时，得到反应混合物；

2)将步骤1)所得反应混合物与甲醇混匀，再加入固体氢氧化钠，在温度为55℃～65℃的条件下反应4～8小时而得。

上述方法的步骤1)中，所述2-羟基-3,7,8-三氯二苯并-4-二噁英与4-溴丁酸乙酯的投料物质的量比为1：1～4；具体为1:2；

所述有机溶剂为DMF；

所述2-羟基-3,7,8-三氯二苯并-4-二噁英与有机溶剂的用量比为20mg:1mL；

所述反应步骤中，温度为60℃；时间为8小时；

所述步骤2)中，所述反应混合物与甲醇的体积比为15-16:1；具体为15.5：1；

所述氢氧化钠与4-溴丁酸乙酯的投料物质的量比为1：5～8；具体为1:6.25；

所述反应步骤中，温度为60℃；时间为6小时。

所述方法还包括：在所述步骤2)反应完毕后，向所得反应液中加入25℃饱和碳酸氢钠水溶液溶解，萃取，弃去有机相，所得水相用0.5M盐酸调pH值至沉淀完全，水洗，蒸干；

具体的，所述萃取步骤中，萃取剂为乙酸乙酯。

另外，上述本发明提供的式I所示半抗原化合物在制备二噁英抗原中的应用及含有式I所示半抗原化合物的二噁英抗原，也属于本发明的保护范围。

具体的，所述式I所示式I所示半抗原化合物与载体蛋白偶联；

所述式I所示半抗原化合物与载体蛋白的投料物质的量比为1：30-90；具体为1:60；

所述载体蛋白具体为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白或卵清白蛋白。

另外，上述本发明提供的式I所示半抗原化合物或所述二噁英抗原在制备抗体中的应用；及由所述式I所示半抗原化合物或由所述二噁英抗原作为免疫原制得的抗体以及式I所示半抗原化合物或所述二噁英抗原或所述抗体在检测二噁英中的应用，也属于本发明的保护范围。

本发明还要求保护一种检测二噁英或二噁英类污染物的试剂盒或试纸条，其包括所述二噁英抗原和所述抗体。

本发明还要求保护一种检测二噁英或二噁英类污染物的方法，包括：用所述二噁英抗原或所述抗体进行检测；或者，用所述检测二噁英或二噁英类污染物的试剂盒或试纸条进行检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

(1)利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的标记物的放大作用，定量的检测样本中微量小分子目标分析物，具有特异性、灵敏度高、准确、快速、方便、廉价等特点。

(2)实验结果表明，用本发明的抗原免疫动物得到的抗血清的效价可达12.8×10⁴，最低检测限为3.1ng/L，半抑制浓度为13.6ng/L，产生的抗体的特异性高、灵敏度高、准确度高。

(3)本发明的抗原和抗体，可用于建立竞争酶联免疫吸附分析技术，从而用于快速检测样品中的二噁英的含量，较现有的色谱法比，具有成本低廉、操作简单、样品前处理简便、无污染、方便快捷的特点，适合于大规模检测，制备方法的产率高，抗原及抗体及方法具有广阔的应用前景。

(4)二噁英检测试剂盒或试纸条灵敏度高，比仪器法操作简便，人员要求低，可检测到Pg数量级。

(5)二噁英检测试剂盒或试纸条检测费用低，相对于HRGC-HRMS仪器检测法，实验成本大大降低。

(6)二噁英检测试剂盒或试纸条分析周期短，引入国内外先进的ASE样品前处理技术，大大缩短了反应时间。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

本发明公开了一种二噁英抗体的制备方法，包括如下步骤：

1.制备式半抗原化合物I：

(1)将2-羟基-3,7,8-三氯二苯并-4-二噁英与DMF按(mg/ml))比例为20:1混合均匀，在400-500rpm磁力搅拌条件下逐滴加入4-溴丁酸乙酯，在温度为50℃～70℃的条件下反应6～12小时；此步骤是为了溶解化合物2-羟基-3,7,8-三氯二苯并-4-二噁英使其与4-溴丁酸乙酯充分反应；其中，温度优选为60℃，时间优选为8小时；所述2-羟基-3,7,8-三氯二苯并-4-二噁英与4-溴丁酸乙酯的投料物质的量比为1：1～4，优选比为1∶2。

(2)将步骤(1)中反应混合物与甲醇按体积比例为15.5：1混合均匀，加入固体氢氧化钠，在温度为55℃～65℃的条件下反应4～8小时；所述氢氧化钠与4-溴丁酸乙酯的投料物质的量比为1：5～8，优选为1：6.25。

(3)向步骤(2)混合物中加入5ml、25℃饱和的碳酸氢钠溶解，利用乙酸乙酯萃取，弃去有机相，其中，水相用0.5M盐酸调PH值至沉淀完全，蒸馏水洗净沉淀，蒸干沉淀，即得半抗原化合物I，并称重；

2.制备二噁英抗原化合物(免疫原)：

(4)将式I所示化合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺按投料物质的量比为1：1～2：1～2混合，在温度为20℃～30℃的条件下，避光反应12～18小时，得到溶解均匀的I溶液；此步骤是为了完全溶解化合物I，其中，温度优选为26℃，时间优选为16小时；所述步骤式I所示化合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的投料物质的量比为1：1～2：1～2，优选为1∶1.5∶1.5；

(5)取10mg/ml载体蛋白溶于0.13M碳酸氢钠水溶液；其中，载体蛋白可为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白或卵清白蛋白，最优选为牛血清白蛋白；

(6)将I溶液逐滴加入载体蛋白溶液中，4℃条件下静置反应16小时；然后装入透析袋，在pH7.4、0.01M的PBS缓冲液透析3天，每天换PBS缓冲液3次，得到的溶液即为免疫原，所述载体蛋白与化合物I的投料物质的量比为30～90:1，优选为60:1；

3.制备二噁英抗体：

(7)抗体的制备过程：选择6～8周20±2g雌性BALB/c健康小鼠作为免疫对象，每隔2～3周将免疫原注射到6～8周雌性BALB/c小鼠，免疫原乳化采取快速乳化法，在冰上约20min即完成，确保免疫原的稳定性和活性，免疫周期2～3个月，产生抗血清，免疫结束后，取出脾脏，研磨获得B细胞，然后与SP2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，筛选阳性孔，得到稳定分泌能与二噁类特异性结合的单克隆细胞株，将杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，备用，将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到二噁英抗体IgG，-20℃保存。

实施例1

一种二噁英抗体的制备方法，包括如下步骤：

1.制备式半抗原化合物I：

(1)将2-羟基-3,7,8-三氯二苯并-4-二噁英与DMF按(mg/ml))比例为20:1混合均匀，在400-500rpm磁力搅拌条件下逐滴加入4-溴丁酸乙酯，在温度为60℃的条件下反应8小时；所述2-羟基-3,7,8-三氯二苯并-4-二噁英与4-溴丁酸乙酯的投料物质的量比为1∶2。

(2)将步骤(1)中反应混合物与甲醇按体积比例为15.5：1混合均匀，加入固体氢氧化钠，在温度为60℃的条件下反应6小时；所述氢氧化钠与4-溴丁酸乙酯的投料物质的量比为1∶6.25。

(3)向步骤(2)混合物中加入5ml、25℃饱和的碳酸氢钠溶解，利用乙酸乙酯萃取，弃去有机相，其中，水相用0.5M盐酸调PH值至沉淀完全，蒸馏水洗净沉淀，蒸干沉淀，即得半抗原化合物I，并称重；

2.制备二噁英抗原化合物：

(4)将式I所示化合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺按投料物质的量比为1∶1.5∶1.5混合，在温度为26℃的条件下，避光反应16小时，得到溶解均匀的I溶液；此步骤是为了完全溶解化合物I；

(5)取10mg/ml牛血清白蛋白溶于0.13M碳酸氢钠水溶液；

(6)将I溶液逐滴加入载体蛋白溶液中，4℃条件下静置反应16小时；然后装入透析袋，在pH7.4、0.01M的PBS缓冲液透析3天，每天换PBS缓冲液3次，得到的溶液即为免疫原，所述牛血清白蛋白与化合物I的投料物质的量比为60:1；

3.制备二噁英抗体：

(7)抗体的制备过程：择6～8周雌性BALB/c小鼠作为免疫对象，每隔2～3周将免疫原注射到6～8周雌性BALB/c小鼠，免疫周期2～3个月，产生抗血清，免疫结束后，取出脾脏，研磨获得B细胞，然后与SP2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，筛选阳性孔，得到稳定分泌能与二噁类特异性结合的单克隆细胞株，将杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，备用，将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到二噁英抗体，-20℃保存。

实施例2

一种二噁英抗体的制备方法，包括如下步骤：

1.制备式半抗原化合物I：

(1)将2-羟基-3,7,8-三氯二苯并-4-二噁英与DMF按(mg/ml))比例为20:1混合均匀，在400-500rpm磁力搅拌条件下逐滴加入4-溴丁酸乙酯，在温度为50℃的条件下反应12小时；所述2-羟基-3,7,8-三氯二苯并-4-二噁英与4-溴丁酸乙酯的投料物质的量比为1：1；

(2)将步骤(1)中反应混合物与甲醇按体积比例为15.5：1混合均匀，加入固体氢氧化钠，在温度为65℃的条件下反应4小时；所述氢氧化钠与4-溴丁酸乙酯的投料物质的量比为1：5；

(3)向步骤(2)混合物中加入5ml、25℃饱和的碳酸氢钠溶解，利用乙酸乙酯萃取，弃去有机相，其中，水相用0.5M盐酸调PH值至沉淀完全，蒸馏水洗净沉淀，蒸干沉淀，即得半抗原化合物I，并称重；

2.制备二噁英抗原化合物：

(4)将式I所示化合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺按投料物质的量比为1：1：2混合，在温度为20℃的条件下，避光反应18小时，得到溶解均匀的I溶液；

(5)取10mg/ml牛血清白蛋白溶于0.13M碳酸氢钠水溶液；

(6)将I溶液逐滴加入载体蛋白溶液中，4℃条件下静置反应16小时；然后装入透析袋，在pH7.4、0.01M的PBS缓冲液透析3天，每天换PBS缓冲液3次，得到的溶液即为免疫原，所述载体蛋白与化合物I的投料物质的量比为30：1；

3.制备二噁英抗体：

(7)抗体的制备过程：择6～8周雌性BALB/c小鼠作为免疫对象，每隔2～3周将免疫原注射到6～8周雌性BALB/c小鼠，免疫周期2～3个月，产生抗血清，免疫结束后，取出脾脏，研磨获得B细胞，然后与SP2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，筛选阳性孔，得到稳定分泌能与二噁类特异性结合的单克隆细胞株，将杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，备用，将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到二噁英抗体，-20℃保存。

实施例3

一种二噁英抗体的制备方法，包括如下步骤：

1.制备式半抗原化合物I：

(1)将2-羟基-3,7,8-三氯二苯并-4-二噁英与DMF按(mg/ml))比例为20:1混合均匀，在400-500rpm磁力搅拌条件下逐滴加入4-溴丁酸乙酯，在温度为70℃的条件下反应6小时；此步骤是为了溶解化合物2-羟基-3,7,8-三氯二苯并-4-二噁英使其与4-溴丁酸乙酯充分反应；所述2-羟基-3,7,8-三氯二苯并-4-二噁英与4-溴丁酸乙酯的投料物质的量比为1：4；

(2)将步骤(1)中反应混合物与甲醇按体积比例为15.5：1混合均匀，加入固体氢氧化钠，在温度为55℃℃的条件下反应8小时；所述氢氧化钠与4-溴丁酸乙酯的投料物质的量比为1：8；

(3)向步骤(2)混合物中加入5ml、25℃饱和的碳酸氢钠溶解，利用乙酸乙酯萃取，弃去有机相，其中，水相用0.5M盐酸调PH值至沉淀完全，蒸馏水洗净沉淀，蒸干沉淀，即得半抗原化合物I，并称重；

2.制备二噁英抗原化合物：

(4)将式I所示化合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺按投料物质的量比为1：1～2：1～2混合，在温度为30℃的条件下，避光反应12小时，得到溶解均匀的I溶液；

(5)取10mg/ml卵清白蛋白溶于0.13M碳酸氢钠水溶液；

(6)将I溶液逐滴加入载体蛋白溶液中，4℃条件下静置反应16小时；然后装入透析袋，在pH7.4、0.01M的PBS缓冲液透析3天，每天换PBS缓冲液3次，得到的溶液即为免疫原，所述载体蛋白与化合物I的投料物质的量比为90:1；

3.制备二噁英抗体：

(7)抗体的制备过程：择6～8周雌性BALB/c小鼠作为免疫对象，每隔2～3周将免疫原注射到6～8周雌性BALB/c小鼠，免疫周期2～3个月，产生抗血清，免疫结束后，取出脾脏，研磨获得B细胞，然后与SP2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，筛选阳性孔，得到稳定分泌能与二噁类特异性结合的单克隆细胞株，将杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，备用，将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到二噁英抗体，-20℃保存。

实施例4

一种二噁英抗体的制备方法，包括如下步骤：

1.制备式半抗原化合物I：

(1)将2-羟基-3,7,8-三氯二苯并-4-二噁英与DMF按(mg/ml))比例为20:1混合均匀，在400-500rpm磁力搅拌条件下逐滴加入4-溴丁酸乙酯，在温度为70℃的条件下反应10小时；此步骤是为了溶解化合物2-羟基-3,7,8-三氯二苯并-4-二噁英使其与4-溴丁酸乙酯充分反应；所述2-羟基-3,7,8-三氯二苯并-4-二噁英与4-溴丁酸乙酯的投料物质的量比为1：2.5；

(2)将步骤(1)中反应混合物与甲醇按体积比例为15.5：1混合均匀，加入固体氢氧化钠，在温度为65℃的条件下反应6小时；

(3)向步骤(2)混合物中加入5ml、25℃饱和的碳酸氢钠溶解，利用乙酸乙酯萃取，弃去有机相，其中，水相用0.5M盐酸调PH值至沉淀完全，蒸馏水洗净沉淀，蒸干沉淀，即得半抗原化合物I，并称重；

2.制备二噁英抗原化合物：

(4)将式I所示化合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺按投料物质的量比为1：2：2混合，在温度为24℃的条件下，避光反应14小时，得到溶解均匀的I溶液；

(5)取10mg/ml人血清白蛋白溶于0.13M碳酸氢钠水溶液；

(6)将I溶液逐滴加入载体蛋白溶液中，4℃条件下静置反应16小时；然后装入透析袋，在pH7.4、0.01M的PBS缓冲液透析3天，每天换PBS缓冲液3次，得到的溶液即为免疫原，所述载体蛋白与化合物I的投料物质的量比为45:1，优选为60:1；

3.制备二噁英抗体：

(7)抗体的制备过程：择6～8周雌性BALB/c小鼠作为免疫对象，每隔2～3周将免疫原注射到6～8周雌性BALB/c小鼠，免疫周期2～3个月，产生抗血清，免疫结束后，取出脾脏，研磨获得B细胞，然后与SP2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，筛选阳性孔，得到稳定分泌能与二噁类特异性结合的单克隆细胞株，将杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，备用，将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到二噁英抗体，-20℃保存。

实施例5

一种二噁英抗体的制备方法，包括如下步骤：

1.制备式半抗原化合物I：

(1)将2-羟基-3,7,8-三氯二苯并-4-二噁英与DMF按(mg/ml))比例为20:1混合均匀，在400-500rpm磁力搅拌条件下逐滴加入4-溴丁酸乙酯，在温度为65℃的条件下反应9小时；所述2-羟基-3,7,8-三氯二苯并-4-二噁英与4-溴丁酸乙酯的投料物质的量比为1：3.3；

(2)将步骤(1)中反应混合物与甲醇按体积比例为15.5：1混合均匀，加入固体氢氧化钠，在温度为58的条件下反应6.5小时；所述氢氧化钠与4-溴丁酸乙酯的投料物质的量比为1：7；

(3)向步骤(2)混合物中加入5ml、25℃饱和的碳酸氢钠溶解，利用乙酸乙酯萃取，弃去有机相，其中，水相用0.5M盐酸调PH值至沉淀完全，蒸馏水洗净沉淀，蒸干沉淀，即得半抗原化合物I，并称重；

2.制备二噁英抗原化合物：

(4)将式I所示化合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺按投料物质的量比为1：1.5：2混合，在温度为30℃的条件下，避光反应16小时，得到溶解均匀的I溶液；

(5)取10mg/ml卵清白蛋白溶于0.13M碳酸氢钠水溶液；

(6)将I溶液逐滴加入载体蛋白溶液中，4℃条件下静置反应16小时；然后装入透析袋，在pH7.4、0.01M的PBS缓冲液透析3天，每天换PBS缓冲液3次，得到的溶液即为免疫原，所述载体蛋白与化合物I的投料物质的量比为75:1；

3.制备二噁英抗体：

(7)抗体的制备过程：择6～8周雌性BALB/c小鼠作为免疫对象，每隔2～3周将免疫原注射到6～8周雌性BALB/c小鼠，免疫周期2～3个月，产生抗血清，免疫结束后，取出脾脏，研磨获得B细胞，然后与SP2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，筛选阳性孔，得到稳定分泌能与二噁类特异性结合的单克隆细胞株，将杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，备用，将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到二噁英抗体，-20℃保存。

详细实施过程

(一)、免疫原和包被原的制备：

(1)半抗原制备

第一步：称取304mg2-羟基-3,7,8-三氯二苯并-4-二噁英溶于15.2mlDMF，在400-500rpm磁力搅拌条件下逐滴加入280ul4-溴丁酸乙酯，控制温度60℃的条件下反应8小时；

第二步：向反应混合物中加入1ml甲醇，加入500mg固体氢氧化钠，控制温度为60℃的条件下反应6小时；

第三步：反应混合物蒸除溶剂，加入25℃、5ml饱和碳酸氢钠溶解，用乙酸乙酯萃取，弃去有机相；水相用0.5M盐酸调PH值至沉淀完全，水洗沉淀，蒸干沉淀，即得半抗原，称重290mg，转化率74.3％。

(2)免疫原的制备

第一步：称取制备好的半抗原3.9mg，溶于0.2mlDMF,加入2.9mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.7mgN-羟基琥珀酰亚胺，混合均匀，26℃避光磁力搅拌反应16小时。

第二步：取10mg牛血清白蛋白(BSA)，溶于1ml0.13M碳酸氢钠水溶液；

第三步：将完全溶解的半抗原溶液逐滴加入BSA溶液中，4℃条件下静置反应16小时；然后装入透析袋，在pH7.4、0.01M的PBS缓冲液中进行透析3天，每天换液3次，得到的溶液即为免疫原。

(3)包被原的制备

用鸡卵白蛋白(OVA)代替BSA，其它同步骤(2)，得到包被原。

第一步：称取制备好的半抗原3.9mg，溶于0.2mlDMF,加入2.9mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.7mgN-羟基琥珀酰亚胺，混合均匀，26℃避光磁力搅拌反应16小时。

第二步：取10mg鸡卵白蛋白(OVA)，溶于1ml0.13M碳酸氢钠水溶液；

第三步：将完全溶解的半抗原溶液逐滴加入BSA溶液中，4℃条件下静置反应16小时；然后装入透析袋，在pH7.4、0.01M的PBS缓冲液中进行透析3天，每天换液3次，得到的溶液即为免疫原。

(二)、动物免疫过程

取(一)中制备的免疫原，用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液稀释，得到免疫原稀释液，用于单克隆抗体的制备。采用BALB/c作为免疫动物。

免疫过程如下(免疫剂量以蛋白量计)：

用二噁英免疫抗原分别免疫6～8周龄Balb/c雌鼠4只，编号1#、2#、3#、4#。首次免疫按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下多点注射免疫，初次免疫后，于第14、28、42天，按上述免疫剂量，以生理盐水溶解免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次。四免一周后断尾取血，采用间接ELISA和间接竞争ELISA法检测，测试方法及结果如下：

制备血清：取血后，室温静置2h，转4℃静置过夜，冷冻离心机9000r/min，离心10min，取上清，即为血清。取血清，用PBS缓冲液稀释，得到血清稀释液。

测试流程(稀释过程、反应步骤、时间)如下：

稀释过程：稀释倍数大可分步骤稀释(在稀释液中加入的被稀释体如超过5ul均要在稀释液中减去，不可忽略不计)。

测效价：

(1)包被原用PBS稀释成1ug/mL，进行包板，每孔100ul；

(2)2-8℃孵育过夜，封闭液封闭并进行清洗，

(3)取血清稀释液100ul加入到酶标板中，25℃孵育25min，

(4)倒掉孔中液体，清洗液洗板3次；

(5)加入100ul的羊抗鼠酶标二抗溶液，25℃孵育25min，

(6)倒掉孔中液体，清洗液洗板3次；

(7)加入100ul显色液，25℃孵育15min，

(8)取出加入100ul停止液，450nm测OD值，实验数据如表1所示：

表1、不同稀释倍数OD值

其中，OUT代表OD值测试超出测试范围。

测抑制：

(1)取50ulTCDD标准溶液200ppt，逐级稀释为100ppt、50ppt、25ppt、12.5ppt、6.25ppt、3.2ppt。加入酶标板中，再取稀释好的血清抗体50ul加入到酶标板中，25℃孵育25min，

(2)倒掉孔中液体，清洗液洗板3次；

(3)加入100ul的羊抗鼠酶标二抗溶液，25℃孵育25min，

(4)倒掉孔中液体，清洗液洗板3次；

(5)加入100ul显色液，25℃孵育15min，

(6)取出加入100ul停止液，450nm测OD值。所得结果如表2所示。

表2、不同标准点下OD值

3、单克隆抗体灵敏度的计算

3#Balb/c小鼠效价12.8×10⁴，IC50为13.6ppt(ng/L)最低，最低检测限3.1ppt(ng/L)，加强免：直接取免疫原稀释液100μg对3#Balb/c小鼠颈背部皮下多点注射追加免疫一次。参考市场试剂盒，细胞融合条件：效价6万以上，IC50为900ppt。

4.与现有二噁英ELISA试剂盒中抗体(CAPE二噁英ELISA试剂盒，货号：DF1-60)比对

表3、与市面抗体比对

本发明抗体	OD值	市面抗体	OD值
				200pg	0.365	——	——
100pg	0.437	100pg	0.200
				50pg	0.547	——	——
25pg	0.687	——	——
				12.5pg	0.850	32pg	0.467
6.25pg	0.968	10pg	0.769
				3.1pg	1.173	3.2pg	0.990
1.55pg	1.305	——	——
				0	1.668	0	1.159
IC50	14.4	IC50	20.3

与市面抗体比对，市面抗体灵敏度最大3.2pg(百分比约85％)，本抗体灵敏度最高至少1.55pg(百分比约78.8％)。

(三)、细胞融合

小鼠拉颈处死，75％酒精浸泡消毒体表，无菌取出脾脏，放入RPMI-1640基础培养液中，并小心剔除筋膜及脂肪，剪碎，置于不锈钢筛(100目)内，无菌研磨，使其释放出单个脾细胞，吸取含有脾细胞的液体置于50mL无菌离心管中，离心。

将骨髓瘤细胞和上述制备好的脾细胞以个数5∶1的比例加入同一根50mL的离心管中，加入37℃温浴的RPMI-1640不完全培养液20mL，混合均匀，离心(1500r/min，6min)，除上清液，用手指轻击离心管底部，使沉淀混匀如糊状。用移液管取37℃预热的PEG、1mL，滴入离心管，静置1min后，于37℃水浴中在2min内滴加RPMI-1640完全培养液10mL。1000r/min离心6min，弃去上清液，加75mL的HAT培养液，轻轻混匀，将混匀悬液分装于有饲养细胞的24孔板中，每孔0.5mL，于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中孵育。

(四)、杂交瘤细胞的培养和筛选

融合后6～9d，用HT培养液半量换液1次，在12～14d后根据增殖情况改用完全培养液。待细胞贴壁至占板孔1/3时，计杂交瘤细胞生长的孔数及细胞总数。取上清液，间接ELISA选择效价高和间接竞争ELISA选择抑制强的阳性杂交瘤细胞。

采用间接ELISA和间接竞争ELISA法进行阳性杂交瘤细胞筛选，显示阳性并出现竞争抑制反应的孔为产二恶英抗体的孔，并可用于进一步的亚克隆。

无菌条件下，洗脱阳性孔内的细胞，用弯头吸管将细胞转移至预先以饲养细胞铺板的96孔培养板中，每个原始孔克隆成8孔，待细胞贴壁长满1/2～1/3孔底后，取上清液，间接ELISA检测。取呈阳性强的亚克隆，如此反复2～5次，待所克隆的8个孔上清液中抗体阳性率为100％时，挑取单细胞克隆，检测为全阳性者转移至24孔细胞培养板或25mL细胞培养瓶扩大培养，建株并以分装、-20℃冻存。提前一周注射0.5mL降植烷至Balb/c小鼠腹腔。取冻存细胞株，复苏后，经大量培养繁殖，收集细胞，用不完全培养基洗涤二次后，再用10mL不完全培养基悬浮，计数。将细胞(每只小鼠1mL，含3.1×10⁷个细胞)腹腔注射小鼠腹部，5～7d后，待小鼠腹部明显膨大时用16号注射器无菌采集腹水。2000r/min离心10min，去除上层脂肪和下层纤维蛋白及细胞，收集中层，取部分ELISA法测定其效价，其余分装-70℃冻存备用。

(五)、单克隆抗体的制备与纯化

取腹水约3mL，加入2倍体积的0.06M、pH为4.5醋酸钠缓冲液。将正辛酸(33μg/mL)逐滴慢慢加入腹水样品中，边加边搅拌，加完后继续搅拌30min，4℃下10000r/min离心30min，去沉淀(白蛋白和其它非IgG蛋白)。取上清经0.45μm微孔膜过滤，与1/10体积10×PBS混合(10×PBS：80gNaCl、2gKCl、11.5gNa₂HPO₄、2gKH₂PO₄、0.59gEDTA、1L蒸馏水，pH7.4)，用1M的NaOH溶液调pH值到7.4。上清冷却到4℃，加硫酸铵(0.277g/mL，使最终饱和度为45％)。搅拌30min，4℃下10000r/min离心30min，弃上清液。用少量pH7.4的PBS溶液溶解沉淀，用50～100倍体积的pH7.4的PBS透析过夜，换液3次。透析后的溶液用PEG-6000适当浓缩，4℃下贮藏备用。

上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。