阅读说明：本技术 一种Setmelanotide的制备方法 (Preparation method of Setmelanotide ) 是由 董华建 郭德文 文永均 于 2020-07-06 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种制备Setmelanotide的方法,方法中采用氨基树脂为起始树脂,按Setmelanotide的氨基序列反相依次接入相应的保护氨基酸得到Setmelanotide肽树脂,Setmelanotide保护肽树脂经酸解后和再经氧化环化后获得Setmelanotide粗品,Setmelanotide粗品再经过纯化和冻干得到Setmelanotide纯品。本发明工艺操作简单,产品总收率高,适合规模化生产。(The invention provides a method for preparing Setmelonide, which comprises the steps of taking amino resin as starting resin, sequentially adding corresponding protective amino acids according to the reversed phase of an amino sequence of Setmelonide to obtain Setmelonide peptide resin, carrying out acidolysis and oxidative cyclization on the Setmelonide protective peptide resin to obtain a Setmelonide crude product, and purifying and freeze-drying the Setmelonide crude product to obtain a pure Setmelonide product. The method has the advantages of simple process operation and high total product yield, and is suitable for large-scale production.)

一种Setmelanotide的制备方法

技术领域

本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及一种Setmelanotide的制备方法。

背景技术

Setmelanotide是一个寡肽类黑素皮质素-4受体(MC4R)激动剂，研究结果表明，每日皮下注射一次setmelanotide可降低三名LEPR缺陷型肥胖症患者的过度饮食和体重。Setmelanotide的耐受性良好，没有严重的不良事件报告。

Setmelanotide具有以下的结构：

Ac-Arg-c(Cys-D-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys)-NH2

Setmelanotide的制备方法已有很少有报道，中国专利CN201080051643报道了液相片段缩合法，该方法复杂繁琐，不便于大规模生产，本发明提供一种高效的Setmelanotide制备方法，以满足医药用途。

发明内容

本发明提供了一种高效的制备方法，采用氨基树脂为起始树脂，制备工艺操作简单，产品收率高、纯度高。

本发明提供了一种Setmelanotide的制备方法，包括：采用氨基树脂为起始树脂，按Setmelanotide的氨基序列反相依次接入相应的保护氨基酸得到Setmelanotide肽树脂，Setmelanotide保护肽树脂经酸解和再经氧化环化反应后获得Setmelanotide粗品，Setmelanotide粗品再经过纯化和冻干得到Setmelanotide纯品。

上述Setmelanotide的制备方法中，所述的氨基树脂的取代值为0.3～1.5mmol/g树脂，优选的取代值为0.6～1.0mmol/g树脂。

进一步的，所述氨基树脂选自Rink Amide-MBHA树脂、Rink Amide-BHA树脂和RinkAmide树脂，优选Rink Amide-MBHA树脂。

上述Setmelanotide的制备方法中，所述的Fmoc-保护氨基酸的用量为起始树脂氨基总摩尔数的1.2～6倍；优选为2.5～4.0倍。

作为本发明优选的方案，所述固相偶联合成法为：前一步反应得到的保护氨基酸-树脂脱去Fmoc保护基后再与下一个保护氨基酸偶联反应。所述的偶联反应时间为60～300分钟，优选的为100～140分钟。

Setmelanotide肽树脂为：

Ac-Arg(Pbf)-Cys(R1)-D-Ala-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp(R2)-Cys(R1)-氨基树脂其中：R1为Trt，或为Acm

R2为Boc，或为H

优选的，Setmelanotide肽树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基，再经氧化环化后得到Setmelanotide粗品。

进一步优选的，所述Setmelanotide肽树脂酸解时采用的酸解剂为三氟醋酸(TFA)、1,2-乙二硫醇(EDT)和水的混合溶剂；其中，混合溶剂的体积配比为：TFA为80～95％，EDT为1～10％，余量为水。

更进一步优选的，混合溶剂的体积配比为：TFA为89～91％、EDT为4～6％，余量为水。最优的，混合溶剂的体积配比为：TFA为90％、EDT为5％，余量为水。

所述酸解剂用量为每克Setmelanotide肽树脂需要4～15mL酸解剂；优选的，每克利Setmelanotide肽树脂需要9～11mL酸解剂。使用酸解剂裂解的时间为室温条件下1～6小时，优选的为3～4小时。

进一步的，所述氧化环化，所用氧化剂氧化剂为碘、H₂O₂或DMSO，优选为碘。氧化剂采用滴定方式加入，到氧化终点时停止加入。

进一步的，Setmelanotide粗品经高效液相色谱纯化、冻干得到Setmelanotide纯品，具体方法为：

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，采用两种流动相系统交替纯化，第一种流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，第二种流动相系统为50mmol醋酸铵/水溶液-乙腈，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，用0.45μm滤膜滤过，得Setmelanotide纯化中间体浓缩液；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到Setmelanotide醋酸水溶液，冷冻干燥，得Setmelanotide纯品。

本发明工艺操作简单，产品总收率高，适合规模化生产。

具体实施方式

本发明公开了一种合成Setmelanotide的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明具体实施方式中，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见下表。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1 Setmelanotide肽树脂的合成

Setmelanotide肽树脂为：

Ac-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-D-Ala-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-氨基树脂

用Rink Amide-MBHA树脂为起始树脂，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与下表所示的保护氨基酸偶联，制得Setmelanotide肽树脂。

本实施例使用的保护氨基酸相对应的保护氨基酸如表下所示：

接肽顺序n＝	保护氨基酸
		1	Fmoc-Cys(Trt)
2	Fmoc-Trp(Boc)
		3	Fmoc-Arg(Pbf)
4	Fmoc-D-Phe
		5	Fmoc-His(Trt)
6	Fmoc-D-Ala
		7	Fmoc-Cys(Trt)
8	Fmoc-Arg(Pbf)
		9	Ac<sub>2</sub>O

1、接入第1个保护氨基酸

取0.03mol第1个保护氨基酸和0.03mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.03mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。

取0.01mol的Rink Amide-MBHA树脂(取代值约0.4mmol/g)，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的树脂。

将活化后的第1个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应120～300分钟，过滤洗涤，得含1个保护氨基酸的树脂。

2、接入第2～9个保护氨基酸

采用上述同样方法，依次接入上述对应的第2～9个保护氨基酸，得到Setmelanotide肽树脂。

实施例2 Setmelanotide肽树脂的合成

Setmelanotide肽树脂为：

Ac-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-D-Ala-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-Cys(Trt)-氨基树脂

肽树脂的制备方法同实施例1。

本实施例使用的保护氨基酸相对应的保护氨基酸如表下所示：

接肽顺序n＝	保护氨基酸
		1	Fmoc-Cys(Trt)
2	Fmoc-Trp
		3	Fmoc-Arg(Pbf)
4	Fmoc-D-Phe
		5	Fmoc-His(Trt)
6	Fmoc-D-Ala
		7	Fmoc-Cys(Trt)
8	Fmoc-Arg(Pbf)
		9	Ac<sub>2</sub>O

实施例3 Setmelanotide肽树脂的合成

Setmelanotide肽树脂为：

Ac-Arg(Pbf)-Cys(Acm)-D-Ala-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-Cys(Acm)-氨基树脂

肽树脂的制备方法同实施例1。

本实施例使用的保护氨基酸相对应的保护氨基酸如表下所示：

接肽顺序n＝	保护氨基酸
		1	Fmoc-Cys(Acm)
2	Fmoc-Trp
		3	Fmoc-Arg(Pbf)
4	Fmoc-D-Phe
		5	Fmoc-His(Trt)
6	Fmoc-D-Ala
		7	Fmoc-Cys(Acm)
8	Fmoc-Arg(Pbf)
		9	Ac<sub>2</sub>O

实施例4 Setmelanotide粗品的制备

取实施例1制得的利Setmelanotide肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝95︰5︰5的裂解试剂(裂解试剂10mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水***沉淀，再用无水***洗沉淀3次，35～45℃减压干燥，得类白色粉末。

所得类白色粉末用30％醋酸溶液溶解并制成约3mg/ml的溶液，搅拌下滴加碘/乙醇饱和溶液至完全环化，35～40℃减压浓缩，得Setmelanotide粗品浓缩液，粗品纯度为88.3％。

实施例5 Setmelanotide粗品的制备

取实施例2制得的利Setmelanotide肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝95︰5︰5的裂解试剂(裂解试剂10mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水***沉淀，再用无水***洗沉淀3次，35～45℃减压干燥，得类白色粉末。

所得类白色粉末用30％醋酸溶液溶解并制成约3mg/ml的溶液，搅拌下滴加碘/乙醇饱和溶液至完全环化，35～40℃减压浓缩，得Setmelanotide粗品浓缩液，粗品纯度为92.8％。

实施例6 Setmelanotide粗品的制备

取实施例3制得的利Setmelanotide肽树脂，加入体积比为TFA︰水︰EDT＝95︰5︰5的裂解试剂(裂解试剂10mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水***沉淀，再用无水***洗沉淀3次，35～45℃减压干燥，得类白色粉末。

所得类白色粉末用30％醋酸溶液溶解并制成约3mg/ml的溶液，于搅拌下滴加碘/乙醇饱和溶液至完全环化，35～40℃减压浓缩，得Setmelanotide粗品浓缩液，粗品纯度为90.7％。

实施例7 Setmelanotide粗品的纯化

取实施例4制得的Setmelanotide粗品浓缩液，用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，采用两种流动相系统交替纯化，第一种流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，第二种流动相系统为50mmol醋酸铵/水溶液-乙腈。77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，用0.45μm滤膜滤过，得Setmelanotide纯化中间体浓缩液；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到Setmelanotide醋酸水溶液，冷冻干燥，得Setmelanotide纯品6.1g，纯度为99.1％，最大单一杂质0.11％，总收率为54.6％，分子量为1117.8(100％M+H)。

实施例8 Setmelanotide粗品的纯化

取实施例5制得的Setmelanotide粗品浓缩液，用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，采用两种流动相系统交替纯化，第一种流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，第二种流动相系统为50mmol醋酸铵/水溶液-乙腈。77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，用0.45μm滤膜滤过，得Setmelanotide纯化中间体浓缩液；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到Setmelanotide醋酸水溶液，冷冻干燥，得Setmelanotide纯品5.6g，纯度为99.5％，最大单一杂质0.05％，总收率为50.1％，分子量为1117.4(100％M+H)。

实施例9 Setmelanotide粗品的纯化

取实施例6制得的Setmelanotide粗品浓缩液，用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，采用两种流动相系统交替纯化，第一种流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，第二种流动相系统为50mmol醋酸铵/水溶液-乙腈。77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，用0.45μm滤膜滤过，得Setmelanotide纯化中间体浓缩液；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到Setmelanotide醋酸水溶液，冷冻干燥，得Setmelanotide纯品5.8g，纯度为99.3％，最大单一杂质0.10％，总收率为51.9％，分子量为1117.6(100％M+H)。

上述实施例表明，本发明提供的方法所得产品纯度大于99.0％，产品总收率大于50％，具有广泛的实用价值和应用前景。