一种pt141合成方法
阅读说明：本技术 一种pt141合成方法 (PT141 synthesis method ) 是由 郑春旭 孔亚 顾维炜 黄保胜 周黎 王良友 于 2019-12-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种PT141合成方法,属于多肽合成技术领域。本发明的合成方法包括如下步骤(1)以Rink HMBA-AM Resin和Fmoc-Lys(Boc)-OH为原料,制备Fmoc-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin；(2)在步骤(1)制得的Fmoc-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin上通过Fmoc固相合成法依次偶联保护基氨基酸,得到线性PT141全保护肽树脂；(3)将步骤(2)制得的线性PT141全保护肽树脂用裂解液裂解脱除氨基酸保护基,对所得产物进行环化处理,使得肽链在2位的Asp处与7位Lys处成环；(4)对步骤(3)所得环化产物进行甲酯化脱除HMBA-Am Resin残基,而后将产物水解,经过纯化,冷冻干燥得PT141。本发明的方法相对其他固相方法收率更高,相对酶制剂方法成本较低,且易于操作,工艺较为简单。(The invention discloses a PT141 synthesis method, and belongs to the technical field of polypeptide synthesis. The synthesis method comprises the following steps of (1) preparing Fmoc-Lys (Boc) -HMBA-AM Resin by taking Rink HMBA-AM Resin and Fmoc-Lys (Boc) -OH as raw materials; (2) sequentially coupling protecting group amino acids on Fmoc-Lys (Boc) -HMBA-Am Resin prepared in the step (1) by an Fmoc solid-phase synthesis method to obtain linear PT141 fully-protected peptide Resin; (3) cracking the linear PT141 full-protection peptide resin prepared in the step (2) by using a cracking solution to remove an amino acid protecting group, and carrying out cyclization treatment on the obtained product to ensure that a peptide chain forms a ring at an Asp position at a 2-position and a Lys position at a 7-position; (4) and (4) performing methyl esterification on the cyclized product obtained in the step (3) to remove HMBA-Am Resin residues, hydrolyzing the product, purifying, and performing freeze drying to obtain PT 141. Compared with other solid phase methods, the method has the advantages of higher yield, lower cost compared with an enzyme preparation method, easy operation and simpler process.)
技术领域
本发明涉及一种PT141合成方法，属于多肽合成技术领域。
背景技术
PT141，即布雷默浪丹(Bremelanotide)，是一种alpha-黑素细胞刺激激素类似物。由美国Palatin公司开发作为一种治疗性功能障碍的环肽类药物。PT141为人工合成的氮端乙酰化环七肽化合物，肽序为
Ac-Nle-[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]-OH
其化学结构存在两处羧基，天冬氨酸侧链羧基和赖氨酸侧链氨基通过形成酰胺键成环，由于C端羧基的存在，直接液相环化产物不唯一，对合成工艺来说存在挑战。目前，合成PT141方法主要为固相合成法，以Fmoc-Asp(OAllyl)-OH和Fmoc-Lys(Alloc)-OH为原料进行合成，但是在合成过程中存在保护氨基酸和脱保护试剂昂贵以及采用HF裂解方式对设备要求较高，并且对环境污染也较严重的问题，同时产品收率也比较低。中国专利200710048824.6公开了一种采用Fmoc(芴甲氧羰基)保护的固相合成方法，收率为17％。中国专利200610086841.4公开的PT-141的固相合成方法，收率为40％以下。
中国专利201510667256.2公开了一种分别合成Ac-Nle-Asp(COOH)-otBu和Boc-His(Trt)-D-Phe-Arg(pbf)-TrP(Boc)-Lys(IVDde)-HMBA-P的方法，该方法需要合成大量片断Ac-Nle-Asp(COOH)-otBu，同时脱除Lys保护基时需要使用水合肼等危险化合物。
中国专利201710619602.9使用酶制剂进行环化，对于反应环境条件控制要求比较严格，且酶制剂较昂贵。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种PT141合成方法，本发明的方法相对其他固相方法收率更高，相对酶制剂方法成本较低，且易于操作，工艺较为简单。
本发明的第一个目的是提供一种PT141合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以Rink HMBA-Am Resin和Fmoc-Lys(Boc)-OH为原料，制备Fmoc-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin；
(2)在步骤(1)制得的Fmoc-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin上通过Fmoc固相合成法依次偶联保护基氨基酸，得到线性PT141全保护肽树脂；
(3)将步骤(2)制得的线性PT141全保护肽树脂用裂解液裂解脱除氨基酸保护基，对所得产物进行环化处理，使得肽链在2位的Asp处与7位Lys处成环；
(4)对步骤(3)所得环化产物进行甲酯化脱除HMBA-Am Resin残基，而后将产物水解，经过纯化，冷冻干燥得PT141。
进一步地，在步骤(2)中，脱Fmoc使用的试剂为15-25％的哌啶/DMF。
进一步地，在步骤(3)中，所述的裂解液包括85-95％三氟乙酸、4-6％苯甲硫醚、1-3％苯甲醚和2-4％1,2-乙二硫醇。
进一步地，所述的裂解液的添加量为6-10ml/g线性PT141全保护肽树脂，裂解时间为1-3h。
进一步地，在步骤(3)中，裂解后还包括采用DCM洗涤2-4遍，DMF洗涤5-7遍的步骤。
进一步地，在步骤(3)中，环化过程是在载体树脂上进行的，采用的缩合剂为HOBt、PyBoP或DIEA。
进一步地，在步骤(4)中，甲酯化所用的试剂为DIEA、MeOH和DMF按照1：1-3：4-6体积比配制而成。
进一步地，在步骤(4)中，水解是采用30-200mg/L的NaOH将溶液调节至碱性进行水解反应去除甲酯。
进一步地，在步骤(4)中，所述的纯化是采用高效液相色谱进行纯化，条件为：纯化：流动相：A相：0.5-1.5‰TFA；B相：乙腈；转盐：流动相：A相：1)40-60mmol/L的NH4Ac水溶液，2)0.3-0.5‰醋酸；B相：乙腈。
本发明的有益效果是：肽序直接偶联完成避免了片段合成，采用常规氨基酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Lys(Boc)-OH为原料替代Fmoc-Asp(OAllyl)-OH和Fmoc-Lys(Alloc)-OH或Fmoc-Lys(IVDde)-OH等昂贵的原料，避免了氢化工艺或水合肼等危险化合物的使用。固相环化，酰胺键成环结构唯一。本发明的方法易于操作，工艺简单，产品纯度可达到99.3％，总收率55.0％，偏于工业化生产。
附图说明
图1为PT141产品的HPLC图；
图2为PT141产品的MS图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本工艺中，“替代度”指的是单位量的树脂负载的物质的数量，单位为“mmol/g”。在文中出现的缩写代表的意义如下所示：
表1本发明相关名词解释
缩写
含义
Fmoc
9-芴甲氧羰基
Boc
叔丁氧羰基
Trt
三苯甲基
HOBt
1-羟基苯并***
Pbf
2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
OtBu
叔丁氧基
DMF
N,N-二甲基甲酰胺
DIC
N,N'-二异丙基碳二亚胺
TFA
三氟乙酸
DBLK
20％六氢吡啶/DMF溶液
HPLC
高效液相色谱
Ac
醋酸盐
DIEA
N,N-二异丙基乙胺
EDT
1,2-乙二硫醇
实施例1：合成Fmoc-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin
称取5mmol Rink HMBA-AM Resin倒入500mL反应柱中，(所需树脂重量(g)＝合成规模(mmol)/Sub(mmol/g))，加入200mL DMF溶胀30min，抽干。加入DMF 100mL洗涤1min。
加入DBLK试剂(哌啶：DMF＝1：4)进行脱帽处理2次，每次100mL，时间分别为5min和15min，两次脱帽之间用DMF洗涤一次，用量100mL洗涤1min。脱帽完毕后加入DMF洗涤5次，每次100mL洗涤1min。取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阳性。
茚三酮检测：取少许树脂置于小玻璃试管中，依次加入试剂a：5％茚三酮的无水乙醇溶液(w/v)、b：苯酚：无水乙醇溶液(4:1，w/v)、c：吡啶各2滴，105℃加热5分钟即成。若溶液及树脂呈蓝色或深蓝色则茚三酮检测为阳性；若溶液澄清，树脂透明无色则茚三酮检测为阴性。
称取7.026g Fmoc-Lys(Boc)-OH、2.432g HOBt至反应柱中，再加入100mL DMF和2.786mL DIC，氮气吹拂搅拌反应2h，取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性，抽干反应液。加入DMF洗涤3次，每次100mL洗涤1min。
加入无水甲醇收缩3次，每次100mL 10min，抽干，真空减压干燥8h，得到Fmoc-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin。
实施例2：固相合成序列Ac-Nle-Asp(OtBu)-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin
称取5mmol Fmoc-Lys(Boc)-HMBA-Am Resin加入500mL反应柱中，加入200mL DMF溶涨30min，抽干。加入100mL DMF洗涤1min并抽干。
加入DBLK试剂(哌啶：DMF＝1：4)进行脱帽处理2次，每次100mL，时间分别为5min和15min，两次脱帽之间用DMF洗涤一次，用量100mL洗涤1min。脱帽完毕后加入DMF洗涤5次，每次100mL洗涤1min。取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阳性。
称取7.899g Fmoc-Trp(Boc)-OH、2.432g HOBt至反应柱中，再加入100m L DMF和2.786mL DIC，氮气吹拂搅拌反应2h，取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性，抽干反应液。加入DMF洗涤3次，每次100mL洗涤1min。
重复上述偶联操作依次加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Nle-OH进行偶联。
氨基酸偶联结束后，加入DBLK试剂(哌啶：DMF＝1：4)进行脱帽处理2次，每次100mL，时间分别为5min和15min，两次脱帽之间用DMF洗涤一次，用量100mL洗涤1min。脱帽完毕后加入DMF洗涤5次，每次100mL洗涤1min。取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阳性。
加入乙酰化试剂(将11.2ml NMM与9.5ml醋酸酐加入500mL烧杯中，再加入100mlDMF搅匀)进行封闭实验，氮气吹拂搅拌反应30min，取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性，抽干反应液。加入DMF洗涤3次，每次100mL洗涤1min。
加入无水甲醇收缩3次，每次100mL 10min，抽干，真空减压干燥8h。
实施例3：裂解脱除氨基酸保护基，并对产物进行环化
将配制好且冰水浴降温处理过的150ml裂解液(三氟乙酸TFA：苯甲硫醚：乙二硫醇：苯甲醚＝90：5：3：2)加入到抽干的肽树脂中，机械搅拌反应2h，过滤.使用DCM洗涤3遍，DMF洗涤6遍。取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阳性。称取2.432g HOBt至反应柱中，再加入100mL DMF和2.786mL DIC，氮气吹拂搅拌反应2h，取少量树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性，抽干反应液。加入DMF洗涤3次，每次100mL洗涤1min。
实施例4：甲酯化、水解、纯化、冻干得到PT141
甲酯化(将产物从载体上去除)：加入100ml甲酯化试剂(DIEA：MeOH：DMF＝1：2：5)，氮气吹拂搅拌反应2-4h，过滤反应液，保留滤液，用2倍体积的纯水稀释。过程中会有白色固体析出，加入适量的乙腈将析出物溶解。
水解(将上步甲酯化形成的C端甲酯去除，形成最终产物)：将30-200mg/LNaOH水溶液缓慢滴入上述溶液中至碱性(pH＝7.5-8.5)反应1-2h，高效液相色谱分析跟踪至水解完全。加入冰醋酸调pH至2-3，得到PT141粗品溶液。
纯化和冻干：粗肽溶液采用高效液相色谱进行纯化，纯化的条件为：第一步纯化：流动相：A相：1‰TFA(量取TFA约20mL，加水至约20L)；B相：乙腈；第二步转盐：流动相：A相：1)50mmol/L的NH4Ac水溶液，2)0.4‰醋酸；B相：乙腈。收集纯度99.0％以上样品冻干。冷冻干燥得2.82gPT141，纯度99.3％，总收率55.0％。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。