包含比拉斯汀、β-环糊精和至少一种胶凝剂的眼用组合物
阅读说明：本技术 包含比拉斯汀、β-环糊精和至少一种胶凝剂的眼用组合物 (Ophthalmic composition comprising bilastine, beta-cyclodextrin and at least one gelling agent ) 是由 贡萨洛·埃尔南德斯·埃雷尔 安那·贡萨洛·戈罗斯蒂萨 卡帕夫洛·莫兰·波拉杜拉 阿图罗·扎齐· 于 2019-01-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种水性眼用药物组合物,其包含：a)至少0.4％w/v的式(I)比拉斯汀或其药学上可接受的盐或其溶剂化物,其中所述比拉斯汀盐或其溶剂化物完全溶解在所述药物组合物中；b)至少一种β-环糊精；c)至少一种药学上可接受的水溶性胶凝剂；其中pH在4至9之间。以及其在治疗和/或预防由H<Sub>1</Sub>组胺受体介导的病症(例如过敏性病症或疾病)中的用途。本发明涉及过敏性结膜炎的治疗和/或预防。<Image he="439" wi="700" file="DDA0002592646070000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The present invention relates to an aqueous ophthalmic pharmaceutical composition comprising a) at least 0.4% w/v of a bilastine of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, wherein the bilastine salt or solvate thereof is completely dissolved in the pharmaceutical composition, b) at least one β -cyclodextrin, c) at least one pharmaceutically acceptable water-soluble gelling agent, wherein the pH is between 4 and 9, and its use in the treatment and/or prevention of inflammation by H 1 Use in a histamine receptor mediated condition (e.g. an allergic condition or disease). The present invention relates to the treatment and/or prevention of allergic conjunctivitis.)
技术领域
本发明涉及适合于每日一次给药的含有高浓度比拉斯汀的水性药物组合物及其作为抗组胺药和抗过敏药眼用药物组合物的用途。
背景技术
人们早就知道，组胺在过敏性疾病(诸如过敏性鼻炎、结膜炎、鼻结膜炎、皮炎、荨麻疹和哮喘)中起着非常重要的作用。作用于H1-受体组胺水平的抗组胺化合物可用于治疗此类疾病。
如果过敏症状主要是眼部症状，则局部治疗似乎优于全身性治疗。局部制剂因比全身性制剂更快起效(几分钟之内)而更优越，因此，能够容易地延缓过敏反应。在头对头比较中，利用结膜抗原激发模型的几项研究表明，在过敏性结膜炎的治疗中，局部药剂优于全身性抗组胺药。口服抗组胺药除了眼睛外，还可缓解其他的过敏症状，但与局部眼用药剂相比，其起效较慢。局部抗组胺剂的副作用也比全身性抗组胺药更少，这是因为穿透结膜所需的剂量较低，并且来自局部使用的血清水平可忽略不计。
尽管目前的局部给药产品具有治疗过敏性结膜炎的功效，但是患者部分症状缓解可能通过方便的每日一次给药在一整天中缓解症状。避免更频繁地给药对患者而言更方便，因为每日一次给药节省成本，有助于确保更好的患者顺应性，更重要的是，这代表着患者的生活质量获得改善。
文献EP0818454A1和EP0580541A1公开了苯并咪唑类化合物具有选择性H1抗组胺活性且没有心律失常作用。专利申请EP3040334A1也公开了具有高效选择性H1抗组胺活性的苯并咪唑化合物，对中枢神经系统和心血管系统缺乏活性。
具有上述性质的特定化合物是2-[4-(2-{4-[1-(2-乙氧基乙基)]-1H-苯并咪唑-2-基]-1-哌啶基}乙基)苯基]-2-甲基丙酸，也称为比拉斯汀(bilastine)，其具有分子式：
该化合物由西班牙Faes Farma研制。比拉斯汀是无镇静副作用、无心脏毒性、无肝代谢的H1拮抗剂苯并咪唑化合物。另外，已证明比拉斯汀对过敏性鼻结膜炎和荨麻疹症状有疗效。
比拉斯汀于1999年1月首次公开，此后，许多包含抗组胺剂的眼用溶液被公开且市售可得，例如EP2709610B1公开了一种含有高浓度奥洛他定(olopatadine)的局部眼用溶液，美国食品药品监督管理局(FDA)最近批准了一种0.77％盐酸奥洛他定的眼用溶液的新制剂。然而，现有技术中没有单一可行的公开提供适于每日一次给药的含高浓度比拉斯汀的眼用药物组合物。
专利申请WO9413299A1公开了1-(2-乙氧基乙基)-2-(4-甲基-1-高哌嗪基)-苯并咪唑(也称为依美斯汀(emedastine))的眼用溶液。尽管在结构上与比拉斯汀相似——依美斯汀是一种包含咪唑环的氮原子上连接乙氧基乙基链的苯并咪唑衍生物——但依美斯汀的水溶性远远高于比拉斯汀，这使得提供包含依美斯汀(浓度大约为8 mg/mL)和本领域技术人员已知的常见赋形剂(例如EDTA，NaCl，羟丙基甲基纤维素(HPMC)和pH调节剂NaOH/HCl和三(羟甲基)氨基甲烷)的眼用溶液变成可能。
现有技术中使用比拉斯汀治疗眼部过敏症状均是采用口服比拉斯汀，突显了提供该分子的眼用溶液的困难。例如：Horak F等人，Inflammation Research，2010，(59)391-398；或，J Bartra等人，J.Investig.Allergol.Clin.lmmunol.，2011，Vol.21，Suppl.3：24-33，仅公开了比拉斯汀片剂。
US2007265247公开了一种包含比拉斯汀的局部制剂。
WO03089425A1公开了比拉斯汀可用于眼用溶液，但未能提供有关如何成功制备该溶液任何技术细节。WO2007047253A2公开了使用羟基丁烯基环糊精增加抗真菌性唑类化合物的水溶性的方法。WO2009003199A1公开了用于鼻和眼组织的包含皮质类固醇、抗组胺药和磺烷基醚环糊精衍生物的水溶液制剂。
鉴于不仅没有单一可行的现有技术公开提供高浓度的比拉斯汀的眼用药物组合物，而且就过敏征兆和症状的每日缓解而言，与比拉斯汀相比，现有技术明确偏向使用奥洛他定，这使问题变得明显。Beauregard C.等人，2008年在ARVO年会摘要甚至教导说比拉斯汀不等于奥洛他定在体内的抗组胺作用力或作用持续时间。
因此，本领域需要提供一种适合于每日一次给药的眼用溶液，其包括高浓度的所述的苯并咪唑化合物。
本发明的发明人惊奇地发现：本发明中包含比拉斯汀(Bilastine)的眼用制剂使该化合物的眼部功效持续时间出乎意料的增加。当考虑到在涉及比拉斯汀和对比抗组胺化合物奥洛他定和氮卓斯汀(azelastine)的临床前研究中未观察到这种功效持续时间提高时，这些发现尤其令人惊讶。因此，本发明首次提供了一种每日一次给药的包含比拉斯汀的眼用制剂。
因此，在第一方面，本发明提供了一种眼用药物组合物，其包含：
a)至少0.4％w/v的比拉斯汀或其药学上可接受的盐或其溶剂化物，其中所述比拉斯汀或其盐或其溶剂化物完全溶解于所述水性眼用药物组合物中；
b)至少一种β-环糊精，所述β-环糊精选自：烷基-β-环糊精、羟烷基β-环糊精、羧烷基β-环糊精、羰基-β-环糊精、磺烷基醚β-环糊精及其混合物中的一种或多种；及
c)至少一种药学上可接受的水溶性胶凝剂或其可接受的盐，其选自：透明质酸、结冷胶、瓜尔豆胶、刺槐豆胶、海藻酸、聚维酮、κ-角叉菜胶、海藻酸盐胶、葡聚糖、硫酸葡聚糖、壳聚糖及其混合物中的一种或多种；
所述组合物的pH值包含在4至9之间，包括该范围的下限和上限。
在第二方面，本发明涉及上述的水性眼用药物组合物用作药物的用途。
在第三方面，本发明涉及上述的水性眼用药物组合物用于治疗和/或预防容易通过H1组胺受体拮抗而缓解的病症或疾病的用途。
本发明的另一个方面涉及上述的水性眼用药物组合物以及药学上可接受的载体、佐剂或溶剂。
本发明的另一方面涉及上述的水性眼用药物组合物在制备用于治疗和/或预防容易通过H1组胺受体的拮抗作用改善的病症或疾病的药物中的用途。
本发明的另一方面涉及一种用于治疗和/或预防容易通过H1组胺受体的拮抗作用而改善的病症或疾病的方法，所述方法包含将治疗有效量比拉斯汀的上述水性眼用药物组合物给药至需要该治疗和/或预防的对象。
这些方面及其优选实施例另外也进一步描述于以下说明并且在权利要求中定义。
附图说明
图1显示了超过6.5mg/mL浓度的比拉斯汀溶液在9％w/v的5种β-环糊精的存在下于不同的pH介质中在t0时的稳定性。
图2显示了超过6.5mg/mL浓度的比拉斯汀溶液在9％w/v的5种β-环糊精的存在下于不同的pH介质中在t1时的稳定性。
图3显示了本发明的组合物的眼平均保留时间(ART)，该组合物包含0.4％w/v的比拉斯汀和9％w/v的HPB。AH是透明质酸钠，GG是结冷胶，MC是甲基纤维素。
图4显示了本发明的眼用制剂在豚鼠中对组胺诱导的结膜炎的效应。
图5显示了使用最小二乘法(LSMeans)计算出以活性-对照的平均眼睛发痒评分来表示治疗差异，在结膜后过敏原激发的不同时间(分钟)：基线，16小时，8小时和15分钟，测量三种比拉斯汀浓度(0.2％w/v比拉斯汀，0.4％w/v比拉斯汀和0.6％w/v比拉斯汀)的治疗差异。
图6显示了后不同时间(分钟)：(基线，16小时，8小时和15分钟时)测得的平均眼睛发痒评分(0-4评分)。
详细说明
本发明人已惊奇地发现，比拉斯汀与至少一种β-环糊精和至少一种药学上可接受的水溶性胶凝剂或其可接受的盐的组合，对于眼科应用最佳，显示在眼睛中优异的长时间作用，这使提供每日一次的包含比拉斯汀的眼科制剂成为可能。令人惊讶地，在临床前试验中无法观察到这些结果，如在关于临床前和临床研究的实施例中所示。因此，在第一方面，本发明提供了一种眼用药物组合物，其包含：
a)至少0.4％w/v的比拉斯汀或其药学上可接受的盐或其溶剂化物，其中所述比拉斯汀或其盐或其溶剂化物完全溶解于所述水性眼用药物组合物中；
b)至少一种β-环糊精，所述β-环糊精选自：烷基-β-环糊精、羟烷基β-环糊精、羧烷基β-环糊精、羰基-β-环糊精、磺基烷基醚β-环糊精及其混合物中的一种或多种，；及
c)至少一种药学上可接受的水溶性胶凝剂或其可接受的盐，其选自：透明质酸、结冷胶、瓜尔豆胶、刺槐豆胶、海藻酸、聚维酮、κ-角叉菜胶、海藻酸盐胶、葡聚糖、硫酸葡聚糖、壳聚糖及其混合物中的一种或多种；
所述组合物的pH值包含在4至9之间，包括该范围的下限和上限。
比拉斯汀
本发明的水性眼用药物组合物包含下式的比拉斯汀：
或其药学上可接受的盐或其溶剂化物。该化合物是2-[4-(2-{4-[1-(2-乙氧基乙基)]-1H-苯并咪唑-2-基]-1-哌啶基}乙基)苯基]-2-甲基丙酸，也称为比拉斯汀(bilastine)。文献EP0818454A1，EP0580541A1和EP3040334A1中描述了比拉斯汀的合成。
比拉斯汀可以是盐或溶剂化物的形式，优选药学上可接受的盐或溶剂化物的形式。
本发明还提供本文所述化合物的“盐”。举例来说，所述盐可以是酸加成盐，碱加成盐或金属盐，并且可以通过本领域技术人员已知的常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。这样的盐通常通过以下方法制备，例如，通过所述化合物的游离酸或碱形式与化学计量的合适的碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备。非水性介质例如***、乙酸乙酯、乙醇、丙酮、异丙醇或乙腈通常是优选的。酸加成盐的说明性实例包括无机酸加成盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等；有机酸加成盐，例如乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、樟脑磺酸盐等。碱加成盐的说明性实例包括无机碱盐，例如铵盐和有机碱盐，再例如乙二胺、乙醇胺、N,N-二亚烷基乙醇胺、三乙醇胺、谷氨酰胺、氨基酸碱式盐等。金属盐的说明性实例包括例如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铝盐和锂盐。
根据本发明，术语“溶剂化物”应理解为任何形式的具有通过非共价键结合的另一分子(最可能是极性溶剂)的本发明活性化合物。溶剂化物的实例包括水合物和醇合物。溶剂化方法在现有技术中通常是已知的。
本发明的化合物也应包括差异仅在于存在一个或多个同位素富集的原子的化合物。例如，除了以氘或氚替换氢，或以13C-或14C富集碳替换碳，或以15N富集氮替换氮之外，具有本发明结构的化合物都在本发明的范围内。
至少为0.4％w/v的浓度意味着在1mL水中有大于4mg的比拉斯汀完全溶解，即没有任何明显的沉淀迹象。在本发明中，除非另有说明，否则所有百分比均以w/v为单位。在另一个实施方案中，比拉斯汀以至少0.6％w/v，优选至少0.7％w/v的浓度完全溶解在本发明的药物组合物中。在另一个实施方案中，比拉斯汀以至少0.6％w/v但不超过1.0％w/v的浓度完全溶解在本发明的药物组合物中。在一个具体的实施方案中，药物组合物包含至少0.4％w/v，至少0.6％w/v，至少0.7％w/v，至少0.8％w/v，至少0.9％w/v，或至少0.6％但不超过1.0％w/v的比拉斯汀，其中比拉斯汀完全溶解。在另一个特定的实施方案中，所述药物组合物包含至少0.4％w/v，至少0.6％w/v，至少0.7％w/v，至少0.8％w/v，至少0.9％w/v，或至少0.6％但不超过1.0％w/v的比拉斯汀，其中比拉斯汀完全溶解。在一个优选的实施方案中，比拉斯汀以至少0.6％w/v但不超过1.0％w/v的浓度完全溶解在本发明的药物组合物中。
环糊精
本发明文中，环糊精(CD)是由在1,4位置连接的5个或更多个β-D-吡喃葡萄糖单元组成的环状结构，一个环糊精分子中通常具有6个(α-环糊精)、7个(β-环糊精)、8个(γ-环糊精)或9个(δ-环糊精)糖单元。
MS值(平均摩尔取代度)是每摩尔吡喃葡萄糖的取代基摩尔平均数。例如，就β-环糊精而言，每个β-环糊精核的平均取代基数可以通过将MS值乘以7(β-环糊精的每个环糊精分子包含7个糖单元)来计算。此值的明确表示法是DS(取代度)。
无定形和结晶环糊精都在本申请的范围内。如本文所用，术语“环糊精”可以指环糊精或环糊精衍生物。环糊精为市售可得或可以通过本领域熟知的方法合成。环糊精的实例包括但不限于经改性或未经改性的α-，β-，γ-和δ-环糊精。本发明的环糊精为β-环糊精。本发明的环糊精衍生物，特别是β-环糊精的衍生物包括其中一些或全部OH基团转化为OR基团的那些衍生物。所述衍生物包括具有C1-6烷基的那些衍生物，例如甲基化、乙基化、丙基化和丁基化的环糊精，其中R为甲基、乙基、丙基或丁基；具有羟烷基取代基的那些，例如羟丙基环糊精或羟乙基环糊精，其中R为-CH2CH(OH)CH3或CH2CH2OH基团；支化的环糊精，例如麦芽糖键合的环糊精；阳离子环糊精；季铵盐；阴离子环糊精，例如羧甲基环糊精、环糊精硫酸盐(cyclodextrin sulfates)和环糊精琥珀酸盐(cyclodextrin succinates)；两性环糊精，例如羧甲基/季铵环糊精。其他具体的改性包括一个或多个羟烷基醚(例如R为C1-6亚烷基羟基)部分；一个或多个磺烷基醚(例如R为C2-6亚烷基SO3 -)部分；羧烷基(例如R为C(O)C1-6烷基)部分；经取代的苯氧基部分；色氨酸部分；或其混合物。每个环糊精分子的OR基团总数定义为取代/改性的程度。
在本发明中，所述眼用药物组合物的环糊精为β-环糊精。在一个优选的实施方案中，所述β-环糊精选自：烷基-β-环糊精、羟烷基β-环糊精、羧烷基-β-环糊精、羰基β-环糊精、磺基烷基醚β-环糊精及其混合物中的一种或多种。
在一个实施方案中，所述β-环糊精为烷基-β-环糊精。优选的烷基-β-环糊精包括甲基β-环糊精；二甲基-β-环糊精；三甲基-β-环糊精；乙基-β-环糊精；二乙基-β-环糊精；丙基-β-环糊精；和丁基-β-环糊精。在更优选的实施方案中，β-环糊精选自甲基-β-环糊精或二甲基-β-环糊精。本发明文中，当使用术语“烷基-β-环糊精”时，是指包括其中烷基部分被任选取代但不包括羟烷基β-环糊精的β-环糊精。
烷基β-环糊精衍生物的取代/改性度优选为约1至约18，约3至约16，约4至约14，约4至约12.6，并且更优选为约4至6。
在一个特定的实施方案中，所述β-环糊精不为烯基-β-环糊精，特别地，所述β-环糊精不为羟基丁烯基-β-环糊精。
在另一个实施方案中，所述环糊精为羟烷基-β-环糊精。优选的羟烷基-β-环糊精包括羟乙基-β-环糊精；羟丙基-β-环糊精(相当于2-羟丙基-β-环糊精)和2-羟丁基-β-环糊精。在一个更优选的实施方案中，所述环糊精为羟丙基-β-环糊精(HPBCD或HR-β-CD)。
羟烷基环糊精衍生物，特别是羟丙基β-环糊精，优选具有约1至约14的取代/改性度，更优选约4至约8。
在另一个实施方案中，所述环糊精为羧烷基-β-环糊精。本文中优选羧烷基-β-环糊精，包括羧甲基-β-环糊精和(2-羧乙基)-β-环糊精。
在另一个实施方案中，所述环糊精为磺基烷基醚β-环糊精。本文中优选磺基烷基醚-β-环糊精为磺基丁基醚-β-环糊精。
磺基烷基醚-β-环糊精衍生物的取代/改性度优选为约1至约14，更优选为约1至约7。
在一个优选的实施方案中，所述环糊精为β-环糊精，其选自：烷基-β-环糊精、羟烷基-β-环糊精、羧烷基-β-环糊精、磺基烷基醚-β-环糊精及其混合物中的一种或多种。
在另一个优选的实施方案中，所述环糊精为β-环糊精，其选自：羟烷基-β-环糊精，羧烷基-β-环糊精，磺基烷基醚-β-环糊精及其混合物中的一种或多种。
在最优选的实施方案中，所述环糊精为β-环糊精，其选自：羟烷基-β-环糊精、磺基烷基醚-β-环糊精及其混合物中的一种或多种。
在本发明的实施例中，使用以下β-环糊精：
-β-CD：β-环糊精(Sigma-Aldrich Ref.：C4767-25G)。
-HR-β-CD：取代度为5.6的2-羟丙基-β-环糊精(Sigma-Aldrich Ref.：332607-5G)。
-HPB：取代度为4.5的2-羟基丙基-β-环糊精，(KleptoseTMRoquette Pharma)。
-CM-β-CD：取代度为3的羧甲基-β-环糊精钠盐(Sigma-Aldrich Ref.：21906-5G)。
-DM-β-CD：七(2,6-二-O-甲基)-β-环糊精(Sigma-Aldrich Ref.：H0513-5G)。
-SBE-β-CD：取代度为6.2-6.9的β-环糊精磺基丁基醚钠盐(USP)(CarbosynthRef.:SBECD)。
在一个优选的实施方案中，所述环糊精为药学上可接受的环糊精。
在一个具体的实施方案中，所述环糊精是以约0.1％至约50％w/v的量存在于所述组合物中。在此，w/v是指重量/体积百分比浓度(g/100mL)，例如，当环糊精以约0.1％至约50％的量存在于组合物中时，是指其以约1mg/mL至约500mg/mL的量存在。在本发明中，除非另有说明，否则所有百分比均以w/v单位表示。在特定的实施方案中，所述环糊精的存在量为约0.25％至约30％，约0.5％至约25％，约1％至约20％，约2％至约15％或约3％至约10％w/v。在一个优选的实施方案中，本发明药物组合物的环糊精的浓度为至少5％w/v，但不超过15％w/v，即约50至150mg/mL。更优选地，所述环糊精的存在量为至少8％但不超过10％w/v。在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物包含9％w/v的环糊精。
胶凝剂
水溶性胶凝剂是指可以增加水溶液(例如本发明的眼用药物组合物)的粘度而实质上不改变其其他性质但形成凝胶的物质，所述凝胶溶解在液相中形成具有弱粘性的内部结构的胶体混合物。在优选的实施方案中，至少一种胶凝剂为用于眼用目的的药学上可接受的胶凝剂。
在一个优选的实施方案中，本发明的眼用药物组合物的至少一种胶凝剂或其可接受的盐选自：透明质酸、结冷胶、瓜尔豆胶、刺槐豆胶、海藻酸、聚维酮、κ-角叉菜胶、海藻酸盐胶、葡聚糖、硫酸葡聚糖、壳聚糖及其混合物中的一种或多种。
在一个优选的实施方案中，所述至少一种药学上可接受的水溶性胶凝剂或其可接受的盐选自透明质酸、结冷胶及其混合物。
因此，在一个优选的实施方案中，所述至少一种药学上可接受的水溶性胶凝剂是透明质酸或其可接受的盐。
在一个具体的实施方案中，所述胶凝剂或其可接受的盐以约0.001％w/v至约2％w/v，优选约0.003％w/v至约1％w/v的量存在于本发明的水性组合物中。在一特定的实施方案中，所述胶凝剂以约0.05％，约0.1％，约0.25％，约0.50％，约0.75％，约1％，约1.5％或约2％的量存在于本发明的水性组合物中。除非另有说明，否则所有百分比均以w/v单位表示。在一个优选的实施方案中，本发明的水性组合物中存在的胶凝剂的量为至少0.05％w/v但不大于1％w/v，最优选为0.1％w/v。
在一个优选的实施方案中，本发明的眼用药物组合物包含：
a)至少0.6％w/v但不超过1.0％w/v的比拉汀或其药学上可接受的盐或其溶剂化物，其中所述比拉汀或其盐或其溶剂化物完全溶解在所述水性眼用药物组合物中；
b)至少一种β-环糊精，所述β-环糊精选自：烷基-β-环糊精、羟烷基β-环糊精、羧烷基β-环糊精、羰基-β-环糊精、磺基烷基醚β-环糊精及其混合物中的一种或多种，；其中所述β-环糊精的浓度至少为5％w/v但不超过15％w/v；和
c)透明质酸或其药学上可接受的盐，其中所述透明质酸或其药学上可接受的盐的浓度为至少0.05％w/v但不超过1％w/v。
在一个具体的实施方案中，所述胶凝剂为透明质酸或其药学上可接受的盐，并且分子量不大于600000Da。胶凝剂的分子量可以根据本领域已知的技术来测量。优选但不限于，所述透明质酸或其药学上可接受的盐的平均分子量可以使用与多角度激光光散射(SEC-MALLS)偶联的尺寸排阻色谱法来确定。或者，所述透明质酸或其药学上可接受的盐的平均分子量也可以使用特性粘度和Mark-Houwink关系式来确定。
进一步实施方案
在一个具体的实施方案中，本发明的眼用药物组合物还包含至少一种药学上可接受的水溶性聚合物作为增粘剂，其选自：纤维素的醚衍生物、聚乙二醇、聚乙烯醇及其混合物中的一种或多种。
水溶性聚合物是指至少部分可溶于水的亲水性聚合物。在一个优选的实施方案中，所述至少一种水溶性聚合物是药学上可接受的水溶性聚合物。
在一个优选的实施方案中，所述至少一种水溶性聚合物是纤维素的醚衍生物，最优选地是甲基纤维素。在另一个实施方案中，所述至少一种水溶性聚合物为聚乙二醇。
在一个具体的实施方案中，所述水溶性聚合物以约0.001％w/v至约15％w/v，优选约0.01％w/v至约15％w/v的量存在于本发明的水性组合物中。在特定的实施方案中，所述水溶性聚合物以约0.01％，约0.05％，约0.1％，约0.25％，约0.50％，约0.75％，约1％，约3％，约5％，约7％，约10％，约13％或约15％的量存在于本发明的水性组合物中。除非另有说明，否则所有百分比均以w/v单位表示。
纤维素醚衍生物
在一个实施方案中，所述水溶性聚合物是纤维素的醚衍生物。纤维素醚衍生物是指纤维素中的羟基已部分或完全被取代而形成纤维素醚(-OR)的纤维素。在一个实施方案中，所述纤维素的醚衍生物选自：烷基纤维素、羟烷基纤维素、羧烷基纤维素及其混合物中的一种或多种。
在一个优选的实施方案中，所述纤维素的醚衍生物选自：羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素、羧烷基纤维素及其混合物中的一种或多种。
在一个实施方案中，所述纤维素醚衍生物为烷基纤维素。本文中优选使用的烷基纤维素包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素、乙基甲基纤维素及其混合物。
在一个实施方案中，所述纤维素醚衍生物为羟烷基纤维素。本文中优选使用的羟烷基纤维素包括羟甲基纤维素(HMC)、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)和乙基羟乙基纤维素。
在一个实施方案中，所述纤维素醚衍生物为羧烷基纤维素。本文中优选使用的羧烷基纤维素包括羧甲基纤维素(CMC)。CMC和羧甲基纤维素钠(CMCNa)是等效的。
聚乙二醇(PEG)
PEG也称为聚环氧乙烷(PEO)或聚氧乙烯(POE)。在一个优选的实施方案中，PEG为低分子量PEG，其意是指分子量在300-1000g/mol之间的PEG。PEG的分子量更优选间于300至500g/mol。在一个优选的实施方案中，所述分子量为400g/mol，即PEG400。
在一个具体的实施方案中，该组合物的克分子渗透压浓度(osmolality)包含在约200mOsm/kg至约640mOsm/kg之间，优选约250mOsm/kg至约600mOsm/kg。在一个优选的实施方案中，所述克分子渗透压浓度为约240mOsm/kg至约340mOsm/kg。本发明的眼用药物溶液的克分子渗透压浓度可以使用本领域公知的标准方法来测量。优选但不限于，本发明的眼用药物溶液的克分子渗透压浓度可以通过用渗透压计测量溶液的冰点降低来确定。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物还可以进一步包含选自下列的渗透压剂或张力剂：甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、赤藓糖醇、***糖醇、木糖醇、核糖醇、半乳糖醇、麦芽糖醇、聚乙二醇、乳糖醇及其混合物中的一种或多种。当存在时，所述渗透压剂或张力剂在本发明的水性组合物中的量为约0.05％、约0.1％、约0.25％、约0.50％、约0.75％、约1％、约1.5％、约1.6％、约2％、约3％、约5％、约7％、约10％、约13％或约15％。在与前者相容的实施方案中，所述渗透压剂或张力剂在本发明的水性组合物中的量小于15％、13％、10％、7％、5％、3％或2％。除非另有说明，否则所有百分比均以w/v单位表示。
在一个优选的实施方案中，当存在时，所述渗透压剂或张力剂在本发明的水性组合物中的量间于0.05％至5％w/v。
在一个特定的实施方案中，发明人惊奇地发现，本发明的组合物是稳定的，并且不需要添加会引起干眼和眼睛刺激的防腐剂，例如苯扎氯铵、咪唑烷基脲、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯氧基乙醇、EDTA二钠、硫柳汞(thimerosal)、氯丁醇和山梨酸。因此，在一个特定的实施方案中，本发明的眼用药物组合物不含防腐剂。
在一个特定的实施方案中，本发明的组合物包含甘油。甘油(Glycerin)是甘油(glycerol)或丙三醇(glycerine)的同义词。优选地，本发明的水性组合物中的甘油的量间于0.05％至5％w/v，更优选间于0.05％至3％w/v。在一个优选的实施方案中，所述甘油作为张力剂存在，其浓度不大于2.5％。在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物包含约1.6％，优选1.61％的甘油。除非另有说明，否则所有百分比均以w/v单位表示。
pH值
本发明的水性药物组合物优选用于眼科用途和/或给药，即适用于这些目的水性眼用药物组合物。眼睛(特别是人眼)的生理pH已知在约6.5-8.0之间。
在一个优选的实施方案中，所述药物组合物的pH值在4至9之间，包括下限和上限。在一些实施方案中，本发明的水性眼用药物组合物的pH为3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1，8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3或9.4。
对于pH值，很容易理解pH值为4也可被认为对应于3.6至4.4的pH范围。类似地，pH值为9也可被认为对应于8.6至9.4的pH范围。在另一个优选的实施方案中，所述药物组合物的pH值为4.0、5.5、7.4、8.0或9.0。
在一个实施方案中，存在一种pH调节剂，其选自盐酸、硼酸、乙酸、氢氧化钠、氢氧化钾或其组合。
在一个实施方案中，存在一种缓冲剂，其选自乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂或其组合。
在另一个实施方案中，所述组合物的pH在维持比拉斯汀的化学、物理和/或生理稳定性并且眼睛良好耐受的范围内。
用途
已经发现，比拉斯汀是组胺H1受体的拮抗剂，因此可用于治疗和/或预防已知容易因组胺H1受体拮抗作用而缓解的疾病。
因此，本发明的一个方面涉及用作药物的如上定义的水性眼用药物组合物。
本发明的另一方面涉及一种用于治疗和/或预防容易通过H1组胺受体的拮抗作用而改善的病症或疾病的如上所定义的水性眼用药物组合物。所述疾病为(例如)过敏性疾病或病症，或源自过敏的症状。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种如上定义的用于治疗和/或预防眼部过敏性病症、过敏性疾病或过敏性症状的水性眼用药物组合物。优选地，过敏性疾病、病症或症状选自鼻炎、鼻结膜炎、过敏性结膜炎、春季角膜结膜炎、特应性角膜结膜炎、***突状结膜炎、眼刺激性、发痒、发红、流泪、结膜水肿、干性角膜炎、干燥性角膜结膜炎或功能障碍性泪液综合征。在一个优选的实施方案中，所述过敏性疾病或病症选自鼻炎、鼻结膜炎、过敏性结膜炎、春季角膜结膜炎、特应性角膜结膜炎、***突状结膜炎和结膜水肿。在另一个优选的实施方案中，过敏症状选自眼刺激、发痒、发红、流泪、干燥性角膜炎、干燥性角结膜炎或功能障碍性泪液综合征。在本发明的上下文中，干眼症包括干燥性角膜炎、干燥性角膜结膜炎或功能障碍性泪液综合征。
优选地，本发明涉及一种如上定义的用于治疗和/或预防过敏性结膜炎的水性眼用药物组合物。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及一种如上定义的用于治疗和/或预防干眼症的水性眼用药物组合物。在一个更优选的实施方案中，本发明涉及一种如上定义的用于同时治疗和/或预防过敏性结膜炎和干眼症的水性眼用药物组合物。
在本说明书的上下文中，术语“治疗”(treatment或to treat)是指给予根据本发明的化合物或制剂以改善或消除所述疾病或与所述疾病相关的一种或多种症状。“治疗”还包括改善或消除所述疾病的生理后遗症。
在本发明的上下文中，术语“改善”应理解为是指对所治疗患者的状况的任何改善。
在本说明书的上下文中，术语“预防”(prevention或者to prevent)是指给予根据本发明的化合物或制剂以降低获得或发展所述疾病或与所述疾病相关的一种或多种症状的风险。
药物组合物
“水性眼用药物组合物”一词是指适合眼用的包含水的液体药物组合物。
在一个实施方案中，比拉斯汀以至少0.4％w/v的浓度完全溶解在本发明的水性眼用药物组合物中。在另一个实施方案中，比拉斯汀以至少0.6％w/v，优选至少0.7％的浓度完全溶解在本发明的水性眼用药物组合物中。在另一个实施方案中，比拉斯汀以范围在0.6至1.0w/v％之间的浓度，优选地以范围在0.6至0.9w/v％之间的浓度，更优选地以范围在0.6至0.8w/v％之间的浓度完全溶解在本发明的水性眼用药物组合物中。优选地，比拉斯汀以0.6％w/v的浓度完全溶解在本发明的水性眼用药物组合物中。在此，w/v％是指重量/体积百分比浓度(g/100mL)，例如，当组合物中的比拉斯汀以约0.6％至约1.0％的量存在时，是指其以约6mg/mL至约10mg/mL的量存在。在本发明中，除非另有说明，否则所有百分比均以w/v单位表示。
在一个实施方案中，比拉斯汀在本发明的药物组合物中的量优选为大于4500μg/mL，优选为大于6000μg/mL，优选为大于6500μg/mL，优选为大于7000μg/mL，优选为大于7500μg/mL，优选为大于8000μg/mL，优选为大于8500μg/mL，优选为大于9000μg/mL，和更优选为大于9500μg/mL。在一优选实施方案中，比拉斯汀在本发明的药物组合物中的量低于10500μg/mL。
在一个特定实施方案中，所述水性眼用药物组合物包含比拉斯汀、β-环糊精和透明质酸或其可接受的盐，其中所述比拉斯汀完全溶解在所述水性眼用药物组合物中。在另一个特定实施方案中，所述水性眼用药物组合物包含比拉斯汀、羟丙基-β-环糊精和透明质酸或其可接受的盐，其中所述比拉斯汀完全溶解在所述水性眼用药物组合物中。
“治疗有效量”一词意指给药时药物提供其中所含的一种或多种药物活性剂在治疗或控制疾病或疾病状态方面获得疗效的量。
在一个优选实施方案中，本发明的药物组合物包含治疗有效量的比拉斯汀。
本发明的水性眼用药物组合物可进一步包含药学上可接受的赋形剂。
“药学上可接受的赋形剂”一词是指与活性成分一起给药的载体、稀释剂或佐剂。所述药学上可接受的赋形剂可为无菌液体，例如水和油，包括来自石油、动物、植物或合成的；例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油及类似物。水或盐水溶液，以及葡萄糖和甘油水溶液，优选用作为载体，特别是用于可注射溶液。适当药物载体描述于E.W.Martin的2005年第21版“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中。
制造本发明的药物组合物给药所需的药物形式所必需的赋形剂和辅助物质，除其他因素外，将取决于所选择的给药药物形式。所述药物组合物的给药的药物形式将根据本领域技术人员已知的常规方法来制造。不同活性成分的给药方法、要使用的赋形剂及其生产方法的综述可见于“Tratado de Farmacia Galénica”,C.Faulí i Trillo,Luzán 5,S.A.de Ediciones,1993。
“药学上可接受的”一词是指生理上可耐受且当施用于人或动物时通常不会产生过敏反应或类似的不良反应(如胃病、头晕及诸如此类者)的组合物和分子实体。优选地，术语“药学上可接受的”意指其被州或联邦政府的监管机构所批准，或涵盖在美国药典或其他公认的药典中用于动物，尤其是用于人类。
本文所揭示的制剂也可选地进一步包含一种或多种眼用赋形剂。作为非限制性实例，眼用赋形剂包括至少一种选自黏膜黏着剂、防腐剂、pH调整剂、张力调整剂(tonicity-adjusting agent)、缓冲剂、抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、化学防腐剂、增黏剂或其组合试剂。在一特定实施方案中，所述眼用组合物进一步包含水溶性聚合物，如上述所定义。
在一特定实施方案中，本发明的组合物不包含皮质类固醇。
在一优选实施方案中，所述眼用药物组合物包含：
a)至少0.6％w/v但不大于1.0％w/v的比拉斯汀或其药学上可接受的盐或其溶剂化物，其中所述比拉斯汀或其盐或其溶剂化物完全溶解在所述水性眼用药物组合物中；
b)至少一种羟烷基β-环糊精，其中所述β-环糊精的浓度为至少5％w/v但不大于15％w/v；
c)透明质酸或其药学上可接受的盐，其中所述透明质酸或其药学上可接受的盐的浓度为至少0.05％w/v但不大于1％w/v；
d)从0.001％w/v至15％w/v的至少一种药学上可接受的水溶性聚合物，其选自：纤维素醚衍生物、聚乙二醇、聚乙烯醇及其混合物中的一种或多种；及
e)从0.05％w/v至5％w/v的至少一种张力剂，所述张力剂选自：甘油、山梨醇、甘露醇、赤藓糖醇、***糖醇、木糖醇、核糖醇、半乳糖醇、麦芽糖醇、聚乙二醇、乳糖醇及其混合物中的一种或多种。
在另一优选实施方案中，所述眼用药物组合物包含：
a)至少0.6％w/v但不大于1.0％w/v的比拉斯汀或其药学上可接受的盐或其溶剂化物，其中所述比拉斯汀或其盐或其溶剂化物完全溶解在所述水性眼用药物组合物中；
b)至少一种羟烷基β-环糊精，其中所述β-环糊精的浓度为至少5％w/v但不大于15％w/v；
c)透明质酸或其药学上可接受的盐，其中所述透明质酸或其药学上可接受的盐的浓度为至少0.05％w/v但不大于1％w/v；
d)从0.001％w/v至15％w/v纤维素醚衍生物；及
e)从0.05％w/v至5％w/v的甘油。
在一更优选实施方案中，所述眼用药物组合物包含：
a)至少0.6％w/v但不大于1.0％w/v的比拉斯汀或其药学上可接受的盐或其溶剂化物，其中所述比拉斯汀或其盐或其溶剂化物完全溶解在所述水性眼用药物组合物中；
b)至少一种羟烷基β-环糊精，其中所述β-环糊精的浓度为至少5％w/v但不大于15％w/v；
c)透明质酸或其药学上可接受的盐，其中所述透明质酸或其药学上可接受的盐的浓度为至少0.05％w/v但不大于1％w/v；
d)从0.005％w/v至0.1％w/v的甲基纤维素；及
e)从0.5％w/v至2％w/v的甘油。
下表1提供了适合于本发明的眼用组合物的示例性优选制剂的示例性成分，以及这些成分所需的重量/体积百分比的列表。应理解，除非另有具体说明，下列表1为示例性的，可从表中加入或去除某些成分且可改变某些成分的浓度，制剂可保持在本发明的范围内。
表1本发明的眼用组合物的示例性优选制剂及各成分所需的重量/体积百分比
成分
w/v％
比拉斯汀
0.6
β-环糊精(羟丙基β-环糊精)
9.0
胶凝剂(透明质酸钠)
0.1
张力剂(甘油)
1.61
增黏剂(甲基纤维素)
0.01
pH调节剂(NaOH或HCl)
量足以达到pH＝7.4
纯化水
适量至100
药物形式
药物组合物的实例包括用于局部给药至眼睛的任何液体组合物。液体形式为溶液、悬浮液或乳液。
用于局部给药至眼睛的适当制剂的实例包括眼药水(即滴眼剂或人工泪液)、眼用乳剂和眼用软膏剂。在一特定实施方案中，本发明的组合物是眼用制剂的形式如眼药水。眼用制剂可包括适当抗微生物剂。在一优选实施方案中，所述眼用制剂不包括防腐剂。在一更优选实施方案中，所述眼用制剂不包括选自下列的防腐剂：苯扎氯铵(benzalkoniumchloride)、咪唑烷基脲、对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、苯氧基乙醇、EDTA二钠、硫柳汞(thimerosal)、氯丁醇和山梨酸。
本发明提供一种如上定义的眼用药物组合物。在一优选实施方案中，所述眼用药物组合物为每日一次给药的药物组合物。
下列示例仅仅是对本发明的某些实施例的说明，不能被认为以任何方式对其加以限制。
实施例
材料和方法
已使用下列材料：比拉斯汀(由Sai Life Sciences供应，批号5000011325)；上述的环糊精如β-CD、HP-β-CD、HPB、CM-β-CD、DM-β-CD和SBE-β-CD；甲基纤维素1500(MC1500)(Acofarma)；结冷胶(GG)(Kelcogel CG-LA,CPKelco)、透明质酸钠(Caref)和甘油(Merck-Millipore)。下列实施例所使用的水为使用Merck-Millipore的净水系统获得的纯化水。
实施例1.超过6.5mg/mL比拉斯汀在25℃下于9％的不同的β-环糊精的存在下于水 溶液中在不同pH值的稳定性
此实施例显示浓度超过6.5mg/mL(0.65％w/v)的比拉斯汀溶液于9.0％w/v的五种环糊精(β-CD、HP-β-CD、CM-β-CD、DM-β-CD和SBE-β-CD)存在下于水溶液中在不同pH值的稳定性。如下所示，由从碱性溶液开始调整而获得各pH值。
在非缓冲溶液中的比拉斯汀(pH调整)
a.在碱性介质中的7mg/mL的比拉斯汀溶液：将70mg的比拉斯汀加至10mL容量瓶中。添加大约5mL的去离子水且接着滴加1M NaOH，同时摇动混合物直至所有的比拉斯汀溶解。接着，添加900mg对应的环糊精，摇动混合物直至环糊精完全溶解(除了不能导致完全溶解的β-CD的特定情况之外)。接着将体积调整至10mL。
b.将900μL的步骤a中所制备的五种比拉斯汀+环糊精溶液分别转移到单独的EP管(Eppendorf tubes)中。
c.在各EP管中，根据需要小心地加入50％AcOH、1M HCl或1M NaOH而将pH调整至所需值。
t0＝0天
将溶液保持在30℃下搅拌1小时，其后测量比拉斯汀浓度。
t1＝7天
在t0分析后，将溶液在恒温室中于22±2℃下保持7天不搅拌，之后再分析。
在恒定搅拌(100 rpm)下将每个EP管引入培养器(
表2在9％w/v的不同环糊精的存在下，在不同pH值的非缓冲水溶液中比拉斯汀在t0时的浓度(目标浓度7mg/mL)
比拉斯汀的浓度相对7mg/mL的偏差是由pH调整步骤后的稀释效应所引起的。
表3在9％w/v的不同环糊精的存在下，在不同pH值的非缓冲水溶液中比拉斯汀在t1(7天)时的浓度(目标浓度7mg/mL)
1周后，这些数值仍超过6.5 mg/mL。与t0时的结果相比，比拉斯汀的浓度有小但普遍增加，这是由溶剂的轻微蒸发所引起的。
此实施例显示了就4.0至9.0的pH范围而言，在30℃下1小时后和在22℃下7天后，在非缓冲溶液中超过6.5 mg/mL的比拉斯汀浓度是稳定的。这些结果表示于图1(t0)和图2(t1)中。
实施例2.0.4％w/v比拉斯汀和9％HPB在不同组合物中的眼部生物黏着性
通过正电子发射断层扫描技术(PET)扫描测量含有0.4％w/v比拉斯汀和9％HPB的组合物在动物(大鼠)眼中的生物黏着性。组合物中的增黏剂和张力剂(甲基纤维素和甘油)及胶凝剂(透明质酸钠和/或结冷胶)的含量不同。正电子发射示踪剂18FDG的添加使得以测量各组合物在大鼠眼组织中的平均滞留时间。
表4包含0.4％w/v比拉斯汀和9％HPB的本发明的组合物的眼部平均滞留时间(ART)
表4显示当透明质酸钠(HA)、结冷胶(GG)、或AH和GG的混合物与比拉斯汀和HPB环糊精在有及没有甲基纤维素(MC)和甘油下组合使用时达成最长滞留时间，或眼部生物黏着性。因此，结果显示至少GG或HA适合于增加包含比拉斯汀和HPB以及可选地MC和甘油的组合物的眼部滞留时间。结果如图3所示。
实施例3.眼用制剂的临床前体内疗效
动物模型
使用雄性Dunkin-Hartley豚鼠，在接收时重300-349g(Harlan LaboratoriesInc./Envigo)并保持在标准收容条件(2只动物/笼)。在连续两次使用之间至少4天的洗涤期后才再次使用动物(每组6-10只)，以使眼睛结膜完全恢复。
实验程序
制备两种比拉斯汀浓度为0.4％和0.6％w/v的比拉斯汀的水性眼用制剂。两种制剂也包含90mg/mL HPB、0.1mg/mL甲基纤维素、1mg/mL透明质酸钠和16.1mg/mL甘油。
通过滴注将眼用制剂施加在右眼(25μL)中，保持动物固定2至3分钟以确保产物在结膜囊中的持久性。接下来，用市售滴眼剂，左眼接受相同体积的对应载体(vehicle)或0.9％NaCl。每只动物都有自己的阳性对照组。
一旦经过既定的时间(其可能是10分钟到24小时)，通过在每只眼睛中给药组胺二盐酸盐溶液(在0.9％NaCl中，5％，25μL/眼)以诱发急性结膜炎，保持动物固定2至3分钟。在施加30分钟后评估对组胺的反应。
以下列参数对每只眼睛评分：水肿程度(结膜水肿)、结膜发红和血管注射(结膜充血)和泪液分泌(泪溢)。根据0至4的主观量表评估严重程度(指南OECD测试编号405：0＝正常；1＝最小；2＝中度；3＝强烈；4＝严重)。将各眼中各参数的个别得分相加的结果被认为是整体结膜炎程度的平均值(0到12之间的总得分)。
统计
未达到统计学显著性或达到统计学显著性但拮抗组胺效应百分比为≤30％之制剂被认为是无活性的。对于每次治疗，计算对照眼(左)和抗组胺药治疗的眼(右)的总评分的平均值。此外，根据下列公式计算抑制百分比(药理效应的平均值)：
抑制(％)＝[(对照组得分-治疗组得分)/对照组得分]×100
统计分析涉及使用非参数检验“Wilcoxon Signed Rank test”(配对数据)和“Mann-Whitney U-Test”(用于独立数据)，以便分别比较各治疗与其对应的对照组和治疗组之间的差异。当p<0.05时，考虑是统计学上显著的差异。
商业制剂的效果
0.5mg/ml氮卓斯汀(azelastine)
比拉斯汀浓度的影响
制备上述4mg/mL(0.4％w/v)比拉斯汀制剂并测定其作用时间。以类似于0.5mg/mL氮卓斯汀的方式，用此制剂获得的抗豚鼠中组胺诱发的结膜炎活性在其施用后9小时仍然显著(36.4％抑制，图4)。
同样制备上述6mg/mL(0.6％w/v)比拉斯汀制剂，且其活性与4mg/mL比拉斯汀比较。所得结果表明，最高比拉斯汀浓度给药后9小时(40.5％抑制和36.4％抑制)和12h(29.0％抑制和20.4％抑制)，在抑制百分比方面，几乎没有提高。在任何时间都没有发现统计差异。在相同的时间间隔，1mg/mL奥洛他定显示出强活性(在给药后9和12小时分别为75.9％抑制和63.9％抑制)。结论是，比拉斯汀浓度的增加在有效性和作用持续时间方面并没有引起显著提高。
甲基纤维素的影响
比较在含有或不含有0.1mg/mL甲基纤维素下等量的0.4％w/v比拉斯汀制剂的有效性。两种配方也包含100mg/mL HPB、1mg/mL透明质酸钠和2mg/mL结冷胶。在给药后9小时，两种制剂均显示出明显的活性(组胺诱发效应的拮抗作用分别为44.7％和47.4％)。这些结果表明甲基纤维素对0.4％w/v比拉斯汀制剂的活性的持续时间没有产生相关的贡献。
甘油的影响
比较在含有或不含有16.1mg/mL甘油下等量的0.4％w/v比拉斯汀制剂的有效性。两种制剂也包含100mg/mL HPB、0.1mg/mL甲基纤维素、1mg/mL透明质酸钠和2mg/mL结冷胶。在给药后9小时，两种制剂均有活性(含甘油和不含甘油的制剂分别为33.5％抑制和45.8％抑制)。在12小时给药，两种制剂明显无活性(分别为24.5％和26.7％的拮抗作用)。在任何时间都没有发现统计差异。这些结果表明甘油对0.4％w/v比拉斯汀制剂的活性的持续期间没有产生相关的贡献。
实施例4.眼用制剂的临床体内疗效
此实施例连同表5-6和图5-6显示在结膜过敏原激发(
制备比拉斯汀浓度为0.2％w/v、0.4％和0.6％w/v的比拉斯汀水性眼用制剂。空白制剂(vehicle formulation)不包含任何比拉斯汀。赋形剂如上表1中所示，即，还包含90mg/mL HPB、0.1mg/mL甲基纤维素、1mg/mL透明质酸钠和16.1mg/mL甘油。
在测试和过敏性结膜炎征兆和症状评估之前15分钟、8或16小时给药一剂量(每眼一滴)的指定测试样品。该研究由大约六到十周期间的八次门诊组成。功效系由ORAInc.(Andover,Massachusetts,United States,01810)使用
在筛选期间，在第1次就诊时，受试者签署知情同意书并进行过敏性皮肤试验。在第2次就诊时，每位合格受试者使用他们阳性反应的过敏原进行双侧
在受试者随机化后，于第4a次就诊开始治疗期。在这次就诊时，受试者接受了随机分配的办公室内(in-office)剂量的治疗。滴注研究药物后大约16小时，受试者在第4b次就诊时进行
在随访期间，在第29(±3)天对所有受试者进行电话追踪。表5显示就诊计划的摘要。
表5就诊计划的摘要
在一个(1)地点，总共筛选了220位受试者以登记约120名受试者。主要目的是测量过敏性结膜炎的主要症状眼睛发痒。
在模型中，每位患者服用药物或载体，并在特定刺激时间接触过敏原。该研究的刺激时间为给药后15分钟、8小时和16小时。其后，于第4b(研究药物滴注后16小时)、5b(研究药物滴注后8小时)、和6(滴注后15分钟)次就诊，在刺激时间后3、5和7分钟的测定时间测定发痒。要求患者按0到4的等级(允许半个单位增量)评定他们的眼睛发痒以获得发痒评分，且在各评分中0为最小，4为最大。因此，患者接受三剂药物或载体，并且各剂量之后进行过敏原刺激，然后如所讨论的由受试者评估眼睛发痒。
治疗成功的定义是至少一种浓度的比拉斯汀眼用溶液显示出：对于所有3次时间点后，超过载体至少0.5个单位的临床优势，且对于大多数时间点后，超过至少1个单位。表6中提供于各个时间点测定的结果，且数据以图5和图6的形式提供。
表6最小二乘法(LSMeans)计算活性-载体的平均眼痒评分治疗差异
*在治疗差异中无临床显著性。
0.6％w/v比拉斯汀在研究药物滴注后15分钟(第6次就诊)、8小时(第5b次就诊)和16小时(第4b次就诊)在眼睛发痒的缓解方面有临床上显著治疗差异。0.2％w/v和0.4％w/v比拉斯汀在研究药物滴注后15分钟(第6次就诊)和8小时(第5b次就诊)在治疗眼睛发痒方面具有临床上显著治疗差异。在所有就诊中，在眼睛发痒的治疗中所有浓度的比拉斯汀与载体相比均显示出有统计学上的显著差异。
从表6和图5-6可以看出，对于眼睛发痒的治疗，当在(第4b次就诊)之前16小时给予时，浓度0.6％w/v的比拉斯汀是唯一显示在临床和统计上均有效的测试浓度。此数据是特别令人惊讶的，因为在此
在先前的临床前测试(诸如前述示例中的一个)中，以豚鼠的急性结膜炎模型评估比拉斯汀眼用制剂在4mg/ml(0.4％w/v)和6mg/ml(0.6％w/v)的浓度下的体内活性，结论是，将比拉斯汀的浓度从0.4％增加至0.6％w/v，在有效性和作用持续时间方面没有带来显著的改善。0.6％w/v比拉斯汀在施用后9小时认为是有效的，但12小时后无效。也证实1mg/mL奥洛他定提供更长持续时间的活性，因为在给药后24小时观察到其抑制活性。有趣的是，现有技术证实在人体临床试验中，在组胺诱发的血管渗漏动物模型中，0.2％奥洛他定溶液的作用持续时间延长(Vogelson CT,Abelson MB,Pasquine T,Stephens DM,Gamache DA,Gross RD,Robertson SM,Yanni JM.Preclinical and clinicalantiallergic effect of olopatadine 0.2％solution 24 hours after topicalocular administration.Allergy Asthma Proc.2004,25:69-75)。在另一项临床试验中，0.77％奥洛他定制剂提供的缓解眼睛发痒的作用维持了24小时(Torkildsen G.,NarvekarA.,Bergmann M.Efficacy and safety of olopatadine hydrochloride 0.77％inpatients with allergic conjunctivitis using a conjunctival allergen-challengemodel.Clinical Ophthalmology 2015:9 1703-1713)。
在另一项研究中，以豚鼠的组胺诱发结膜血管渗透性的模型比较比拉斯汀和奥洛他定的抗组胺效应。为了测量体内抗组胺活性，在用局部药物或载体的预治疗和静脉内装载伊凡氏蓝染料后，给予豚鼠结膜下组胺刺激。当在组胺刺激前2至8小时给药比拉斯汀时，未达到50％功效，而奥洛他定保持ED50低于0.1％(May 2008,Volume 49,Issue 13,ARVOAnnual Meeting Abstract,Comparative Effects of Olopatadine,Bepotastine,andBilastine on Conjunctival Mast Cell Stabilization and Histamine-InducedVascular Permeability,C.Beauregard；D.J.Stephens；S.T.Miller；L.Roberts；D.A.Gamache；J.M.Yanni)。因此，到目前为止，现有技术清楚地指出：比拉斯汀和奥洛他定在体内的抗组胺作用的效力或持续时间不能等同。
然而，令人惊讶地，表6和图5-6中的数据显示：如以
目前可用药物治疗的局限性(诸如需要多次每日给药和眼睛副作用)会导致治疗顺应性差或治疗中断，特别是如果对生活质量的负面影响被视为超出过敏性结膜炎本身所带来的负担。此外，每日一次给药的治疗方案已显示出对于患者的顺应性有显著贡献，降低错过给药的风险，且可能改善治疗结果和症状控制。
因此，难以用一剂量抗过敏性眼药水控制过敏性结膜炎症状并因此必须使用第二剂量的患者可受益于具有至少0.4％w/v的比拉斯汀含量的制剂的每日一次给药方案所带来的便利性提升。
实施例5.眼用制剂的眼睛体内生物分布
此实施例证实了实施例4的结果，其是通过显示本发明眼用制剂中的比拉斯汀一旦给药至兔眼，与角膜、虹膜、视网膜和晶状体组织相比，主要存在于结膜中。
制备比拉斯汀浓度为0.6％w/v的比拉斯汀水性眼用制剂。赋形剂如上表1中所示，即，也包含90mg/mL HPB、0.1mg/mL甲基纤维素、1mg/mL透明质酸钠和16.1mg/mL甘油。
此实施例的结果是依照下列良好实验室规范标准获得的：
·Real Decreto(Royal Decree)1369/2000年7月19日(spain)
·OECD Principles of Good Laboratory Practice(1997修订)，ENV/MC/CHEM(98)17；
·2004年2月11日的EC Commission Directive 2004/10/EC；
·Arrêté du 14 Mars 2000(France),2004/10/EC
·OECD ENV/JM/MONO(2002)9，2002年6月25日
·FDA Guidance For Industry-Bioanalytical Method Validation-2018年5月，及
·EMA Guideline on bioanalytical method validation EMEA/CHMP/EWP/192217/2009 Rev 1 Corr 2-2011年7月。
42只4-5个月大的荷兰黑带兔被选为测试对象。治疗开始时动物的体重为1.6至2.1 kg。
动物照顾和饲养：
驯养 12-14天
兽医检查 在到达和开始治疗之前，由兽医检查动物。
条件 使用隔离系统形成最佳卫生条件。空调每小时换气14-16次，连续监测环境，室温范围为19-21℃，湿度介于50和85％之间。12小时荧光灯/12小时黑暗
住处 个别Noryl笼子(65.3×65.3×47cm)。
饮食 自由采食颗粒状标准Teklad 2030C的兔饲料(由Envigo RMS,S.L.供应)。
水 自由饮用瓶装自来水
环境优质化计划 提供针对此物种的不同类型的物质以减轻压力、增强安适感和改善行为。
动物的每只眼睛中每次接受30μL眼用制剂。通过自动吸量管将眼用制剂直接放在每只动物的双眼上。每只眼睛使用新的吸量管尖。
滴注后未洗涤试验动物的眼睛。在给药前称重动物，并在给药后观察以记录任何可能的临床征兆。
在每个时间点(0.5、1、2、4、6、8、12和24小时)处死2至3只动物，并从两只眼睛收集下列组织：房水、玻璃体、角膜、结膜、虹膜/睫状体、晶状体和视网膜/脉络膜。在取样后，直接对所有固体基质进行称重(4位小数精度)以确定所收集的各组织的量。
通过LC-MS/MS测定比拉斯汀浓度。
根据分析方法进行比拉斯汀分析：
-PKH/MOA/1022用于兔血浆，
-PKH/MOA/1042用于兔房水，
-PKH/MOA/1043用于兔玻璃体，
-PKH/MOA/1028用于兔角膜匀浆，
-PKH/MOA/1041用于兔虹膜/睫状体匀浆，
-PKH/MOA/1036用于兔结膜匀浆，
-PKH/MOA/1032用于兔晶状体匀浆，
-PKH/MOA/1029用于兔视网膜/脉络膜匀浆，
其是根据先前由Eurofins|ADME BIOANALYSES开发和验证的the Guidance forIndustry-Bioanalytical Method Validation-FDA 2018年5月和EMA Guideline-EMEA/CHMP/EWP/192217/2009-2011年7月21日，在研究编号18-014A至18-014H中。
分析方法涉及血浆蛋白沉淀并涉及其他基质的稀释，接着以F21201RR(比拉斯汀-d6)作为内标进行LC-MS/MS分析。
结果显示，在给药后24小时，在结膜中发现显著浓度的比拉斯汀(平均值：388.45ng/g)，而其余的眼组织包含较少浓度的比拉斯汀：角膜(平均值：28.68ng/g)、虹膜/睫状体(12.42ng/g)、视网膜/脉络膜(1.91ng/g)和晶状体(0.12ng/g)。
具体实施方式
图1显示了超过6.5mg/mL浓度的比拉斯汀溶液在9％w/v的5种β-环糊精的存在下于不同的pH介质中在t0时的稳定性。
图2显示了超过6.5mg/mL浓度的比拉斯汀溶液在9％w/v的5种β-环糊精的存在下于不同的pH介质中在t1时的稳定性。
图3显示了本发明的组合物的眼平均保留时间(ART)，该组合物包含0.4％w/v的比拉斯汀和9％w/v的HPB。AH是透明质酸钠，GG是结冷胶，MC是甲基纤维素。
图4显示了本发明的眼用制剂在豚鼠中对组胺诱导的结膜炎的效应。
图5显示了使用最小二乘法(LSMeans)计算出以活性-对照的平均眼睛发痒评分来表示治疗差异，在结膜后过敏原激发的不同时间(分钟)：基线，16小时，8小时和15分钟，测量三种比拉斯汀浓度(0.2％w/v比拉斯汀，0.4％w/v比拉斯汀和0.6％w/v比拉斯汀)的治疗差异。
图6显示了后不同时间(分钟)：(基线，16小时，8小时和15分钟时)测得的平均眼睛发痒评分(0-4评分)。
详细说明
本发明人已惊奇地发现，比拉斯汀与至少一种β-环糊精和至少一种药学上可接受的水溶性胶凝剂或其可接受的盐的组合，对于眼科应用最佳，显示在眼睛中优异的长时间作用，这使提供每日一次的包含比拉斯汀的眼科制剂成为可能。令人惊讶地，在临床前试验中无法观察到这些结果，如在关于临床前和临床研究的实施例中所示。因此，在第一方面，本发明提供了一种眼用药物组合物，其包含：
a)至少0.4％w/v的比拉斯汀或其药学上可接受的盐或其溶剂化物，其中所述比拉斯汀或其盐或其溶剂化物完全溶解于所述水性眼用药物组合物中；
b)至少一种β-环糊精，所述β-环糊精选自：烷基-β-环糊精、羟烷基β-环糊精、羧烷基β-环糊精、羰基-β-环糊精、磺基烷基醚β-环糊精及其混合物中的一种或多种，；及
c)至少一种药学上可接受的水溶性胶凝剂或其可接受的盐，其选自：透明质酸、结冷胶、瓜尔豆胶、刺槐豆胶、海藻酸、聚维酮、κ-角叉菜胶、海藻酸盐胶、葡聚糖、硫酸葡聚糖、壳聚糖及其混合物中的一种或多种；
所述组合物的pH值包含在4至9之间，包括该范围的下限和上限。
比拉斯汀
本发明的水性眼用药物组合物包含下式的比拉斯汀：
或其药学上可接受的盐或其溶剂化物。该化合物是2-[4-(2-{4-[1-(2-乙氧基乙基)]-1H-苯并咪唑-2-基]-1-哌啶基}乙基)苯基]-2-甲基丙酸，也称为比拉斯汀(bilastine)。文献EP0818454A1，EP0580541A1和EP3040334A1中描述了比拉斯汀的合成。
比拉斯汀可以是盐或溶剂化物的形式，优选药学上可接受的盐或溶剂化物的形式。
本发明还提供本文所述化合物的“盐”。举例来说，所述盐可以是酸加成盐，碱加成盐或金属盐，并且可以通过本领域技术人员已知的常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。这样的盐通常通过以下方法制备，例如，通过所述化合物的游离酸或碱形式与化学计量的合适的碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备。非水性介质例如***、乙酸乙酯、乙醇、丙酮、异丙醇或乙腈通常是优选的。酸加成盐的说明性实例包括无机酸加成盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等；有机酸加成盐，例如乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、樟脑磺酸盐等。碱加成盐的说明性实例包括无机碱盐，例如铵盐和有机碱盐，再例如乙二胺、乙醇胺、N,N-二亚烷基乙醇胺、三乙醇胺、谷氨酰胺、氨基酸碱式盐等。金属盐的说明性实例包括例如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铝盐和锂盐。
根据本发明，术语“溶剂化物”应理解为任何形式的具有通过非共价键结合的另一分子(最可能是极性溶剂)的本发明活性化合物。溶剂化物的实例包括水合物和醇合物。溶剂化方法在现有技术中通常是已知的。
本发明的化合物也应包括差异仅在于存在一个或多个同位素富集的原子的化合物。例如，除了以氘或氚替换氢，或以13C-或14C富集碳替换碳，或以15N富集氮替换氮之外，具有本发明结构的化合物都在本发明的范围内。
至少为0.4％w/v的浓度意味着在1mL水中有大于4mg的比拉斯汀完全溶解，即没有任何明显的沉淀迹象。在本发明中，除非另有说明，否则所有百分比均以w/v为单位。在另一个实施方案中，比拉斯汀以至少0.6％w/v，优选至少0.7％w/v的浓度完全溶解在本发明的药物组合物中。在另一个实施方案中，比拉斯汀以至少0.6％w/v但不超过1.0％w/v的浓度完全溶解在本发明的药物组合物中。在一个具体的实施方案中，药物组合物包含至少0.4％w/v，至少0.6％w/v，至少0.7％w/v，至少0.8％w/v，至少0.9％w/v，或至少0.6％但不超过1.0％w/v的比拉斯汀，其中比拉斯汀完全溶解。在另一个特定的实施方案中，所述药物组合物包含至少0.4％w/v，至少0.6％w/v，至少0.7％w/v，至少0.8％w/v，至少0.9％w/v，或至少0.6％但不超过1.0％w/v的比拉斯汀，其中比拉斯汀完全溶解。在一个优选的实施方案中，比拉斯汀以至少0.6％w/v但不超过1.0％w/v的浓度完全溶解在本发明的药物组合物中。
环糊精
本发明文中，环糊精(CD)是由在1,4位置连接的5个或更多个β-D-吡喃葡萄糖单元组成的环状结构，一个环糊精分子中通常具有6个(α-环糊精)、7个(β-环糊精)、8个(γ-环糊精)或9个(δ-环糊精)糖单元。
MS值(平均摩尔取代度)是每摩尔吡喃葡萄糖的取代基摩尔平均数。例如，就β-环糊精而言，每个β-环糊精核的平均取代基数可以通过将MS值乘以7(β-环糊精的每个环糊精分子包含7个糖单元)来计算。此值的明确表示法是DS(取代度)。
无定形和结晶环糊精都在本申请的范围内。如本文所用，术语“环糊精”可以指环糊精或环糊精衍生物。环糊精为市售可得或可以通过本领域熟知的方法合成。环糊精的实例包括但不限于经改性或未经改性的α-，β-，γ-和δ-环糊精。本发明的环糊精为β-环糊精。本发明的环糊精衍生物，特别是β-环糊精的衍生物包括其中一些或全部OH基团转化为OR基团的那些衍生物。所述衍生物包括具有C1-6烷基的那些衍生物，例如甲基化、乙基化、丙基化和丁基化的环糊精，其中R为甲基、乙基、丙基或丁基；具有羟烷基取代基的那些，例如羟丙基环糊精或羟乙基环糊精，其中R为-CH2CH(OH)CH3或CH2CH2OH基团；支化的环糊精，例如麦芽糖键合的环糊精；阳离子环糊精；季铵盐；阴离子环糊精，例如羧甲基环糊精、环糊精硫酸盐(cyclodextrin sulfates)和环糊精琥珀酸盐(cyclodextrin succinates)；两性环糊精，例如羧甲基/季铵环糊精。其他具体的改性包括一个或多个羟烷基醚(例如R为C1-6亚烷基羟基)部分；一个或多个磺烷基醚(例如R为C2-6亚烷基SO3 -)部分；羧烷基(例如R为C(O)C1-6烷基)部分；经取代的苯氧基部分；色氨酸部分；或其混合物。每个环糊精分子的OR基团总数定义为取代/改性的程度。
在本发明中，所述眼用药物组合物的环糊精为β-环糊精。在一个优选的实施方案中，所述β-环糊精选自：烷基-β-环糊精、羟烷基β-环糊精、羧烷基-β-环糊精、羰基β-环糊精、磺基烷基醚β-环糊精及其混合物中的一种或多种。
在一个实施方案中，所述β-环糊精为烷基-β-环糊精。优选的烷基-β-环糊精包括甲基β-环糊精；二甲基-β-环糊精；三甲基-β-环糊精；乙基-β-环糊精；二乙基-β-环糊精；丙基-β-环糊精；和丁基-β-环糊精。在更优选的实施方案中，β-环糊精选自甲基-β-环糊精或二甲基-β-环糊精。本发明文中，当使用术语“烷基-β-环糊精”时，是指包括其中烷基部分被任选取代但不包括羟烷基β-环糊精的β-环糊精。
烷基β-环糊精衍生物的取代/改性度优选为约1至约18，约3至约16，约4至约14，约4至约12.6，并且更优选为约4至6。
在一个特定的实施方案中，所述β-环糊精不为烯基-β-环糊精，特别地，所述β-环糊精不为羟基丁烯基-β-环糊精。
在另一个实施方案中，所述环糊精为羟烷基-β-环糊精。优选的羟烷基-β-环糊精包括羟乙基-β-环糊精；羟丙基-β-环糊精(相当于2-羟丙基-β-环糊精)和2-羟丁基-β-环糊精。在一个更优选的实施方案中，所述环糊精为羟丙基-β-环糊精(HPBCD或HR-β-CD)。
羟烷基环糊精衍生物，特别是羟丙基β-环糊精，优选具有约1至约14的取代/改性度，更优选约4至约8。
在另一个实施方案中，所述环糊精为羧烷基-β-环糊精。本文中优选羧烷基-β-环糊精，包括羧甲基-β-环糊精和(2-羧乙基)-β-环糊精。
在另一个实施方案中，所述环糊精为磺基烷基醚β-环糊精。本文中优选磺基烷基醚-β-环糊精为磺基丁基醚-β-环糊精。
磺基烷基醚-β-环糊精衍生物的取代/改性度优选为约1至约14，更优选为约1至约7。
在一个优选的实施方案中，所述环糊精为β-环糊精，其选自：烷基-β-环糊精、羟烷基-β-环糊精、羧烷基-β-环糊精、磺基烷基醚-β-环糊精及其混合物中的一种或多种。
在另一个优选的实施方案中，所述环糊精为β-环糊精，其选自：羟烷基-β-环糊精，羧烷基-β-环糊精，磺基烷基醚-β-环糊精及其混合物中的一种或多种。
在最优选的实施方案中，所述环糊精为β-环糊精，其选自：羟烷基-β-环糊精、磺基烷基醚-β-环糊精及其混合物中的一种或多种。
在本发明的实施例中，使用以下β-环糊精：
-β-CD：β-环糊精(Sigma-Aldrich Ref.：C4767-25G)。
-HR-β-CD：取代度为5.6的2-羟丙基-β-环糊精(Sigma-Aldrich Ref.：332607-5G)。
-HPB：取代度为4.5的2-羟基丙基-β-环糊精，(KleptoseTMRoquette Pharma)。
-CM-β-CD：取代度为3的羧甲基-β-环糊精钠盐(Sigma-Aldrich Ref.：21906-5G)。
-DM-β-CD：七(2,6-二-O-甲基)-β-环糊精(Sigma-Aldrich Ref.：H0513-5G)。
-SBE-β-CD：取代度为6.2-6.9的β-环糊精磺基丁基醚钠盐(USP)(CarbosynthRef.:SBECD)。
在一个优选的实施方案中，所述环糊精为药学上可接受的环糊精。
在一个具体的实施方案中，所述环糊精是以约0.1％至约50％w/v的量存在于所述组合物中。在此，w/v是指重量/体积百分比浓度(g/100mL)，例如，当环糊精以约0.1％至约50％的量存在于组合物中时，是指其以约1mg/mL至约500mg/mL的量存在。在本发明中，除非另有说明，否则所有百分比均以w/v单位表示。在特定的实施方案中，所述环糊精的存在量为约0.25％至约30％，约0.5％至约25％，约1％至约20％，约2％至约15％或约3％至约10％w/v。在一个优选的实施方案中，本发明药物组合物的环糊精的浓度为至少5％w/v，但不超过15％w/v，即约50至150mg/mL。更优选地，所述环糊精的存在量为至少8％但不超过10％w/v。在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物包含9％w/v的环糊精。
胶凝剂
水溶性胶凝剂是指可以增加水溶液(例如本发明的眼用药物组合物)的粘度而实质上不改变其其他性质但形成凝胶的物质，所述凝胶溶解在液相中形成具有弱粘性的内部结构的胶体混合物。在优选的实施方案中，至少一种胶凝剂为用于眼用目的的药学上可接受的胶凝剂。
在一个优选的实施方案中，本发明的眼用药物组合物的至少一种胶凝剂或其可接受的盐选自：透明质酸、结冷胶、瓜尔豆胶、刺槐豆胶、海藻酸、聚维酮、κ-角叉菜胶、海藻酸盐胶、葡聚糖、硫酸葡聚糖、壳聚糖及其混合物中的一种或多种。
在一个优选的实施方案中，所述至少一种药学上可接受的水溶性胶凝剂或其可接受的盐选自透明质酸、结冷胶及其混合物。
因此，在一个优选的实施方案中，所述至少一种药学上可接受的水溶性胶凝剂是透明质酸或其可接受的盐。
在一个具体的实施方案中，所述胶凝剂或其可接受的盐以约0.001％w/v至约2％w/v，优选约0.003％w/v至约1％w/v的量存在于本发明的水性组合物中。在一特定的实施方案中，所述胶凝剂以约0.05％，约0.1％，约0.25％，约0.50％，约0.75％，约1％，约1.5％或约2％的量存在于本发明的水性组合物中。除非另有说明，否则所有百分比均以w/v单位表示。在一个优选的实施方案中，本发明的水性组合物中存在的胶凝剂的量为至少0.05％w/v但不大于1％w/v，最优选为0.1％w/v。
在一个优选的实施方案中，本发明的眼用药物组合物包含：
a)至少0.6％w/v但不超过1.0％w/v的比拉汀或其药学上可接受的盐或其溶剂化物，其中所述比拉汀或其盐或其溶剂化物完全溶解在所述水性眼用药物组合物中；
b)至少一种β-环糊精，所述β-环糊精选自：烷基-β-环糊精、羟烷基β-环糊精、羧烷基β-环糊精、羰基-β-环糊精、磺基烷基醚β-环糊精及其混合物中的一种或多种，；其中所述β-环糊精的浓度至少为5％w/v但不超过15％w/v；和
c)透明质酸或其药学上可接受的盐，其中所述透明质酸或其药学上可接受的盐的浓度为至少0.05％w/v但不超过1％w/v。
在一个具体的实施方案中，所述胶凝剂为透明质酸或其药学上可接受的盐，并且分子量不大于600000Da。胶凝剂的分子量可以根据本领域已知的技术来测量。优选但不限于，所述透明质酸或其药学上可接受的盐的平均分子量可以使用与多角度激光光散射(SEC-MALLS)偶联的尺寸排阻色谱法来确定。或者，所述透明质酸或其药学上可接受的盐的平均分子量也可以使用特性粘度和Mark-Houwink关系式来确定。
进一步实施方案
在一个具体的实施方案中，本发明的眼用药物组合物还包含至少一种药学上可接受的水溶性聚合物作为增粘剂，其选自：纤维素的醚衍生物、聚乙二醇、聚乙烯醇及其混合物中的一种或多种。
水溶性聚合物是指至少部分可溶于水的亲水性聚合物。在一个优选的实施方案中，所述至少一种水溶性聚合物是药学上可接受的水溶性聚合物。
在一个优选的实施方案中，所述至少一种水溶性聚合物是纤维素的醚衍生物，最优选地是甲基纤维素。在另一个实施方案中，所述至少一种水溶性聚合物为聚乙二醇。
在一个具体的实施方案中，所述水溶性聚合物以约0.001％w/v至约15％w/v，优选约0.01％w/v至约15％w/v的量存在于本发明的水性组合物中。在特定的实施方案中，所述水溶性聚合物以约0.01％，约0.05％，约0.1％，约0.25％，约0.50％，约0.75％，约1％，约3％，约5％，约7％，约10％，约13％或约15％的量存在于本发明的水性组合物中。除非另有说明，否则所有百分比均以w/v单位表示。
纤维素醚衍生物
在一个实施方案中，所述水溶性聚合物是纤维素的醚衍生物。纤维素醚衍生物是指纤维素中的羟基已部分或完全被取代而形成纤维素醚(-OR)的纤维素。在一个实施方案中，所述纤维素的醚衍生物选自：烷基纤维素、羟烷基纤维素、羧烷基纤维素及其混合物中的一种或多种。
在一个优选的实施方案中，所述纤维素的醚衍生物选自：羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素、羧烷基纤维素及其混合物中的一种或多种。
在一个实施方案中，所述纤维素醚衍生物为烷基纤维素。本文中优选使用的烷基纤维素包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素、乙基甲基纤维素及其混合物。
在一个实施方案中，所述纤维素醚衍生物为羟烷基纤维素。本文中优选使用的羟烷基纤维素包括羟甲基纤维素(HMC)、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)和乙基羟乙基纤维素。
在一个实施方案中，所述纤维素醚衍生物为羧烷基纤维素。本文中优选使用的羧烷基纤维素包括羧甲基纤维素(CMC)。CMC和羧甲基纤维素钠(CMCNa)是等效的。
聚乙二醇(PEG)
PEG也称为聚环氧乙烷(PEO)或聚氧乙烯(POE)。在一个优选的实施方案中，PEG为低分子量PEG，其意是指分子量在300-1000g/mol之间的PEG。PEG的分子量更优选间于300至500g/mol。在一个优选的实施方案中，所述分子量为400g/mol，即PEG400。
在一个具体的实施方案中，该组合物的克分子渗透压浓度(osmolality)包含在约200mOsm/kg至约640mOsm/kg之间，优选约250mOsm/kg至约600mOsm/kg。在一个优选的实施方案中，所述克分子渗透压浓度为约240mOsm/kg至约340mOsm/kg。本发明的眼用药物溶液的克分子渗透压浓度可以使用本领域公知的标准方法来测量。优选但不限于，本发明的眼用药物溶液的克分子渗透压浓度可以通过用渗透压计测量溶液的冰点降低来确定。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物还可以进一步包含选自下列的渗透压剂或张力剂：甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、赤藓糖醇、***糖醇、木糖醇、核糖醇、半乳糖醇、麦芽糖醇、聚乙二醇、乳糖醇及其混合物中的一种或多种。当存在时，所述渗透压剂或张力剂在本发明的水性组合物中的量为约0.05％、约0.1％、约0.25％、约0.50％、约0.75％、约1％、约1.5％、约1.6％、约2％、约3％、约5％、约7％、约10％、约13％或约15％。在与前者相容的实施方案中，所述渗透压剂或张力剂在本发明的水性组合物中的量小于15％、13％、10％、7％、5％、3％或2％。除非另有说明，否则所有百分比均以w/v单位表示。
在一个优选的实施方案中，当存在时，所述渗透压剂或张力剂在本发明的水性组合物中的量间于0.05％至5％w/v。
在一个特定的实施方案中，发明人惊奇地发现，本发明的组合物是稳定的，并且不需要添加会引起干眼和眼睛刺激的防腐剂，例如苯扎氯铵、咪唑烷基脲、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯氧基乙醇、EDTA二钠、硫柳汞(thimerosal)、氯丁醇和山梨酸。因此，在一个特定的实施方案中，本发明的眼用药物组合物不含防腐剂。
在一个特定的实施方案中，本发明的组合物包含甘油。甘油(Glycerin)是甘油(glycerol)或丙三醇(glycerine)的同义词。优选地，本发明的水性组合物中的甘油的量间于0.05％至5％w/v，更优选间于0.05％至3％w/v。在一个优选的实施方案中，所述甘油作为张力剂存在，其浓度不大于2.5％。在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物包含约1.6％，优选1.61％的甘油。除非另有说明，否则所有百分比均以w/v单位表示。
pH值
本发明的水性药物组合物优选用于眼科用途和/或给药，即适用于这些目的水性眼用药物组合物。眼睛(特别是人眼)的生理pH已知在约6.5-8.0之间。
在一个优选的实施方案中，所述药物组合物的pH值在4至9之间，包括下限和上限。在一些实施方案中，本发明的水性眼用药物组合物的pH为3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1，8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3或9.4。
对于pH值，很容易理解pH值为4也可被认为对应于3.6至4.4的pH范围。类似地，pH值为9也可被认为对应于8.6至9.4的pH范围。在另一个优选的实施方案中，所述药物组合物的pH值为4.0、5.5、7.4、8.0或9.0。
在一个实施方案中，存在一种pH调节剂，其选自盐酸、硼酸、乙酸、氢氧化钠、氢氧化钾或其组合。
在一个实施方案中，存在一种缓冲剂，其选自乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂或其组合。
在另一个实施方案中，所述组合物的pH在维持比拉斯汀的化学、物理和/或生理稳定性并且眼睛良好耐受的范围内。
用途
已经发现，比拉斯汀是组胺H1受体的拮抗剂，因此可用于治疗和/或预防已知容易因组胺H1受体拮抗作用而缓解的疾病。
因此，本发明的一个方面涉及用作药物的如上定义的水性眼用药物组合物。
本发明的另一方面涉及一种用于治疗和/或预防容易通过H1组胺受体的拮抗作用而改善的病症或疾病的如上所定义的水性眼用药物组合物。所述疾病为(例如)过敏性疾病或病症，或源自过敏的症状。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种如上定义的用于治疗和/或预防眼部过敏性病症、过敏性疾病或过敏性症状的水性眼用药物组合物。优选地，过敏性疾病、病症或症状选自鼻炎、鼻结膜炎、过敏性结膜炎、春季角膜结膜炎、特应性角膜结膜炎、***突状结膜炎、眼刺激性、发痒、发红、流泪、结膜水肿、干性角膜炎、干燥性角膜结膜炎或功能障碍性泪液综合征。在一个优选的实施方案中，所述过敏性疾病或病症选自鼻炎、鼻结膜炎、过敏性结膜炎、春季角膜结膜炎、特应性角膜结膜炎、***突状结膜炎和结膜水肿。在另一个优选的实施方案中，过敏症状选自眼刺激、发痒、发红、流泪、干燥性角膜炎、干燥性角结膜炎或功能障碍性泪液综合征。在本发明的上下文中，干眼症包括干燥性角膜炎、干燥性角膜结膜炎或功能障碍性泪液综合征。
优选地，本发明涉及一种如上定义的用于治疗和/或预防过敏性结膜炎的水性眼用药物组合物。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及一种如上定义的用于治疗和/或预防干眼症的水性眼用药物组合物。在一个更优选的实施方案中，本发明涉及一种如上定义的用于同时治疗和/或预防过敏性结膜炎和干眼症的水性眼用药物组合物。
在本说明书的上下文中，术语“治疗”(treatment或to treat)是指给予根据本发明的化合物或制剂以改善或消除所述疾病或与所述疾病相关的一种或多种症状。“治疗”还包括改善或消除所述疾病的生理后遗症。
在本发明的上下文中，术语“改善”应理解为是指对所治疗患者的状况的任何改善。
在本说明书的上下文中，术语“预防”(prevention或者to prevent)是指给予根据本发明的化合物或制剂以降低获得或发展所述疾病或与所述疾病相关的一种或多种症状的风险。
药物组合物
“水性眼用药物组合物”一词是指适合眼用的包含水的液体药物组合物。
在一个实施方案中，比拉斯汀以至少0.4％w/v的浓度完全溶解在本发明的水性眼用药物组合物中。在另一个实施方案中，比拉斯汀以至少0.6％w/v，优选至少0.7％的浓度完全溶解在本发明的水性眼用药物组合物中。在另一个实施方案中，比拉斯汀以范围在0.6至1.0w/v％之间的浓度，优选地以范围在0.6至0.9w/v％之间的浓度，更优选地以范围在0.6至0.8w/v％之间的浓度完全溶解在本发明的水性眼用药物组合物中。优选地，比拉斯汀以0.6％w/v的浓度完全溶解在本发明的水性眼用药物组合物中。在此，w/v％是指重量/体积百分比浓度(g/100mL)，例如，当组合物中的比拉斯汀以约0.6％至约1.0％的量存在时，是指其以约6mg/mL至约10mg/mL的量存在。在本发明中，除非另有说明，否则所有百分比均以w/v单位表示。
在一个实施方案中，比拉斯汀在本发明的药物组合物中的量优选为大于4500μg/mL，优选为大于6000μg/mL，优选为大于6500μg/mL，优选为大于7000μg/mL，优选为大于7500μg/mL，优选为大于8000μg/mL，优选为大于8500μg/mL，优选为大于9000μg/mL，和更优选为大于9500μg/mL。在一优选实施方案中，比拉斯汀在本发明的药物组合物中的量低于10500μg/mL。
在一个特定实施方案中，所述水性眼用药物组合物包含比拉斯汀、β-环糊精和透明质酸或其可接受的盐，其中所述比拉斯汀完全溶解在所述水性眼用药物组合物中。在另一个特定实施方案中，所述水性眼用药物组合物包含比拉斯汀、羟丙基-β-环糊精和透明质酸或其可接受的盐，其中所述比拉斯汀完全溶解在所述水性眼用药物组合物中。
“治疗有效量”一词意指给药时药物提供其中所含的一种或多种药物活性剂在治疗或控制疾病或疾病状态方面获得疗效的量。
在一个优选实施方案中，本发明的药物组合物包含治疗有效量的比拉斯汀。
本发明的水性眼用药物组合物可进一步包含药学上可接受的赋形剂。
“药学上可接受的赋形剂”一词是指与活性成分一起给药的载体、稀释剂或佐剂。所述药学上可接受的赋形剂可为无菌液体，例如水和油，包括来自石油、动物、植物或合成的；例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油及类似物。水或盐水溶液，以及葡萄糖和甘油水溶液，优选用作为载体，特别是用于可注射溶液。适当药物载体描述于E.W.Martin的2005年第21版“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中。
制造本发明的药物组合物给药所需的药物形式所必需的赋形剂和辅助物质，除其他因素外，将取决于所选择的给药药物形式。所述药物组合物的给药的药物形式将根据本领域技术人员已知的常规方法来制造。不同活性成分的给药方法、要使用的赋形剂及其生产方法的综述可见于“Tratado de Farmacia Galénica”,C.Faulí i Trillo,Luzán 5,S.A.de Ediciones,1993。
“药学上可接受的”一词是指生理上可耐受且当施用于人或动物时通常不会产生过敏反应或类似的不良反应(如胃病、头晕及诸如此类者)的组合物和分子实体。优选地，术语“药学上可接受的”意指其被州或联邦政府的监管机构所批准，或涵盖在美国药典或其他公认的药典中用于动物，尤其是用于人类。
本文所揭示的制剂也可选地进一步包含一种或多种眼用赋形剂。作为非限制性实例，眼用赋形剂包括至少一种选自黏膜黏着剂、防腐剂、pH调整剂、张力调整剂(tonicity-adjusting agent)、缓冲剂、抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、化学防腐剂、增黏剂或其组合试剂。在一特定实施方案中，所述眼用组合物进一步包含水溶性聚合物，如上述所定义。
在一特定实施方案中，本发明的组合物不包含皮质类固醇。
在一优选实施方案中，所述眼用药物组合物包含：
a)至少0.6％w/v但不大于1.0％w/v的比拉斯汀或其药学上可接受的盐或其溶剂化物，其中所述比拉斯汀或其盐或其溶剂化物完全溶解在所述水性眼用药物组合物中；
b)至少一种羟烷基β-环糊精，其中所述β-环糊精的浓度为至少5％w/v但不大于15％w/v；
c)透明质酸或其药学上可接受的盐，其中所述透明质酸或其药学上可接受的盐的浓度为至少0.05％w/v但不大于1％w/v；
d)从0.001％w/v至15％w/v的至少一种药学上可接受的水溶性聚合物，其选自：纤维素醚衍生物、聚乙二醇、聚乙烯醇及其混合物中的一种或多种；及
e)从0.05％w/v至5％w/v的至少一种张力剂，所述张力剂选自：甘油、山梨醇、甘露醇、赤藓糖醇、***糖醇、木糖醇、核糖醇、半乳糖醇、麦芽糖醇、聚乙二醇、乳糖醇及其混合物中的一种或多种。
在另一优选实施方案中，所述眼用药物组合物包含：
a)至少0.6％w/v但不大于1.0％w/v的比拉斯汀或其药学上可接受的盐或其溶剂化物，其中所述比拉斯汀或其盐或其溶剂化物完全溶解在所述水性眼用药物组合物中；
b)至少一种羟烷基β-环糊精，其中所述β-环糊精的浓度为至少5％w/v但不大于15％w/v；
c)透明质酸或其药学上可接受的盐，其中所述透明质酸或其药学上可接受的盐的浓度为至少0.05％w/v但不大于1％w/v；
d)从0.001％w/v至15％w/v纤维素醚衍生物；及
e)从0.05％w/v至5％w/v的甘油。
在一更优选实施方案中，所述眼用药物组合物包含：
a)至少0.6％w/v但不大于1.0％w/v的比拉斯汀或其药学上可接受的盐或其溶剂化物，其中所述比拉斯汀或其盐或其溶剂化物完全溶解在所述水性眼用药物组合物中；
b)至少一种羟烷基β-环糊精，其中所述β-环糊精的浓度为至少5％w/v但不大于15％w/v；
c)透明质酸或其药学上可接受的盐，其中所述透明质酸或其药学上可接受的盐的浓度为至少0.05％w/v但不大于1％w/v；
d)从0.005％w/v至0.1％w/v的甲基纤维素；及
e)从0.5％w/v至2％w/v的甘油。
下表1提供了适合于本发明的眼用组合物的示例性优选制剂的示例性成分，以及这些成分所需的重量/体积百分比的列表。应理解，除非另有具体说明，下列表1为示例性的，可从表中加入或去除某些成分且可改变某些成分的浓度，制剂可保持在本发明的范围内。
表1本发明的眼用组合物的示例性优选制剂及各成分所需的重量/体积百分比
成分
w/v％
比拉斯汀
0.6
β-环糊精(羟丙基β-环糊精)
9.0
胶凝剂(透明质酸钠)
0.1
张力剂(甘油)
1.61
增黏剂(甲基纤维素)
0.01
pH调节剂(NaOH或HCl)
量足以达到pH＝7.4
纯化水
适量至100
药物形式
药物组合物的实例包括用于局部给药至眼睛的任何液体组合物。液体形式为溶液、悬浮液或乳液。
用于局部给药至眼睛的适当制剂的实例包括眼药水(即滴眼剂或人工泪液)、眼用乳剂和眼用软膏剂。在一特定实施方案中，本发明的组合物是眼用制剂的形式如眼药水。眼用制剂可包括适当抗微生物剂。在一优选实施方案中，所述眼用制剂不包括防腐剂。在一更优选实施方案中，所述眼用制剂不包括选自下列的防腐剂：苯扎氯铵(benzalkoniumchloride)、咪唑烷基脲、对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、苯氧基乙醇、EDTA二钠、硫柳汞(thimerosal)、氯丁醇和山梨酸。
本发明提供一种如上定义的眼用药物组合物。在一优选实施方案中，所述眼用药物组合物为每日一次给药的药物组合物。
下列示例仅仅是对本发明的某些实施例的说明，不能被认为以任何方式对其加以限制。
实施例
材料和方法
已使用下列材料：比拉斯汀(由Sai Life Sciences供应，批号5000011325)；上述的环糊精如β-CD、HP-β-CD、HPB、CM-β-CD、DM-β-CD和SBE-β-CD；甲基纤维素1500(MC1500)(Acofarma)；结冷胶(GG)(Kelcogel CG-LA,CPKelco)、透明质酸钠(Caref)和甘油(Merck-Millipore)。下列实施例所使用的水为使用Merck-Millipore的净水系统获得的纯化水。
实施例1.超过6.5mg/mL比拉斯汀在25℃下于9％的不同的β-环糊精的存在下于水 溶液中在不同pH值的稳定性
此实施例显示浓度超过6.5mg/mL(0.65％w/v)的比拉斯汀溶液于9.0％w/v的五种环糊精(β-CD、HP-β-CD、CM-β-CD、DM-β-CD和SBE-β-CD)存在下于水溶液中在不同pH值的稳定性。如下所示，由从碱性溶液开始调整而获得各pH值。
在非缓冲溶液中的比拉斯汀(pH调整)
a.在碱性介质中的7mg/mL的比拉斯汀溶液：将70mg的比拉斯汀加至10mL容量瓶中。添加大约5mL的去离子水且接着滴加1M NaOH，同时摇动混合物直至所有的比拉斯汀溶解。接着，添加900mg对应的环糊精，摇动混合物直至环糊精完全溶解(除了不能导致完全溶解的β-CD的特定情况之外)。接着将体积调整至10mL。
b.将900μL的步骤a中所制备的五种比拉斯汀+环糊精溶液分别转移到单独的EP管(Eppendorf tubes)中。
c.在各EP管中，根据需要小心地加入50％AcOH、1M HCl或1M NaOH而将pH调整至所需值。
t0＝0天
将溶液保持在30℃下搅拌1小时，其后测量比拉斯汀浓度。
t1＝7天
在t0分析后，将溶液在恒温室中于22±2℃下保持7天不搅拌，之后再分析。
在恒定搅拌(100 rpm)下将每个EP管引入培养器(
表2在9％w/v的不同环糊精的存在下，在不同pH值的非缓冲水溶液中比拉斯汀在t0时的浓度(目标浓度7mg/mL)
比拉斯汀的浓度相对7mg/mL的偏差是由pH调整步骤后的稀释效应所引起的。
表3在9％w/v的不同环糊精的存在下，在不同pH值的非缓冲水溶液中比拉斯汀在t1(7天)时的浓度(目标浓度7mg/mL)
1周后，这些数值仍超过6.5 mg/mL。与t0时的结果相比，比拉斯汀的浓度有小但普遍增加，这是由溶剂的轻微蒸发所引起的。
此实施例显示了就4.0至9.0的pH范围而言，在30℃下1小时后和在22℃下7天后，在非缓冲溶液中超过6.5 mg/mL的比拉斯汀浓度是稳定的。这些结果表示于图1(t0)和图2(t1)中。
实施例2.0.4％w/v比拉斯汀和9％HPB在不同组合物中的眼部生物黏着性
通过正电子发射断层扫描技术(PET)扫描测量含有0.4％w/v比拉斯汀和9％HPB的组合物在动物(大鼠)眼中的生物黏着性。组合物中的增黏剂和张力剂(甲基纤维素和甘油)及胶凝剂(透明质酸钠和/或结冷胶)的含量不同。正电子发射示踪剂18FDG的添加使得以测量各组合物在大鼠眼组织中的平均滞留时间。
表4包含0.4％w/v比拉斯汀和9％HPB的本发明的组合物的眼部平均滞留时间(ART)
表4显示当透明质酸钠(HA)、结冷胶(GG)、或AH和GG的混合物与比拉斯汀和HPB环糊精在有及没有甲基纤维素(MC)和甘油下组合使用时达成最长滞留时间，或眼部生物黏着性。因此，结果显示至少GG或HA适合于增加包含比拉斯汀和HPB以及可选地MC和甘油的组合物的眼部滞留时间。结果如图3所示。
实施例3.眼用制剂的临床前体内疗效
动物模型
使用雄性Dunkin-Hartley豚鼠，在接收时重300-349g(Harlan LaboratoriesInc./Envigo)并保持在标准收容条件(2只动物/笼)。在连续两次使用之间至少4天的洗涤期后才再次使用动物(每组6-10只)，以使眼睛结膜完全恢复。
实验程序
制备两种比拉斯汀浓度为0.4％和0.6％w/v的比拉斯汀的水性眼用制剂。两种制剂也包含90mg/mL HPB、0.1mg/mL甲基纤维素、1mg/mL透明质酸钠和16.1mg/mL甘油。
通过滴注将眼用制剂施加在右眼(25μL)中，保持动物固定2至3分钟以确保产物在结膜囊中的持久性。接下来，用市售滴眼剂，左眼接受相同体积的对应载体(vehicle)或0.9％NaCl。每只动物都有自己的阳性对照组。
一旦经过既定的时间(其可能是10分钟到24小时)，通过在每只眼睛中给药组胺二盐酸盐溶液(在0.9％NaCl中，5％，25μL/眼)以诱发急性结膜炎，保持动物固定2至3分钟。在施加30分钟后评估对组胺的反应。
以下列参数对每只眼睛评分：水肿程度(结膜水肿)、结膜发红和血管注射(结膜充血)和泪液分泌(泪溢)。根据0至4的主观量表评估严重程度(指南OECD测试编号405：0＝正常；1＝最小；2＝中度；3＝强烈；4＝严重)。将各眼中各参数的个别得分相加的结果被认为是整体结膜炎程度的平均值(0到12之间的总得分)。
统计
未达到统计学显著性或达到统计学显著性但拮抗组胺效应百分比为≤30％之制剂被认为是无活性的。对于每次治疗，计算对照眼(左)和抗组胺药治疗的眼(右)的总评分的平均值。此外，根据下列公式计算抑制百分比(药理效应的平均值)：
抑制(％)＝[(对照组得分-治疗组得分)/对照组得分]×100
统计分析涉及使用非参数检验“Wilcoxon Signed Rank test”(配对数据)和“Mann-Whitney U-Test”(用于独立数据)，以便分别比较各治疗与其对应的对照组和治疗组之间的差异。当p<0.05时，考虑是统计学上显著的差异。
商业制剂的效果
0.5mg/ml氮卓斯汀(azelastine)
比拉斯汀浓度的影响
制备上述4mg/mL(0.4％w/v)比拉斯汀制剂并测定其作用时间。以类似于0.5mg/mL氮卓斯汀的方式，用此制剂获得的抗豚鼠中组胺诱发的结膜炎活性在其施用后9小时仍然显著(36.4％抑制，图4)。
同样制备上述6mg/mL(0.6％w/v)比拉斯汀制剂，且其活性与4mg/mL比拉斯汀比较。所得结果表明，最高比拉斯汀浓度给药后9小时(40.5％抑制和36.4％抑制)和12h(29.0％抑制和20.4％抑制)，在抑制百分比方面，几乎没有提高。在任何时间都没有发现统计差异。在相同的时间间隔，1mg/mL奥洛他定显示出强活性(在给药后9和12小时分别为75.9％抑制和63.9％抑制)。结论是，比拉斯汀浓度的增加在有效性和作用持续时间方面并没有引起显著提高。
甲基纤维素的影响
比较在含有或不含有0.1mg/mL甲基纤维素下等量的0.4％w/v比拉斯汀制剂的有效性。两种配方也包含100mg/mL HPB、1mg/mL透明质酸钠和2mg/mL结冷胶。在给药后9小时，两种制剂均显示出明显的活性(组胺诱发效应的拮抗作用分别为44.7％和47.4％)。这些结果表明甲基纤维素对0.4％w/v比拉斯汀制剂的活性的持续时间没有产生相关的贡献。
甘油的影响
比较在含有或不含有16.1mg/mL甘油下等量的0.4％w/v比拉斯汀制剂的有效性。两种制剂也包含100mg/mL HPB、0.1mg/mL甲基纤维素、1mg/mL透明质酸钠和2mg/mL结冷胶。在给药后9小时，两种制剂均有活性(含甘油和不含甘油的制剂分别为33.5％抑制和45.8％抑制)。在12小时给药，两种制剂明显无活性(分别为24.5％和26.7％的拮抗作用)。在任何时间都没有发现统计差异。这些结果表明甘油对0.4％w/v比拉斯汀制剂的活性的持续期间没有产生相关的贡献。
实施例4.眼用制剂的临床体内疗效
此实施例连同表5-6和图5-6显示在结膜过敏原激发(
制备比拉斯汀浓度为0.2％w/v、0.4％和0.6％w/v的比拉斯汀水性眼用制剂。空白制剂(vehicle formulation)不包含任何比拉斯汀。赋形剂如上表1中所示，即，还包含90mg/mL HPB、0.1mg/mL甲基纤维素、1mg/mL透明质酸钠和16.1mg/mL甘油。
在测试和过敏性结膜炎征兆和症状评估之前15分钟、8或16小时给药一剂量(每眼一滴)的指定测试样品。该研究由大约六到十周期间的八次门诊组成。功效系由ORAInc.(Andover,Massachusetts,United States,01810)使用
在筛选期间，在第1次就诊时，受试者签署知情同意书并进行过敏性皮肤试验。在第2次就诊时，每位合格受试者使用他们阳性反应的过敏原进行双侧
在受试者随机化后，于第4a次就诊开始治疗期。在这次就诊时，受试者接受了随机分配的办公室内(in-office)剂量的治疗。滴注研究药物后大约16小时，受试者在第4b次就诊时进行
在随访期间，在第29(±3)天对所有受试者进行电话追踪。表5显示就诊计划的摘要。
表5就诊计划的摘要
在一个(1)地点，总共筛选了220位受试者以登记约120名受试者。主要目的是测量过敏性结膜炎的主要症状眼睛发痒。
在模型中，每位患者服用药物或载体，并在特定刺激时间接触过敏原。该研究的刺激时间为给药后15分钟、8小时和16小时。其后，于第4b(研究药物滴注后16小时)、5b(研究药物滴注后8小时)、和6(滴注后15分钟)次就诊，在刺激时间后3、5和7分钟的测定时间测定发痒。要求患者按0到4的等级(允许半个单位增量)评定他们的眼睛发痒以获得发痒评分，且在各评分中0为最小，4为最大。因此，患者接受三剂药物或载体，并且各剂量之后进行过敏原刺激，然后如所讨论的由受试者评估眼睛发痒。
治疗成功的定义是至少一种浓度的比拉斯汀眼用溶液显示出：对于所有3次时间点后，超过载体至少0.5个单位的临床优势，且对于大多数时间点后，超过至少1个单位。表6中提供于各个时间点测定的结果，且数据以图5和图6的形式提供。
表6最小二乘法(LSMeans)计算活性-载体的平均眼痒评分治疗差异
*在治疗差异中无临床显著性。
0.6％w/v比拉斯汀在研究药物滴注后15分钟(第6次就诊)、8小时(第5b次就诊)和16小时(第4b次就诊)在眼睛发痒的缓解方面有临床上显著治疗差异。0.2％w/v和0.4％w/v比拉斯汀在研究药物滴注后15分钟(第6次就诊)和8小时(第5b次就诊)在治疗眼睛发痒方面具有临床上显著治疗差异。在所有就诊中，在眼睛发痒的治疗中所有浓度的比拉斯汀与载体相比均显示出有统计学上的显著差异。
从表6和图5-6可以看出，对于眼睛发痒的治疗，当在(第4b次就诊)之前16小时给予时，浓度0.6％w/v的比拉斯汀是唯一显示在临床和统计上均有效的测试浓度。此数据是特别令人惊讶的，因为在此
在先前的临床前测试(诸如前述示例中的一个)中，以豚鼠的急性结膜炎模型评估比拉斯汀眼用制剂在4mg/ml(0.4％w/v)和6mg/ml(0.6％w/v)的浓度下的体内活性，结论是，将比拉斯汀的浓度从0.4％增加至0.6％w/v，在有效性和作用持续时间方面没有带来显著的改善。0.6％w/v比拉斯汀在施用后9小时认为是有效的，但12小时后无效。也证实1mg/mL奥洛他定提供更长持续时间的活性，因为在给药后24小时观察到其抑制活性。有趣的是，现有技术证实在人体临床试验中，在组胺诱发的血管渗漏动物模型中，0.2％奥洛他定溶液的作用持续时间延长(Vogelson CT,Abelson MB,Pasquine T,Stephens DM,Gamache DA,Gross RD,Robertson SM,Yanni JM.Preclinical and clinicalantiallergic effect of olopatadine 0.2％solution 24 hours after topicalocular administration.Allergy Asthma Proc.2004,25:69-75)。在另一项临床试验中，0.77％奥洛他定制剂提供的缓解眼睛发痒的作用维持了24小时(Torkildsen G.,NarvekarA.,Bergmann M.Efficacy and safety of olopatadine hydrochloride 0.77％inpatients with allergic conjunctivitis using a conjunctival allergen-challengemodel.Clinical Ophthalmology 2015:9 1703-1713)。
在另一项研究中，以豚鼠的组胺诱发结膜血管渗透性的模型比较比拉斯汀和奥洛他定的抗组胺效应。为了测量体内抗组胺活性，在用局部药物或载体的预治疗和静脉内装载伊凡氏蓝染料后，给予豚鼠结膜下组胺刺激。当在组胺刺激前2至8小时给药比拉斯汀时，未达到50％功效，而奥洛他定保持ED50低于0.1％(May 2008,Volume 49,Issue 13,ARVOAnnual Meeting Abstract,Comparative Effects of Olopatadine,Bepotastine,andBilastine on Conjunctival Mast Cell Stabilization and Histamine-InducedVascular Permeability,C.Beauregard；D.J.Stephens；S.T.Miller；L.Roberts；D.A.Gamache；J.M.Yanni)。因此，到目前为止，现有技术清楚地指出：比拉斯汀和奥洛他定在体内的抗组胺作用的效力或持续时间不能等同。
然而，令人惊讶地，表6和图5-6中的数据显示：如以
目前可用药物治疗的局限性(诸如需要多次每日给药和眼睛副作用)会导致治疗顺应性差或治疗中断，特别是如果对生活质量的负面影响被视为超出过敏性结膜炎本身所带来的负担。此外，每日一次给药的治疗方案已显示出对于患者的顺应性有显著贡献，降低错过给药的风险，且可能改善治疗结果和症状控制。
因此，难以用一剂量抗过敏性眼药水控制过敏性结膜炎症状并因此必须使用第二剂量的患者可受益于具有至少0.4％w/v的比拉斯汀含量的制剂的每日一次给药方案所带来的便利性提升。
实施例5.眼用制剂的眼睛体内生物分布
此实施例证实了实施例4的结果，其是通过显示本发明眼用制剂中的比拉斯汀一旦给药至兔眼，与角膜、虹膜、视网膜和晶状体组织相比，主要存在于结膜中。
制备比拉斯汀浓度为0.6％w/v的比拉斯汀水性眼用制剂。赋形剂如上表1中所示，即，也包含90mg/mL HPB、0.1mg/mL甲基纤维素、1mg/mL透明质酸钠和16.1mg/mL甘油。
此实施例的结果是依照下列良好实验室规范标准获得的：
·Real Decreto(Royal Decree)1369/2000年7月19日(spain)
·OECD Principles of Good Laboratory Practice(1997修订)，ENV/MC/CHEM(98)17；
·2004年2月11日的EC Commission Directive 2004/10/EC；
·Arrêté du 14 Mars 2000(France),2004/10/EC
·OECD ENV/JM/MONO(2002)9，2002年6月25日
·FDA Guidance For Industry-Bioanalytical Method Validation-2018年5月，及
·EMA Guideline on bioanalytical method validation EMEA/CHMP/EWP/192217/2009 Rev 1 Corr 2-2011年7月。
42只4-5个月大的荷兰黑带兔被选为测试对象。治疗开始时动物的体重为1.6至2.1 kg。
动物照顾和饲养：
驯养 12-14天
兽医检查 在到达和开始治疗之前，由兽医检查动物。
条件 使用隔离系统形成最佳卫生条件。空调每小时换气14-16次，连续监测环境，室温范围为19-21℃，湿度介于50和85％之间。12小时荧光灯/12小时黑暗
住处 个别Noryl笼子(65.3×65.3×47cm)。
饮食 自由采食颗粒状标准Teklad 2030C的兔饲料(由Envigo RMS,S.L.供应)。
水 自由饮用瓶装自来水
环境优质化计划 提供针对此物种的不同类型的物质以减轻压力、增强安适感和改善行为。
动物的每只眼睛中每次接受30μL眼用制剂。通过自动吸量管将眼用制剂直接放在每只动物的双眼上。每只眼睛使用新的吸量管尖。
滴注后未洗涤试验动物的眼睛。在给药前称重动物，并在给药后观察以记录任何可能的临床征兆。
在每个时间点(0.5、1、2、4、6、8、12和24小时)处死2至3只动物，并从两只眼睛收集下列组织：房水、玻璃体、角膜、结膜、虹膜/睫状体、晶状体和视网膜/脉络膜。在取样后，直接对所有固体基质进行称重(4位小数精度)以确定所收集的各组织的量。
通过LC-MS/MS测定比拉斯汀浓度。
根据分析方法进行比拉斯汀分析：
-PKH/MOA/1022用于兔血浆，
-PKH/MOA/1042用于兔房水，
-PKH/MOA/1043用于兔玻璃体，
-PKH/MOA/1028用于兔角膜匀浆，
-PKH/MOA/1041用于兔虹膜/睫状体匀浆，
-PKH/MOA/1036用于兔结膜匀浆，
-PKH/MOA/1032用于兔晶状体匀浆，
-PKH/MOA/1029用于兔视网膜/脉络膜匀浆，
其是根据先前由Eurofins|ADME BIOANALYSES开发和验证的the Guidance forIndustry-Bioanalytical Method Validation-FDA 2018年5月和EMA Guideline-EMEA/CHMP/EWP/192217/2009-2011年7月21日，在研究编号18-014A至18-014H中。
分析方法涉及血浆蛋白沉淀并涉及其他基质的稀释，接着以F21201RR(比拉斯汀-d6)作为内标进行LC-MS/MS分析。
结果显示，在给药后24小时，在结膜中发现显著浓度的比拉斯汀(平均值：388.45ng/g)，而其余的眼组织包含较少浓度的比拉斯汀：角膜(平均值：28.68ng/g)、虹膜/睫状体(12.42ng/g)、视网膜/脉络膜(1.91ng/g)和晶状体(0.12ng/g)。
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