阅读说明：本技术 新甾体皂苷类化合物及其制备方法和在制备治疗2型糖尿病药物中的应用 (New steroid saponin compound, preparation method thereof and application thereof in preparing medicament for treating type 2 diabetes ) 是由 丛悦 郭敬功 刘*** 王书云 李钦 于 2020-07-03 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,涉及从韭菜子中提取新甾体皂苷类化合物,尤其是韭菜子苷A(Alliumin A)、韭菜子苷B(Alliumin B)、韭菜子苷C(Alliumin C)、韭菜子苷D(Alliumin D)、韭菜子苷E(Alliumin E)；其结构通式如下所示,<Image he="216" wi="556" file="100004_DEST_PATH_IMAGE001.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>经动物实验发现,该甾体皂苷类化合物可以显著降低小鼠空腹血糖、糖化血清蛋白(GSP)、甘油三酯(TG)水平,可用于制备预防和治疗2型糖尿病的药物、保健品或食品等。本发明化合物制备方法简便,溶剂可回收利用,提取量大,可工业化生产并且韭菜子来源广泛,取材便利。(The invention belongs to the technical field of medicines, and relates to a new steroid saponin compound extracted from semen allii tuberosi, in particular to allin A (alliumin A), allin B (alliumin B), allin C (alliumin C), allin D (alliumin D) and allin E (alliumin E); the general formula of the structure is shown as follows, animal experiments show that the steroid saponin compound can obviously reduce fasting blood glucose and saccharification of miceSerum Protein (GSP) and Triglyceride (TG) levels, and can be used for preparing medicine, health product or food for preventing and treating type 2 diabetes. The compound of the invention has simple preparation method, recyclable solvent, large extraction amount, wide source of the semen allii tuberosi and convenient material taking, and can be industrially produced.)

新甾体皂苷类化合物及其制备方法和在制备治疗2型糖尿病 药物中的应用

技术领域

本发明属于药学技术领域，具体涉及五种新的甾体皂苷类化合物及其制备方法和在制备2型糖尿病药物中的应用。

背景技术

2型糖尿病是一种复杂的慢性代谢紊乱性疾病，病因主要是胰岛素抵抗和胰岛素缺乏引起的胰腺β-cell功能障碍；其特点是糖、脂类和蛋白质代谢紊乱，临床症状为血糖升高、多饮、多尿、多食和消瘦，疲乏无力。2型糖尿病可引起多种脏器损伤，从而产生多种并发症，已成为全球主要的健康问题。2型糖尿病的发病率日益升高成为21世纪全球公共卫生关注的问题，环境因素和遗传因素等导致了糖尿病的流行加速。目前，饮食和运动与药物治疗相结合是治疗糖尿病的常用策略，临床上药物治疗主要是口服降糖药和胰岛素注射。然而，目前大多数降糖药对人体产生毒副作用，长期注射胰岛素也可增强胰岛素抵抗，因此寻找新的治疗或预防2型糖尿病的药物或保健品迫在眉睫。

韭菜子(Semen Allii Tuberose)是百合科葱属多年生植物韭菜(Alliiumtuberosum Rottl.exSpreng.)的干燥成熟种子，为药食同源的中药，具有补肝益肾、健脾提神、行气理血、润肠通便等功效，用于肝肾亏虚，腰膝酸痛，阳痿遗精等，收载于《中国药典》。研究表明韭菜子化学成分主要有生物碱类、硫化物、黄酮类等化合物。现代药理研究证明韭菜子具有温肾壮阳、加强免疫、抗氧化、抗衰老、抑菌等作用。韭菜子为药食同源的中药，并为韭菜生产的附属产品，韭菜种植面积广泛、货源充足。但目前从韭菜子中大量提取甾体皂苷的报道较少，尚无从韭菜子提取获得的新甾体皂苷类化合物以及其对2型糖尿病小鼠治疗的相关报道。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一新的甾体皂苷类化合物及其制备方法，本发明经试验发现：该甾体皂苷类化合物可用于制备预防和治疗2型糖尿病的药物、食品或保健品等。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

新甾体皂苷类化合物，其结构通式如下所示，

式中，R为H或OH，R₂为H或OH，R₃为H或OH，R₄为CH₃或OH，R₅为H、OH或CH₃，

R₁为

R₆为

其中，GLC为葡萄糖，RHA为鼠李糖，XYL为木糖。

进一步优选，上述的新甾体皂苷类化合物，其包括韭菜子苷A(Alliumin A)、韭菜子苷B(Alliumin B)、韭菜子苷C(Alliumin C)、韭菜子苷D(Alliumin D)和韭菜子苷E(Alliumin E)，具体结构式如下所示：

以及韭菜子苷B

本发明提供了上述新甾体皂苷类化合物的制备方法，其具体包括如下步骤：

1)将粉碎后的韭菜子、炒韭菜子或者盐炙韭菜子的干粉，用30-40％乙醇加热回流提取1-2小时，提取2-3次，合并提取液，减压回收乙醇，获得水提液；

2)水提液用大孔吸附树脂吸附，然后依次用水(水洗脱液弃掉)、30％乙醇、60％乙醇梯度洗脱，分别收集30％乙醇洗脱液、60％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，分别得到组分A和组分B；

3)组分A经ODS开放柱纯化，用30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇梯度洗脱，收集50％甲醇洗脱液和70％甲醇洗脱液，合并后减压回收溶剂，得到组分A1；

4)组分A1经ODS开放柱纯化，用35％甲醇、55％甲醇、75％甲醇梯度洗脱，分别收集55％甲醇洗脱液、75％甲醇洗脱液，减压回收溶剂，分别得到组分A1-1和A1-2；

5)组分A1-1经制备型高效液相，以流速6ml/min、波长203nm、63％甲醇水混合液进行等度洗脱，得到韭菜子苷A和韭菜子苷B；

6)组分A1-2经半制备型高效液相，以流速6ml/min、波长203nm、21％乙腈水混合液进行等度洗脱，得到韭菜子苷E和韭菜子苷C；

7)组分B经ODS开放柱纯化，用40％甲醇、50％甲醇、70％甲醇梯度洗脱，收集50％甲醇洗脱液、70％甲醇洗脱液，合并后减压回收溶剂，以TLC薄层色谱检测合并，得到四个组分，按照所得组分极性由大到小依次标记为组分B1～B4；将组分B2经半制备型高效液相，以流速6ml/min、波长203nm、23％乙腈水混合液进行等度洗脱，得到韭菜子苷D。

进一步的，步骤2)中，所述大孔吸附树脂的型号为HPD100、HPD600、HPD400、D101、AB-8、ADS-17或DM130等。

本发明还提供了上述新甾体皂苷类化合物在制备预防和治疗2型糖尿病药物、功能性食品、保健品等中的应用。

和现有技术相比，本发明的有益效果：

1)本发明化合物结构稳定，属于甾体皂苷类化合物，且其提取原料来自食用韭菜的种子，广泛分布于我国大部分地区，资源十分丰富。本发明化合物提取制备条件温和、技术难度小、生产成本低、环境污染小；同时其原料丰富、属于天然可再生资源；提取分离技术难度小，溶剂可回收使用，不会造成生态环境污染；提取量大、可工业化生产并且韭菜子来源广泛，取材便利；

2)经试验发现：本发明新甾体皂苷类化合物在治疗2型糖尿病方面有着显著的治疗效果，可用于制备预防和治疗2型糖尿病药物、功能性食品、保健品等。

附图说明

图1为韭菜子苷A的HR-ESI-MS谱；

图2为韭菜子苷A的¹H NMR谱；

图3为韭菜子苷A的¹³C NMR谱；

图4为韭菜子苷A的HSQC谱；

图5为韭菜子苷A的HMBC谱；

图6为韭菜子苷A的HSQC-TOCSY谱；

图7为韭菜子苷A的NOESY谱；

图8为韭菜子苷B的HR-ESI-MS谱；

图9为韭菜子苷B的¹H NMR谱；

图10为韭菜子苷B的¹³C NMR谱；

图11为韭菜子苷B的HSQC谱；

图12为韭菜子苷B的HMBC谱；

图13为韭菜子苷B的NOESY谱；

图14为韭菜子苷C的HR-ESI-MS谱；

图15为韭菜子苷C的¹H NMR谱；

图16为韭菜子苷C的¹³C NMR谱；

图17为韭菜子苷C的HSQC谱；

图18为韭菜子苷C的HMBC谱；

图19为韭菜子苷C的NOESY谱；

图20为韭菜子苷D的HR-ESI-MS谱；

图21为韭菜子苷D的¹H NMR谱；

图22为韭菜子苷D的¹³C NMR谱；

图23为韭菜子苷D的HSQC谱；

图24为韭菜子苷D的HMBC谱；

图25为韭菜子苷D的HSQC-TOCSY谱；

图26为韭菜子苷D的NOESY谱；

图27为韭菜子苷E的HR-ESI-MS谱；

图28为韭菜子苷E的¹H NMR谱；

图29为韭菜子苷E的¹³C NMR谱；

图30为韭菜子苷E的HSQC谱；

图31为韭菜子苷E的HMBC谱；

图32为韭菜子苷E的HSQC-TOCSY谱；

图33为韭菜子苷E的NOESY谱。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

本发明新甾体皂苷类化合物的提取原料为韭菜(Alliium tuberosumRottl.exSpreng.)的干燥成熟种子，于2017年9月购于河南省禹州药材市场，由河南大学丛悦教授鉴定，标本储存在河南大学药学院标本馆。

下述实施例中，如无特殊说明，甲醇、乙醇、乙腈均指的是体积百分比浓度。

实施例1

本发明新甾体皂苷类化合物的结构式分别如下所示：

韭菜子苷A

韭菜子苷B

韭菜子苷C

韭菜子苷D

韭菜子苷E

上述新甾体皂苷类化合物的制备方法，其具体包括如下步骤：

1)将5kg粉碎后的韭菜子干粉，用35％乙醇(2×50L)加热回流提取1h，提取2次，合并提取液，提取结束后减压回收乙醇，获得水提液；

2)将水提液用大孔吸附树脂D101吸附，然后依次用水、30％乙醇、60％乙醇梯度洗脱，分别收集30％乙醇洗脱液、60％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，分别得到组分A和组分B；

3)组分A经ODS开放柱纯化，用30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇梯度洗脱，收集50％甲醇洗脱液和70％甲醇洗脱液，合并后减压回收溶剂，得到组分A1；

4)组分A1经ODS开放柱纯化，用35％甲醇、55％甲醇、75％甲醇梯度洗脱，分别收集55％甲醇洗脱液、75％甲醇洗脱液，减压回收溶剂，分别得到组分A1-1和A1-2；

5)组分A1-1经制备型高效液相，以流速6ml/min、波长203nm、63％甲醇水混合液进行等度洗脱，得到韭菜子苷A(26mg，t_R＝30min)和韭菜子苷B(43mg，t_R＝43min)；

6)组分A1-2经半制备型高效液相，以流速6ml/min、波长203nm、21％乙腈水混合液进行等度洗脱，得到韭菜子苷E(39mg，t_R＝38min)和韭菜子苷C(33mg，t_R＝41min)；

7)组分B经ODS开放柱纯化，用40％甲醇、50％甲醇、70％甲醇梯度洗脱，收集50％甲醇洗脱液、70％甲醇洗脱液，合并后减压回收溶剂，以TLC薄层色谱检测合并，得到四个组分，按照所得组分极性由大到小依次标记为组分B1～B4；

8)将组分B2经半制备型高效液相，以流速6ml/min、波长203nm、23％乙腈水混合液进行等度洗脱，得到韭菜子苷D(41mg，t_R＝48min)。

下述给出了实施例1制备所得新甾体皂苷类化合物韭菜子苷A、B、C、D、E的相关试验数据(具体可见图1至图33)。

韭菜子苷A：白色粉末，m.p.:240～243℃，[α]²⁰ _D–63.80(c＝0.001，H₂O)HR-ESI-MS:m/z795.4169[M+Na]⁺(calcd for 795.4137)，确定出其分子式为C₃₉H₆₄O₁₅。核磁共振数据见表1。

结构解析(详见图1至7)：

¹H-NMR(C₅D₅N)谱中显示出：四个甲基氢信号δ0.81(3H，s，H-18)，1.12(3H，s，H-19)，1.14(3H，d，J＝6.8Hz，H-C21)，δ1.70(3H，d，J＝6.2Hz，H-Rha-6)；两个糖的端基氢信号δ5.03(1H，d，J＝7.8Hz，H-Glc-1)，5.88(1H，s，H-Rha-1)；母核6位羟基取代的氢信号δ4.03(1H，m)；27位羟基取代的氢信号δ3.65(m)，3.73(m)。¹³C-NMR(C₅D₅N)谱中显示有39个碳信号，低场区给出了两个糖的端基碳信号δ101.6(C-Glc-1)，102.5(C-Rha-1)；母核中5、6位有羟基取代的碳信号δ72.8(C-5)、δ65.9(C-6)；27位羟基取代的碳信号为δ64.2(C-27)。通过2DNMR(HSQC、HMBC、HSQC-TOCSY)，将碳和氢的信号进行了归属(表1)，在HMBC谱中可以看出，葡萄糖的端基氢信号δ5.03(1H，d，J＝7.8Hz，H-Glc-1)与δ78.8(C-3)位远程相关，所以葡萄糖连在母核的C-3位；鼠李糖的端基氢信号δ6.01(1H，s，H-Rha-1)与δ77.9(C-Glc-4)远程相关，因此鼠李糖连在葡萄糖的C-4位；母核中的δ4.03(H-6)与δ35.6(C-7)、δ34.7(C-4)远程相关，C-19上的氢信号δ1.12(s)与δ35.4(C-1)、72.8(C-5)、65.9(C-6)、42.8(C-10)、44.3(C-9)远程相关，C-18上的氢信号δ0.81(s)与δ62.7(C-17)、41.9(C-20)、109.4(C-22)远程相关，C-3上的氢δ4.64(brs)与72.8(C-5)远程相关，由此推测出C-5和C-6位被羟基取代，δ3.91(H-26)与109.4(C-22)远程相关，由此可知母核是螺甾烷醇类结构，δ3.65(H-27)与63.9(C-26)、39.0(C-25)、23.9(C-24)远程相关，所以推测C-27位有羟基取代。以上数据归属与已知化合物(25S)-螺甾烷-3β，5β，6α-三羟基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1-4)-β-D-吡喃葡萄糖苷的核磁数据进行对比，根据质谱数据，该化合物比(25S)-螺甾烷-3β，5β，6α-三羟基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1-4)-β-D-吡喃葡萄糖苷多一个氧。从NOESY谱中可以看到，H-C(3)与H-C(4)δ2.23有NOE效应，Me(18)和H-C(20)存在NOE效应，Me(19)和H-C(4)δ2.12、H-C(6)存在NOE效应，CH₂(27)与H-C(26)呈NOE效应，因而可以推测出H-C(4)δ2.12、H-C(6)、H-C(20)处在同一平面上，且和Me(18)与Me(19)一样处于β键，H-C(3)、H-C(4)处于α键，母核3位碳相连的葡萄糖是β位取代。Me(19)碳信号δ17.3，进一步证明5位羟基为β位取代。葡萄糖端基氢信号耦合常数为J＝7.8Hz，推测葡萄糖为β构型；鼠李糖5位碳信号δ70.2，推测鼠李糖为α构型。经scifinder数据库查询，推测化合物1为新化合物，结构为：(25S)-螺甾烷-3β，5β，6α，27-四羟基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷，命名为韭菜子苷A。

表1韭菜子苷A的100MHz碳谱和400MHz氢谱数据

韭菜子苷B：白色粉末，[α]²⁰ _D–6.80(c＝0.001，H₂O)。HR-ESI-MS:m/z 663.3370[M+Na]⁺(calcd for 663.3351)，确定出其分子式为C₃₃H₅₂O₁₂。

结构解析(详见图8至13)：

¹H-NMR(C₅D₅N)谱中给出，两个糖的端基氢信号δ5.08(1H，d,J＝7.8Hz，H-Glc-1)，6.37(1H，s，H-Rha-1)；一个烯烃氢信号δ6.56(1H，s，H-C-16)；一个乙酰基上的甲基氢信号δ2.21(3H，s，H-21)；三个甲基氢信号δ0.87(3H，s，H-18)，0.87(3H，s，H-19)，1.70(3H，d，J＝6.2Hz，H-Rha-6)；母核中2位羟基取代的氢信号δ4.11(m，H-C-2)；3位羟基取代的氢信号δ3.87(m，H-C-3)。¹³C-NMR(C₅D₅N))谱中给出，低场区给出一个羰基碳信号δ196.1(C-20)；两个烯烃碳信号δ144.5(C-16)，155.1(C-17)；两个糖的端基碳信号δ100.9(C-Glc-1)，102.0(C-Rha-1)；母核中2和3位羟基取代的碳信号δ70.4(C-2)，85.0(C-3)。通过2DNMR(HMQC、HMBC)，将碳和氢的信号进行了归属(表2)，在HMBC谱中给出，母核中δ0.87(3H，s，H-18)分别与δ34.9(C-12)、46.3(C-13)、56.0(C-14)、155.1(C-17)远程相关，δ6.56(1H，br s，H-16)分别与δ46.3(C-13)、196.1(C-20)、155.1(C-17)远程相关，这说明C-16与C-17有不饱和双键；葡萄糖的端基氢信号δ5.08(1H，d,J＝7.8Hz，H-Glc-1)与δ85.0(C-3)呈远程相关，所以葡萄糖连在母核C-3位上；鼠李糖的端基氢信号δ6.37(1H，s，H-Rha-1)与δ77.6(C-Glc-2)远程相关，δ77.6(C-Glc-2)与δ4.30(1H，m，H-Glc-3)远程相关，所以鼠李糖连在葡萄糖的C-2位上。通过与已知化合物对比碳谱和氢谱数据，推测该化合物与2α,3β-二羟基-5α-20-酮-孕甾-16-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的结构相似，母核基本一致，推测化合物2连糖部分比已知化合物少一个氧。从NOESY谱中可以看出，H-C(3)与H-C(4)δ2.06、H-C(5)均有相关信号峰，H-C(9)与H-C(5)、H-C(14)存在NOE效应，Me(19)与H-C(1)δ1.13、H-C(2)、H-C(8)存在NOE效应，H-C(8)与Me(18)存在NOE效应，由此可以判断出H-C(1)δ1.13、H-C(2)、H-C(8)处在同一个平面上，即β键；H-C(3)、H-C(4)δ2.06、H-C(5)、H-C(9)、H-C(14)处于同一平面，处于同一个平面上，且都处于α键。根据文献报道，5位H处于α位，C-5、C-9、C-19的化学位移分别处于43–46、54–56、11–14ppm范围内，5位H处于β位，C-5、C-9、C-19的化学位移分别处于35–36、40、24ppm范围内，该化合物C-5、C-9、C-19的化学位移分别为44.6、54.7、13.2，证明5位H处于α位，与NOESY谱结果一致。经scifinder数据库查询，推测化合物2为新化合物，命名为：2α，3β-二羟基-5α-20-酮-孕甾-16-烯-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷，命名为韭菜子苷B。核磁数据见表2。

表2韭菜子苷B的100MHz碳谱和400MHz氢谱数据

韭菜子苷C：白色粉末，[α]²⁰ _D–82.30(c＝0.001，H₂O)。HR-ESI-MS m/z 1073.5059[M+Na]⁺(calcd for 1073.5145)，确定出其分子式为C₅₀H₈₂O₂₃。核磁共振数据见表3。

结构解析(详见图14至19)：

¹H-NMR(C₅D₅N)谱中可以看出，四个糖的端基氢信号δ5.01(1H，d，J＝7.8Hz，H-Glc-1)，δ4.84(1H，d，J＝7.8Hz，H-Glc’-1)，δ6.24(1H，s，H-Rha-1)，δ5.01(1H，d，J＝7.6Hz，H-Xyl-1)；一个烯烃氢信号δ4.51(1H，m，H-23)；五个甲基氢信号δ0.85(3H，s，H-18)，δ0.89(3H，s，H-19)，δ1.05(3H，d，J＝6.2Hz，H-27)，δ1.68(3H，s，H-21)，δ1.69(3H，d，J＝5.2Hz，H-Rha-6)；母核2位有羟基取代时的氢信号δ4.11(m，H-2)。¹³C-NMR(C₅D₅N)谱中显示，低场区给出两个烯烃碳信号δ163.4(C-22)和91.0(C-23)；四个糖的端基碳信号δ100.2(C-Glc-1)，δ104.9(C-Glc’-1)，101.9(C-Rha-1)，δ105.5(C-Xyl-1)。通过2DNMR(HMQC、HMBC)，将碳和氢的信号进行了归属(表3)，在HMBC谱中给出：δ4.83(1H，d，J＝7.8Hz，H-Glc’-1)与δ75.1(C-26)远程相关，说明26位连有一个葡萄糖；δ5.01(1H，d，J＝7.8Hz，H-Glc-1)与δ84.7(C-3)远程相关，说明3位连有一个葡萄糖；木糖端基氢信号δ5.01(1H，d，J＝7.6Hz，H-Xyl-1)与母核3位相连的葡萄糖δ81.1(C-Glc-2)呈远程相关，这说明木糖连在葡萄糖的2位；鼠李糖的端基氢信号δ6.24(1H，s，H-Rha-1)母核3位相连的葡萄糖δ77.5(C-Glc-4)呈远程相关，所以鼠李糖连在葡萄糖的4位上；母核中的δ0.89(H-19)与δ45.7(C-1)、44.4(C-5)、54.0(C-9)、36.6(C-10)远程相关，δ0.85(H-18)与δ39.2(C-12)、δ40.4(C-13)、δ56.4(C-14)、δ67.7(C-17)远程相关，δ1.68(H-21)与δ67.7(C-17)、76.5(C-20)、163.4(C-22)呈远程相关，δ1.05(H-27)与29.4(C-24)、34.6(C-25)、75.1(C-26)呈远程相关，对比碳谱数据和氢谱数据，推测母核结构与已知化合物26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S，20R)-5α-呋甾-22(23)-en-2α，3β，20，26-四羟基-3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-1→2-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷相似，比这个已知化合物少一个亚甲基(-CH₂)。从NOESY谱中可以看出，H-C(5)与H-C(3)、H-C(9)存在相关信号峰，H-C(9)与H-C(14)有NOE相关，Me(19)与H-C(2)存在NOE效应，Me(21)与H-C(23)存在NOE相关，由此可以判断出H-C(2)、Me(18)、Me(19)处在同一平面上，且均为β键，H-C(3)、H-C(5)、H-C(9)和H-C(14)处于同一平面，且都是α键。经scifinder数据库查询，推测该化合物为新化合物，结构为：26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S，20S)-5α-呋甾-22(23)-en-2α，3β，20β，26-四羟基-3-O-[O-β-D-吡喃木糖基-1→2)]-[α-L-鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷，命名为韭菜子苷C。

表3韭菜子苷C的100MHz碳谱和400MHz氢谱数据

韭菜子苷D：白色结晶，[α]²⁰ _D–51.20(c＝0.001，H₂O)，HR-ESI-MS:m/z 941.4677[M+H]⁺(calcd for 941.4722)，确定出其分子式为C₄₅H₇₄O₁₉。

结构解析(详见图20至26)：

¹H-NMR(C₅D₅N)谱中可以看出，三个糖的端基氢信号为δ5.01(1H,d,J＝8.0Hz,H-Glc-1)，δ4.88(1H,d,J＝8.0Hz,H-Glc’-1)，δ6.22(1H,s,H-Rha-1)；一个烯烃氢信号δ4.66(1H，m，H-C-23)；五个甲基质籽信号峰δ0.88(3H，s，H-18)，δ0.92(3H，s，H-19)，δ1.15(3H，d，J＝6.3Hz，H-27)，δ1.81(3H，s，H-21)，δ1.76(3H，d，J＝6.2Hz，H-Rha-6))；母核2位有羟基取代氢信号δ4.15(m，H-2)。¹³C-NMR(C₅D₅N))谱中显示，低场区给出一个烯烃碳信号δ162.9(C-22)；三个糖的端基碳信号为δ100.2(C-Glc-1)，δ104.5(C-Glc’-1)，102.2(C-Rha-1)；母核2、3、16、20位有氧取代的碳信号δ70.4(C-2)、83.8(C-3)、84.1(C-16)、76.9(C-20)。通过2DNMR(HMQC、HMBC、HSQC-TOCSY)，将碳和氢的信号进行了归属(表4)，在HMBC谱中可以看出：母核3位碳上的氢信号δ4.04(m)与葡萄糖δ100.2(C-Glc-1)呈远程相关，说明葡萄糖连在了母核的3位上；鼠李糖的端基氢信号δ6.22(1H,s,H-Rha-1)与葡萄糖δ78.6(C-Glc-2)呈远程相关，这说明鼠李糖连在葡萄糖的2位上；母核26位上的氢信号δ4.22(1H,m,H-26)，3.61(1H,m,H-26)与26位葡萄糖δ104.5(C-Glc’-1)远程相关，说明此葡萄糖连在母核的26位上；此外，母核中的δ0.92(CH₃-19)与δ45.3(C-1)、44.2(C-5)、53.7(C-9)、36.6(C-10)远程相关；δ0.88(CH₃-18)与δ39.1(C-12)、40.5(C-13)、56.3(C-14)、67.2(C-17)远程相关；δ1.81(CH₃-18)与δ67.2(C-17)、76.9(C-20)、162.9(C-22)呈远程相关，C-27上的甲基信号δ1.15(CH₃-27)与δ29.3(C-24)、34.5(C-25)、75.3(C-26)呈远程相关，推测该化合物母核结构为呋甾类。以上数据归属通过与已知化合物的核磁数据进行对比，发现该化合物比26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S，20R)-5α-呋甾-22(23)-en-2α，3β，20，26-四羟基-3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-1→2-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷的分子量少146.06，推测少一个鼠李糖。从NOESY谱中可以看出，Me(19)与H-C(2)有相关信号峰，H-C(5)与H-C(3)和H-C(9)存在NOE效应，H-C(14)与H-C(9)、H-C(16)存在NOE效应，Me(18)与Me(21)存在NOE效应，由此可以推断出H-C(2)和Me(21)处于β键，H-C(3)、H-C(5)、H-C(9)、H-C(14)、H-C(16)且都处于α键。经scifinder数据库查询，推测该化合物为新化合物，结构为：26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S，20R)-5α-呋甾-22(23)-en-2α，3β，20α，26-四羟基-3-O-[α-L-鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷，命名为韭菜子苷D。核磁数据见表4。

表4韭菜子苷D的100MHz碳谱和400MHz氢谱数据

韭菜子苷E：白色粉末，[a]²⁰ _D–80.20(c＝0.001，H₂O)。根据化合物的高分辨质谱数据HR-ESI-MSm/z 1087.5277[M+Na]⁺(calcd for 1087.5301)及¹³C-NMR数据(表5)，可以确定出其分子式为C₅₁H₈₄O₂₃。

结构解析(详见图27至33)：

¹H-NMR(C₅D₅N+D₂O)谱中可以看出，四个糖的端基氢信号4.91(1H，d，J＝7.0Hz，H-Glc-1)，δ5.49(1H，d，J＝8.0Hz，H-Glc’-1)，δ4.85(1H，d，J＝8.0Hz，H-Glc”-1)，δ5.77(1H，s，H-Rha-1)；一个烯烃氢信号δ4.61(1H，m，H-23)；五个甲基氢信号δ0.90(3H，s，H-18)，δ1.00(3H，s，H-19)，δ1.11(3H，d，J＝6.0Hz，H-27)，δ1.80(3H，s，H-21)，δ1.68(3H，d，J＝6.4Hz，H-Rha-6)。¹³C-NMR(C₅D₅N+H₂O)谱中显示，低场区给出两个烯烃碳信号δ163.1(C-22)和91.5(C-23)；四个糖的端基碳信号δ101.0(C-Glc-1)，δ104.5(C-Glc’-1)，δ104.6(C-Glc”-1)，102.2(C-Rha-1)。通过2D-NMR(HMQC、HMBC、HSQC-TOCSY)，将碳和氢的信号进行了归属(表5)，在HMBC谱中给出：δ4.85(1H，d，J＝8.0Hz，H-Glc”-1)与δ75.2(C-26)远程相关，说明26位连有一个葡萄糖；δ4.91(1H，d，J＝7.0Hz，H-Glc-1)与δ75.2(C-3)远程相关，说明3位连有一个葡萄糖；另一个葡萄糖端基氢信号δ5.49(1H，d，J＝8.0Hz，H-Glc’-1)与母核3位相连的葡萄糖δ81.1(C-Glc-2)呈远程相关，这说明此葡萄糖连在3位葡萄糖的2位；鼠李糖的端基氢信号δ5.77(1H，s，H-Rha-1)与母核3位相连的葡萄糖δ76.7(C-Glc-4)呈远程相关，所以鼠李糖连在3位葡萄糖的4位；母核中的δ1.00s(H-19)与δ30.6(C-1)、36.3(C-5)、39.8(C-9)、34.9(C-10)远程相关，δ0.90s(H-18)与δ39.4(C-12)、δ40.6(C-13)、δ56.5(C-14)、δ67.4(C-17)远程相关，δ1.80s(H-21)与δ67.4(C-17)、76.2(C-20)、163.1(C-22)呈远程相关，δ1.11(H-27)与29.4(C-24)、34.6(C-25)、75.2(C-26)呈远程相关，推测母核结构与已知化合物26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S，20S)-5α-呋甾-22(23)-en-3β，20，26-三羟基-3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-1→2]-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷相似。对比碳谱数据和氢谱数据，推测出该化合物比26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S，20S)-5α-呋甾-22(23)-en-3β，20，26-三羟基-3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-1→2]-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷多一个氧(O)。根据文献报道，C-5、C-9、C-19的化学位移分别处于35–36、40、24ppm范围内，5位H处于β位，该化合物C-5、C-9、C-19的化学位移分别为36.3、39.8、23.7，证明5位H处于β位。由于C-25(34.6)，C-26(75.2)和C-27(17.2)与文献数据对照，进一步确定25位为S构型。从NOESY谱中可以看出，H-C(5)与δ1.92m H-C(4)存在相关信号峰，H-C(3)与δ1.85m H-C(1)、δ1.85m H-C(4)有NOE相关，H-C(14)与H-C(9)、H-C(16)、H-C(17)有NOE相关，Me(19)与δ1.50m H-C(1)、H-C(5)存在NOE效应，由此可以判断出δ1.50m H-C(1)、δ1.92m H-C(4)、H-C(5)与Me(19)处在同一平面上，且均为β键，δ1.85mH-C(1)、δ1.85mH-C(4)、H-C(3)、H-C(9)、H-C(14)、H-C(16)和H-C(17)处于同一平面，且都是α键。经scifinder数据库查询，推测该化合物为新化合物，结构为：26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S，20S)-5β-呋甾-22(23)-双键-3β，20β，26-三羟基-3-O-[α-L-鼠李糖基-(1→4)]-[α-L-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷，命名为韭菜子苷E。

表5韭菜子苷E的100MHz碳谱和400MHz氢谱数据

应用试验：下面对本发明新甾体皂苷类化合物进行降血糖作用试验。

实验原料：实施例1制备所得甾体皂苷化合物作为实验原料。

实验动物：昆明种小鼠，体重23±2g，SPF级，由河南省实验动物中心提供，生产批号：SCXK(豫)2018-0001。

实验试剂：链脲佐菌素(STZ)：Sigma-Aldrich公司。高脂饲料：北京博爱港生物技术有限公司；达乐自动码血糖仪；糖化血清蛋白(GSP)、甘油三酯(TG)由南京建成生物工程研究所提供。

小鼠2型糖尿病模型建立：78只SPF级的昆明雄性小鼠适应性饲养一周(温度25±2℃，光照12h/d，湿度40-45％)，喂养标准饲料，自由饮水。一周后，除正常空白对照组(n＝6)喂养标准饲料外，其他小鼠均喂养高脂饲料。喂养4周后，高脂小鼠腹腔注射剂量为100mg/kg的STZ溶液，两周后筛选空腹血糖值＞16.0mmol/L的糖尿病小鼠。

给药方法：将糖尿病小鼠随机分为12组，每组6只(n＝6)：模型对照组、阳性对照组、韭菜子苷A、韭菜子苷B、韭菜子苷C、韭菜子苷D、韭菜子苷E的高剂量组、低剂量组。空白对照组和模型对照组按0.15mL/10g灌胃生理盐水，阳性对照组灌胃二甲双胍(350mg/kg，0.15mL/10g)，韭菜子苷A、韭菜子苷B、韭菜子苷C、韭菜子苷D、韭菜子苷E的高、低剂量组分别以18mg/kg和6mg/kg(0.15mL/10g)灌胃给药。灌胃给药3周，禁食不禁水12-14h，摘眼球取血，于4℃、4000rpm/min离心10min取血清，检测小鼠糖化血清蛋白GSP、甘油三酯TG。

采用Graphpad Prism 6统计学软件进行处理分析，结果以

表示，组间比较采用One-way ANOVA单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。结果见表6和7。

表6、甾体皂苷类化合物对2型糖尿病小鼠空腹血糖的影响

与空白对照组比较：^#P<0.01

与模型对照组比较：*P＜0.05；**P＜0.01

表6的结果表明：链脲佐菌素造模后，通过对小鼠空腹血糖水平的测定，与空白对照组相比，模型对照组和各给药组小鼠的初始血糖水平明显高于空白对照组，说明造模成功(P＜0.01)。与模型对照组相比，在给药第12天后，韭菜子苷A、韭菜子苷B、韭菜子苷C、韭菜子苷D、韭菜子苷E的高、低剂量组血糖水平开始缓慢下降，其中高剂量组血糖水平下降显著(P＜0.05)；在给药第21天后，韭菜子苷A、韭菜子苷B、韭菜子苷C、韭菜子苷D、韭菜子苷E的高、低剂量组血糖水平都下降显著(P＜0.05；P＜0.01)。以上结果说明韭菜子苷A、韭菜子苷B、韭菜子苷C、韭菜子苷D、韭菜子苷E的高、低剂量组均具有降低2型糖尿病小鼠的空腹血糖水平作用。

表7、甾体皂苷类化合物对2型糖尿病小鼠GSP和TG的影响

与空白对照组比较：^#P<0.01

与模型对照组比较：*P＜0.05；**P＜0.01

由表7可知：与空白对照组相比，模型对照组小鼠血清中TG和GSP水平显著升高(P＜0.01)。给药治疗后，与模型对照组相比，韭菜子苷A、韭菜子苷B、韭菜子苷C、韭菜子苷D、韭菜子苷E的高、低剂量组TG和GSP水平都不同程度显著下降(P＜0.05；P＜0.01)。

综上说明：本发明所述新甾体皂苷类化合物，尤其是韭菜子苷A、韭菜子苷B、韭菜子苷C、韭菜子苷D、韭菜子苷E对2型糖尿病具有一定的治疗作用，可用于制备预防和治疗2型糖尿病的药物、食品、保健品等。