一种分离的核酸分子及其用途

文档序号：1122953 发布日期：2020-10-02 浏览：9次 >En<

阅读说明：本技术 一种分离的核酸分子及其用途 (Isolated nucleic acid molecule and application thereof ) 是由杨丽萍陈邵宏贾睿璇张天赋张凡曾巧莉和赛超史天永郝丹丹姜尚伟裴于 2020-08-07 设计创作，主要内容包括：本申请涉及一种分离的核酸分子,其包括编码CAG启动子的核苷酸序列、编码第一蛋白的核苷酸序列、编码第二蛋白的核苷酸序列和编码BGH信号位点的核苷酸序列,其中所述第一蛋白和第二蛋白各自不同地选自下组：CYP4V2蛋白和RdCVF蛋白,其中编码所述CYP4V2蛋白的核苷酸序列包含SEQ ID NO:168的核苷酸序列,编码所述RdCVF蛋白的核苷酸序列包含SEQ ID NO:167的核苷酸序列。本申请还涉及所述核酸分子在制备用于治疗、缓解和/或预防与视网膜色素上皮(RPE)萎缩相关的疾病或病症的药物中的用途。(The present application relates to an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a CAG promoter, a nucleotide sequence encoding a first protein, a nucleotide sequence encoding a second protein and a nucleotide sequence encoding a BGH signal site, wherein the first and second proteins are each differently selected from the group consisting of: CYP4V2 protein and RdCVF protein, wherein the nucleotide sequence for coding the CYP4V2 protein comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO:168, and the nucleotide sequence for coding the RdCVF protein comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 167. The application also relates to the use of said nucleic acid molecule for the preparation of a medicament for the treatment, alleviation and/or prevention of a disease or disorder associated with atrophy of the Retinal Pigment Epithelium (RPE).)

一种分离的核酸分子及其用途

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种分离的核酸分子及其用途。

背景技术

结晶样视网膜变性（Bietti’s crystalline dystrophy，BCD）是一种视网膜变性罕见病，其症状主要包括角膜中的晶体（透明覆盖物），沉积在视网膜的光敏组织中的细小、黄色或白色晶体状的沉积物，以及视网膜、脉络膜毛细血管和脉络膜的进行性萎缩。沉积物会损伤视网膜，导致视力逐渐丧失。患有结晶样视网膜变性的人通常会在十几岁或二十几岁时开始察觉到视力问题，每只眼睛的视力问题可能以不同的速度恶化，即使在同一个家庭中症状的严重程度和进展在不同的个体中差异很大，然而大多数患者在四十或五十岁时就会失明。据估计，世界范围内每67,000人中有1人患有结晶样视网膜变性，在东亚人中更为常见，尤其是中国人和日本人。

现有研究表明BCD为常染色体隐性遗传疾病，并且是由CYP4V2基因突变引起的，目前国内外关于BCD患者的基因研究中已发现CYP4V2多个基因突变位点。CYP4V2基因是细胞色素P450超家族中的蛋白质之一，CYP4V2基因编码蛋白参与脂肪酸代谢的过程，一般认为结晶样视网膜变性中CYP4V2基因突变破坏了其参与脂肪酸代谢的酶功能，从而影响了脂质分解。然而CYP4V2如何导致了BCD的特定体征和症状尚不清楚。目前BCD的治疗主要参考视网膜色素变性(RP)的治疗方法，虽然CYP4V2基因突变的研究为未来的基因治疗提供了可能，但是目前还没有效的治疗方法。

发明内容

本申请提供了一种分离的核酸分子及其用途。本申请所述的试剂盒具有至少一个选自下组的有益效果：1）能够显著提高 CYP4V2 蛋白和/或RdCVF的表达水平；2）有效改善视网膜功能；3）预防和/或治疗 BCD；4）有效减少 CYP4V2 基因突变的 RPE 细胞的脂质沉积情况；5）改善BCD患者的视网膜功能；6）改善 BCD 患者的 RPE 细胞形态，维持 RPE细胞数目。本申请还提供了包含特定序列的病毒载体，及其在治疗、缓解和/或预防与视网膜色素上皮（RPE）萎缩相关的疾病或病症中的应用。

一方面，本申请提供了一种分离的核酸分子，其包括编码CAG启动子的核苷酸序列、编码第一蛋白的核苷酸序列、编码第二蛋白的核苷酸序列和编码BGH信号位点的核苷酸序列，其中所述第一蛋白和第二蛋白各自不同地选自下组：CYP4V2 蛋白和RdCVF蛋白，其中编码所述CYP4V2 蛋白的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 168的核苷酸序列，编码所述RdCVF蛋白的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 167的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述核酸分子包括1个以上编码CAG启动子的核苷酸序列，所述编码CAG启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 165的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述核酸分子包括1个以上编码BGH信号位点的核苷酸序列，所述编码BGH信号位点的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 18的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述核酸分子包括编码信号肽的核苷酸序列，所述信号肽包含SEQ ID NO:174-178中任一项所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述编码信号肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO:169-173中任一项所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述的核酸分子包含SEQ ID NO: 156-161中任一项所示的核苷酸序列。

另一方面，本申请提供一种注射用试剂盒，其包含携带本申请所述的核酸分子的载体和药学上可接受的辅料。

在某些实施方式中，所述药学上可接受的辅料适于视网膜下注射。

另一方面，本申请提供一种AAV病毒载体，其包含本申请所述的核酸分子。

另一方面，本申请提供一种携带核酸分子的病毒载体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、缓解和/或预防与视网膜色素上皮（RPE）萎缩相关的疾病或病症，其中所述核酸分子包含本申请所述的核酸分子。

在某些实施方式中，所述疾病或病症包括结晶样视网膜变性。

本申请提供了CYP4V2和RdCVF在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、缓解和/或预防与视网膜色素上皮（RPE）萎缩相关的疾病或病症。

在某些实施方式中，所述疾病或病症包括结晶样视网膜变性。

在某些实施方式中，所述CYP4V2为人CYP4V2。

在某些实施方式中，所述CYP4V2包含SEQ ID NO: 76-82中任一项所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述编码CYP4V2的多核苷酸包含SEQ ID NO:62-68中任一项所示的核酸序列。

在某些实施方式中，所述RdCVF为人RdCVF。

在某些实施方式中，所述RdCVF包含SEQ ID NO: 83-89中任一项所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，其中所述编码RdCVF的多核苷酸包含SEQ ID NO: 69-75中任一项所示的核酸序列。

在某些实施方式中，所述药物包含编码所述CYP4V2的多核苷酸以及编码所述RdCVF的多核苷酸。

在某些实施方式中，所述编码CYP4V2的多核苷酸和所述编码RdCVF的多核苷酸位于不同的载体上。

在某些实施方式中，所述编码CYP4V2的多核苷酸和所述编码RdCVF的多核苷酸位于同一载体上。

在某些实施方式中，所述载体包括病毒载体。

在某些实施方式中，所述载体为病毒载体，其所述病毒载体包括AAV载体。

在某些实施方式中，所述载体还包含启动子，所述启动子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端且与所述编码CYP4V2的多核苷酸可操作连接。

在某些实施方式中，所述载体还包含启动子，所述启动子位于所述编码RdCVF的多核苷酸的5’端且与所述编码RdCVF的多核苷酸可操作连接。

在某些实施方式中，所述启动子包含SEQ ID NO:1-12中任一项所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述载体还包含多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的3’端。

在某些实施方式中，所述载体还包含多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码RdCVF的多核苷酸的3’端。

在某些实施方式中，所述载体还包含编码自我剪切肽的多核苷酸，所述编码自我剪切肽的多核苷酸位于所述编码CYP4V2的多核苷酸与所述编码RdCVF的多核苷酸之间。

在某些实施方式中，所述自我剪切肽包含P2A。

在某些实施方式中，所述编码自我剪切肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:22-25中任一项所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述载体以5’至3’方向依次包含：所述启动子、所述编码CYP4V2的多核苷酸、所述编码自我剪切肽的多核苷酸、所述编码RdCVF的多核苷酸和所述多聚腺苷酸信号位点。

在某些实施方式中，所述载体以5’至3’方向依次包含：所述启动子、所述编码CYP4V2的多核苷酸、所述多聚腺苷酸信号位点；或者，所述载体以5’至3’方向依次包含：所述启动子、所述编码RdCVF的多核苷酸、所述多聚腺苷酸信号位点。

在某些实施方式中，所述载体还包含内含子。

在某些实施方式中，所述内含子包含SEQ ID NO: 13-16中任一项所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述内含子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸中，或者，位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端。

在某些实施方式中，所述内含子位于所述编码RdCVF的多核苷酸中，或者，位于所述编码RdCVF的多核苷酸的5’端。

在某些实施方式中，所述载体包含SEQ ID NO: 90-116中任一项所示的核苷酸序列。

本申请还提供了用于治疗、缓解和/或预防与视网膜色素上皮（RPE）萎缩相关的疾病或病症的载体组合，其包括第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码CYP4V2的多核苷酸，所述第二载体包含编码RdCVF的多核苷酸。

在某些实施方式中，所述疾病或病症包括结晶样视网膜变性。

在某些实施方式中，所述CYP4V2为人CYP4V2。

在某些实施方式中，所述CYP4V2包含SEQ ID NO: 76-82中任一项所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述编码CYP4V2的多核苷酸包含SEQ ID NO:62-68中任一项所示的核酸序列。

在某些实施方式中，所述RdCVF为人RdCVF。

在某些实施方式中，所述RdCVF包含SEQ ID NO: 83-89中任一项所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述编码RdCVF的多核苷酸包含SEQ ID NO: 69-75中任一项所示的核酸序列。

在某些实施方式中，所述载体包括病毒载体。

在某些实施方式中，所述载体为病毒载体，其所述病毒载体包括AAV载体。

在某些实施方式中，所述第一载体还包含启动子，所述启动子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端且与所述编码CYP4V2的多核苷酸可操作连接。

在某些实施方式中，所述第二载体还包含启动子，所述启动子位于所述编码RdCVF的多核苷酸的5’端且与所述编码RdCVF的多核苷酸可操作连接。

在某些实施方式中，所述启动子包含SEQ ID NO:1-12中任一项所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述第一载体还包含多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的3’端。

在某些实施方式中，所述第二载体还包含多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码RdCVF的多核苷酸的3’端。

在某些实施方式中，所述第一载体以5’至3’方向依次包含：所述启动子、所述编码CYP4V2的多核苷酸、所述多聚腺苷酸信号位点；和/或，所述第二载体以5’至3’方向依次包含：所述启动子、所述编码RdCVF的多核苷酸、所述多聚腺苷酸信号位点。

在某些实施方式中，所述第一载体和/或所述第二载体还包含内含子。

在某些实施方式中，所述内含子包含SEQ ID NO: 13-16中任一项所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述内含子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸中，或者，位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端。

在某些实施方式中，所述内含子位于所述编码RdCVF的多核苷酸中，或者，位于所述编码RdCVF的多核苷酸的5’端。

在某些实施方式中，所述第一载体包含SEQ ID NO: 90-95中任一项所示的核苷酸序列；和/或，所述第二载体包含SEQ ID NO: 96-100中任一项所示的核苷酸序列。

本申请还提供一种或多种分离的核酸分子，其包含a) 编码CYP4V2的多核苷酸以及b) 编码RdCVF的多核苷酸。

在某些实施方式中，所述CYP4V2为人CYP4V2。

在某些实施方式中，所述CYP4V2包含SEQ ID NO: 76-82中任一项所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述编码CYP4V2的多核苷酸包含SEQ ID NO: 62-68中任一项所示的核酸序列。

在某些实施方式中，所述RdCVF为人RdCVF。

在某些实施方式中，所述RdCVF包含SEQ ID NO: 83-89中任一项所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述编码RdCVF的多核苷酸包含SEQ ID NO: 69-75中任一项所示的核酸序列。

在某些实施方式中，所述分离的核酸分子还包含启动子，所述启动子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端且与所述编码CYP4V2的多核苷酸可操作连接。

在某些实施方式中，所述分离的核酸分子还包含启动子，所述启动子位于所述编码RdCVF的多核苷酸的5’端且与所述编码RdCVF的多核苷酸可操作连接。

在某些实施方式中，所述启动子包含SEQ ID NO:1-12中任一项所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述分离的核酸分子包含编码CYP4V2的多核苷酸和编码RdCVF的多核苷酸。

在某些实施方式中，所述分离的核酸分子还包含编码自我剪切肽的多核苷酸，所述编码自我剪切肽的多核苷酸位于所述编码CYP4V2的多核苷酸与所述编码RdCVF的多核苷酸之间。

在某些实施方式中，所述自我剪切肽包含P2A。

在某些实施方式中，所述编码自我剪切肽的多核苷酸包含SEQ ID NO: 22-25中任一项所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述分离的核酸分子还包含多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的3’端。

在某些实施方式中，所述分离的核酸分子还包含多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码RdCVF的多核苷酸的3’端。

在某些实施方式中，所述的分离的核酸分子，其以5’至3’方向依次包含：所述启动子、所述编码CYP4V2的多核苷酸、所述编码自我剪切肽的多核苷酸、所述编码RdCVF的多核苷酸和所述多聚腺苷酸信号位点。

在某些实施方式中，所述分离的核酸分子，其还包含内含子。

在某些实施方式中，所述内含子包含SEQ ID NO: 13-16中任一项所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述其中内含子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸中，或者，所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端。

在某些实施方式中，所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO: 101-115中任一项所示的核苷酸序列。

本申请还提供一种载体，其包含本申请所述的分离的核酸分子。

在某些实施方式中，所述载体为病毒载体。

在某些实施方式中，所述病毒载体包括AAV载体。

本申请还提供一种细胞，其包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体。

本申请还提供一种药物组合物，其包含本申请所述的分离的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞。

本申请还提供本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体、本申请所述的细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、缓解和/或预防与视网膜色素上皮（RPE）萎缩相关的疾病或病症。

在某些实施方式中，所述疾病或病症包括结晶样视网膜变性。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的

具体实施方式

进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

附图说明

本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：

图1显示了本申请中不同CYP4V2启动子的表达效果。

图2显示了本申请中CAG、EF1a、OPEFS及EFS启动子的表达效果。

图3和图4显示了本申请中启动子后连接内含子的表达增强作用。

图5显示了本申请中表达载体选择不同PolyA信号位点对目的基因表达的影响。

图6显示了本申请中含有RdCVF基因***信号肽后，CYP4V2、RdCVF基因的表达载体在293T细胞中的表达情况。

图7显示了本申请中含有CYP4V2、RdCVF基因的表达载体在293T细胞中的表达情况。

图8显示了本申请中含有CYP4V2、RdCVF基因的表达载体在ARPE-19细胞中的表达情况。

图9显示了本申请中不同血清型AAV病毒对小鼠视网膜的感染情况，双箭头表示EGFP报告基因的表达范围。

图10显示了本申请中RPE细胞的制备过程中荧光显微镜观察到的肾上皮细胞、IPSC细胞、RPE细胞形态。

图11A显示了本申请中病毒滴度对人iPSC分化的RPE细胞死亡的影响，11B、11C分别显示了病毒滴度对人iPSC分化的RPE细胞中炎症因子NLRP3、TNF-α表达情况的影响，11D显示了不同病毒滴度条件下目的基因在人iPSC分化的RPE细胞的表达情况。

图12显示了本申请中不同病毒感染人iPSC分化的RPE细胞后CYP4V2、RdCVF的表达情况。

图13显示了本申请中包含不同启动子和CYP4V2基因的病毒处理BCD小鼠后对眼底结晶沉积情况的影响。

图14显示了本申请中包含不同启动子和CYP4V2基因的病毒处理BCD小鼠对眼底结晶沉积情况的影响的统计结果。

图15显示了本申请中包含不同启动子和CYP4V2基因的病毒处理BCD小鼠后CYP4V2免疫荧光染色结果。

图16显示了本申请中不同剂量的包含CYP4V2基因的病毒处理BCD小鼠后对眼底结晶沉积情况的影响。

图17显示了本申请中不同剂量的包含CYP4V2基因的病毒处理BCD小鼠后对眼底结晶沉积情况的影响的统计结果。

图18显示了本申请中不同剂量的包含CYP4V2基因的病毒处理BCD小鼠后对炎症因子TNF-α、IFN-γ、NLRP3表达水平的影响。

图19显示了本申请中不同病毒处理BCD小鼠后对眼底结晶沉积情况的影响。

图20显示了本申请中不同病毒处理BCD小鼠后对眼底结晶沉积情况的影响的统计结果。

图21显示了本申请中不同病毒处理BCD小鼠后对视网膜功能（视网膜电图（ERG））的影响。

图22显示了本申请中不同病毒处理BCD小鼠后CYP4V2、RdCVF的免疫荧光染色结果。

图23显示了本申请中不同病毒处理BCD小鼠后对RPE细胞数量及形态的影响。

图24显示了本申请中不同病毒处理BCD小鼠后对RPE细胞数量影响的统计结果。

图25显示了本申请中启动子后不含有内含子的不同病毒处理BCD小鼠后对视网膜功能（视网膜电图（ERG））的影响。

图26显示了本申请中p1启动子不同病毒处理BCD小鼠后对视网膜功能（视网膜电图（ERG））的影响。

图27显示了本申请中WPRE-SV40 poly A信号位点不同病毒处理BCD小鼠后对视网膜功能（视网膜电图（ERG））的影响。

图28显示了本申请中不包含信号位点不同病毒处理BCD小鼠后对视网膜功能（视网膜电图（ERG））的影响。

图29显示了本申请中增加信号肽的不同病毒处理BCD小鼠后对视网膜功能（视网膜电图（ERG））的影响。

图30-图31显示了本申请所述的核酸分子的结构示意图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

以下对本申请做进一步描述：在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

在本申请中，术语“分离的”通常指从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。

在本申请中，术语“分离的核酸分子”通常指任何长度的分离形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或从其天然环境分离的或人工合成的类似物。

在本申请中，术语“CYP4V2”通常是指一种蛋白质，其为细胞色素P450家族4亚家族V成员2。胞色素P450，也称作cytochromeP450或CYP450，通常是指一类亚铁血红素蛋白家族，属于单氧酶的一类，参与内源性物质或包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢。根据氨基酸序列的同源程度，其成员又依次分为家族、亚家族和酶个体三级。细胞色素P450酶系统可以缩写为CYP，其中家族以***数字表示，亚家族以大写英文字母表示，酶个体以***数字表示，例如本申请中的CYP4V2。人CYP4V2基因（HGNC：23198）全长19.28kb，位于4q35，具有11个外显子，在脂肪酸代谢中发挥重要作用（Kumar S.,Bioinformation, 2011,7:360-365）。CYP4V2几乎在所有组织中表达，但是在视网膜和视网膜色素上皮中以高水平表达，而角膜，组织中以稍低的水平表达，CYP4V2基因的突变可能导致BCD（Li等，Am J Hum Genet。74:817-826, 2004)。

在本申请中，术语“RdCVF”也称作视杆细胞源性视锥细胞生长因子(Rod derivedcone survival factor），通常是指一种截短的类硫氧还蛋白，其缺乏硫醇氧化还原酶活性。RdCVF是类核氧化还原蛋白1（nucleoredoxin-like 1, Nxnl1）基因的一种剪接变体，该基因另外的剪接产物是RdCVFL，RdCVFL是一种活性硫氧还蛋白，能够保护其结合配体即微管相关蛋白TAU免于氧化和聚集（Elachouri等，2015和Fridlich等，2009）。Nxnl1基因缺失的小鼠可以表现出年龄依赖性视杆细胞和视锥细胞功能丧失和视锥细胞退行性变化，以及视杆细胞和视锥细胞对氧化应激的超敏反应（Cronin等，2010）。Nxnl1的表达可以是视杆细胞依赖性的，其在视网膜色素变性（RP）中的视杆细胞死亡后显著减少（Delyfer等，2011;Reichman等，2010）。RdCVF可以在几种不同基因型的视网膜色素变性（RP）模型中保护视锥细胞功能（Byrne等, 2015; Le´ veillard 等, 2004; Yang 等, 2009）。RdCVF分子可作为信号肽分泌至细胞外，促进感光细胞对葡萄糖的吸收，有利于维持感光细胞的存活。Nxnl1基因在人类、黑猩猩、恒河猴、狗、牛、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼和青蛙中都是保守的。在人类中Nxnl1也称作Txnl6，Nxnl1位于19p13.11，包含两个外显子。Nxnl1可以在人体组织中普遍表达，包括晶状体、视网膜、胃、肾、心脏、结肠和脾，在晶状体、视网膜中有相对更高的表达水平。

在本申请中，术语“启动子”通常指一段能使特定基因进行转录的脱氧核糖核酸（DNA）序列。启动子可以被RNA聚合酶辨认，并开始转录合成RNA。在核糖核酸（RNA）合成中，启动子可以和调控基因转录的转录因子产生相互作用，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动子包含核心启动子区域和调控区域，位于控制基因表达的调控序列中、基因转录起始位点的上游（DNA反义链的5’方向），本身并无编译功能。根据其作用方式及功能分为三类：组成型启动子（在多数或全部组织中保持持续的活性）、特异型启动子（组织特异性或者发育时期的特异性）和诱导型启动子（受外界化学或物理信号调控）。

在本申请中，术语“可操作连接”通常是指将编码序列表达所必需的调控序列置于相对于编码序列的适当位置，以便实现编码序列的表达。例如，当第一核酸序列处于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作连接。在某些实施方式中，可以表示表达载体中编码序列和转录控制元件的排列。所述控制元件可以包括启动子、增强子和终止元件。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子被可操作地连接至编码序列。在某些实施方式中，“可操作连接”还可以是指目的基因连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节目的基因的转录和翻译的预期功能。

在本申请中，术语“自我剪切肽”，也称作2A肽（2A self-cleaving peptides），通常是指一类长18-22个氨基酸残基的肽片段，能诱导细胞内含有2A肽的重组蛋白自我剪切。2A肽通常源自病毒基因组的2A区域。在基因工程操作中，2A肽可以使一个开放读框（ORF）转译出的肽链分为数个独立的肽链。在某些实施方式下，如果需要两个蛋白分开表达（例如需要一个蛋白进入细胞核、另一个蛋白在细胞质中表达），又希望只在载体上构建一个开放读框，可以通过在它们的编码区中***一段2A肽序列实现。在某些实施方式下，如果两个蛋白融合后的融合蛋白没有功能，可以在两个蛋白的编码区中间***一段编码2A肽的序列，或将连结肽更换为2A肽，使转译完成后两个蛋白分开，独立进行折叠，从而提供使两个蛋白恢复功能的可能。2A肽可以包括P2A、E2A、F2A、T2A，它们都是以来源的病毒命名的。其中P2A源于猪捷申病毒（Porcine teschovirus）的2A肽。

在本申请中，术语“多聚腺苷酸序列”，也称作多聚腺苷酸尾，PolyA尾，通常是指转录后的mRNA在3’端加上的一段几十至几百个单一的腺苷酸链。多聚腺苷酸化通常发生在脱氧核糖核酸（DNA）在细胞核内转录成核糖核酸（RNA）的过程中及完成后，该反应通常是由多聚腺苷酸聚合酶完成的。在真核生物中，多聚腺苷酸化是一种机制，可以使mRNA分子于其3’端中断，多聚腺苷酸序列可以保护mRNA免受核酸外切酶攻击，并且对mRNA的细胞核输出、翻译和稳定性都十分重要。

在本申请中，术语“多聚腺苷酸信号位点”通常是指一段位于信使RNA（mRNA）的3’端能够被多聚腺苷酸化相关裂解因子识别的碱基序列。通常也是mRNA上的一段顺式调节信号。一般情况下加尾的过程（即多聚腺苷酸化）开始于转录终止后，多聚腺苷酸化相关裂解因子在多聚腺苷酸信号位点的调控下，在mRNA的3’UTR的后面加上几十到几百个单一的腺苷酸。常见的加尾信号包括SV40，BGH，HSV，TK信号等。所述多聚腺苷酸化相关裂解因子可以包括裂解/聚腺苷酸特异性因子（CPSF）、裂解刺激因子（CstF）、裂解因子I（CFI）、裂解因子II（CFII）。多聚腺苷酸信号位点通常可以包含AAUAAA序列，但是在真核生物组之间有所不同。例如，大多数人的多聚腺苷酸信号位点含有AAUAAA序列，但该序列在植物和真菌中较少见。

在本申请中，术语“信号肽”通常指可以引导合成的蛋白质向分泌通路转移的肽链。所述信号肽的长度可以为约5-约30个氨基酸。所述信号肽的N端可以包含碱性氨基酸和/或疏水性氨基酸。所述信号肽可以包含带负电荷的C端，其可以作为信号肽的切割位点。当合成的蛋白质进入内质网腔，所述信号肽可以在信号肽酶的作用下被切除。

在本申请中，术语“内含子”可以包括经过转录的，但却从RNA转录本中通过将序列(外显子)两端的任一端拼接在一起而被去除的DNA片段。内含子通常被认为是基因的蛋白编码区内的干扰序列，且通常不含有由该基因产生的蛋白所代表的信息。

在本申请中，术语“载体”通常指可将编码某蛋白的多聚核苷酸***其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）或P1来源的人工染色体（PAC）；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及病毒载体等。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。

在本申请中，术语“病毒载体”通常使指充当基因递送载体且包含包装于病毒衣壳内的重组病毒基因组的非野生型重组病毒颗粒。用作载体的动物病毒种类可以包括逆转录酶病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒（AAV）、疱疹病毒（如单纯疱疹病毒）、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒（例如SV40）。

在本申请中，术语“AAV载体”也称作腺相关病毒载体，通常是指腺病毒本身或其衍生物。腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV)通常是指一类属于微小病毒科、依赖病毒属的单链DNA病毒。AAV基因组可以包含DNA链两端的反向末端重复序列（ITR）和两个开放阅读框（ORF）。所述开放的阅读框可以包括rep和cap。rep由编码AAV生命周期所需的Rep蛋白的多个重叠基因组成，cap包含编码衣壳蛋白的重叠核苷酸序列，所述核苷酸序列可以包括VP1，VP2和VP3。所述衣壳蛋白相互作用形成衣壳。在缺少辅助病毒的情况下，AAV可以整合其基因组到人类19号染色体的一个特别位点（AAVS位点），直到有辅助病毒将其从潜伏状态下拯救出来(Kotin等，1990)。通常认为AAV以不整合的形式为主。AAV的位点特异性的整合能力、其自然缺陷及其免疫原性低使其成为理想的基因治疗载体。AAV具有多种常见血清型,100多种病毒变种。在本申请中，AAV衣壳、ITR和其它所选AAV组件选自任何AAV，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV8bp、AAV7M8和AAVAnc80、任何已知或提及的AAV的变体或尚待发现的AAV或其变体或混合物。

在本申请中，术语“细胞”通常可以是或已经是核酸分子或载体的接受者的单个细胞、细胞系或细胞培养物。细胞可以包括本申请所述的核酸分子或本发明所述的载体。细胞可以包括单个细胞的后代。由于天然、偶然或有意的突变，后代可以不一定与原始母细胞完全相同(在总DNA互补体的形态上或在基因组上)。细胞可包括用本申请所述的载体在体外转染的细胞。细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞，例如COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、COS-1细胞、NS0细胞或骨髓瘤细胞。在某些实施方案中，细胞为哺乳动物细胞。在某些实施方案中，哺乳动物细胞为HEK293T细胞。

在本申请中，术语“药物组合物”通常指涉及适合施用于患者、例如人患者的组合物。例如，本申请所述的药物组合物，其可以包含本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。此外，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下可以对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。

在本申请中，术语“试剂盒”通常指包含本申请所述载体的包装产品。所述试剂盒可以包含容纳有该试剂盒组分的容器。所述容器可以包含关于本申请所述载体的治疗说明和/或给药方案和/或说明书。所述容器可以包括带有盖子的容器。

在本申请中，术语“预防”通常是指对健康受试者预防性地施用组合，以预防某种疾病或病症的发生。其也可以包含对处于待治疗变应性疾病前期的患者预防性地施用组合。“预防”不需要100％消除疾病或病症发生的可能性，换句话说，“预防”通常指在所述施用组合的存在下疾病或病症发生的可能性降低了。

在本申请中，术语“缓解”指减少、缩减或迟滞某种病状、疾病、病症或表型。所述病状、疾病、病症或表型可以包括受试者主观感知例如疼痛、晕眩或其他生理性障碍，或者医学上可以检测的指征，例如通过医学检验手段检测到的病灶情况。

在本申请中，术语“治疗”通常指用于改变所处理的个体或细胞在临床病理过程中的自然过程的临床干预。可以包括改善病状态、消除病灶或改善的预后。

在本申请中，术语“视网膜色素上皮（RPE）”通常是指一层紧贴于视网膜感觉神经之外的色素细胞。视网膜色素上皮由单层六边形细胞组成，其内含有密集的色素颗粒。视网膜色素上皮（RPE）与其下的脉络膜和其上视网膜神经细胞紧密相连，其主要功能可以包括：控制视网膜下间隙的液体和营养，起到血-视网膜屏障的功能；合成生长因子调整局部的结构；吸收光，调节电平衡；视色素的再生和合成；吞噬和消化光感受器外节；维持视网膜的附着；损伤后的再生和修复。通常认为RPE是维持光感受器功能的重要组织，同时也受脉络膜和视网膜的很多病变影响。

在本申请中，术语“视网膜色素上皮（RPE）萎缩”通常是指视网膜色素上皮（RPE）表现为细胞死亡或功能障碍的退行性变化。年龄相关黄斑变性或视网膜色素变性（RP）通常伴有视网膜色素上皮萎缩。视网膜色素变性（Retinitis Pigmentosa，简称RP）也称视网膜色素病变，通常是指一类遗传性眼科疾病。其遗传方式有常染色体隐性、显性与X性连锁三种，也存在双基因和线粒体遗传。初期普遍的病征可以是夜盲、视野变窄，能够看到正前方景物而无法看见略偏左右的视野，之后视力将会逐渐消失。RP可以包括单眼性原发性视网膜色素变性、象限性原发性视网膜色素变性、中心性或旁中心性原发性视网膜色素变性、无色素性视网膜色素变性白点状视网膜变性、结晶样视网膜变性、静脉胖色素性视网膜色素变性、小动脉旁色素上皮保留型视网膜色素变性、Leber先天黑蒙和其他综合征中的视网膜色素变性。

在本申请中，术语“结晶样视网膜变性”通常是指一类由意大利眼科医生GBBietti博士于1937年首次描述的常染色体隐性遗传眼病。其主要症状包括角膜中的晶体（透明覆盖物），沉积在视网膜的光敏组织中的细小、黄色或白色晶体状的沉积物，以及视网膜、脉络膜毛细血管和脉络膜的进行性萎缩。结晶样视网膜变性可以包括由CYP4V2基因突变引起的疾病。

在本申请中，术语“包含”或“包括”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。

在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5%-10%的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的范围内变动。

一方面，本申请提供了CYP4V2和RdCVF在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、缓解和/或预防与视网膜色素上皮（RPE）萎缩相关的疾病或病症。

在本申请中，所述药物可以包含编码所述CYP4V2的多核苷酸以及编码所述RdCVF的多核苷酸。例如，所述编码CYP4V2的多核苷酸和所述编码RdCVF的多核苷酸位于不同的载体上。例如，所述编码CYP4V2的多核苷酸和所述编码RdCVF的多核苷酸位于同一载体上。

另一方面，本申请还提供了用于治疗、缓解和/或预防与视网膜色素上皮（RPE）萎缩相关的疾病或病症的载体组合，其包括第一载体和第二载体，所述第一载体可以包含编码CYP4V2的多核苷酸，所述第二载体可以包含编码RdCVF的多核苷酸。

另一方面，本申请还提供了一种分离的核酸分子，其可以包含编码CYP4V2的多核苷酸以及编码RdCVF的多核苷酸。

另一方面，本申请还提供了细胞，其可以包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体组合。

本申请还提供了药物组合物，其可以包含本申请所述的所述的核酸分子、本申请所述的载体组合和/或本申请所述的细胞。

另一方面，本申请还提供了本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体组合、本申请所述的细胞和/或本申请所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物可以用于预防、缓解和/或治疗视网膜色素上皮（RPE）萎缩相关的疾病或病症。

CYP4V2

在本申请中，CYP4V2可以包含一类其功能障碍或其编码基因突变可能导致结晶样视网膜变性的蛋白，包括但不限于人类、黑猩猩、大猩猩、恒河猴、狗、牛、小鼠、大鼠、鸡、果蝇、线虫或青蛙的CYP4V2或其功能性变体。

例如，所述CYP4V2可以包含人CYP4V2。

例如，所述CYP4V2可以包含SEQ ID NO: 76-82中任一项所示的氨基酸序列。

例如，所述CYP4V2可以包含SEQ ID NO: 76所示的氨基酸序列。

例如，所述CYP4V2可以包含与SEQ ID NO: 76-82所示的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸序列，例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同源的任意一种氨基酸序列，并且所述氨基酸序列与本申请所述的RdCVF联合施用能够改善与视网膜色素上皮（RPE）萎缩相关的疾病或病症。

在本申请中，所述编码CYP4V2的多核苷酸可以包含SEQ ID NO:62-68中任一项所示的核酸序列。

例如，所述编码CYP4V2的多核苷酸可以包含SEQ ID NO:62所示的核酸序列。

例如，所述编码CYP4V2的多核苷酸可以包含与SEQ ID NO: 62-68所示的核酸序列至少90%同源的氨基酸序列，例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同源的任意一种多核苷酸序列，并且所述核苷酸序列所编码的多肽与本申请所述的RdCVF联合施用能够改善与视网膜色素上皮（RPE）萎缩相关的疾病或病症。

RdCVF

在本申请中，所述RdCVF可以包含一种由视杆细胞产生的并且有利于视锥细胞的蛋白。所述RdCVF包括但不限于人类、黑猩猩、大猩猩、恒河猴、狗、牛、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼和青蛙的RdCVF或其功能性变体。

例如，所述RdCVF可以包含人RdCVF。

例如，所述RdCVF可以包含SEQ ID NO: 83-89中任一项所示的氨基酸序列。

例如，所述RdCVF可以包含SEQ ID NO: 83所示的氨基酸序列。

例如，所述RdCVF可以包含与SEQ ID NO:83-89所示的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸序列，例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同源的任意一种氨基酸序列，并且所述氨基酸序列与本申请所述的CYP4V2联合施用能够改善与视网膜色素上皮（RPE）萎缩相关的疾病或病症。

在本申请中，所述编码RdCVF的多核苷酸可以包含SEQ ID NO:69-75中任一项所示的核酸序列。

例如，所述编码RdCVF的多核苷酸可以包含SEQ ID NO:69所示的核酸序列。

例如，所述编码RdCVF的多核苷酸可以包含与SEQ ID NO: 69-75所示的核酸序列至少90%同源的氨基酸序列，例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同源的任意一种多核苷酸序列，并且所述核苷酸序列所编码的多肽与本申请所述的CYP4V2联合施用能够改善与视网膜色素上皮（RPE）萎缩相关的疾病或病症。

启动子

在本申请中，所述启动子可以包含RPE细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、角膜细胞特异性启动子、眼细胞特异性启动子或组成型启动子。所述启动子还可以包含哺乳动物β肌动蛋白启动子或病毒启动子。所述启动子还可以包含CAG启动子（杂合CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白启动子，也称为CAGGS启动子，CB启动子或CBA启动子）、人β肌动蛋白启动子、小CBA（smCBA）启动子、CBS启动子或CBh启动子、延伸因子1α短（EFS）启动子、延伸因子1α（EF-1α）启动子、CMV启动子、PGK启动子、UBC启动子、GUSB启动子、UCOE启动子、VMD2（也称为BEST1）启动子、OPEFS启动子、CYP4V2自身启动子、RPE65启动子或其杂合体或衍生物。

例如，所述启动子可以包含CYP4V2自身启动子，所述CYP4V2自身启动子可以包含所述编码CYP4V2的多核苷酸上游2000bp核苷酸序列的全部或部分。

例如，所述启动子可以包含SEQ ID NO:1-12中任一项所示的核苷酸序列。

例如，所述CYP4V2自身启动子可以包括CYP4V2-Pf启动子、CYP4V2-P1启动子、CYP4V2-P2启动子、CYP4V2-P3启动子、CYP4V2-P4启动子、CYP4V2-P5启动子、CYP4V2-P6启动子；所述CYP4V2-Pf启动子可以包含SEQ ID NO:6所示的核酸序列，所述CYP4V2-P1启动子可以包含SEQ ID NO:7所示的核酸序列，所述CYP4V2-P2启动子可以包含SEQ ID NO:8所示的核酸序列，所述CYP4V2-P3启动子可以包含SEQ ID NO:9所示的核酸序列，CYP4V2-P4启动子可以包含SEQ ID NO:10所示的核酸序列，所述CYP4V2-P5启动子可以包含SEQ ID NO:11所示的核酸序列，所述CYP4V2-P6启动子可以包含SEQ ID NO:12所示的核酸序列。

例如，所述启动子可以为OPEFS，包含SEQ ID NO:1所示的核酸序列。

例如，所述启动子可以为EFS，包含SEQ ID NO:2所示的核酸序列。

例如，所述启动子可以为EF1a，包含SEQ ID NO:3所示的核酸序列。

例如，所述启动子可以为CAG，包含SEQ ID NO:4所示的核酸序列。

例如，所述启动子可以为RPE65，包含SEQ ID NO:5所示的核酸序列。

多聚腺苷酸信号位点

在本申请中，所述多聚腺苷酸信号位点可以包含SV40信号位点、BGH信号位点、WPRE信号位点、WPRE-SV40信号位点、WPRE-BGH信号位点或其衍生物。

例如，所述多聚腺苷酸信号位点可被多聚腺苷酸化相关裂解因子识别从而产生SV40多聚腺苷酸序列、BGH信号多聚腺苷酸序列、HSV信号多聚腺苷酸序列、TK信号多聚腺苷酸序列、WPRE信号多聚腺苷酸序列等。

例如，所述多聚腺苷酸信号位点可以包含AAUAAA序列。

例如，所述多聚腺苷酸信号位点可以包含SEQ ID NO:17-21所示的核酸序列。

自我剪切肽

在本申请中，所述编码自我剪切肽的多核苷酸位于所述编码CYP4V2的多核苷酸与所述编码RdCVF的多核苷酸之间。

例如，所述自我剪切肽可以包含T2A、P2A、E2A或F2A。

例如，所述自我剪切肽可以包含P2A。

例如，所述自我剪切肽可以包含SEQ ID NO:26-29中任一项所示的氨基酸序列。

例如，所述编码自我剪切肽的多核苷酸可以包含SEQ ID NO:22-25中任一项所示的核酸序列。

例如，所述剪切肽的N端还可以连接GSG（Gly-Ser-Gly，甘氨酸、丝氨酸、甘氨酸）序列。

内含子

在本申请中，所述内含子可以位于目的基因的5’端或者位于目的基因的核苷酸序列中。所述目的基因可以包括编码CYP4V2的多核苷酸或编码RdCVF的多核苷酸。所述内含子能够增强所述目的基因的表达。例如，所述内含子可以包含人β-globin内含子、SV40内含子、杂合CBA/MVM 内含子或其他人工合成内含子。

例如，所述内含子包含SEQ ID NO: 13-16中任一项所示的核苷酸序列。

分离的核酸分子

在本申请中，所述分离的核酸分子从5’端到3’端可以依次包含编码CYP4V2的多核苷酸、编码RdCVF的多核苷酸。

例如，所述分离的核酸分子从5’端到3’端可以依次包含所述编码CYP4V2的多核苷酸、所述编码RdCVF的多核苷酸，所述编码CYP4V2的多核苷酸可以包含SEQ ID NO:62-68中任一项所示的核酸序列，所述编码RdCVF的多核苷酸可以包含SEQ ID NO:69-75中任一项所示的核酸序列。

在本申请中，所述分离的核酸分子从5’端到3’端可以依次包含编码所述RdCVF的多核苷酸、所述编码CYP4V2的多核苷酸。

例如，所述分离的核酸分子从5’端到3’端可以依次包含编码所述RdCVF的多核苷酸、所述编码CYP4V2的多核苷酸，所述编码RdCVF的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 69-75中任一项所示的核酸序列，所述编码CYP4V2的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 62-68中任一项所示的核酸序列。

在本申请中，所述分离的核酸分子还可以包含所述启动子。

例如，所述启动子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端且与所述编码CYP4V2的多核苷酸可操作连接。

例如，所述启动子位于所述编码RdCVF的多核苷酸的5’端且与所述编码RdCVF的多核苷酸可操作连接。

例如，所述分离的核酸分子从5’端到3’端可以依次包含所述启动子、所述编码CYP4V2的多核苷酸、所述编码RdCVF的多核苷酸。

例如，所述分离的核酸分子从5’端到3’端可以依次包含所述启动子、所述编码RdCVF的多核苷酸、所述编码CYP4V2的多核苷酸。

例如，所述启动子可以包含SEQ ID NO:1-12中任一项所示的核酸序列，所述编码RdCVF的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 69-75中任一项所示的核酸序列，所述编码CYP4V2的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 62-68中任一项所示的核酸序列。

例如，所述分离的核酸分子从5’端到3’端可以依次包含所述启动子、所述编码CYP4V2的多核苷酸、所述启动子、所述编码RdCVF的多核苷酸。

例如，所述启动子可以包含SEQ ID NO:1-12中任一项所示的核酸序列，所述编码CYP4V2的多核苷酸可以包含SEQ ID NO:62-68中任一项所示的核酸序列，所述编码RdCVF的多核苷酸可以包含SEQ ID NO:69-75中任一项所示的核酸序列。

例如，所述分离的核酸分子从5’端到3’端可以依次包含所述启动子、所述编码RdCVF的多核苷酸、所述启动子、所述编码CYP4V2的多核苷酸。

例如，所述启动子可以包含SEQ ID NO: 1-12中任一项所示的核酸序列，所述编码RdCVF的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 69-75中任一项所示的核酸序列、所述编码CYP4V2的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 62-68中任一项所示的核酸序列。

在本申请中，所述分离的核酸分子还可以包含编码所述自我剪切肽的多核苷酸。

例如，所述分离的核酸分子从5’端到3’端可以依次包含启动子、编码CYP4V2的多核苷酸、编码自我剪切肽的多核苷酸、编码RdCVF的多核苷酸。

例如，所述启动子可以包含SEQ ID NO: 1-12中任一项所示的核酸序列，所述编码CYP4V2的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 62-68中任一项所示的核酸序列，所述编码自我剪切肽的多核苷酸可以包含SEQ ID NO:22-25中任一项所示的核酸序列，所述编码RdCVF的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 69-75中任一项所示的核酸序列。

例如，所述分离的核酸分子从5’端到3’端可以依次包含启动子、编码RdCVF的多核苷酸、编码自我剪切肽的多核苷酸、编码CYP4V2的多核苷酸。

例如，所述启动子可以包含SEQ ID NO: 1-12中任一项所示的核酸序列，所述编码RdCVF的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 69-75中任一项所示的核酸序列，所述编码自我剪切肽的多核苷酸可以包含SEQ ID NO:22-25中任一项所示的核酸序列，所述编码CYP4V2的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 62-68中任一项所示的核酸序列。

例如，所述分离的核酸分子可以包含SEQ ID NO:101-105中任一项所示的核酸序列。

在本申请中，所述分离的核酸分子还可以包含所述多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的3’端。

在本申请中，所述分离的核酸分子还可以包含多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码RdCVF的多核苷酸的3’端。

例如，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含所述启动子、所述编码CYP4V2的多核苷酸、所述编码自我剪切肽的多核苷酸、所述编码RdCVF的多核苷酸、所述多聚腺苷酸信号位点。

例如，所述启动子可以包含SEQ ID NO: 1-12中任一项所示的核酸序列，所述编码RdCVF的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 69-75中任一项所示的核酸序列，所述编码自我剪切肽的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 22-25中任一项所示的核酸序列，所述编码CYP4V2的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 62-68中任一项所示的核酸序列，所述多聚腺苷酸信号位点可以包含可以包含如SEQ ID NO: 17-21中任一项所示的核苷酸序列。

在本申请中，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含所述启动子、所述编码RdCVF的多核苷酸、所述编码自我剪切肽的多核苷酸、所述编码CYP4V2的多核苷酸、所述多聚腺苷酸信号位点。

例如，所述启动子可以包含SEQ ID NO: 1-12中任一项所示的核酸序列，所述编码RdCVF的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 69-75中任一项所示的核酸序列，所述编码自我剪切肽的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 22-25中任一项所示的核酸序列，所述编码CYP4V2的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 62-68中任一项所示的核酸序列，所述多聚腺苷酸信号位点可以包含SEQ ID NO: 17-21中任一项所示的核苷酸序列。

例如，所述分离的核酸分子可以包含SEQ ID NO:106-108中任一项所示的核酸序列。

在本申请中，所述分离的核酸分子还可以包含所述内含子。

例如，所述内含子可以包含SEQ ID NO: 13-16中任一项所示的核苷酸序列。

例如，所述内含子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸中，或者，所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端。

例如，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含所述启动子、所述内含子、所述编码CYP4V2的多核苷酸、所述编码自我剪切肽的多核苷酸、所述编码RdCVF的多核苷酸。

例如，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含所述启动子、***了所述内含子的编码所述CYP4V2的多核苷酸、所述编码自我剪切肽的多核苷酸、所述编码RdCVF的多核苷酸。

例如，所述启动子可以包含SEQ ID NO: 1-12中任一项所示的核酸序列，所述内含子可以包含SEQ ID NO: 13-16中任一项所示的核酸序列，所述编码CYP4V2的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 62-68中任一项所示的核酸序列，所述编码自我剪切肽的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 22-25中任一项所示的核酸序列，所述编码RdCVF的多核苷酸可以包含SEQID NO: 69-75中任一项所示的核酸序列。

例如，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含所述启动子、所述内含子、所述编码CYP4V2的多核苷酸、所述编码自我剪切肽的多核苷酸、所述编码RdCVF的多核苷酸、所述多聚腺苷酸信号位点。

例如，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含所述启动子、***了所述内含子的编码所述CYP4V2的多核苷酸、所述编码自我剪切肽的多核苷酸、所述编码RdCVF的多核苷酸、所述多聚腺苷酸信号位点。

例如，所述***了所述内含子的编码所述CYP4V2的多核苷酸可以包含SEQ ID NO:116所述的核酸序列。

例如，所述内含子位于所述编码RdCVF的多核苷酸中，或者，所述编码RdCVF的多核苷酸的5’端。

例如，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含所述启动子、所述内含子、所述编码RdCVF的多核苷酸、所述编码自我剪切肽的多核苷酸、所述编码CYP4V2的多核苷酸。

例如，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含所述启动子、***了所述内含子的编码所述RdCVF的多核苷酸、所述编码自我剪切肽的多核苷酸、所述编码CYP4V2的多核苷酸。

例如，所述启动子可以包含SEQ ID NO: 1-12中任一项所示的核酸序列，所述内含子可以包含SEQ ID NO: 13-16中任一项所示的核酸序列，所述编码RdCVF的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 69-75中任一项所示的核酸序列，所述编码自我剪切肽的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 22-25中任一项所示的核酸序列，所述编码CYP4V2的多核苷酸可以包含SEQID NO: 62-68中任一项所示的核酸序列。

例如，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含所述启动子、所述内含子、所述编码RdCVF的多核苷酸、所述编码自我剪切肽的多核苷酸、所述编码CYP4V2的多核苷酸、所述多聚腺苷酸信号位点。

例如，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含所述启动子、***了所述内含子的编码所述RdCVF的多核苷酸、所述编码自我剪切肽的多核苷酸、所述编码CYP4V2的多核苷酸、所述多聚腺苷酸信号位点。

例如，所述分离的核酸分子可以包含如SEQ ID NO: 109-115中任一项所示的核苷酸序列。

在本申请中，所述分离的核酸分子的结构的示意图可以参见图30和图31，其中SP表示所述编码信号肽的核苷酸序列。

在本申请的所述分离的核酸分子中，编码所述CYP4V2 蛋白的核苷酸序列可以包含kozak序列（例如，可以在5’端包含所述kozak序列）。和/或，其中所述编码所述RdCVF蛋白的核苷酸序列可以包含kozak序列（例如，可以在5’端包含所述kozak序列）。其中，所述kozak序列可以包含SEQ ID NO: 166所示的核苷酸序列。

在本申请中，所述分离的核酸分子的5’还可以包含包装信号5' ITR，其可以包含SEQ ID NO: 162所示的核苷酸序列。

在本申请中，所述分离的核酸分子的3’还可以包含包装信号3' ITR，其可以包含SEQ ID NO: 163所示的核苷酸序列。

在本申请中，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含编码CAG启动子的核苷酸序列、编码所述CYP4V2 蛋白的核苷酸序列、编码BGH信号位点的核苷酸序列、编码CAG启动子的核苷酸序列、编码所述RdCVF蛋白的核苷酸序列和编码BGH信号位点的核苷酸序列。

在本申请中，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含编码CAG启动子的核苷酸序列、编码所述RdCVF蛋白的核苷酸序列、编码BGH信号位点的核苷酸序列、编码CAG启动子的核苷酸序列、编码所述CYP4V2蛋白的核苷酸序列和编码BGH信号位点的核苷酸序列。

在本申请中，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含编码BGH信号位点的核苷酸序列、编码所述CYP4V2 蛋白的核苷酸序列、编码CAG启动子的核苷酸序列、编码CAG启动子的核苷酸序列、编码所述RdCVF蛋白的核苷酸序列和编码BGH信号位点的核苷酸序列。

在本申请中，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含编码BGH信号位点的核苷酸序列、编码所述RdCVF蛋白的核苷酸序列、编码CAG启动子的核苷酸序列、编码CAG启动子的核苷酸序列、编码所述CYP4V2蛋白的核苷酸序列和编码BGH信号位点的核苷酸序列。

在本申请中，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含编码CAG启动子的核苷酸序列、编码所述CYP4V2 蛋白的核苷酸序列、编码BGH信号位点的核苷酸序列、编码BGH信号位点的核苷酸序列、编码所述RdCVF蛋白的核苷酸序列和编码CAG启动子的核苷酸序列。

在本申请中，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含编码CAG启动子的核苷酸序列、编码所述RdCVF蛋白的核苷酸序列、编码BGH信号位点的核苷酸序列、编码BGH信号位点的核苷酸序列、编码所述CYP4V2蛋白的核苷酸序列和编码CAG启动子的核苷酸序列。

在本申请中，所述分离的核酸分子可以包含编码信号肽的核苷酸序列。例如，所述信号肽可以包含SEQ ID NO: 174-178中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述编码信号肽的核苷酸序列可以包含SEQ ID NO: 169-173中任一项所示的核苷酸序列。

例如，所述编码信号肽的核苷酸可以包含kozak序列（例如，可以在5’端包含所述kozak序列）。其中，所述kozak序列可以包含SEQ ID NO: 166所示的核苷酸序列。

在本申请的所述分离的核酸分子中，编码所述CYP4V2 蛋白的核苷酸序列可以包含kozak序列（例如，可以在5’端包含所述kozak序列）。其中，所述kozak序列可以包含SEQID NO: 166所示的核苷酸序列。

在本申请中，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含编码CAG启动子的核苷酸序列、编码所述CYP4V2 蛋白的核苷酸序列、编码BGH信号位点的核苷酸序列、编码CAG启动子的核苷酸序列、编码信号肽的核苷酸序列、编码所述RdCVF蛋白的核苷酸序列和编码BGH信号位点的核苷酸序列。

在本申请中，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含编码CAG启动子的核苷酸序列、编码信号肽的核苷酸序列、编码所述RdCVF蛋白的核苷酸序列、编码BGH信号位点的核苷酸序列、编码CAG启动子的核苷酸序列、编码所述CYP4V2蛋白的核苷酸序列和编码BGH信号位点的核苷酸序列。

在本申请中，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含编码BGH信号位点的核苷酸序列、编码所述CYP4V2 蛋白的核苷酸序列、编码CAG启动子的核苷酸序列、编码CAG启动子的核苷酸序列、编码信号肽的核苷酸序列、编码所述RdCVF蛋白的核苷酸序列和编码BGH信号位点的核苷酸序列。

在本申请中，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含编码BGH信号位点的核苷酸序列、编码所述RdCVF蛋白的核苷酸序列、编码信号肽的核苷酸序列、编码CAG启动子的核苷酸序列、编码CAG启动子的核苷酸序列、编码所述CYP4V2蛋白的核苷酸序列和编码BGH信号位点的核苷酸序列。

在本申请中，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含编码CAG启动子的核苷酸序列、编码所述CYP4V2 蛋白的核苷酸序列、编码BGH信号位点的核苷酸序列、编码BGH信号位点的核苷酸序列、编码所述RdCVF蛋白的核苷酸序列、编码信号肽的核苷酸序列和编码CAG启动子的核苷酸序列。

在本申请中，所述的分离的核酸分子从5’至3’方向可以依次包含编码CAG启动子的核苷酸序列、编码信号肽的核苷酸序列、编码所述RdCVF蛋白的核苷酸序列、编码BGH信号位点的核苷酸序列、编码BGH信号位点的核苷酸序列、编码所述CYP4V2蛋白的核苷酸序列和编码CAG启动子的核苷酸序列。

在本申请中，所述分离的核酸分子还可以包含编码载体骨架的核苷酸序列，例如，所述载体骨架可以为pAV-kanaR。例如，编码所述载体骨架的核苷酸序列可以包含SEQ IDNO: 164所示的核苷酸序列。

在本申请中，所述的分离的核酸分子可以包含SEQ ID NO: 156-161中任一项所示的核苷酸序列。

载体

在本申请中，所述载体可以包括质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体如酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）或P1来源的人工染色体（PAC）、噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及病毒载体。

例如，所述病毒载体可以包括逆转录酶病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒（AAV载体）、疱疹病毒（如单纯疱疹病毒）、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒（例如SV40）。

例如，所述腺相关病毒载体（AAV载体）基因可以包含反向末端重复序列（ITR）、开放阅读框（ORF），所述开放阅读框可以包括编码Rep蛋白的多核苷酸，还可以包括编码衣壳的多核苷酸。

例如，所述腺相关病毒载体（AAV载体）还可以包括重组腺相关病毒载体（rAAV载体）。

例如，所述重组腺相关病毒载体中衣壳、ITR和其它所选AAV组件可以选自任何AAV，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV8bp、AAV7M8和AAVAnc80、DJ、DJ/8、Rh10任何已知或提及的AAV的变体或尚待发现的AAV或其变体或混合物。

例如，所述AAV载体可以是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV8bp、AAV7M8、AAVAnc80、DJ、DJ/8、Rh10中的任意一种。

例如，所述AAV载体为眼组织亲和性AAV载体，例如，AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV8、DJ/8或任意rAAV载体。

例如，所述AAV载体可以是AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8或AAV2/9。

例如，所述病毒载体可以包含pAAV-RC5-Amp、RC8-cap、AAV2/8、AAV-helper-Amp、AAV-helper。

例如，所述病毒载体可以包含SEQ ID NO: 133-137中任一项所示的核苷酸序列。

例如，所述载体还可以包含如SEQ ID NO: 90-115中任一项所示的核苷酸序列。

例如，所述载体还可以包含如SEQ ID NO: 117-121中任一项所示的核苷酸序列。

例如，所述载体可以包含如SEQ ID NO: 122-132中任一项所示的核苷酸序列。

在本申请中，所述载体可以包含本申请所述的分离的核酸分子。

例如，所述载体可以包含如SEQ ID NO: 101-115中任一项所示的核苷酸序列。

在本申请中，所述载体可以包含编码所述CYP4V2的多核苷酸或者所述编码RdCVF的多核苷酸。

例如，所述载体还可以包含启动子，所述启动子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端且与所述编码CYP4V2的多核苷酸可操作连接。

例如，所述载体还可以包含启动子，所述启动子位于所述编码RdCVF的多核苷酸的5’端且与所述编码RdCVF的多核苷酸可操作连接。

例如，所述载体还可以包含多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的3’端。

例如，所述载体以5’至3’方向可以依次包含：所述启动子、所述编码CYP4V2的多核苷酸、所述多聚腺苷酸信号位点。

例如，所述载体以5’至3’方向可以依次包含：如SEQ ID NO: 1-12中任一项所示的启动子序列、如SEQ ID NO: 62-68中任一项所示的编码CYP4V2的多核苷酸序列、如SEQ IDNO: 17-21中任一项所示的多聚腺苷酸信号位点序列。

例如，所述载体可以包含SEQ ID NO: 90-92中任一项所示的核苷酸序列。

例如，所述载体还可以包含多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码RdCVF的多核苷酸的3’端。

例如，所述载体以5’至3’方向可以依次包含：所述启动子、所述编码RdCVF的多核苷酸、所述多聚腺苷酸信号位点。

例如，所述载体以5’至3’方向可以依次包含：如SEQ ID NO: 1-12中任一项所示的启动子序列、如SEQ ID NO: 69-75中任一项所示的编码RdCVF的多核苷酸序列、如SEQ IDNO: 17-21中任一项所示的多聚腺苷酸信号位点序列。

例如，所述载体可以包含如SEQ ID NO: 96-98中任一项所示的核酸序列。

例如，所述载体还可以包含内含子。

例如，所述内含子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸中，或者，位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端。

例如，所述内含子位于所述编码RdCVF的多核苷酸中，或者，位于所述编码RdCVF的多核苷酸的5’端。

例如，所述载体以5’至3’方向可以依次包含：所述启动子、所述内含子、所述编码CYP4V2的多核苷酸或所述编码RdCVF的多核苷酸。

例如，所述载体以5’至3’方向可以依次包含：所述启动子、***了所述内含子的编码所述CYP4V2的多核苷酸或***了所述内含子的编码所述RdCVF的多核苷酸。

例如，所述载体以5’至3’方向可以依次包含：所述启动子、所述内含子、所述编码CYP4V2的多核苷酸或所述编码RdCVF的多核苷酸、所述多聚腺苷酸信号位点。

例如，所述载体以5’至3’方向可以依次包含：所述启动子、***了所述内含子的编码所述CYP4V2的多核苷酸或***了所述内含子的编码所述RdCVF的多核苷酸、所述多聚腺苷酸信号位点。

例如，所述启动子可以包含SEQ ID NO: 1-12中任一项所示的核酸序列，所述内含子可以包含SEQ ID NO: 13-16中任一项所示的核酸序列，所述编码CYP4V2的多核苷酸可以包含SEQ ID NO: 62-68中任一项所示的核酸序列，所述编码RdCVF的多核苷酸可以包含SEQID NO: 69-75中任一项所示的核酸序列，所述多聚腺苷酸信号位点可以包含SEQ ID NO:17-21中任一项所示的核苷酸序列。

例如，所述***了所述内含子的编码所述CYP4V2的多核苷酸可以包含SEQ ID NO:116所述的核酸序列。

例如，所述载体可以包含SEQ ID NO: 93-95和99-100中任一项所示的核苷酸序列。

载体组合

本申请还提供了用于治疗、缓解和/或预防与视网膜色素上皮（RPE）萎缩相关的疾病或病症的载体组合，其包括第一载体和第二载体，所述第一载体可以包含编码CYP4V2的多核苷酸，所述第二载体可以包含编码RdCVF的多核苷酸。

例如，所述第一载体还可以包含启动子，所述启动子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端且与所述编码CYP4V2的多核苷酸可操作连接。

例如，所述第一载体以5’至3’方向可以依次包含：如SEQ ID NO: 1-12中任一项所示的启动子序列、如SEQ ID NO: 62-68中任一项所示的编码CYP4V2的多核苷酸序列。

例如，所述第一载体可以包含SEQ ID NO: 117所示的多核苷酸序列。

例如，所述第二载体还可以包含启动子，所述启动子位于所述编码RdCVF的多核苷酸的5’端且与所述编码RdCVF的多核苷酸可操作连接。

例如，所述第二载体可以包含SEQ ID NO: 120所示的多核苷酸序列。

例如，所述第一载体以5’至3’方向可以依次包含：如SEQ ID NO: 1-12中任一项所示的启动子序列、如SEQ ID NO: 69-75中任一项所示的编码RdCVF的多核苷酸序列。

例如，所述第一载体还可以包含多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的3’端。

例如，所述第二载体还可以包含多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码RdCVF的多核苷酸的3’端。

例如，所述第一载体以5’至3’方向可以依次包含：所述启动子、所述编码CYP4V2的多核苷酸、所述多聚腺苷酸信号位点；和/或，所述第二载体以5’至3’方向可以依次包含：所述启动子、所述编码RdCVF的多核苷酸、所述多聚腺苷酸信号位点。

例如，所述第一载体以5’至3’方向可以依次包含：如SEQ ID NO: 1-12中任一项所示的启动子序列、如SEQ ID NO: 62-68中任一项所示的编码CYP4V2的多核苷酸序列、如SEQID NO: 17-21中任一项所示的多聚腺苷酸信号位点序列。

例如所述第一载体可以包含如SEQ ID NO: 90-92中任一项所示的核苷酸序列。

例如，所述第二载体以5’至3’方向可以依次包含：如SEQ ID NO: 1-12中任一项所示的启动子序列、如SEQ ID NO: 69-75中任一项所示的编码RdCVF的多核苷酸序列、如SEQID NO: 17-21中任一项所示的多聚腺苷酸信号位点序列。

例如所述第二载体可以包含如SEQ ID NO: 96-98中任一项所示的核苷酸序列。

例如，所述第一载体和/或所述第二载体还可以包含内含子。

例如，所述内含子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸中，或者，位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端。

例如，所述内含子位于所述编码RdCVF的多核苷酸中，或者，位于所述编码RdCVF的多核苷酸的5’端。

例如，所述第一载体可以包含SEQ ID NO: 93-95中任一项所示的核苷酸序列；和/或，所述第二载体可以包含SEQ ID NO: 99-100中任一项所示的核苷酸序列。

例如，所述第一载体可以包含SEQ ID NO: 118-119中任一项所示的核苷酸序列；和/或，所述第二载体可以包含SEQ ID NO: 121中任一项所示的核苷酸序列。

例如，所述载体可以包含如SEQ ID NO: 156-161中任一项所示的核酸序列。

细胞

本申请还提供了细胞，其可以包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体组合。

例如，所述细胞可以是使得所述核酸分子在其中表达的细胞。

例如，所述细胞可以包含单个细胞的后代。所述后代可以不一定与原始母细胞完全相同（在总DNA互补体的形态上或在基因组上）。

例如，所述细胞还可以包含用本发明所述的载体在体外转染的细胞。

例如，所述细胞可以包含细菌细胞（例如，大肠杆菌）、酵母细胞或其它真核细胞，例如COS细胞、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、COS-1细胞、NS0细胞或骨髓瘤细胞、293T细胞。

例如，所述细胞为来自结晶样视网膜变性患者的细胞。

例如，所述细胞可以包含体细胞或干细胞。

例如，所述细胞可以包含视网膜细胞、角膜细胞、脉络膜细胞、晶状体细胞、神经细胞、RPE细胞、干细胞，所述干细胞可以包含诱导性多能干细胞（iPSC）、胚胎干细胞（ESC）、间充质干细胞（MSC）、成体干细胞或源自干细胞的任何细胞。

例如，所述视网膜细胞、角膜细胞、脉络膜细胞、晶状体细胞、神经细胞、RPE细胞可以是由所述干细胞诱导分化的。

例如，所述细胞可以包含ARPE-19细胞、人iPSC诱导的RPE细胞。

药物组合物

本申请还提供了药物组合物，其可以包含本申请所述的所述的核酸分子、本申请所述的载体组合和/或本申请所述的细胞。

例如，所述药物组合物还可以包含任选地药学上可接受的佐剂。

例如，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。

例如，所述组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下对接受者无毒。

例如，所述药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。

例如，所述药学上可接受的佐剂可以包括与药物给药相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂，通常安全、无毒，且既不是生物学上也非其它方面不合需要的。

例如，所述药物组合物可以包含肠胃外、经皮、腔内、动脉内、鞘内和/或眼内施用或直接注射到组织中。

例如，所述药物组合物可以通过滴注、输注或注射施用于患者或者受试者。

例如，所述药物组合物可以不间断（或连续）施用。

例如，所述不间断（或连续）施用可以通过患者佩戴的小泵系统来实现，以测量流入患者体内的治疗剂，如WO2015/036583所述。

在本申请中，所述受试者可以包括人类和非人类动物。例如，所述受试者可以包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。

本申请还提供一种注射用试剂盒，其包含携带本申请所述的分离的核酸分子的载体和药学上可接受的辅料。例如，所述载体可以包含如SEQ ID NO: 156-161中任一项所示的核酸序列。

例如，所述药学上可接受的辅料可以适于视网膜下注射。

例如，所述药学上可接受的辅料可以包括散瞳剂。所述散瞳剂可以包括阿托品。

例如，所述药学上可接受的辅料可以包括麻醉剂。所述麻醉剂可以包括***和/或甲苯噻嗪安。

所述药学上可接受的辅料还可以包括生理盐水和/或消毒剂。

在本申请中，所述注射用试剂盒还可以包括注射器。

与视网膜色素上皮（RPE）萎缩相关的疾病或病症

在本申请中，所述视网膜色素上皮（RPE）萎缩相关的疾病或病症可以包括年龄相关黄斑变性或视网膜色素变性（RP）。

例如，所述视网膜色素变性可以包括单眼性原发性视网膜色素变性、象限性原发性视网膜色素变性、中心性或旁中心性原发性视网膜色素变性、无色素性视网膜色素变性白点状视网膜变性、结晶样视网膜变性、静脉胖色素性视网膜色素变性、小动脉旁色素上皮保留型视网膜色素变性、Leber先天黑蒙和其他综合征中的视网膜色素变性。

例如，所述视网膜色素变性可以包括结晶样视网膜变性。

例如，所述结晶样视网膜变性可以包括由CYP4V2基因突变引起的疾病。

例如，所述CYP4V2基因突变可以包括但不限于错义突变、复制错误、剪接位点错误、移码、碱基缺失或***、无义突变、多态性（例如，单核苷酸多态性）、过早终止、CYP4V2部分或全基因缺失及尚未鉴定的与结晶样视网膜变性相关的CYP4V2基因变异。

例如，所述CYP4V2基因突变可以包括表1所示突变：

表1 CYP4V2基因突变部分类型

表1中所示的CYP4V2基因突变型可自数据库

获得。

本申请还包括如下的实施方式：

1.CYP4V2和RdCVF在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、缓解和/或预防与视网膜色素上皮（RPE）萎缩相关的疾病或病症。

2.根据实施方式1所述的用途，其中所述疾病或病症包括结晶样视网膜变性。

3.根据实施方式1-2中任一项所述的用途，其中所述CYP4V2为人CYP4V2。

4.根据实施方式1-3中任一项所述的用途，其中所述CYP4V2包含SEQ ID NO: 76-82中任一项所示的氨基酸序列。

5.根据实施方式1-4中任一项所述的用途，其中所述编码CYP4V2的多核苷酸包含SEQ ID NO:62-68中任一项所示的核酸序列。

6.根据实施方式1-5中任一项所述的用途，其中所述RdCVF为人RdCVF。

7.根据实施方式1-6中任一项所述的用途，其中所述RdCVF包含SEQ ID NO: 83-89中任一项所示的氨基酸序列。

8.根据实施方式1-7中任一项所述的用途，其中所述编码RdCVF的多核苷酸包含SEQ ID NO: 69-75中任一项所示的核酸序列。

9.根据实施方式1-8中任一项所述的用途，其中所述药物包含编码所述CYP4V2的多核苷酸以及编码所述RdCVF的多核苷酸。

10.根据实施方式1-9所述的用途，其中所述编码CYP4V2的多核苷酸和所述编码RdCVF的多核苷酸位于不同的载体上。

11.根据实施方式1-9中任一项所述的用途，其中所述编码CYP4V2的多核苷酸和所述编码RdCVF的多核苷酸位于同一载体上。

12.根据实施方式10-11中任一项所述的用途，其中所述载体包括病毒载体。

13.根据实施方式10-12中任一项所述的用途，其中所述载体为病毒载体，其所述病毒载体包括AAV载体。

14.根据实施方式10-13中任一项所述的用途，其中所述载体还包含启动子，所述启动子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端且与所述编码CYP4V2的多核苷酸可操作连接。

15.根据实施方式10-14中任一项所述的用途，其中所述载体还包含启动子，所述启动子位于所述编码RdCVF的多核苷酸的5’端且与所述编码RdCVF的多核苷酸可操作连接。

16.根据实施方式14-15中任一项所述的用途，其中所述启动子包含SEQ ID NO:1-12中任一项所示的核苷酸序列。

17.根据实施方式10-16中任一项所述的用途，其中所述载体还包含多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的3’端。

18.根据实施方式10-16中任一项所述的用途，其中所述载体还包含多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码RdCVF的多核苷酸的3’端。

19.根据实施方式10-18中任一项所述的用途，其中所述载体还包含编码自我剪切肽的多核苷酸，所述编码自我剪切肽的多核苷酸位于所述编码CYP4V2的多核苷酸与所述编码RdCVF的多核苷酸之间。

20.根据实施方式19中任一项所述的用途，其中所述自我剪切肽包含P2A。

21.根据实施方式19-20中任一项所述的用途，其中所述编码自我剪切肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:22-25中任一项所示的核苷酸序列。

22.根据实施方式10-21中任一项所述的用途，其中所述载体以5’至3’方向依次包含：所述启动子、所述编码CYP4V2的多核苷酸、所述编码自我剪切肽的多核苷酸、所述编码RdCVF的多核苷酸和所述多聚腺苷酸信号位点。

23.根据实施方式10-18中任一项所述的用途，其中所述载体以5’至3’方向依次包含：所述启动子、所述编码CYP4V2的多核苷酸、所述多聚腺苷酸信号位点；或者，所述载体以5’至3’方向依次包含：所述启动子、所述编码RdCVF的多核苷酸、所述多聚腺苷酸信号位点。

24. 根据实施方式10-23中任一项所述的用途，其中所述载体还包含内含子。

25. 根据实施方式24所述的用途，其中所述内含子包含SEQ ID NO: 13-16中任一项所示的核苷酸序列。

26. 根据实施方式24-25中任一项所述的用途，其中所述内含子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸中，或者，位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端。

27. 根据实施方式24-25中任一项所述的用途，其中所述内含子位于所述编码RdCVF的多核苷酸中，或者，位于所述编码RdCVF的多核苷酸的5’端。

28. 根据实施方式1-27中任一项所述的用途，其中所述载体包含SEQ ID NO: 90-116中任一项所示的核苷酸序列。

29. 用于治疗、缓解和/或预防与视网膜色素上皮（RPE）萎缩相关的疾病或病症的载体组合，其包括第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码CYP4V2的多核苷酸，所述第二载体包含编码RdCVF的多核苷酸。

30. 根据实施方式29所述的载体组合，其中所述疾病或病症包括结晶样视网膜变性。

31. 根据实施方式29-30中任一项所述的载体组合，其中所述CYP4V2为人CYP4V2。

32. 根据实施方式29-31中任一项所述的载体组合，其中所述CYP4V2包含SEQ IDNO: 76-82中任一项所示的氨基酸序列。

33. 根据实施方式29-32中任一项所述的载体组合，其中所述编码CYP4V2的多核苷酸包含SEQ ID NO:62-69中任一项所示的核酸序列。

34. 根据实施方式29-33中任一项所述的载体组合，其中所述RdCVF为人RdCVF。

35. 根据实施方式29-34中任一项所述的载体组合，其中所述RdCVF包含SEQ IDNO: 83-89中任一项所示的氨基酸序列。

36. 根据实施方式29-35中任一项所述的载体组合，其中所述编码RdCVF的多核苷酸包含SEQ ID NO: 69-75中任一项所示的核酸序列。

37. 根据实施方式29-36中任一项所述的载体组合，其中所述载体包括病毒载体。

38. 根据实施方式29-37中任一项所述的载体组合，其中所述载体为病毒载体，其所述病毒载体包括AAV载体。

39. 根据实施方式29-38中任一项所述的载体组合，其中所述第一载体还包含启动子，所述启动子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端且与所述编码CYP4V2的多核苷酸可操作连接。

40. 根据实施方式29-39中任一项所述的载体组合，其中所述第二载体还包含启动子，所述启动子位于所述编码RdCVF的多核苷酸的5’端且与所述编码RdCVF的多核苷酸可操作连接。

41. 根据实施方式39-40中任一项所述的载体组合，其中所述启动子包含SEQ IDNO:1-12中任一项所示的核苷酸序列。

42. 根据实施方式29-41中任一项所述的载体组合，其中所述第一载体还包含多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的3’端。

43. 根据实施方式29-42中任一项所述的载体组合，其中所述第二载体还包含多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码RdCVF的多核苷酸的3’端。

44. 根据实施方式29-43中任一项所述的载体组合，其中所述第一载体以5’至3’方向依次包含：所述启动子、所述编码CYP4V2的多核苷酸、所述多聚腺苷酸信号位点；和/或，所述第二载体以5’至3’方向依次包含：所述启动子、所述编码RdCVF的多核苷酸、所述多聚腺苷酸信号位点。

45. 根据实施方式29-44中任一项所述的载体组合，其中所述第一载体和/或所述第二载体还包含内含子。

46. 根据实施方式45所述的载体组合，其中所述内含子包含SEQ ID NO: 13-16中任一项所示的核苷酸序列。

47. 根据实施方式29-46中任一项所述的载体组合，其中所述内含子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸中，或者，位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端。

48. 根据实施方式29-47中任一项所述的载体组合，其中所述内含子位于所述编码RdCVF的多核苷酸中，或者，位于所述编码RdCVF的多核苷酸的5’端。

49. 根据实施方式29-48中任一项所述的载体组合，其中所述第一载体包含SEQID NO: 90-95中任一项所示的核苷酸序列；和/或，所述第二载体包含SEQ ID NO: 96-100中任一项所示的核苷酸序列。

50. 分离的一种或多种核酸分子，其包含a) 编码CYP4V2的多核苷酸以及b) 编码RdCVF的多核苷酸。

51. 根据实施方式50所述的分离的核酸分子，其中所述CYP4V2为人CYP4V2。

52. 根据实施方式50-51中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述CYP4V2包含SEQ ID NO: 76-82中任一项所示的氨基酸序列。

53. 根据实施方式50-52中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述编码CYP4V2的多核苷酸包含SEQ ID NO:62-68中任一项所示的核酸序列。

54. 根据实施方式50-53中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述RdCVF为人RdCVF。

55. 根据实施方式50-54中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述RdCVF包含SEQ ID NO: 83-89中任一项所示的氨基酸序列。

56. 根据实施方式50-55中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述编码RdCVF的多核苷酸包含SEQ ID NO: 69-75中任一项所示的核酸序列。

57. 根据实施方式50-56中任一项所述的分离的核酸分子，其还包含启动子，所述启动子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端且与所述编码CYP4V2的多核苷酸可操作连接。

58. 根据实施方式50-57中任一项所述的分离的核酸分子，其还包含启动子，所述启动子位于所述编码RdCVF的多核苷酸的5’端且与所述编码RdCVF的多核苷酸可操作连接。

59. 根据实施方式57-58中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述启动子包含SEQ ID NO:1-12中任一项所示的核苷酸序列。

60. 根据实施方式50-59中任一项所述的分离的核酸分子，其包含编码CYP4V2的多核苷酸和编码RdCVF的多核苷酸。

61. 根据实施方式50-60所述的分离的核酸分子，其还包含编码自我剪切肽的多核苷酸，所述编码自我剪切肽的多核苷酸位于所述编码CYP4V2的多核苷酸与所述编码RdCVF的多核苷酸之间。

62. 根据实施方式61所述的分离的核酸分子，其中所述自我剪切肽包含P2A。

63. 根据实施方式61-62中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述编码自我剪切肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:22-25中任一项所示的核苷酸序列。

64. 根据实施方式50-63中任一项所述的分离的核酸分子，其还包含多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的3’端。

65. 根据实施方式50-64中任一项所述的分离的核酸分子，其还包含多聚腺苷酸信号位点，所述多聚腺苷酸信号位点位于所述编码RdCVF的多核苷酸的3’端。

66. 根据实施方式50-65中任一项所述的分离的核酸分子，其以5’至3’方向依次包含：所述启动子、所述编码CYP4V2的多核苷酸、所述编码自我剪切肽的多核苷酸、所述编码RdCVF的多核苷酸和所述多聚腺苷酸信号位点。

67. 根据实施方式50-66中任一项所述的分离的核酸分子，其还包含内含子。

68. 根据实施方式67所述的分离的核酸分子，其中所述内含子包含SEQ ID NO:13-16中任一项所示的核苷酸序列。

69. 根据实施方式67-68中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述内含子位于所述编码CYP4V2的多核苷酸中，或者，位于所述编码CYP4V2的多核苷酸的5’端。

70. 根据实施方式50-69中任一项所述的分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO:101-115中任一项所示的核苷酸序列。

71. 载体，其包含实施方式50-70中任一项所述的分离的核酸分子。

72. 根据实施方式71所述的载体，其为病毒载体。

73. 根据实施方式71-72中任一项所述的载体，其为病毒载体，且所述病毒载体包括AAV载体。

74. 细胞，其包含根据实施方式50-70中任一项所述的分离的核酸分子或根据实施方式29-49中任一项所述的载体组合。

75. 药物组合物，其包含实施方式50-70中任一项所述的分离的核酸分子，实施方式29-49中任一项所述的载体组合，或实施方式74所述的细胞。

76. 实施方式50-70中任一项所述的分离的核酸分子，实施方式29-49中任一项所述的载体组合，或实施方式74所述的细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、缓解和/或预防与视网膜色素上皮（RPE）萎缩相关的疾病或病症。

77. 根据实施方式76所述的用途，其中所述疾病或病症包括结晶样视网膜变性。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请中的核酸分子、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因***到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook, J., Fritsch, E．F． and Maniais，T．（1989） Molecular Cloning： A Laboratory Manual，2nd edition，Cold springHarbor Laboratory Press。未注明的化学试剂均可通过常规商业渠道购买获得。

实施例

实施例1. 通过CYP4V2的表达验证启动子强度

（1）全长CYP4V2启动子序列为人源基因组CYP4V2（HGNC:23198）编码区上游2000bp，由苏州金唯智公司合成。

（2）设计不同长度启动子CYP4V2-Pf、CYP4V2-P1、CYP4V2-P2、CYP4V2-P3、CYP4V2-P4、CYP4V2-P5、CYP4V2-P6的引物序列，以步骤（1）所得核酸分子为模板进行PCR扩增，凝胶电泳回收扩增产物。引物序列如SEQ ID NO: 30-37所示。

PCR反应体系（50μl）如下：

H₂O (Invitrogen, 10977015) 20μl

Primer F (10pmol/μl) 2μl

Primer R (10pmol/μl) 2μl

primeSTAR MAX (Takrara，R045R) 25μl

CYP4V2-pro-2000bp 5ng

表2 PCR反应条件。

（3）分别从CAG启动子两端扩增pAV-CAG-CYP4V2-P2A-EGFP载体（购自山东维真生物科技有限公司），凝胶电泳回收扩增产物。引物序列如SEQ ID NO: 38-39所示。PCR反应体系（50μl）如下：

H₂O (Invitrogen, 10977015) 20μl

Primer F (10pmol/μl) 2μl

Primer R (10pmol/μl) 2μl

primeSTAR MAX (Takrara，R045R) 25μl

pAV-CAG-CYP4V2-P2A-EGFP 5ng

表3 PCR反应条件。

（4）将步骤（2）所得的不同CYP4V2启动子序列（如SEQ ID NO: 6-12所示）同源连接至由步骤（3）所得的线性化pAV-CAG-CYP4V2-P2A-EGFP载体，代替原载体中的CAG启动子。

连接体系（置于冰上操作）如下：

线性化pAV-CAG-CYP4V2-P2A-EGFP载体 1-2 μl

CYP4V2-Pf/P1/P2/P3/P4/P5/P6启动子片段 2-4 μl

Lightening Cloning Master Mix（博奥龙，BDIT0014-20） 5 μl

ddH₂O x μl

Total 10 μl

在50℃水浴锅内放置40min，取5μl反应液转化transtb13大肠杆菌感受态细胞，摇菌测序，使用中提试剂盒（Omega，D6915-04）提质粒。

（5）第一天分293T细胞（ATCC，CRL-3216）到35mm细胞培养皿，第二天至70%左右，配制转染体系：100 μl无血清DMEM分别加入2μg步骤（4）所得质粒，加入3μl PEI，混匀，静止20min；将所得转染体系加入细胞培养基中，晃匀，置于CO₂培养箱中，6h后或过夜换液。

（6）48小时后RIPA裂解液（北京普利莱C1053-100）裂解细胞，跑蛋白胶。Westernblot检测CYP4V2的表达。所使用抗体：anti-CYP4V2（Atlas，HPA029122），anti- actin（Abclonal，AC026），goat-anti-rabbit（Abclonal，AS014）。

结果如图1所示，CYP4V2-PF启动子、CYP4V2-P1启动子、CYP4V2-P2启动子、CYP4V2-P3启动子、CYP4V2-P4启动子、CYP4V2-P5启动子、CYP4V2-P6启动子均能够实现CYP4V2的表达，其中CYP4V2-PF启动子、CYP4V2-P3启动子、CYP4V2-P4启动子、CYP4V2-P5启动子有较良好的表达效果，而CYP4V2-P5序列更短更有优势。

实施例2. 以EGFP为报告基因验证启动子强度

（1）PCR扩增启动子EF1a、EFS、OPEFS。EF1a引物序列如SEQ ID NO: 40-41所示，EFS引物序列如SEQ ID NO: 42-43所示。OPEFS启动子以通用启动子EFS为基础，设计引物采用两轮PCR将EFS改造为OPEFS。第一轮PCR反应所用引物为EFS正向引物（如SEQ ID NO: 42所示）和OPEFS-overlapR1（如SEQ ID NO: 44所示），第二轮PCR反应所用引物为EFS正向引物（如SEQID NO: 42所示）和OPEFS-overlapR2（如SEQ ID NO: 45所示）。凝胶电泳回收扩增产物。PCR反应体系（50μl）如下：

H2O (Invitrogen, 10977015) 20μl

Primer F (10pmol/μl) 2μl

Primer R (10pmol/μl) 2μl

primeSTAR MAX (Takrara，R045R) 25μl

pAV-CAG-CYP4V2-P2A-EGFP 5ng

表4 PCR反应条件。

（2）将步骤（1）所得扩增产物（启动子OPEFS、EFS、EF1a核酸分子，序列如SEQ IDNO: 1-3所示）同源重组连接到按照实施例1步骤（3）所得线性化的pAV-CAG-CYP4V2-P2A-EGFP中，得到pAV-EF1a-CYP4V2-P2A-EGFP，pAV-EFS-CYP4V2-P2A-EGFP和pAV-OPEFS-CYP4V2-P2A-EGFP。连接体系（置于冰上操作）如下：

线性化的pAV-CAG-CYP4V2-P2A-EGFP载体 1-2 μl

EF1a、EFS、OPEFS片段 2-4 μl

Lightening Cloning Master Mix（博奥龙，BDIT0014-20） 5 μl

ddH₂O x μl

Total 10 μl

在50℃水浴锅内放置40min，取5μl反应液转化transtb13大肠杆菌感受态细胞，摇菌测序，使用中提试剂盒（Omega，D6915-04）提质粒。

（3）按照实施例1步骤（5）的方法利用PEI（Polysciences 24765-1）分别将pAV-CAG-CYP4V2-P2A-EGFP, pAV-EF1a-CYP4V2-P2A-EGFP，pAV-EFS-CYP4V2-P2A-EGFP和pAV-OPEFS-CYP4V2-P2A-EGFP质粒转染提前铺于6孔板的293T细胞（ATCC，CRL-3216），细胞密度为70%左右。

（4）24小时后荧光显微镜（Life AMF4305）观察荧光信号。

结果如图2所示，CAG、EF1a、OPEFS相对于EFS都具有较好的表达效果，其中OPEFS序列较短，更有优势。

实施例3. 验证内含子的增强效果

（一）将内含子克隆到基因5’非编码区。

（1）P5-intron的克隆。以CYP4V2-P5启动子序列和人β-globin内含子为基础，设计引物，采用overlap PCR改造得到P5-intron。1）以CYP4V2-P5启动子序列为模板，利用CYP4V2-P5正向引物（CYP4V2-P5F，如SEQ ID NO: 46所示）和CYP4V2-P5（in）反向引物（如SEQ ID NO: 47所示）进行PCR扩增；2）以人β-globin内含子为模板，利用β-globin内含子（c）（如SEQ ID NO: 48所示）和β-globin内含子反向引物（如SEQ ID NO: 49所示）进行PCR扩增；3）分别回收扩增产物，将1）和2）所得目的产物作为共同模板，利用CYP4V2-P5正向引物（CYP4V2-P5F，如SEQ ID NO: 46所示）和β-globin内含子反向引物，如SEQ ID NO: 49所示）进行PCR扩增，PCR扩增按照实施例2步骤（1）的体系和条件进行。回收扩增所得P5-intron目的产物。

（2）将扩增得到的P5-intron序列进行测序，之后同源重组连接到按照实施例1步骤（3）所得线性化的pAV-CAG-CYP4V2-P2A-EGFP中，得到pAV-p5-intron-CYP4V2-P2A-EGFP。连接体系（置于冰上操作）如下：

线性化pAV-CAG-CYP4V2-P2A-EGFP载体 1-2 μl

P5-intron片段 2-4 μl

Lightening Cloning Master Mix（博奥龙，BDIT0014-20） 5 μl

ddH₂O x μl

Total 10 μl

（3）在50℃水浴锅内放置40min，取5μl反应液转化transtb13大肠杆菌感受态细胞，摇菌测序，使用中提试剂盒（Omega，D6915-04）提质粒。

（二）将内含子克隆到基因编码区。

（1）CYP4V2-CDSintron的克隆，在该片段中，内含子位于CYP4V2的第一个和第二个外显子之间。以CYP4V2的CDS序列和人β-globin内含子为基础，设计引物，采用overlap PCR改造得到CDSintron：

1）以CYP4V2的CDS序列为模板，利用引物对CYP4V2-Fpr/CYP4V2-E1-R（序列分别如SEQID NO: 50、51所示）和CYP4V2-E2-F/CYP4V2-R（序列分别如SEQ ID NO: 52、53所示）进行PCR扩增，分别得到PCR产物CYP4V2-E1和CYP4V2-E2~11；

2）以β-globin内含子为模板，利用引物对Intron-F/Intron-R（序列分别如SEQ ID NO:54、55所示）进行PCR扩增；

3）分别回收扩增产物，将1）所得目的产物CYP4V2-E1和2）所得目的产物作为共同模板，利用CYP4V2-CDS正向引物CYP4V2-Fpr（序列如SEQ ID NO: 50所示）和β-globin内含子反向引物Intron-R（序列如SEQ ID NO: 55所示），进行PCR扩增，PCR扩增按照实施例2步骤（1）的体系和条件进行。回收扩增所得CYP4V2-E1-intron目的产物。

4）将3）所得目的产物CYP4V2-E1-intron和1）所得目的产物CYP4V2-E2~11作为共同模板，利用CYP4V2-CDS正向引物CYP4V2-Fpr和CYP4V2-CDS反向引物CYP4V2-R，进行PCR扩增，PCR扩增按照实施例2步骤（1）的体系和条件进行。

（2）将扩增得到的CDSintron序列进行测序。

（3）37℃，2h酶切pAV-p5-CYP4V2-P2A-EGFP得到线性化的载体，凝胶电泳回收。酶切体系如下：

pAV-p5-CYP4V2-P2A-EGFP 2μg

EcoRI (NEB，R3101S) 2μl

MluI (NEB，R3198S) 2μl

Cutsmart Buffer (NEB) 4μl

H₂O (Invitrogen, 10977015) to 40μl

（4）将CYP4V2-CDSintron同源重组连接到线性化的pAV-p5-CYP4V2-P2A-EGFP中，得到pAV-p5-CDSintron-CYP4V2-P2A-EGFP。连接体系（置于冰上操作）如下：

线性化pAV-p5-CYP4V2-P2A-EGFP载体 1-2 μl

CYP4V2-CDSintron片段 2-4 μl

Lightening Cloning Master Mix（博奥龙，BDIT0014-20） 5 μl

ddH₂O x μl

Total 10 μl

（5）在50℃水浴锅内放置40min，取5μl反应液转化transtb13大肠杆菌感受态细胞，摇菌测序，使用中提试剂盒（Omega，D6915-04）提质粒。

（三）验证内含子位于基因5’非编码区和编码区时的增强效果

（1）将pAV-p5-CYP4V2-P2A-EGFP，pAV-p5-intron-CYP4V2-P2A-EGFP和pAV-p5-CDSintron-CYP4V2-P2A-EGFP按照实施例1步骤（5）的方法利用PEI（Polysciences 24765-1）转染提前铺于6孔板的293T细胞（ATCC，CRL-3216），细胞密度为70%左右。

（2）24小时后荧光显微镜（Life AMF4305）观察荧光信号。

（3）48小时后RIPA裂解液（北京普利莱C1053-100）裂解细胞，跑蛋白胶。Westernblot检测CYP4V2的表达。所使用抗体：anti-CYP4V2（Atlas，HPA029122），anti- actin（Abclonal，AC026），goat-anti-rabbit（Abclonal，AS014）。

结果如图3和图4所示，人β-globin内含子***基因5’非编码区和编码区时后表达效果增强。

实施例4. PolyA信号位点的选择

（1）将实施例2所得pAV-OPEFS-CYP4V2-P2A-EGFP载体中的SV40分别替换为BGH，WPRE，WPRE-SV40和WPRE-BGH，序列如SEQ ID NO: 19-21所示，得到pAV-OPEFS-CYP4V2-P2A-EGFP-BGH，pAV-OPEFS-CYP4V2-P2A-EGFP-WPRE，pAV-OPEFS-CYP4V2-P2A-EGFP-WPRE-SV40，pAV-OPEFS-CYP4V2-P2A-EGFP-WPRE-BGH。该部分由北京擎科生物负责基因合成和亚克隆。

（2）将步骤（1）所得载体将测序验证后使用中提试剂盒（Omega，D6915-04）提取质粒。

（3）按照实施例1步骤（5）的方法利用PEI（Polysciences 24765-1）分别将本实施例步骤（2）所得质粒转染提前铺于6孔板的293T细胞（ATCC，CRL- 3216），细胞密度为70%左右。

（4）24小时后荧光显微镜（Life AMF4305）观察荧光信号。

（5）48小时后RIPA裂解液（北京普利莱C1053-100）裂解细胞，跑蛋白胶。Westernblot检测CYP4V2的表达。所使用抗体：anti-CYP4V2（Atlas，HPA029122），anti- actin（Abclonal，AC026），goat-anti-rabbit（Abclonal，AS014）。

结果如图5所示，其中M （mock）为空白对照，S为SV40，B为BGH，W为WPRE，WS为WPRE-SV40，WB为WPRE-BGH。各实验组相对于对照组均能够检测到CYP4V2的表达。

实施例5. 验证信号肽对RdCVF分泌功能的增强效果

（一）构建pAV-CAG-CYP4V2-BGH-CAG-RdCVF-BGH。

（1）以pAV-CAG-CYP4V2-BGH作为骨架，使用BstEII进行载体线性化。

（2）以pAV-CAG-RdCVF-BGH为模板，PCR分别扩增CAG-RdCVF片段和BGH片段。

使用引物为：

BGH-R(B) cggccgttgggtccgcacgtGGTTACCccatagagcccaccgcatcc （其核苷酸序列如SEQ ID NO.179所示）

CMV-F ggtgggctctatggGGTAACCCCATTGACGTCAATAATGACG（其核苷酸序列如SEQ IDNO.180所示）

Rdcvf-BGH-F(in) ggaggtgactgtgccttctagttgcc （其核苷酸序列如SEQ ID NO.181所示）

Rdcvf-BGH-R(in) aggcacagtcacctcctcagatcatcctc （其核苷酸序列如SEQ IDNO.182所示）

（3）2片段与载体进行重组连接，得到pAV-CAG-CYP4V2-BGH-CAG-RdCVF-BGH。

（二）构建pAV-CAG-CYP4V2-BGH-CAG-spRdCVF-BGH。

（1）构建pAV-CAG-spRdCVF-BGH。使用BglII线性化pAV-CAG-RdCVF-BGH。同源重组引入spGL序列。引物序列如下：

spGL-F：GCCTTTCTCTCCACAGgaattccgccaccatgggagtcaaagttctgtttgccctgatctgcatcgctgtggccgaggccgcctccctgttctct（其核苷酸序列如SEQ ID NO.183所示）

spGL-R：agagaacagggaggcggcctcggccacagcgatgcagatcagggcaaacagaactttgactcccatggtggcggaattcCTGTGGAGAGAAAGGC（其核苷酸序列如SEQ ID NO.184所示）

（2）以pAV-CAG-spRdCVF-BGH为模板，PCR分别扩增CAG-spRdCVF片段和BGH片段。

使用引物为：

BGH-R(B) cggccgttgggtccgcacgtGGTTACCccatagagcccaccgcatcc

CMV-F ggtgggctctatggGGTAACCCCATTGACGTCAATAATGACG

Rdcvf-BGH-F(in) ggaggtgactgtgccttctagttgcc

Rdcvf-BGH-R(in) aggcacagtcacctcctcagatcatcctc

（3）载体骨架和重组连接过程与本实施例（一）相同。

（三）验证信号肽对RdCVF分泌功能的增强效果。

（1）将pAV-CAG-CYP4V2-BGH-CAG-RdCVF-BGH以及pAV-CAG-CYP4V2-BGH-CAG-spGL-RdCVF-BGH按照实施例1步骤（5）的方法利用PEI（Polysciences 24765-1）转染提前铺于6孔板的293T细胞（ATCC，CRL-3216），细胞密度为70%左右。

（2）48小时后RIPA裂解液（北京普利莱C1053-100）裂解细胞，跑蛋白胶。Westernblot检测CYP4V2的表达、RdCVF的表达及分泌。所使用抗体：anti-CYP4V2（Atlas，HPA029122），anti- actin（Abclonal，AC026），RdCVF Antibody (TXNL6 Antibody，H00115861-D01P)，goat-anti-rabbit（Abclonal，AS014）。

结果如图6所示，其中mock为空白对照，C-R为pAV-CAG-CYP4V2-BGH-CAG-RdCVF-BGH转染组，C-spR为pAV-CAG-CYP4V2-BGH-CAG-spGL-RdCVF-BGH转染组。信号肽序列***RdCVF编码区后，CYP4V2的表达不受影响；而RdCVF的表达水平略有增强，分泌功能显著增强。

实施例6. 表达载体构建

（1）pAV-OPEFS-CYP4V2-BGH，pAV-OPEFS-RdCVF-BGH，pAV-OPEFS-CYP4V2-P2A-RdCVF-BGH（卡纳抗性）的构建。pAV-OPEFS-CYP4V2-P2A-EGFP-BGH中氨苄抗性基因替换为卡纳抗性基因，由苏州金唯智负责载体改造；pAV-OPEFS-CYP4V2-BGH（表达序列如SEQ ID NO:90所示），pAV-OPEFS-RdCVF-BGH（表达序列如SEQ ID NO:96所示），pAV-OPEFS-CYP4V2-P2A-RdCVF-BGH（表达序列如SEQ ID NO:106所示）由苏州金唯智负责相关基因的合成和载体（卡纳抗性）改造。

（2）pAV-p5-intron-CYP4V2-BGH（表达序列如SEQ ID NO:93所示），pAV-p5-intron-RdCVF-BGH（表达序列如SEQ ID NO:99所示），pAV-p5-intron-CYP4V2-P2A-RdCVF-BGH（表达序列如SEQ ID NO:113所示）(卡纳抗性)的构建。37℃酶切pAV-OPEFS-CYP4V2-BGH，pAV-OPEFS-RdCVF-BGH，pAV-OPEFS-CYP4V2-P2A-RdCVF-BGH（卡纳抗性）2h得到线性化的载体，凝胶电泳回收。酶切体系如下：

Vecter plasmid 2μg

EcoRI (Takara D1040A) 2μl

BamHI(Takara D1010A) 2μl

10×K Buffer(Takara) 4μl

H₂O (Invitrogen, 10977015) to 40μl

（3）从pAV-p5-intron-CYP4V2-P2A-EGFP中PCR扩增得到P5-intron片段，凝胶电泳回收。所用正向引物如SEQ ID NO: 46所示，反向引物如如SEQ ID NO: 55所示。

（4）将酶切的回收载体和需要与其重组的线性片段连接，连接体系(置于冰上操作)如下：

步骤（2）所得酶切载体 1-2 μl

P5-intron片段 2-4 μl

Lightening Cloning Master Mix（博奥龙，BDIT0014-20） 5 μl

ddH₂O x μl

Total 10 μl

在50℃水浴锅内放置40min，取5μl反应液转化transtb13大肠杆菌感受态细胞，摇菌测序，使用中提试剂盒（Omega，D6915-04）提质粒。

实施例7. 293T细胞中的表达载体表达情况检测

（1）按照实施例1步骤（5）的方法利用PEI（Polysciences 24765-1）将实施例6步骤（1）改造得到的pAV-OPEFS-CYP4V2-BGH，pAV-OPEFS-RdCVF-BGH，pAV-OPEFS-CYP4V2-P2A-RdCVF-BGH质粒转染提前铺于6孔板的293T细胞（ATCC，CRL-3216），细胞密度为70%左右。

（2）48小时后收集细胞培养基上清（sup），细胞用PBS洗后使用RIPA裂解液（北京普利莱C1053-100）裂解细胞（lys），Western blot检测各组上清或细胞裂解液（lys）中CYP4V2和/或RdCVF的表达。所使用抗体：anti-CYP4V2 (Atlas，HPA029122)，anti-actin(Abclonal, AC026), goat-anti-rabbit (Abclonal, AS014), RdCVF Antibody (TXNL6Antibody，H00115861-D01P)。

结果如图7所示，其中M （mock）为空白对照，C表示OPEFS-CYP4V2组，C-R表示OPEFS-CYP4V2-P2A-RdCVF组，R表示OPEFS-RdCVF组。空白对照组M组细胞的裂解液（lys）和细胞培养基上清（sup）中均没有CYP4V2或者RdCVF的表达；pAV-OPEFS-CYP4V2-BGH转染的细胞裂解液中有CYP4V2的表达；pAV-OPEFS-RdCVF-BGH转染的细胞上清和裂解液中有RdCVF的表达；pAV-OPEFS-CYP4V2-P2A-RdCVF-BGH转染的细胞裂解液中有CYP4V2的表达，同时细胞裂解液和上清中有RdCVF的表达。

实施例8. ARPE-19细胞中的表达载体表达情况检测

（1）按照实施例1步骤（5）的方法利用PEI（Polysciences 24765-1）将实施例6步骤（1）改造得到的pAV-OPEFS-CYP4V2-BGH，pAV-OPEFS-RdCVF-BGH，pAV-OPEFS-CYP4V2-P2A-RdCVF-BGH质粒转染提前铺于6孔板的ARPE-19细胞（ATCC，CRL-2302），细胞密度为70%左右。

（2）48小时后收集细胞培养基上清（sup），细胞用PBS洗后使用RIPA裂解液（北京普利莱C1053-100）裂解细胞（lys），Western blot检测各组上清或细胞裂解液（lys）中CYP4V2和/或RdCVF的表达。所使用抗体：anti-CYP4V2 (Atlas，HPA029122)，anti-actin(Abclonal, AC026),goat-anti-rabbit (Abclonal, AS014), TXNL6 Antibody(H00115861-D01P)。

结果如图8所示，其中M（mock）为空白对照，C表示OPEFS-CYP4V2组，C-R表示OPEFS-CYP4V2-P2A-RdCVF组，R表示OPEFS-RdCVF组。空白对照组mock组细胞的裂解液和细胞培养基上清中均没有CYP4V2或者RdCVF的表达；pAV-OPEFS-CYP4V2-BGH转染的细胞裂解液中有CYP4V2的表达；pAV-OPEFS-RdCVF-BGH转染的细胞上清和细胞裂解液中有RdCVF的表达；pAV-OPEFS-CYP4V2-P2A-RdCVF-BGH，转染的细胞裂解液中有CYP4V2的表达，同时上清和细胞裂解液中有RdCVF的表达。

实施例9. 病毒载体

（一）AAV血清型的选择：使用包装GFP报告基因的AAV2/2, AAV2/5, AAV2/8, AAV2/9血清型病毒（购自山东维真生物科技有限公司），对野生型小鼠进行视网膜下腔注射。1个月后切片进行视网膜组织形态学观察。结果如图9所示，双箭头表示EGFP报告基因的表达范围，选择对视网膜偏嗜性良好的AAV2/8血清型。

AAV2/8载体的构建：

（1）在pAAV-RC5-Amp（购自北京西美杰科技有限公司，载体序列如SEQ ID NO: 133所示）基础上改造。PCR扩增除Amp以外的pAAV-RC5序列，所用引物为RC5-F/RC5-R，如SEQ IDNO: 56-57所示。

（2）Kana部分采用PCR方法从pEGFP-N1上扩增得到，所用引物为Kana-F/ Kana-R，如SEQ ID NO: 58-59所示。

（3）将以上PCR得到的两种DNA片段，采用同源重组的方法得到pAAV-RC5-Kana.

（4）在pAAV-RC5-Kana的基础上改造，采用PCR方法扩增除RC5-cap以外的pAAV-Kana序列，所用引物为RC5-Kana-F/ RC5-Kana-R，如SEQ ID NO: 60-61所示。

（5）将基因合成的RC8-cap序列（北京擎科生物，序列如SEQ ID NO: 134所示），与步骤（4）得到的pAAV-Kana线性化载体采用同源重组的方法得到pAAV-RC8-Kana（即AAV2/8），载体序列如SEQ ID NO: 135所示。

（二）AAV-helper选择：选择通用型AAV-helper辅助质粒将抗性由氨苄改为卡纳。具体改造过程如下：

1）在pAAV-helper-Amp（购自北京西美杰科技有限公司，载体序列如SEQ ID NO: 136所示）基础上改造。采用PCR方法扩增除Amp以外的pAAV-helper序列，所用引物为RC5-F/RC5-R，如SEQ ID NO: 56-57所示。

2）Kana部分采用PCR方法从pEGFP-N1上扩增得到，所用引物为Kana-F/ Kana-R，如SEQ ID NO: 58-59所示。

3）将以上PCR得到的两种DNA片段，采用同源重组的方法得到pAAV-helper-Kana，（即AAV-helper），载体序列如SEQ ID NO: 137所示。

实施例10. 病毒包装和纯化

（一）病毒包装

（1）第0天：细胞接种（接种数为1x10⁷），将293T细胞接种于15 cm培养皿中。

（2）第1天：293T细胞量在80%-90%时，换含10%血清（上海吉泰依科赛，FSP500）的完全培养基（Gibco，C11965500BT）20ml，进行质粒转染，具体转染体系见表5。

表5 转染体系

表5中的表达载体为按照实施例6的方法构建得到的表达载体。（3）第2天：转染12-18小时后换新鲜完全培养基30ml。

（4）第3天：转染48小时换新鲜完全培养基30ml。

（5）第4天：转染72h后按照常规方法胰酶消化293T细胞，并收集至50 ml离心管中，用PBS洗两次，1200 rpm离心5 min，吸干PBS，冻存于-80℃冰箱。

（二）病毒纯化

1）将本实施例步骤（5）所得的AAV293T细胞15℃-25℃解冻。

2）每个15cm培养皿用2 ml 细胞裂解液（150mM NaCl，50mM Tris，pH8.5）重悬细胞（每个50ml离心管收集了3个15cm培养皿的细胞，3个即为6ml细胞裂解液）。

3）离心管内加入细胞裂解液半数体积（3ml）的氯仿，拧紧管口，水平放置于37°C摇床250rpm摇动30min。

4）加入水相四分之一体积（1.5ml）5M的氯化钠，混匀。转移至高速离心管，11000rpm离心25min。

5）取上层水相，将交界处不易吸取的部分转移至1.5ml离心管，12000rpm离心30s，合并上清，往上层水相中加入核酸酶（Benzonase）至终浓度50 U/ml，加入脱氧胆酸纳至终浓度0.4%，添加终浓度为10mM的MgCl₂，0.5mM的CaCl₂，5 IU/ml的Turbo DNase I，25 ug/ml的RNaseA（储存液浓度10mg/ml）。

6）37°C水浴30min。

7）加入水相四分之一（2ml）体积的50% PEG8000，震荡混匀，冰上放置1hr，11000rpm离心25min。

8）吸取并弃上清，再次离心1min，去除残余上清。

9）按最终溶解体积需求加入PBS，吹打悬浮，转移至1.5ml离心管，转移时小体积移液（<200μl），避免因沉淀粘附而损失病毒。

10）加入500μl 氯仿，震荡，12000rpm离心20min。

11）无菌条件下吸取上清，分装-80℃保存。

实施例11. 病毒滴度测定

（一）标品 pAAV-EGFP的配制

1.标品梯度：1x10⁸ 拷贝/5μl，1x10⁷拷贝/5μl，1x10⁶拷贝/5μl，1x10⁵拷贝/5μl，1x10⁴拷贝/5μl，1x10³拷贝/μl，1x10²拷贝/5μl。

2.稀释步骤：

a.将原液十倍稀释后用Nano定量，以此定量结果为准做后续稀释。

b.将定量后的样品逐级稀释质粒至1ng/μl。

c.将1ng/μl样品稀释至1x10⁸拷贝/μl。

d.将1x10⁸ 拷贝/μl稀释液五倍稀释至1x10⁸ 拷贝/5μl。

e.依次十倍稀释至1x10² 拷贝/5μl。

（二）样品的处理与稀释

1. 17μl DNase1+1ml 1×buffer（全式金 GD-201-01）配制成50U/ml的buffer。

2. 吸取实施例10步骤11）获得的待测样品5μl加入95μl步骤1配制的buffer中稀释样品（10倍稀释）。

3. 混合均匀（涡旋振荡5s），PCR仪上37℃放置30min；75℃放置15min。

4.震荡混匀步骤3的反应液，吸取其中50μl，加入450μl去核酶水中，作为第一稀释梯度（200倍稀释）。

5. 吸取步骤4混匀的第一梯度反应液50μl，加入450μl去核酶水中，作为第二稀释梯度（2000倍稀释）。

6. 吸取步骤5混匀的第一梯度反应液50μl，加入450μl去核酶水中，作为第三稀释梯度（2000倍稀释）。

（三）荧光定量PCR

表6 荧光定量PCR扩增体系：

表7荧光定量PCR扩增条件（ABI 7500实时荧光定量PCR仪）：

表8 病毒滴度定量结果

检测结果表8显示AAV-OPEFS-EGFP、AAV-OPEFS-CYP4V2病毒滴度分别为1.00E+13vg/ml，3.06E+13vg/ml，可用于后续感染实验；本申请实施例中使用的其他病毒的滴度测定均以本实施例的方法进行。

实施例12. 不同剂量病毒感染人iPSC分化的RPE细胞

（1）人诱导多潜能干细胞（IPSC）的制备。使用Urineasy 尿液细胞分离试剂盒（北京赛贝，CA3102500）从尿液中提取肾上皮细胞，使用Urineasy 尿液细胞扩增试剂盒（北京赛贝，CA3103200）培养扩增，选取3-4代汇合度达到70-80%细胞进行重编程实验。重编程实验使用hiPSC重编程试剂盒（北京赛贝，CA5002002），按照试剂盒说明书中的操作方法进行操作，获得人IPSC用于下一步细胞分化实验。

（2）RPE细胞的制备。按照文献(da Cruz, L., et al. (2018)，Phase 1 clinicalstudy of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch inage-related macμlar degeneration，Nat Biotechnol 36(4): 328-337.)中记载的方法制备RPE细胞。将3*10⁴/cm²人IPSC培养于T25瓶的TESR-E8培养基4ml（STEMCELL, CAT#05990,#05991）中，5天后更换为含有20%的血清替代物（Gibco，CAT#A3181502）6 ml的培养基（Gibco，CAT#10829018），培养2天后换为6 ml无血清培养基（Gibco，CAT#10829018）继续培养约20周。得到椭圆形深色的可***细胞，即RPE细胞。图10显示了荧光显微镜（LifeAMF4305）在白光下分别在4、10、10倍镜下观察到的肾上皮细胞、IPSC细胞、RPE细胞。

（3）采用剂量梯度（MOI=0，1x10³，1x10⁴，1x10⁵）将含有pAV-OPEFS-EGFP-BGH或pAV-OPEFS-CYP4V2-BGH的包装病毒感染等量人iPSC分化的RPE细胞。

（4）72h后消化细胞，并将各组分为三份，一份用cell titer glow（Promega，G9241）按照说明书分析细胞死亡情况。一份按照实施例7步骤（2）的方法Western blot检测CYP4V2的表达。一份用于提取RNA，RT-qPCR检测炎症因子mRNA水平：NLRP3,TNF-α, IFN-γ。其中，使用RNA提取试剂盒（天根，DP430）按照说明书提取RNA；使用反转录试剂盒（Takara，RR407A）按照说明书反转录cDNA。RT-qPCR按照实施例11步骤（三）的方法进行，RT-qPCR引物序列如SEQ ID NO: 138-145所示。

结果如图11A-11D显示，随着pAV-OPEFS-EGFP-BGH病毒滴度的增加，EGFP表达量随之增加，炎症因子TNF-α和NLRP3表达水平随之增加，细胞死亡率随之增加；随着pAV-OPEFS-CYP4V2-BGH病毒滴度的增加，CYP4V2表达量随之增加，炎症因子TNF-α和NLRP3表达水平随之增加，细胞死亡率随之增加。说明对于人iPSC分化的RPE细胞，高滴度的AAV病毒存在细胞毒性，因此可以选择1x10⁴以下的剂量用于后续人iPSC分化的RPE细胞实验。

实施例13. 不同病毒感染BCD病人iPSC分化的RPE细胞的效果

（1）按照实施例8的方法包装病毒：A: pAV-p5-intron-CYP4V2-BGH（表达序列如SEQ IDNO:93所示）；B: pAV-p5-intron-RdCVF-BGH（表达序列如SEQ ID NO:99所示）；C: pAV-p5-intron-CYP4V2-P2A-RdCVF-BGH（表达序列如SEQ ID NO:113所示）；D: pAV-p5-intron-EGFP-BGH。

（2）采用MOI=1x10⁴的病毒A,B,C,D以及1/2 MOI的病毒A+1/2 MOI的病毒B（下文成为E组）感染等量BCD病人（基因型为CYP4V2：c.802-8_810del17bpinsGC纯合突变）iPSC分化的RPE细胞，RPE细胞的制备方法见实施例12。BCD病人为于2018年11月至2018年12月在北京大学第三医院眼科收治的患者。北京大学第三医院伦理委员会批准了本研究的所有方面，并从受试者（或其法定监护人）处获得了样品采集的知情同意书。患者尿液样本在收集后1小时内按照实施例12的方法进行操作。

（3）72h后显微镜下观察脂质沉积情况。

（4）收细胞，收集细胞培养基上清（sup）；细胞用PBS洗后使用RIPA裂解液（北京普利莱C1053-100）裂解细胞，得到细胞裂解液（lys），western检测蛋白表达水平。所使用抗体：anti-CYP4V2（Atlas，HPA029122），anti-β-actin（Abclonal, AC026），goat-anti-rabbit（Abclonal, AS014），TXNL6 Antibody（H00115861-D01P）。

蛋白表达结果如图12A显示，无病毒感染的空白对照M（Mock）组的BCD病人iPSC分化的RPE细胞无CYP4V2或RdCVF表达；感染病毒D组的BCD病人iPSC分化的RPE细胞无CYP4V2或RdCVF表达，有EGFP表达；感染病毒A组的BCD病人iPSC分化的RPE细胞裂解液中可检测到CYP4V2表达；感染病毒B组的BCD病人iPSC分化的RPE细胞上清和细胞裂解液中可检测RdCVF表达；感染病毒C组及E组的BCD病人iPSC分化的RPE细胞裂解液中可检测到CYP4V2表达，同时细胞上清和细胞裂解液中可检测RdCVF表达。

脂质沉积观察结果如图12B显示，与M组相比，A组、C组和E组的脂质沉积情况都有改善。D组由于EGFP表达与脂质染色的荧光互相感染，故不计入比较。

实施例14. 病毒转染BCD小鼠的启动子选择

（1）按照实施例8的方法包装病毒：A: pAV-p5-intron-CYP4V2-BGH（表达序列如SEQ IDNO:93所示）；B: pAV-OPEFS-CYP4V2-BGH（表达序列如SEQ ID NO:90所示）。启动子A：p5-intron；启动子B：OPEFS。BCD小鼠（购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司，Cyp4v3-/-）1月龄进行视网膜下腔注射，两种启动子病毒分别注射10只小鼠，双侧眼球注射治疗载体（pAV-p5-intron-CYP4V2-BGH（表达序列如SEQ ID NO:93所示）/pAV-OPEFS-CYP4V2-BGH（表达序列如SEQ ID NO:90所示）），注射后3个月观察。

视网膜下腔注射方法：

1）准备实验物品，将小鼠用1%阿托品散瞳，后按80 mg/kg*** + 8 mg/kg甲苯噻嗪安腹腔内注射麻醉。

2）麻醉后再次用1%阿托品散瞳，然后将小鼠置于眼外科手术显微镜（Topcon，OMS800）的动物实验平台前方，在小鼠眼球上滴加0.5%丙美卡因局麻。

3）以荧光素钠：病毒=100：1的浓度在病毒里加入荧光素钠原液，用移液枪吸混。

4）用胰岛素针在小鼠眼球睫状体平坦部预扎一个小孔，用微量注射器的针头穿过该小孔后进入小鼠眼球玻璃体腔，这时在小鼠眼球上滴加适量2%羟甲基纤维素使在镜下能见到小鼠眼底，再继续将针头避开晶状体***对侧周边的视网膜下，缓慢推入带有荧光素钠的病毒，每只眼睛注射量为1μl，病毒浓度为1x10⁹，以荧光素钠为指示剂判断是否注射入视网膜下腔。

术后用生理盐水清洗眼球表面，置于笼子里等小鼠苏醒。

（2）在体眼底照相观察结晶样沉积情况

1）取空白对照（KO）、注射启动子A: pAV-p5-intron-CYP4V2-BGH（表达序列如SEQ IDNO:93所示）、启动子B: pAV-OPEFS -CYP4V2-BGH（表达序列如SEQ ID NO:90所示）的小鼠，小鼠眼球用1% 阿托品散瞳，后按80 mg/kg*** + 8 mg/kg甲苯噻嗪安腹腔内注射麻醉。

2）使麻醉后的小鼠平躺于Micro III 小动物视网膜影像系统（Phoenix ResearchLaboratory，Micro III）的实验台，在小鼠眼球上滴加适量2%羟甲基纤维素以改善镜头及角膜的接触效果。

3）升降、旋转实验台调整小鼠眼睛的位置，调整焦距与光强得到小鼠眼底图像，用Micro III软件拍摄。

4）摄片完成后，利用GraphPad Prism软件进行结晶沉积定量分析。

眼底摄片结果如图13显示；图14为注射含小鼠有不同启动子的病毒后，小鼠的眼底结晶数量统计结果（n=5）。图13和14表明注射含有不同启动子的病毒后，眼底结晶沉积情况均有所改善。

（3）视网膜组织形态学观察：

1）固定脱水：颈椎脱臼处死小鼠，摘取眼球，将小鼠眼球放入1.5ml EP管内，加入1ml4% 多聚甲醛4℃过夜。然后将眼球转入盛有1ml 30% 蔗糖溶液的1.5ml EP管内脱水，眼球沉底即可。

2）将小鼠眼球放入装有冷冻包埋剂（OCT）的1.5ml EP管中，用镊子将小鼠眼睛摆成直视前方的方位，盖好EP管后放入液氮内，待完全冻上后可进行冰冻切片，切片厚度为7μm。4℃丙酮固定10 min后，放入-80℃保存。

3）取出切片，待切片恢复至室温后，用PBS洗3次，每次5min。

4）将玻片无组织处擦干，每张切片滴加40μl封闭液（5%驴血清），室温封闭1h。

5）用5%驴血清稀释一抗，滴加40μl左右抗体工作液，使完全覆盖小鼠眼球组织，4℃过夜。本实验所用一抗有：CYP4V2（1：50，购自Sigma），

6）取出玻片，PBS洗3次，每次5min。

7）用PBS以1:800的比例稀释二抗（购自Thermo Fisher Scientific），滴加40μl左右二抗工作液，使完全覆盖小鼠眼睛组织，室温孵育1h。

8）PBS洗3遍后，滴加DAPI稀释液（1：5000），室温孵育15min。

9）在载玻片中滴加防荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片，-20℃避光保存。

10）用配备有NIS-Elements C软件的尼康A1激光共聚焦显微镜观察，拍照。

图15的免疫荧光结果显示，注射启动子A病毒和启动子B病毒的BCD小鼠均可以表达CYP4V2（图中双箭头指示范围）。

实施例15. 病毒感染BCD小鼠的剂量选择

（1）按照实施例14的方法验证病毒剂量。BCD小鼠（Cyp4v3-/-）1月龄进行视网膜下腔注射，双侧眼球注射治疗载体pAV-OPEFS-CYP4V2-BGH（表达序列如SEQ ID NO:90所示），每只眼分别注射1E8vg，1E9vg，1E10vg病毒。注射后3个月观察。

结晶样沉积情况如图16的摄片结果所示；图17为注射1E8vg和1E9vg病毒的BCD小鼠与未注射病毒的BCD小鼠相同面积眼底结晶数量的统计结果。与未注射病毒BCD小鼠相比，注射1E8vg，1E9vg病毒的BCD小鼠显示结晶沉积数量减少，注射1E9vg病毒的BCD小鼠结晶数量减少更明显。注射1E10vg病毒的BCD小鼠显示结晶沉积情况未见明显改善，且损伤严重。

（2）剥离RPE细胞层，提RNA，检测炎症因子TNF-α、IFN-γ、NLRP3的表达水平。提取RNA和反转录过程按照实施例12步骤（4）方法进行，RT-qPCR按照实施例11步骤（三）的方法进行。qPCR引物序列如SEQ ID NO: 146-153所示。

图18显示注射1E10vg病毒使得炎症因子TNF-α、IFN-γ、NLRP3表达升高，说明1E10vg的病毒剂量对于BCD小鼠有毒副反应，1E9vg好于1E8vg。因此，选择以1E10vg以下的病毒剂量病毒剂量进行后续实验。

实施例16. 不同病毒转染BCD小鼠的效果

(一) p5-intron启动子病毒感染BCD小鼠的效果

（2）取1月龄BCD小鼠（Cyp4v3-/-）分为五组：KO组，A组，B组，A+B组，C组，使用1E9vg的病毒A,B,C以及病毒A+病毒B（A、B分别为5E8vg），KO组为空白对照，不做处理。按照实施例14的方法进行视网膜下腔注射。

（3）按照实施例14的方法体眼底照相观察结晶样沉积情况。图19显示使用不同病毒进行视网膜下腔注射治疗后的BCD小鼠眼底摄片结果显示结晶沉积情况。图20为使用不同病毒进行视网膜下腔注射治疗后的BCD小鼠眼底结晶数量统计结果（n=5）。结果表明病毒A+B组和病毒C组的小鼠结晶数量减少更显著。病毒B组小鼠眼底结晶情况未见明显改善。

（4）在体视网膜功能检查：视网膜电图（ERG）

1）小鼠暗适应：将小鼠暗适应至少16小时，之后所有操作在暗红光下进行。

2）小鼠麻醉：按80 mg/kg*** + 8 mg/kg甲苯噻嗪安腹腔内注射麻醉。

3）麻醉完成后，在暗红光照明下小鼠眼睛用1% 阿托品散瞳，将小鼠用胶带固定放置在视觉电生理仪Espion E2的动物实验平台前方，双眼一致，充分暴露。将地电极针***小鼠尾巴根部，参考电极针***小鼠下颌，两个金环记录电极夹在动物实验平台的电极支架上，调整其角度，使其分别轻微的接触左右眼角膜的中心顶端，滴加适量2% 羟甲基纤维素，改善金环电极及角膜的接触效果。

4）在计算机Espion E2 系统内输入小鼠编号与月龄信息后运行程序。分别行暗适应闪光强度为0.003，0.01，0.1，1，3，10，100 cd·s/m²（背景光强度为0 cd·s/m²，刺激间隔为15s，记录3个ERG信号的平均值）；明适应闪光强度为3，10，30，100 cd·s/m²（明适应时间5min，背景光强度为30 cd·s/m²，刺激间隔为15s，记录5个ERG信号的平均值）。程序运行结束后自动保存运行结果，使用GraphPad Prism统计结果。

图21为使用不同病毒进行视网膜下腔注射治疗后BCD小鼠的ERG记录结果，结果显示病毒B组小鼠ERG波幅没有明显改变，病毒A组，病毒A+B组，病毒C组小鼠的ERG波幅均有增高（p<0.05），且病毒A+B组和病毒C组好于病毒A组（p<0.05）。

（5）按照实施例14步骤（3）的方法检测BCD小鼠CYP4V2、RdCVF表达情况。RdCVF（1：50，H00115861-D01P）。

图22为使用不同病毒进行视网膜下腔注射治疗后的BCD小鼠免疫荧光染色图。结果显示病毒A组小鼠表达CYP4V2（双箭头指示范围），病毒B组小鼠表达RdCVF（单箭头指示范围），病毒A+B组和病毒C组均可检测到CYP4V2和RdCVF的表达。

（6）小鼠眼球RPE铺片染色检查RPE细胞数量及形态

1）在1.5mlEP管中加入预冷的PBS，处死小鼠后将小鼠眼球取下，浸入PBS中15min。

2）将小鼠眼球转移到1ml 4%多聚甲醛的1.5mlEP管中固定1h。

3）在体视显微镜（Olympus，SZ61-SET）下去除小鼠眼球前节，将神经视网膜层与RPE层分离，并将RPE层剪成4瓣。

4）将RPE铺片放入预冷的PBS中清洗3次，每次5min。

5）将RPE铺片放入0.1% Triton中通透20min，后用PBS清洗3次，每次5min。

6）将RPE铺片放入96孔板的一个孔内，加入按1：200比例PBS稀释后的Phalloidin工作液，室温孵育1h。

7）PBS清洗3次，每次5min，将RPE铺片至于载玻片上展平，滴加少量封片剂后用盖玻片封片，在Nikon荧光显微镜下观察。

图23的Phalloidin标记的F-actin染色结果显示，注射启动子A病毒和启动子B病毒的BCD小鼠与未注射病毒的BCD小鼠相比，RPE细胞的六边形形态更完整，排列紧密。

图23的Phalloidin标记的F-actin染色结果显示，B组相对于KO组没有明显变化，病毒A+B组和C组相对于其他三组显示RPE细胞的六边形形态更完整，排列紧密，图24取同等面积计数RPE细胞数量统计结果显示，病毒A+B组和病毒C组的同等面积内RPE细胞数量多于病毒A组（n=5）。

综合结晶样沉积、视网膜电图（ERG）和RPE细胞数量及形态观察结果可知，单独表达RdCVF（B组）没有改善BCD小鼠的结晶样沉积、视网膜电图（ERG）和RPE细胞数量及形态的情况；RdCVF与CYP4V2共表达（A+B组和C组）则显著提高了单独表达CYP4V2对于BCD小鼠的结晶样沉积、视网膜电图（ERG）和RPE细胞数量及形态的改善情况，表明共表达CYP4V2和RdCVF相较于单独表达CYP4V2或RdCVF有明显的协同作用。

(二) 启动子后不含有内含子的病毒感染BCD小鼠的ERG效果

（1）按照实施例8的方法包装病毒：A: pAV-p5-CYP4V2-BGH（表达序列如SEQ ID NO:91所示）；B: pAV-p5-RdCVF-BGH（表达序列如SEQ ID NO:97所示）；C: pAV-p5-CYP4V2-P2A-RdCVF-BGH（表达序列如SEQ ID NO:107所示）。

（3）按照本实施例（一）步骤（4）的方法进行在体视网膜功能检查：视网膜电图（ERG）。图25为使用上述不同病毒进行视网膜下腔注射治疗后BCD小鼠的ERG记录结果，结果显示病毒B组小鼠ERG波幅没有明显改变，病毒A组，病毒A+B组，病毒C组小鼠的ERG波幅均有增高（p<0.05），且病毒A+B组和病毒C组好于病毒A组（p<0.05）。

(三) p1启动子病毒感染BCD小鼠的ERG效果

（1）按照实施例8的方法包装病毒：A: pAV-p1-CYP4V2-BGH（表达序列如SEQ ID NO:92所示）；B: pAV-p1-RdCVF-BGH（表达序列如SEQ ID NO:98所示）；C: pAV-p1-CYP4V2-P2A-RdCVF-BGH（表达序列如SEQ ID NO:108所示）。

（3）按照本实施例（一）步骤（4）的方法进行在体视网膜功能检查：视网膜电图（ERG）。图26为使用上述不同病毒进行视网膜下腔注射治疗后BCD小鼠的ERG记录结果，结果显示病毒B组小鼠ERG波幅没有明显改变，病毒A组，病毒A+B组，病毒C组小鼠的ERG波幅均有增高（p<0.05），且病毒A+B组和病毒C组好于病毒A组（p<0.05）。

(四) WPRE-SV40 poly A信号位点病毒感染BCD小鼠的ERG效果

（1）按照实施例8的方法包装病毒：A: pAV-p5-intron-CYP4V2-WPRE-SV40（表达序列如SEQ ID NO:94所示）；B: pAV-p5-intron-RdCVF-WPRE-SV40（表达序列如SEQ ID NO:100所示）；C: pAV-p5-intron-CYP4V2-P2A-RdCVF-WPRE-SV40（表达序列如SEQ ID NO:114所示）。

（3）按照本实施例（一）步骤（4）的方法进行在体视网膜功能检查：视网膜电图（ERG）。图27为使用上述不同病毒进行视网膜下腔注射治疗后BCD小鼠的ERG记录结果，结果显示病毒B组小鼠ERG波幅没有明显改变，病毒A组，病毒A+B组，病毒C组小鼠的ERG波幅均有增高（p<0.05），且病毒A+B组和病毒C组好于病毒A组（p<0.05）。

(五) 不包含信号位点病毒感染BCD小鼠的效果

（1）按照实施例8的方法包装病毒：A: pAV-p5-CYP4V2（如SEQ ID NO:117所示）；B:pAV-p5-RdCVF（如SEQ ID NO:120所示）；C: pAV-p5-CYP4V2-P2A-RdCVF（如SEQ ID NO:122所示）。

（3）按照本实施例（一）步骤（4）的方法进行在体视网膜功能检查：视网膜电图（ERG）。

图28为使用上述不同病毒进行视网膜下腔注射治疗后BCD小鼠的ERG记录结果，结果显示，与对照相比，病毒B组小鼠ERG波幅没有明显改变，病毒A组，病毒A+B组，病毒C组小鼠的ERG波幅均有增高，且病毒A+B组和病毒C组好于病毒A组（p<0.05）。

(六) 包含信号肽的病毒感染BCD小鼠的效果

（1）按照实施例8的方法包装病毒：A: pAV-CAG-CYP4V2-BGH-CAG-RdCVF-BGH（其核苷酸序列如SEQ ID NO.156所示）以及B: pAV-CAG-CYP4V2-BGH-CAG-spGL-RdCVF-BGH（其中，spGL的核苷酸序列如SEQ ID NO.169所示）。

（2）取1月龄BCD小鼠（Cyp4v3-/-）分为3组：KO组，A组，B组。A，B组：使用1E9vg的病毒A或病毒B。KO组为空白对照，不做处理。按照实施例14的方法进行视网膜下腔注射。

（3）按照本实施例（一）步骤（4）的方法进行在体视网膜功能检查：视网膜电图（ERG）。

图29为使用上述不同病毒进行视网膜下腔注射治疗后BCD小鼠的ERG记录结果，结果显示，与对照相比，病毒A组，病毒B组小鼠的ERG波幅均有增高，且病毒B组增幅好于病毒A组（p<0.05）。

前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方式的范围内。

序列表

<110> 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院）

北京中因科技有限公司

<120> 一种分离的核酸分子及其用途

<130> 0138-PA-009

<160> 184

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 345

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> OPEFS启动子

<400> 1

gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa 60

ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc 120

gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc 180

tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtat caaggttaca agacaggttt 240

aaggagacca atagaaactg ggcttgtcga gacagagaag actcttgcgt ttctgatagg 300

cacctattgg tcttactgac atccactttg cctttctctc cacag 345

<210> 2

<211> 212

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> EFS启动子

<400> 2

gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa 60

ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc 120

gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc 180

tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac ag 212

<210> 3

<211> 1162

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> EF1a启动子

<400> 3

gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 60

gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 120

atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 180

tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg 240

tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta 300

cttccacctg gctccagtac gtgattcttg atcccgagct ggagccaggg gcgggccttg 360

cgctttagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc gctggggccg 420

ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc 480

catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa 540

tgcgggccag gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc 600

ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat 660

cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg 720

tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag 780

atggccgctt cccggccctg ctccaggggg ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga 840

gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa aggggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc 900

atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct ggagcttttg 960

gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc cccacactga 1020

gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct tggaatttgc 1080

cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt 1140

tcttccattt caggtgtcgt ga 1162

<210> 4

<211> 939

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CAG启动子

<400> 4

ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 60

cgtcaatggg tggagtsaat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 120

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 180

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 240

ctattaccat ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc tcccccccct 300

ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg 360

gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg ggcggggcga 420

ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg 480

cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg ggagtcgctg 540

cgacgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc gccccggctc 600

tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc tccgggctgt 660

aattagcgct tggtttaatg acggcttgtt tcttttctgt ggctgcgtga aagccttgag 720

gggctccggg agggcccttt gtgcgggggg agcggctcgg ggctgtccgc ggggggacgg 780

ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga ccggcggctc 840

tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt 900

gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg caaagaatt 939

<210> 5

<211> 1614

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> RPE65启动子

<400> 5

tattgtgcaa ataagtgctc actccaaatt agtggtatat ttattgaagt ttaatattgt 60

gtttgtgata cagaagtatt tgctttaatt ctaaataaaa attttatgct tttattgctg 120

gtttaagaag atttggatta tccttgtact ttgaggagaa gtttcttatt tgaaatattt 180

tggaaacagg tcttttaatg tggaaagata gatattaatc tcctcttcta ttactctcca 240

agatccaaca aaagtgatta taccccccaa aatatgatgg tagtatctta tactaccatc 300

attttatagg catagggctc ttagctgcaa ataatggaac taactctaat aaagcagaac 360

gcaaatattg taaatattag agagctaaca atctctggga tggctaaagg atggagcttg 420

gaggctaccc agccagtaac aatattccgg gctccactgt tgaatggaga cactacaact 480

gccttggatg ggcagagata ttatggatgc taagccccag gtgctaccat taggacttct 540

accactgtcc ctaacgggtg gagcccatca catgcctatg ccctcactgt aaggaaatga 600

agctactgtt gtatatcttg ggaagcactt ggattaattg ttatacagtt ttgttgaaga 660

agacccctag ggtaagtagc cataactgca cactaaattt aaaattgtta atgagtttct 720

caaaaaaaat gttaaggttg ttagctggta tagtatatat cttgcctgtt ttccaaggac 780

ttctttgggc agtaccttgt ctgtgctggc aagcaactga gacttaatga aagagtattg 840

gagatatgaa tgaattgatg ctgtatactc tcagagtgcc aaacatatac caatggacaa 900

gaaggtgagg cagagagcag acaggcatta gtgacaagca aagatatgca gaatttcatt 960

ctcagcaaat caaaagtcct caacctggtt ggaagaatat tggcactgaa tggtatcaat 1020

aaggttgcta gagagggtta gaggtgcaca atgtgcttcc ataacatttt atacttctcc 1080

aatcttagca ctaatcaaac atggttgaat actttgttta ctataactct tacagagtta 1140

taagatctgt gaagacaggg acagggacaa tacccatctc tgtctggttc ataggtggta 1200

tgtaatagat atttttaaaa ataagtgagt taatgaatga gggtgagaat gaaggcacag 1260

aggtattagg gggaggtggg ccccagagaa tggtgccaag gtccagtggg gtgactggga 1320

tcagctcagg cctgacgctg gccactccca cctagctcct ttctttctaa tctgttctca 1380

ttctccttgg gaaggattga ggtctctgga aaacagccaa acaactgtta tgggaacagc 1440

aagcccaaat aaagccaagc atcaggggga tctgagagct gaaagcaact tctgttcccc 1500

ctccctcagc tgaaggggtg gggaagggct cccaaagcca taactccttt taagggattt 1560

agaaggcata aaaaggcccc tggctgagaa cttccttctt cattctgcag ttgg 1614

<210> 6

<211> 2000

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CYP4V2-Pf启动子

<400> 6

acccacctca tcctgcacct gtcactgcgt gggaccctgt gctccaggca ggggcacctc 60

actgccccct gagctcattt tacccctcct ggctctgcag catttctgac catttctgcc 120

caggccgaga ctcactgctg cccagagcaa tctcccttct ctccttctgg aggggagggg 180

ttgtatgtta cccgcctggt tttatccaca gaggttagca gagactgata cagacaaacc 240

ctttttcttt ctaattttag attcaagagc acatgtgcag gtttgttaaa tttgcctgac 300

gctgaggttt gagtttctat tgatcccctc acctgaatag ggaacacagt acccaataca 360

cagtttttca accattactc cccttccttc ctccccctat tttagaatcc ccagtatgta 420

gacaaattgt ttacttttat agctgtaatt aaccttatta tagctcagcc tcaacccttt 480

agagaggagg aaactaaagc ccatgagact tgcttaaaga tactaagtga acatatttat 540

tttttaaagt gttaaagtga ttaaacaatg tagacgtgaa tgaaataaaa agcgtaagtt 600

ccccatcttc attcccactc catagagctg atcagtattt ttacttgcag acattagtgg 660

agccgtagag aaagaaacct tttctccaaa agaaggcatt actttacaca ctccgttctg 720

caacttgttt tgttcacttg ctatttcacg tcagcccatg cagatgactt aaaacaaatt 780

caaatggaga aaagccttag gcatgttttt ctctgcacta aagaggccct gcaggtggct 840

gtggccaact tatgcagtgg cttcgagtga acgaacgtaa ttagtaatta agcaaagcgg 900

gcatccagga cattcagttt catcttcctg gcactttagt gtttaggaag ggcctggcct 960

ctcggggagc gacactcctc gcccggccac tttgtaagaa gcatcgagcg tggaaaaggg 1020

gctggggtca gcactggggc cctctgccgg gaagagagac tggcggccag cacacgcgtc 1080

tccccaggct gaaatggggc accctctcgc ggcccttccc tcccttcccg ggctgggtgg 1140

caggtcttgg ctcttctgcg agtaccccgc ggctgcggtc tcccggcacc cgctgagcag 1200

cctcgcccgc cttcctctcc cacccgcccc tgcgtgctct ccggggctcc ggcttcctcg 1260

gtctggtgcc tggtgcgtat tttggaaaat acctggctca taaccacctc attgagctcc 1320

cagtgtccca gtgggccagc ggacacacac gggtagctga cttccctaac gtgtccccaa 1380

agcctccctg gattacagcg cccgctgctc catgtgaccc cgcgggagcc aggacgcgcc 1440

ccgcctcccg gggctgcaag ttgcgcaggg agcgagcgat gcgcagcaga gctgggctcc 1500

gagccggatg cgccttcctt tcctctccag agcaggctgc ccgcccgcgg aatcccgcac 1560

gtagagcaac ctcgcagcac cctcagaaca gccccgctgg ggcgcgccgg gctgccgcgg 1620

tgacctttcc gacgcccctg accccgcatc cggaggcggc cggaagtgtc gccggcctcc 1680

tcccggcgca gcctccgggc ctccagtgca atcactacgc cctggggccc ggaaaccgtt 1740

ttccggtctt tcgctttcgg ctggggcgtg gaggccgcgg tgctgcgtag gccgggccgg 1800

gcgcaggaac agccccgtgg cgccctctct ggccgccgcc cgggcgggaa acgtcgttcc 1860

ggggaccggg cgaccccgca gcggggagcg cgccaggtcc gcgcggggaa gtgggcggtg 1920

tgcggccggc accgcctcgc accacgcccc cgcgggcccg cactttcccg gagtgcaccc 1980

cgcggccgcc agccggggcg 2000

<210> 7

<211> 1700

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CYP4V2-P1启动子

<400> 7

gctgaggttt gagtttctat tgatcccctc acctgaatag ggaacacagt acccaataca 60

cagtttttca accattactc cccttccttc ctccccctat tttagaatcc ccagtatgta 120

gacaaattgt ttacttttat agctgtaatt aaccttatta tagctcagcc tcaacccttt 180

agagaggagg aaactaaagc ccatgagact tgcttaaaga tactaagtga acatatttat 240

tttttaaagt gttaaagtga ttaaacaatg tagacgtgaa tgaaataaaa agcgtaagtt 300

ccccatcttc attcccactc catagagctg atcagtattt ttacttgcag acattagtgg 360

agccgtagag aaagaaacct tttctccaaa agaaggcatt actttacaca ctccgttctg 420

caacttgttt tgttcacttg ctatttcacg tcagcccatg cagatgactt aaaacaaatt 480

caaatggaga aaagccttag gcatgttttt ctctgcacta aagaggccct gcaggtggct 540

gtggccaact tatgcagtgg cttcgagtga acgaacgtaa ttagtaatta agcaaagcgg 600

gcatccagga cattcagttt catcttcctg gcactttagt gtttaggaag ggcctggcct 660

ctcggggagc gacactcctc gcccggccac tttgtaagaa gcatcgagcg tggaaaaggg 720

gctggggtca gcactggggc cctctgccgg gaagagagac tggcggccag cacacgcgtc 780

tccccaggct gaaatggggc accctctcgc ggcccttccc tcccttcccg ggctgggtgg 840

caggtcttgg ctcttctgcg agtaccccgc ggctgcggtc tcccggcacc cgctgagcag 900

cctcgcccgc cttcctctcc cacccgcccc tgcgtgctct ccggggctcc ggcttcctcg 960

gtctggtgcc tggtgcgtat tttggaaaat acctggctca taaccacctc attgagctcc 1020

cagtgtccca gtgggccagc ggacacacac gggtagctga cttccctaac gtgtccccaa 1080

agcctccctg gattacagcg cccgctgctc catgtgaccc cgcgggagcc aggacgcgcc 1140

ccgcctcccg gggctgcaag ttgcgcaggg agcgagcgat gcgcagcaga gctgggctcc 1200

gagccggatg cgccttcctt tcctctccag agcaggctgc ccgcccgcgg aatcccgcac 1260

gtagagcaac ctcgcagcac cctcagaaca gccccgctgg ggcgcgccgg gctgccgcgg 1320

tgacctttcc gacgcccctg accccgcatc cggaggcggc cggaagtgtc gccggcctcc 1380

tcccggcgca gcctccgggc ctccagtgca atcactacgc cctggggccc ggaaaccgtt 1440

ttccggtctt tcgctttcgg ctggggcgtg gaggccgcgg tgctgcgtag gccgggccgg 1500

gcgcaggaac agccccgtgg cgccctctct ggccgccgcc cgggcgggaa acgtcgttcc 1560

ggggaccggg cgaccccgca gcggggagcg cgccaggtcc gcgcggggaa gtgggcggtg 1620

tgcggccggc accgcctcgc accacgcccc cgcgggcccg cactttcccg gagtgcaccc 1680

cgcggccgcc agccggggcg 1700

<210> 8

<211> 1400

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CYP4V2-P2启动子

<400> 8

ccccatcttc attcccactc catagagctg atcagtattt ttacttgcag acattagtgg 60

agccgtagag aaagaaacct tttctccaaa agaaggcatt actttacaca ctccgttctg 120

caacttgttt tgttcacttg ctatttcacg tcagcccatg cagatgactt aaaacaaatt 180

caaatggaga aaagccttag gcatgttttt ctctgcacta aagaggccct gcaggtggct 240

gtggccaact tatgcagtgg cttcgagtga acgaacgtaa ttagtaatta agcaaagcgg 300

gcatccagga cattcagttt catcttcctg gcactttagt gtttaggaag ggcctggcct 360

ctcggggagc gacactcctc gcccggccac tttgtaagaa gcatcgagcg tggaaaaggg 420

gctggggtca gcactggggc cctctgccgg gaagagagac tggcggccag cacacgcgtc 480

tccccaggct gaaatggggc accctctcgc ggcccttccc tcccttcccg ggctgggtgg 540

caggtcttgg ctcttctgcg agtaccccgc ggctgcggtc tcccggcacc cgctgagcag 600

cctcgcccgc cttcctctcc cacccgcccc tgcgtgctct ccggggctcc ggcttcctcg 660

gtctggtgcc tggtgcgtat tttggaaaat acctggctca taaccacctc attgagctcc 720

cagtgtccca gtgggccagc ggacacacac gggtagctga cttccctaac gtgtccccaa 780

agcctccctg gattacagcg cccgctgctc catgtgaccc cgcgggagcc aggacgcgcc 840

ccgcctcccg gggctgcaag ttgcgcaggg agcgagcgat gcgcagcaga gctgggctcc 900

gagccggatg cgccttcctt tcctctccag agcaggctgc ccgcccgcgg aatcccgcac 960

gtagagcaac ctcgcagcac cctcagaaca gccccgctgg ggcgcgccgg gctgccgcgg 1020

tgacctttcc gacgcccctg accccgcatc cggaggcggc cggaagtgtc gccggcctcc 1080

tcccggcgca gcctccgggc ctccagtgca atcactacgc cctggggccc ggaaaccgtt 1140

ttccggtctt tcgctttcgg ctggggcgtg gaggccgcgg tgctgcgtag gccgggccgg 1200

gcgcaggaac agccccgtgg cgccctctct ggccgccgcc cgggcgggaa acgtcgttcc 1260

ggggaccggg cgaccccgca gcggggagcg cgccaggtcc gcgcggggaa gtgggcggtg 1320

tgcggccggc accgcctcgc accacgcccc cgcgggcccg cactttcccg gagtgcaccc 1380

cgcggccgcc agccggggcg 1400

<210> 9

<211> 1100

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CYP4V2-P3启动子

<400> 9

gcatccagga cattcagttt catcttcctg gcactttagt gtttaggaag ggcctggcct 60

ctcggggagc gacactcctc gcccggccac tttgtaagaa gcatcgagcg tggaaaaggg 120

gctggggtca gcactggggc cctctgccgg gaagagagac tggcggccag cacacgcgtc 180

tccccaggct gaaatggggc accctctcgc ggcccttccc tcccttcccg ggctgggtgg 240

caggtcttgg ctcttctgcg agtaccccgc ggctgcggtc tcccggcacc cgctgagcag 300

cctcgcccgc cttcctctcc cacccgcccc tgcgtgctct ccggggctcc ggcttcctcg 360

gtctggtgcc tggtgcgtat tttggaaaat acctggctca taaccacctc attgagctcc 420

cagtgtccca gtgggccagc ggacacacac gggtagctga cttccctaac gtgtccccaa 480

agcctccctg gattacagcg cccgctgctc catgtgaccc cgcgggagcc aggacgcgcc 540

ccgcctcccg gggctgcaag ttgcgcaggg agcgagcgat gcgcagcaga gctgggctcc 600

gagccggatg cgccttcctt tcctctccag agcaggctgc ccgcccgcgg aatcccgcac 660

gtagagcaac ctcgcagcac cctcagaaca gccccgctgg ggcgcgccgg gctgccgcgg 720

tgacctttcc gacgcccctg accccgcatc cggaggcggc cggaagtgtc gccggcctcc 780

tcccggcgca gcctccgggc ctccagtgca atcactacgc cctggggccc ggaaaccgtt 840

ttccggtctt tcgctttcgg ctggggcgtg gaggccgcgg tgctgcgtag gccgggccgg 900

gcgcaggaac agccccgtgg cgccctctct ggccgccgcc cgggcgggaa acgtcgttcc 960

ggggaccggg cgaccccgca gcggggagcg cgccaggtcc gcgcggggaa gtgggcggtg 1020

tgcggccggc accgcctcgc accacgcccc cgcgggcccg cactttcccg gagtgcaccc 1080

cgcggccgcc agccggggcg 1100

<210> 10

<211> 800

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CYP4V2-P4启动子

<400> 10

cctcgcccgc cttcctctcc cacccgcccc tgcgtgctct ccggggctcc ggcttcctcg 60

gtctggtgcc tggtgcgtat tttggaaaat acctggctca taaccacctc attgagctcc 120

cagtgtccca gtgggccagc ggacacacac gggtagctga cttccctaac gtgtccccaa 180

agcctccctg gattacagcg cccgctgctc catgtgaccc cgcgggagcc aggacgcgcc 240

ccgcctcccg gggctgcaag ttgcgcaggg agcgagcgat gcgcagcaga gctgggctcc 300

gagccggatg cgccttcctt tcctctccag agcaggctgc ccgcccgcgg aatcccgcac 360

gtagagcaac ctcgcagcac cctcagaaca gccccgctgg ggcgcgccgg gctgccgcgg 420

tgacctttcc gacgcccctg accccgcatc cggaggcggc cggaagtgtc gccggcctcc 480

tcccggcgca gcctccgggc ctccagtgca atcactacgc cctggggccc ggaaaccgtt 540

ttccggtctt tcgctttcgg ctggggcgtg gaggccgcgg tgctgcgtag gccgggccgg 600

gcgcaggaac agccccgtgg cgccctctct ggccgccgcc cgggcgggaa acgtcgttcc 660

ggggaccggg cgaccccgca gcggggagcg cgccaggtcc gcgcggggaa gtgggcggtg 720

tgcggccggc accgcctcgc accacgcccc cgcgggcccg cactttcccg gagtgcaccc 780

cgcggccgcc agccggggcg 800

<210> 11

<211> 500

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CYP4V2-P5启动子

<400> 11

gagccggatg cgccttcctt tcctctccag agcaggctgc ccgcccgcgg aatcccgcac 60

gtagagcaac ctcgcagcac cctcagaaca gccccgctgg ggcgcgccgg gctgccgcgg 120

tgacctttcc gacgcccctg accccgcatc cggaggcggc cggaagtgtc gccggcctcc 180

tcccggcgca gcctccgggc ctccagtgca atcactacgc cctggggccc ggaaaccgtt 240

ttccggtctt tcgctttcgg ctggggcgtg gaggccgcgg tgctgcgtag gccgggccgg 300

gcgcaggaac agccccgtgg cgccctctct ggccgccgcc cgggcgggaa acgtcgttcc 360

ggggaccggg cgaccccgca gcggggagcg cgccaggtcc gcgcggggaa gtgggcggtg 420

tgcggccggc accgcctcgc accacgcccc cgcgggcccg cactttcccg gagtgcaccc 480

cgcggccgcc agccggggcg 500

<210> 12

<211> 200

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CYP4V2-P6启动子

<400> 12

gcgcaggaac agccccgtgg cgccctctct ggccgccgcc cgggcgggaa acgtcgttcc 60

ggggaccggg cgaccccgca gcggggagcg cgccaggtcc gcgcggggaa gtgggcggtg 120

tgcggccggc accgcctcgc accacgcccc cgcgggcccg cactttcccg gagtgcaccc 180

cgcggccgcc agccggggcg 200

<210> 13

<211> 133

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人β-globin内含子

<400> 13

gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 60

cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 120

tttctctcca cag 133

<210> 14

<211> 99

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SV40 内含子

<400> 14

gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa 60

agaactgctc ctcagtggat gttgccttta cttctaggc 99

<210> 15

<211> 296

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工内含子

<400> 15

gaattaattc gctgtctgcg agggccagct gttggggtga gtactccctc tcaaaagcgg 60

gcatgacttc tgcgctaaga ttgtcagttt ccaaaaacga ggaggatttg atattcacct 120

ggcccgcggt gatgcctttg agggtggccg cgtccatctg gtcagaaaag acaatctttt 180

tgttgtcaag cttgaggtgt ggcaggcttg agatctggcc atacacttga gtgacaatga 240

catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag gtccaactgc aggtcg 296

<210> 16

<211> 409

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> hybrid CBA/MVM内含子

<400> 16

ggagtcgctg cgacgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc 60

gccccggctc tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc 120

tccgggctgt aattagcgct tggtttaatg acggcttgtt tcttttctgt ggctgcgtga 180

aagccttgag gggctccggg agggcccttt gtgcgggggg agcggctcgg ggctgtccgc 240

ggggggacgg ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga 300

ccggcggctc tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc 360

tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg caaagaatt 409

<210> 17

<211> 122

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> SV40信号位点

<400> 17

aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60

aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120

ta 122

<210> 18

<211> 225

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> BGH 信号位点

<400> 18

ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60

tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120

tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180

gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225

<210> 19

<211> 589

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> WPRE信号位点

<400> 19

aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60

ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120

atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180

tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240

ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300

attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360

ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420

gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480

aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540

cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589

<210> 20

<211> 717

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> WPRE-SV40信号位点

<400> 20