阅读说明：本技术 一种重组质粒和重组工程菌及其构建方法和提高d-阿洛酮糖的产量的应用 (Recombinant plasmid, recombinant engineering bacterium, construction methods of recombinant plasmid and recombinant engineering bacterium, and application of recombinant plasmid and recombinant engine) 是由 谭丹 刘禹佳 房欣蕾 樊沛瑶 余韫 卢晓云 于 2020-05-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种重组质粒和重组工程菌及其构建方法和提高D-阿洛酮糖的产量的应用,属于酶定向进化技术领域。本发明设计了定向进化的重组质粒,该定向进化的重组质粒便可视作一基因电路,即DTE酶效率的基因电路。与此同时,并本发明还公开了基于上述重组质粒构建得到的重组工程菌,具体为大肠杆菌E.coli DH5αpSB1C3-psiR-pPsi-EGFP-cp-kanR-DTE。本发明的上述基因电路使用阻遏蛋白PsiR与其对应启动子pPsi实现了D-阿洛酮糖的生物传感器；使得菌体可感应体内D-阿洛酮糖的生产量以表达不同水平的抗生素抗性基因,从而将DTE酶的效率转化为菌体的生存优势。(The invention discloses a recombinant plasmid, a recombinant engineering bacterium, a construction method thereof and application of the recombinant plasmid and the recombinant engineering bacterium in improving the yield of D-psicose, and belongs to the technical field of enzyme directed evolution. The invention designs the recombinant plasmid of directed evolution, and the recombinant plasmid of directed evolution can be regarded as a gene circuit, namely the gene circuit of DTE enzyme efficiency. Meanwhile, the invention also discloses a recombinant engineering bacterium constructed based on the recombinant plasmid, in particular to escherichia coli E.coli DH5 alpha pSB1C 3-psiR-pPsi-EGFP-cp-kanR-DTE. The gene circuit realizes a D-psicose biosensor by using the repressor protein PsiR and the corresponding promoter pPsi; the cells can sense the production of D-psicose in vivo to express antibiotic resistance genes at different levels, thereby converting the efficiency of DTE enzyme into the survival advantage of the cells.)

一种重组质粒和重组工程菌及其构建方法和提高D-阿洛酮糖 的产量的应用

技术领域

本发明属于酶定向进化技术领域，涉及一种重组质粒和重组工程菌及其构建方法和提高D-阿洛酮糖的产量的应用。

背景技术

D-阿洛酮糖是天然少量存在的稀有单糖，是果糖的C-3差向异构体。作为一种稀有糖，其口感较好且后味不苦，是一种新型甜味剂。在10％的稀释浓度下， D-阿洛酮糖是蔗糖70％的甜度，但仅有其0.3％的热量。是蔗糖的理想替代物。D-阿洛酮糖可抑制肠道α-糖苷酶与肝脏产脂酶，可抑制脂肪的积累。D-阿洛酮糖具有血糖抑制功能。在饮食中补充阿洛酮糖可缓解餐后血糖升高并增强对胰岛素的敏感性。动物实验也报道了D-阿洛酮糖对于Ⅱ型糖尿病具有保护作用。相比于D-果糖与D-葡萄糖，D-阿洛酮糖还原性更高，更易引发美拉德反应，以调节糕点的颜色并增加风味。D-阿洛酮糖还具有神经保护作用，对于神经退行性疾病具有潜在的医疗价值。在小鼠实验中，D-阿洛酮糖可被小肠吸收，但几乎在体内不被代谢，而随尿液排出。在小鼠实验中，长期施加3％阿洛酮糖喂养并未产生明显的副作用。D-阿洛酮糖在2011年被FDA批准为“GRAS”(通常视为安全)。

由于天然产量极低且化学生产工艺复杂，D-阿洛酮糖的工业生产一般使用生物发酵方法。D-塔格糖差向异构酶(EC 5.1.3.31,D-tagatose-3-epimerase,DTE酶) 家族催化D-果糖与D-阿洛酮糖之间的转化，是工业生产D-阿洛酮糖的关键酶。 DTE酶家族包含数种来源的酶，其最适底物、酶效率、最适pH与温度和金属离子辅因子也各不相同。其中发现最早的来源于Pseudomonas cichorii ST-24菌株，其最适底物为D-塔格糖，因此被命名为DTE酶。随后被发现的来源于 Agrobacterium tumefaciens的DTE酶家族成员特异性催化D-果糖与D-阿洛酮糖之间的转化，被命名为DPE酶(D-阿洛酮糖差向异构酶)。DTE酶家族在Rhodobactersphaeroides SK011，Clostridium cellulolyticum H10等菌株中也被发现与表征。使用未经改造的天然DTE酶以D-果糖为底物生产D-阿洛酮糖，其平衡转化率在30％上下，因此在产率上有较大的提升空间。且天然DTE酶的最适pH 均为弱碱性，但发酵生产D-阿洛酮糖要求酸性环境以减少美拉德反应的发生，因此如何工程改造DTE酶的最适pH也是一重要方向。

合成生物学是一门研究生物系统工程化设计的学科。该学科注重将理性设计、系统建模与工程中的概念，如模块化、标准化设计等引入传统的基因工程。定向进化与生物传感器是合成生物学中两项重要的使能技术。定向进化模仿达尔文式自然选择，用于优化某一特定的生物特性，如某一种酶、某一代谢通路乃至优化整个生命体。定向进化的优势在于对目标系统的知识不充分的情况下优化系统的特性，从而大大加快合成生物学设计、测试、构建这一循环的速度。但定向进化中突变文库的构建方式、表型的呈现方式与筛选通量等往往制约着该技术的应用；如何从一多样化的种群中筛选最适的个体是定向进化的核心问题之一。近年来，合成生物学技术与理念的发展使得研究者得以构建比以往更复杂的工程菌以及工程细胞。随着工程菌或工程细胞复杂度的增加，其中***的DNA片段，如质粒等也变得更加复杂，且其倾向于由若干已被研究报道的、模块化的DNA片段所组成。因此，这些由合成生物学启示的***DNA片段或***质粒往往被形象地称作“基因电路“。

根据不同的筛选平台，定向进化可分为体内、体外与离体等方式。其中体内方式最接近于达尔文进化。MAGE(多元自动化基因组工程)是一种体内定向进化方法，利用了λ噬菌体的Red重组系统将单链DNA文库重组入宿主基因组中。该方法极大地提升了突变文库的容量，但缺乏高效的筛选手段，易造成文库的浪费。PACE(噬菌体加速连续进化)是一项里程碑式的定向进化技术。该技术可在无人工干预的条件下完成连续的多轮(数百轮)的定向进化，大大提高了进化的效率，因而使得原本棘手的进化目标得以实现。但该技术要求连续培养，对培养体系流动的控制要求较高，易出现噬菌体完全洗去以致进化失败。同时该技术使用体内诱变，无法有效地控制文库的构成。除了以上这些新颖的手段以外，也可用传统方法进行定向进化。若用传统方法定向进化某一酶的生产效率，则往往需使用HPLC等定量方法检测每一个突变株中酶的活性，耗时耗力且筛选通量很低。若待进化的表型可用荧光蛋白表征，则传统上可用96孔板筛选突变株，由此将筛选通量提升至10²数量级，但仍然远无法满足文库筛选的需求。本发明通过生物传感器将待优化的DTE酶的酶活性转化为菌体的生存优势，因而可在琼脂平板上利用一定浓度的抗生素直接筛选，其通量可达10⁸数量级，且操作简单，不要求连续培养等技术。

生命体时刻都在接受环境信号并作出响应。进化赋予了这些响应机制不同的特性：结合不同的信号分子乃至是光、电信号；具有适当的阈值以便引发相应的细胞反应。当这些自然存在的信号响应机制被应用于人工构造的基因线路中时，便被称为生物传感器。很多生物传感器以转录调节作为机理：受诱导启动子在不同环境信号的作用下与不同的激活因子与阻遏因子相结合，以改变下游基因的转录水平。除此之外，还有翻译水平或翻译后水平等的生物传感器。生物传感器在合成生物学中往往起到接收信号、传递信号的核心作用。

随着近年来合成生物学新技术与新概念的发展，将生物传感器应用于DTE 酶的定向进化，以提高DTE酶的生产活性逐步成为可能。随着合成生物学社区的不断扩大，受诱导启动子数据库规模也不断增大。从该数据库中选取受D-阿洛酮糖诱导的启动子，并在其下游连接抗生素抗性基因。将此基因线路转入生产 D-阿洛酮糖的菌株体内，如此便可用抗生素抗性蛋白的生产量表征该菌株体内 D-阿洛酮糖的产量。在体外使用易错PCR与PCR改组技术构建DTE酶基因文库，并克隆入基因线路中。诱导DTE酶的表达，随后使用不同浓度的对应抗生素培养载有该文库的菌体，便可定量地筛选出载有至少为某一酶效率的菌株。扩增存活菌株中DTE酶，重复上述体外文库构建方法并筛选。如此便可反复提升DTE 酶的效率。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种重组质粒和重组工程菌及其构建方法和提高D-阿洛酮糖的产量的应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种重组质粒，于pSB1C3载体质粒中***一段骨架序列，该骨架上依次带有或于限制性内切酶位点***D-阿洛酮糖诱导阻遏蛋白psiR因子的编码序列、受D-阿洛酮糖诱导启动子pPsi、荧光蛋白EGFP编码序列、偶联元件cp和卡那霉素抗性基因片段kanR，得到质粒pSB1C3-psiR-pPsi-EGFP-cp-kanR；再使用限制性内切酶将DTE酶文库连接入骨架，得到重组质粒 pSB1C3-psiR-pPsi-EGFP-cp-kanR-DTE。

优选地，所述骨架的核苷酸序列如SED.ID.NO.1所示；D-阿洛酮糖诱导阻遏蛋白psiR因子的核苷酸序列如SED.ID.NO.2所示；荧光蛋白EGFP、偶联元件 cp与卡那霉素抗性基因片段kanR相连的序列如SED.ID.NO.3所示；DTE酶文库的原始序列如SED.ID.NO.4所示。

优选地，所述D-阿洛酮糖诱导阻遏蛋白psiR因子基因来源于Agrobacteriumtumefaciens，iGEM元件编号为BBa_K2448006；DTE酶原始序列来源于 Pseudomonascichorii，iGEM元件编号BBa_K2791019。

优选地，所述受D-阿洛酮糖诱导启动子pPsi为A.tumefaciens中天然启动子与强启动子pTac杂交而成，iGEM元件编号为BBa_K2448016；pPsi下游与pLac 下游RBS均为强RBS，iGEM元件编号BBa_B0034。

本发明还公开了上述的重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

(1)将骨架使用限制性内切酶连入载体pSB1C3，得到质粒pSB1C3-pPsi；

(2)采用Golden Gate连接方式依次将D-阿洛酮糖诱导阻遏蛋白psiR序列、荧光蛋白EGFP、偶联元件cp与卡那霉素抗性基因片段kanR连入骨架中，得到质粒pSB1C3-psiR-pPsi-EGFP-cp-kanR；

(3)采用BioBrick组装方式，使用限制性内切酶将DTE酶文库连接入骨架中，得到重组质粒pSB1C3-psiR-pPsi-EGFP-cp-kanR-DTE。

本发明还公开了基于上述的重组质粒构建得到的重组工程菌，该重组工程菌为Device-D-cp0-w/o-dte，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.18931。

本发明还公开了上述重组工程菌在生产D-阿洛酮糖中的应用，所述重组工程菌能够定向进化以提升DTE酶生产D-阿洛酮糖的效率。

本发明还公开了利用上述重组工程菌定向进化DTE酶的方法，将重组工程菌Device-D-cp0-w/o-dte在LB培养基中诱导DTE酶表达后，逐步移入分别施加有D-果糖或施加2μg/ml卡那霉素的固体培养基中培养，并筛选存活菌落以准备下一轮的文库构建。

进一步地，文库构建包括：收集存活菌落，使用缓冲液洗涤后提取质粒，随后用与DTE编码序列互补的引物对扩增文库。

进一步地，具体包括以下步骤：

1)将重组工程菌Device-D-cp0-w/o-dte以2％的接种量接入LB培养基中，另加入氯霉素与IPTG进行培养；

2)收集菌液，离心并重悬后涂布于固体培养基平板上，涂布后在37℃下培养12小时，随后将菌苔转印至另一固体LB培养基，该培养基中加入卡那霉素；其中，固体培养基由MM培养基加入15g/L琼脂粉和50g/L果糖组成；

3)挑取固体培养基上的存活菌落并培养于加入LB培养基的摇菌管中，并加入氯霉素，随后洗涤、抽提质粒；

4)使用与DTE编码序列互补的特异性引物构成PCR体系，扩增DTE文库。

更进一步地，具体步骤如下：

1)将重组工程菌Device-D-cp0-w/o-dte以2％的接种量接入装有100mL LB 培养基的200mL锥形瓶，锥形瓶中另加入100mg/L的氯霉素与0.2g/L的IPTG，在37℃、200rpm/min的条件下培养10小时；

2)收集6mL菌液，离心并重悬至200μL，涂布于固体培养基平板上，涂布后在37℃下培养12小时，随后将菌苔转印至另一固体LB培养基，该培养基中加入浓度为2μg/ml的卡那霉素；若干轮进化后可适当提高培养基中卡那霉素的浓度；其中，固体培养基由MM培养基加入15g/L琼脂粉和50g/L果糖组成；

3)挑取固体培养基上的存活菌落并培养于加入LB培养基的摇菌管中，培养基中加入100mg/L氯霉素。随后使用1x PBS洗涤两次，抽提质粒。使用与DTE 编码序列互补的特异性引物构成PCR体系，扩增DTE文库。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明应用合成生物学思想，设计了定向进化的重组质粒，该定向进化的重组质粒便可视作一基因电路，即用以提升DTE酶效率的基因电路。与此同时，本发明还公开了基于上述重组质粒构建得到的重组工程菌，具体为大肠杆菌E. coli DH5αpSB1C3-psiR-pPsi-EGFP-cp-kanR-DTE。本发明的上述基因电路使用阻遏蛋白PsiR与其对应启动子pPsi实现了D-阿洛酮糖的生物传感器；使得菌体可感应体内D-阿洛酮糖的生产量以表达不同水平的抗生素抗性基因，从而将DTE 酶的效率转化为菌体的生存优势。相比于单次筛选，本发明所述构建文库-筛选携带高效DTE的菌株-基于高效菌株再次构建文库的过程可获得更高效的DTE序列。该方法具有以下优势：

1.可在对于DTE酶活性位点与该酶作用机理研究不充分的情况下优化该酶的特性；

2.使用体外文库构建。相比于体内突变，增强了对于文库构建的控制性；

3.使用抗生素与抗生素抗性基因施加筛选压力，相对于PACE(噬菌体加速连续进化)等连续培养方法，降低了操作难度；

4.质粒构建过程为层次化设计，便于替换元件以便推广这一定向进化平台；

5.相邻转录单元方向均相反，以减少通读的风险，并减少菌体在压力下同源重组以修改基因电路的几率；

6.质粒上载有转录因子LacI的拷贝，以补充基因组LacI的表达，降低pLac 下游基因的泄露表达；

7.使用了受D-阿洛酮糖诱导启动子pPsi与pTac杂交的启动子，增强了D- 阿洛酮糖生物传感器的灵敏度；

8.抗生素抗性基因上游连有一翻译偶联元件。这一元件降低了抗性基因的表达水平，增大了菌体对于生存压力的灵敏度。

菌株保藏

本发明公开了一株重组工程菌，命名为Device-D-cp0-w/o-dte，建议的分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，于2019年11月8日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，地址是中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为CGMCCNo.18931。

附图说明

图1为本发明的重组质粒的结构示意图；

图2为利用本定向进化平台提升DTE酶效率的流程图；

图3为重组质粒pSB1C3-psiR-pPsi-EGFP-cp-kanR-DTE构建的技术路线图；

图4为

具体实施方式

中感应电路部分检测pPsi的正交性实验结果；

图5为具体实施方式中选择电路部分检测卡那霉素和卡那霉素抗性蛋白的相互作用的实验结果；

图6为具体实施方式中偶合电路部分检测RFP、EGFP荧光强度与IPTG浓度之间关系的实验结果；(a)、(b)为诱导后，包含偶合电路的细菌群体中RFP (a)与GFP(b)荧光强度随诱导物IPTG浓度的变化；(c)为细菌所表达RFP 与GFP荧光强度的相关性；

图7为具体实施方式中进化电路部分检测含有不同活性DTE酶的大肠杆菌细胞的荧光强度变化的实验结果。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明公开的重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

(1)合成用于该定向进化平台质粒的骨架，并将该骨架与载体pSB1C3使用限制性内切酶EcoRI与SpeI消化并连接。其中骨架依次连接有lacI基因、pPsi 启动子，RBS与终止子、pLac启动子，RBS与终止子、BbsI位点和BsaI位点等。其中lacI基因表达LacI阻遏蛋白，用于补充基因组表达的LacI。pPsi启动子受到阻遏因子PsiR的阻遏，并受到诱导物D-阿洛酮糖的诱导而表达。pLac启动子受IPTG诱导表达。得到重组质粒pSB1C3-pPsi。受D-阿洛酮糖诱导的启动子 pPsi为Agrobacterium tumefacienss中天然启动子与强启动子pTac杂交而成，iGEM 元件编号BBa_K2448016。pPsi下游与pLac下游RBS(核糖体结合位点)均为强RBS，iGEM元件编号BBa_B0034。BbsI位点与BsaI位点均用于随后步骤中的Golden Gate组装。

(2)合成带有BsaI位点的psiR基因序列，使用BsaIⅡs型限制性内切酶以GoldenGate组装方法在pSB1C3-pPsi中***PsiR阻遏因子编码基因。该PsiR 阻遏因子基因来源于Agrobacterium tumefaciens，iGEM元件编号BBa_K2448006。得到重组质粒pSB1C3-psiR-pPsi。

(3)PCR扩增绿色荧光蛋白EGFP片段与抗生素抗性基因片段，并在此二片段引入BbsI位点。使用BbsIⅡs型限制性内切酶以Golden Gate组装方法在 pSB1C3-psiR-pPsi中同时***绿色荧光蛋白EGFP编码基因、翻译偶联元件cp 与卡那霉素抗性基因kanR得到重组质粒pSB1C3-psiR-pPsi-EGFP-cp-kanR。其中绿色荧光蛋白iGEM元件编号为BBa_K2791050。

(4)使用SpeI和PstI限制性内切酶以BioBrick组装方式连入DTE酶文库，得到重组质粒pSB1C3-psiR-pPsi-EGFP-cp-kanR-DTE。其中DTE酶原始序列来源于Pseudomonascichorii，iGEM元件编号BBa_K2791019。

所述骨架的核苷酸序列如SED.ID.NO.1所示；D-阿洛酮糖诱导阻遏蛋白psiR 因子的核苷酸序列如SED.ID.NO.2所示；荧光蛋白EGFP、偶联元件cp与卡那霉素抗性基因片段kanR相连的序列如SED.ID.NO.3所示；DTE酶文库的原始序列如SED.ID.NO.4所示。

将具有定向进化功能的质粒pSB1C3-psiR-pPsi-EGFP-cp-kanR-DTE转化入大肠杆菌E.coli，得到菌株Device-D-cp0-w/o-dte的步骤如下：

取100μl感受态细胞，加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰上放置30min。将离心管42℃热激90s。快速将离心管放入到冰上，使其冷却2min。每管加入900μl 不含抗生素的SOC培养基，于37℃摇床低速培养1h。低速离心，弃去约800μl 上清，取剩余200μl菌液直接涂布于含100μg/ml氯霉素的LB固体培养皿上。平板于37℃正向放置至液体被吸收，置平板于37℃培养18-24h。挑取单克隆进行酶切验证，并送至擎科生物进行测序鉴定。

参见图2，本发明还公开了一种基于上述公开的重组大肠杆菌菌株的DTE酶定向进化方法。将文库通过BioBrick组装方式连入后获得的重组大肠杆菌菌株 E.coli DH5αpSB1C3-psiR-pPsi-EGFP-cp-kanR-DTE。在LB培养基中诱导DTE酶表达后，逐步移入分别施加D-果糖或施加2μg/ml卡那霉素的固体培养基中培养，并收集存活菌落；随后使用缓冲液洗涤，并提取质粒，最后用与DTE编码序列互补的引物对扩增文库。

所述将实现定向进化平台的大肠杆菌菌株E.coli DH5α pSB1C3-psiR-pPsi-EGFP-cp-kanR-DTE在LB培养基诱导表达DTE酶，其具体操作为：将上述菌株以2％的接种量接入装有100mL LB培养基的200mL锥形瓶中。锥形瓶中另加入100mg/L的氯霉素与0.2g/L的IPTG。在37℃、200rpm/min 的条件下培养10小时。所述移入固体培养基培养，具体操作为：

收集6mL菌液，离心并重悬至200μL，涂布于固体培养基平板上。固体培养基由MM培养基加入15g/L琼脂粉和50g/L果糖组成。涂布后在37℃下培养 12小时。随后将菌苔转印至另一固体LB培养基，该培养基中加入浓度为2μg/ml 的卡那霉素。

所述筛选存活菌落并再次构建文库，具体操作为：

从中心挑取存活菌落并培养于加入LB培养基的摇菌管中，培养基中加入 100mg/L氯霉素。使用特异性引物构成PCR体系，95℃裂解菌体后扩增DTE酶编码序列。

本发明所搭建的平台也可用于其他酶的定向进化。应用定向进化技术以提升某种酶的特性时，研究者往往期望将此种酶表达的定量表型，例如此种酶催化下生产产物的量，转化为菌株的生存优势。基于上述提升DTE酶活性的实例，本发明公开了一种基于本定向进化基因电路将某种酶的产物的量转化为菌株生存优势的通用策略。参见图3，具体实施方式为：

(1)对于某种待优化的酶Enz，其编码序列为enz。存在响应其酶促反应产物的生物传感器。此生物传感器由受该产物诱导的阻遏蛋白Rep(编码序列为rep) 与结合Rep并受其阻遏的受诱导启动子pRep组成。

(2)对于骨架质粒pSB1C3，在其BsaI酶切位点以Golden Gate组装方式连入受诱导的阻遏蛋白编码序列rep与其对应的启动子pRep，得到质粒pSB- rep-pRep。

(3)在质粒pSB1C3-rep-pRep的BbsI位点上以Golden Gate组装方式同时连入绿色荧光蛋白编码序列EGFP、翻译偶联元件cp与卡那霉素抗性基因kanR，得到质粒pSB1C3-rep-pRep-EGFP-cp-kanR。

(4)使用易错PCR构建编码序列enz的文库，并使用XbaI酶切位点与PstI 酶切位点以BioBrick组装方式连入该文库。得到质粒 pSB1C3-rep-pRep-EGFP-cp-kanR-enz。

(5)对于不同的受诱导启动子pRep，其启动强度与启动阈值也有所不同。据此选择合适的卡那霉素浓度，并根据这一抗生素浓度筛选载有文库的菌株，以获得产量得到优化的酶Enz。

本发明致力于改善DTE酶的酶活，本发明设计了一种自动化、高通量、可重复的直接进化平台使DTE酶可以方便地进行自我进化。为设计定向进化DTE 酶效率的基因电路，达到以抗生素抗性蛋白的表达量表征D-阿洛酮糖的产量的目的，本发明共设计了4个基因电路的遗传单元，并对每个单元进行了测试，以确保实现最终可以筛选高效酶活DTE的功能，这四个单元分别是感应电路，选择电路，偶合电路和进化电路。

1、感应电路

感应电路将D-阿洛酮糖的浓度转化为下游基因EGFP的表达水平。该电路质粒为pSB1C3-psiR-pPsi-EGFP，该电路基于阻遏物PsiR和其对应的诱导型启动子 pPsi，电路中设计了各种调节元件以实现稳定的生物传感。该通用回路中的阻遏物、诱导型启动子和下游元件具有不同的酶切位点，阻遏物和诱导型启动子采用两个不同的Golden Gate识别位点以实现调控系统的无缝连接，下游元件使用标准的BioBrick组装方式进行连接。

为了测试pPsi和PsiR的效率，我们进行了pPsi的正交性与pPsi的效率两个实验。实验结果见图4。图4显示，不同类型糖的实验组所检测到的荧光强度不同，而阿洛酮糖组的荧光强度总是高于其他糖实验组。因此，可以得出这样的结论：pPsi启动子特异响应于D-阿洛酮糖并且对其他糖不敏感。

pPsi的效率检测实验旨在检测阿洛酮糖浓度对pPsi表达强度的影响，结果表明50mM阿洛酮糖诱导的荧光强度最高，且阿洛酮糖浓度越高，荧光强度将越强烈。我们可以得出结论，pPsi的效率和培养基中的阿洛酮糖浓度是正相关的。

2、选择电路

选择电路将抗生素抗性基因的表达水平转化为菌体在梯度浓度抗生素条件下的不同生长速率，并以荧光强度作为量化指标。本电路质粒为pSB1C3-lacI- pLac-EGFP-kanR。本电路对卡那霉素，链霉素和氨苄青霉素的三种抗生素抗性蛋白进行了表征，最终卡那霉素由于其更宽的动态范围被选用。

我们设计了一系列实验来表征选择电路的功能，以选择电路-KanR为例，实验结果见图5中(a)和(b)所示，结果表明，当IPTG的浓度位于一定范围时，细菌的最终OD600将随着卡那霉素浓度的增加而降低。这意味着如果KanR的表达水平高，细菌具有很高的存活可能性，因为较高的IPTG浓度可以诱导更多的 KanR表达。此外，表达更多KanR的细菌存活更多。

3、偶合电路

偶合电路是通过偶联元件cp来控制其茎环两端的表达水平，以提高对抗生素生存压力的敏感性。该电路的质粒为pSB1C3-lacI-pLac-RFP-cp-EGFP。该部分的设计利用了核糖体的解旋酶活性，当核糖体接近上游编码序列的末端时，它将解开两个编码序列之间的发夹结构以进行下游序列的表达。该发夹结构的长度对应于核糖体可以解开的最佳距离。通过这种发夹结构，可以使下游转化水平与上游定量相关。这个偶联元件解决的问题是定向进化和合成生物学最关键问题之一：如何控制输入和输出的比例。

为了测试通过发夹结构，下游翻译水平是否与上游表达定量相关。我们设计了实验，实验结果见图6中(a)、(b)和(c)。结果显示，GFP荧光强度明显强于RFP荧光强度，二者荧光强度的线性关系也可初步测定。

4、进化电路

进化电路总结了上面使用的所有调控单元，并将DTE酶活定量转换为菌株在特定浓度抗生素环境下的抗压生长能力。该电路质粒为 pSB1C3-psiR-pPsi-EGFP-cp-kanR-DTE。利用选择和偶合电路的特性，我们获得了合适的抗生素浓度，以便于在进化中施加生长压力。

我们已知DTE酶家族中各酶的活性不同，且DTE酶活性显著高于DPE酶。为使系统真正发挥作用，我们分别使用了酶活具有显著差异的DTE酶和DPE酶构建了进化电路质粒并将其转化为大肠杆菌。

首先，根据感应电路，介质中pPsi的效率和阿洛酮糖的浓度是正相关的。其次，如果DTE的活性较高，则培养基中会有更多的阿洛酮糖导致更多的基因表达。第三，根据偶联电路，荧光强度与抗性基因的表达定性相关。为了表征抗生素抗性基因的表达，我们设计了实验，结果显示于图7。图7显示在含有DTE的大肠杆菌中表达的抗生素基因总是高于DPE，这意味着DTE的活性高于DPE。这证明我们的系统可以区分具有不同活性的DTE，即系统确实有效。

根据选择电路，卡那霉素优于其他抗生素。我们设定了三个卡那霉素浓度梯度并测量在这些浓度下大肠杆菌细胞生长的变化。结果表明菌浓度随着抗生素浓度的增加而逐渐降低。即增加抗生素浓度意味着增加进化压力，抑制细菌生长也更明显。以上所有实验结果表明进化电路可以正常工作。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

序列表

<110> 西安交通大学

<120> 一种重组质粒和重组工程菌及其构建方法和提高D-阿洛酮糖的产量的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1648

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaattcgcgg ccgcttctag aggagatcta cactagcact atcagagtta ttaagctact 60

aaagcgtagt tttcgtcgtt tgcagcctgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc 120

agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgccagg 180

gtggtttttc ttttcaccag tgagacgggc aacagctgat tgcccttcac cgcctggccc 240

tgagagagtt gcagcaagcg gtccacgctg gtttgcccca gcaggcgaaa atcctgtttg 300

atggtggtta acggcgggat ataacatgag ctatcctcgg tatcgtcgta tcccactacc 360

gagatatccg caccaacgcg cagcccggac tcggtaatgg cgcgcattgc gcccagcgcc 420

atctgatcgt tggcaaccag catcgcagtg ggaacgatgc cctcattcag catttgcatg 480

gtttgttgaa aaccggacat ggcactccag tcgccttccc gttccgctat cggctgaatt 540

tgattgcgag tgagatattt atgccagcca gccagacgca gacgcgccga gacagaactt 600

aatgggcccg ctaacagcgc gatttgctgg tgacccaatg cgaccagatg ctccacgccc 660

agtcgcgtac catcctcatg ggagaaaata atactgttga tgggtgtctg gtcagagaca 720

tcaagaaata acgccggaac attagtgcag gcagcttcca cagcaatggc atcctggtca 780

tccagcggat agttaatgat cagcccactg acgcgttgcg cgagaagatt gtgcaccgcc 840

gctttacagg cttcgacgcc gcttcgttct accatcgaca ccaccacgct ggcacccagt 900

tgatcggcgc gagatttaat cgccgcgaca atttgcgacg gcgcgtgcag ggccagactg 960

gaggtggcaa cgccaatcag caacgactgt ttgcccgcca gttgttgtgc cacgcggttg 1020

ggaatgtaat tcagctccgc catcgccgct tccacttttt cccgcgtttt cgcagaaacg 1080

tggctggcct ggttcaccac gcgggaaacg gtctgataag agacaccggc atactctgcg 1140

acatcgtata acgttactgg tttcacattc accattagtt ttctcctctt tggcgctatc 1200

atgccatacc gcgaaaggtt ttgcaccagg cacgtaagag gttccaactt tcaccataat 1260

gaaactcaca caggaaagga gaccgtacca tggtctccgc aaaaaacccc gcttcggcgg 1320

ggttttttcg ctataaacgc agaaaggccc acccgaaggt gagccagtgt gactctagta 1380

gagagcgttc accgacaaac aacagataaa acgaaaggcc cagtctttcg actgagcctt 1440

tcgttttatt tgatgcctgg gtcttcactg tttgaagact ttctcctctt tttgcaccat 1500

cgattgtgca atccacacat tatacgagcc gatgattaat tgtcaacagc tcaaattgtg 1560

agcggataac aattgacatt gtgagcggat aacaagatac tgagcacaga attgtaaaga 1620

ggagaaatac tagtagcggc cgctgcag 1648

<210> 2

<211> 1108

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtctcggaa agactaatga ccggtatctc ttctaaaaaa gctaccatct acgacctgtc 60

tatcctgtct ggtgcttctg cttctaccgt ttctgctgtt ctgaacggtt cttggcgtaa 120

acgtcgtatc tctgaagaaa ccgctgacaa aatcctgtct ctggctaaag ctcagcgtta 180

caccaccaac ttacaggctc gtggtctgcg ttcttctaaa tctggtctgg ttggtctgct 240

ggttccggtt tacgacaacc gtttcttctc ttctatggct cagaccttcg aaggtcaggc 300

tcgtaaacgt ggtctgtctc cgatggttgt ttctggtcgt cgtgacccgg aagaagaacg 360

tcgtaccgtt gaaaccctga tcgcttactc tatcgacgct ctgttcatcg ctggtgttac 420

cgacccggac ggtgttcacc aggtttgcgc tcgtgctgct ctgccgcacg ttaacatcga 480

cctgccgggt aaattcgctt cttctgttat ctctaacaac cgtcacggtg ctgaaatcct 540

gaccgctgct atcctggctc acgctgctaa aggtggttct ctgggtccgg acgacgttat 600

cctgttcggt ggtcacgacg accacgcttc tcgtgaacgt atcgacggtt tccacgctgc 660

taaagctgac tacttcggtg ttgaaggtgg tgacgacatc gaaatcaccg gttactctcc 720

gcacatgacc gaaatggctt tcgaacgttt cttcggtcgt cgtggtcgtc tgccgcgttg 780

cttcttcgtt aactcttcta tcaacttcga aggtctgctg cgtttcatgg gtcgtcacga 840

cggtgaagct ttcggtgaca tcgttgttgg ttgcttcgac tacgacccgt tcgcttcttt 900

cctgccgttc ccggtttaca tgatcaaacc ggacatcgct cagatgctgg aaaaaggttt 960

cgaactgctg gaagaaaacc gtaccgaacc ggaagttacc atcatcgaac cgcagctgat 1020

cccgccgcgt accgctctgg aaggtccgct ggacgacatc tgggacccgg ttgctctgcg 1080

tcgtatggct aaataacgca aagagacc 1108

<210> 3

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaagacagga gaaaactaat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc 60

atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc 120

gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg 180

cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc 240

taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc 300

caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag 360

ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac 420

ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg 480

gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac 540

ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg 600

ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag 660

aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg 720

gacgagctgt acaagtaagt cttc 744

<210> 4

<211> 914

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaattcgcgg ccgcttctag atgaacaagg tgggcatgtt ttatacctat tggagcaccg 60

aatggatggt ggattttccg gcgaccgcga aacgtattgc gggcctgggc tttgatctga 120

tggaaattaa cctggaggag tttcataacc tggcggatgc gaaaaaacgc gaactgaaag 180

cggtggcgga tgatttaggc ttaaccgtga tgtgctgcat tggcctgaaa agcgaatatg 240

attttgcgag cccggataaa agcgttcgtg atgcgggcac cgaatatgtg aaacgcctgc 300

tggatgattg ccatttactg ggtgcgccgg tttttgcggg cctgaacttt tgtgcgtggc 360

cgcagcatcc tcctctggat atggtggata aacgcccgta tgtggatcgc gcgattgaat 420

cagttcgccg cgtgattaaa gtggcggaag actatggcat tatttatgcg ctggaagtgg 480

tgaaccgcta tgaacagtgg ctgtgcaacg atgcgaaaga agcgattgcg tttgcggatg 540

cggttgatag cccggcgtgc aaagttcagc tggatacctt tcatatgaac atcgaggaaa 600

acagctttcg cgatgcgatt ctggcgtgca aaggcaaagt gggccatttt catattggcg 660

aacagaaccg cttacctcct ggtgaaggcc gtttaccgtg ggatgaaatt tttggcgcgc 720

tgaaagaaat tggctatgat ggcaccattg cgatggaacc gtttatgcgc accggtggtt 780

cagttggccg cgatgtttgt gtttggcgcg atctgtcaaa tggcgcgacc gatgaagaaa 840

tggatgaacg cgcgcgtcgt agcttacagt ttgtgcgcga taaattagcg tgatactagt 900

agcggccgct gcag 914