阅读说明：本技术 一种甘油三酯的检测试剂、检测试纸及试纸制备方法 (Triglyceride detection reagent, triglyceride detection test paper and preparation method of triglyceride detection test paper ) 是由 左园 宗小林 石丹垚 甘建民 崔娜娜 茹振楠 于 2020-08-12 设计创作，主要内容包括：本发明是一种甘油三酯的检测试剂、检测试纸及试纸制备方法,检测试剂包括0.5-1.5KU/ml的脂蛋白脂肪酶、0.3-0.5KU/ml的黄递酶、0.32-0.94KU/ml的甘油脱氢酶、5-15mmol/L的辅酶Ⅰ和2-6mmol/L的显色物质,还包括质量分数为0.2%-1.0%的TritonX-100溶液、0.01-0.1mol/L的缓冲液；显色物质为氯化硝基四氮唑蓝、二甲基噻唑二苯基四唑嗅蓝、二氯靛酚钠、TNBT、碘硝基氯化四氮唑蓝中的一种,检测试纸包括反应底层、反应层、滤血层、毛细进样层和亲水层,检测试剂位于反应层上表面。本发明测试结果受到其他物质的干扰影响较小,试剂检测更为稳定。(The invention relates to a triglyceride detection reagent, a detection test paper and a test paper preparation method, wherein the detection reagent comprises 0.5-1.5KU/ml lipoprotein lipase, 0.3-0.5KU/ml diaphorase, 0.32-0.94KU/ml glycerol dehydrogenase, 5-15mmol/L coenzyme I and 2-6mmol/L chromogenic substance, and also comprises 0.2-1.0% TritonX-100 solution and 0.01-0.1mol/L buffer solution according to mass fraction; the chromogenic substance is one of nitrotetrazolium chloride, dimethylthiazolediphenyltetrazole olfactory blue, sodium dichlorophenolate, TNBT and iodonitrotetrazolium chloride, the detection test paper comprises a reaction bottom layer, a reaction layer, a blood filtering layer, a capillary sample injection layer and a hydrophilic layer, and the detection reagent is positioned on the upper surface of the reaction layer. The test result of the invention is less influenced by the interference of other substances, and the reagent detection is more stable.)

一种甘油三酯的检测试剂、检测试纸及试纸制备方法

技术领域

本发明涉及甘油三酯检测的技术领域，尤其涉及一种甘油三酯的检测试剂、检测试纸及试纸制备方法。

背景技术

目前普遍应用的甘油三酯的干化学测试方法是采用脂蛋白酯酶、甘油激酶、甘油磷酸氧化酶偶联Trinder反应。但是该体系中的氧化还原显色剂暴露在空气或遇到光时非常不稳定，并且如果保存不当，产品未被使用前很容易提前氧化发生颜色变化，造成产品失效或检测结果不准确。

现有的解决方法如专利CN105295441B向配方中加入显色剂稳定剂、还原剂、螯合剂、辅助稳定剂等多种助剂，从而使显色剂保持更好的显色能力；专利CN102128919B也采用两种显色稳定剂，其中一种显色稳定剂具有比显色剂较强的还原能力，另一种显色稳定剂具有介于显色剂和第一种显色稳定剂之间的还原能力，但是两篇专利中的还原性稳定剂的添加对显色剂的氧化还原反应均具有一定的干扰效应，对检测结果产生很大的影响。

发明内容

本发明旨在解决现有技术的不足，而提供一种甘油三酯的检测试剂、检测试纸及试纸制备方法。

本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种甘油三酯的检测试剂，包括0.5-1.5KU/ml的脂蛋白脂肪酶、0.3-0.5KU/ml的黄递酶、0.32-0.94KU/ml的甘油脱氢酶、5-15mmol/L的辅酶Ⅰ和2-6mmol/L的显色物质，还包括质量分数为0.2%-1.0%的TritonX-100溶液、0.01-0.1mol/L的缓冲液；

所述显色物质为氯化硝基四氮唑蓝、二甲基噻唑二苯基四唑嗅蓝、二氯靛酚钠、TNBT、碘硝基氯化四氮唑蓝中的一种；

所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液、CAPS缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、碳酸钾-碳酸氢钠缓冲液中的一种；

所述缓冲液的pH为8.0-11.0。

添加有上述甘油三酯的检测试剂的检测试纸，包括从下到上依次层叠设置的反应底层、反应层、滤血层、毛细进样层和亲水层；甘油三酯的检测试剂涂覆在反应层的上表面。

所述反应底层为长条片状薄板，所述反应底层上设有反射检测孔。

所述反应底层采用聚氯乙烯、聚酰胺酯、聚碳酸酯和聚酯中的任意一种材质制成，所述反应底层的厚度为0.2mm。

所述反应层为长条片状薄膜，所述反应层的宽度与反应底层的宽度一致且长度小于反应底层的长度；所述反应层上设有反应区，所述反应区为环形槽，所述反应区的环形槽的中心与反射检测孔的中心对应设置。

所述滤血层为长条片状薄膜，所述滤血层的尺寸与反应层大小一致，所述滤血层上设有滤血区，所述滤血区为环形槽，所述滤血区的环形槽与反应区的环形槽位置对应。

所述毛细进样层上表面沿长度方向设有两条双面胶带，所述毛细进样层上表面在两条双面胶带之间形成沟道，所述毛细进样层的沟道内设有扩散孔，所述扩散孔的直径与反射检测孔的直径相同，毛细进样层沟道上的扩散孔与滤血区同心设置。

所述亲水层为长条片状薄膜，所述亲水层长度与双面胶带的长度相同且宽度与两个双面胶带的间隔宽度相同，所述亲水层完全覆盖在两个双面胶带和沟道上。

所述亲水层为聚酯、聚乙吡咯烷酮制成。

上述添加有甘油三酯的检测试剂的检测试纸的制备方法，具体步骤为：

S1、选取反应底层，并在反应底层上加工出反射检测孔；

S2、将设置有反应区的反应层通过双面胶粘贴在反应底层上，并确保反应区与反射检测孔中心对齐；

S3、按照配比配制甘油三酯的检测试剂，将配制好的甘油三酯的检测试剂用点液机滴加到反应层的反应区，每孔加样量为1μl，滴完液进行干燥，干燥温度为37℃，干燥时间为20min；

S4、在反应层上贴上滤血层，确保滤血层上的滤血区与反应区对齐；

S5、在滤血层上贴上毛细进样层，再将两个长条的双面胶带贴于毛细进样层的上表面，两个长条的双面胶带之间形成狭长的沟道，确保毛细进样层沟道上的扩散孔与滤血区同心设置；

S6、将亲水层与双面胶带粘合，使得亲水层覆盖整个沟道以及双面胶带；

S7、最后进行分切即得甘油三酯的检测试纸。

本发明的有益效果是：本发明干化学检测采用甘油脱氢酶的比色测试路线，采用的显色物质催化生成不溶性蓝色产物，所产生的显色的强度与甘油三酯的浓度相关，区别于通常所采用的脂蛋白酯酶、甘油激酶、甘油磷酸氧化酶偶联Trinder反应。本发明采用的显色物质是一种稳定的显色剂，因此不需要添加多种保护剂，测试结果受到其他物质的干扰影响较小，试纸检测更为稳定。

附图说明

图1为本发明中检测试纸的结构示意图；

图2为测试甘油三酯血清样本的对比例和实施例的甘油三酯浓度与ΔAD值的标准曲线图；

图中：1-反应底层；2-反应层；3-滤血层；4-毛细进样层；5-亲水层；6-反射检测孔；7-反应区；8-滤血区；9-双面胶带；10-扩散孔；

以下将结合本发明的实施例参照附图进行详细叙述。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：

一种甘油三酯的检测试剂，包括0.5-1.5KU/ml的脂蛋白脂肪酶、0.3-0.5KU/ml的黄递酶、0.32-0.94KU/ml的甘油脱氢酶、5-15mmol/L的辅酶Ⅰ和2-6mmol/L的显色物质，还包括质量分数为0.2%-1.0%的TritonX-100溶液、0.01-0.1mol/L的缓冲液；

所述显色物质为氯化硝基四氮唑蓝、二甲基噻唑二苯基四唑嗅蓝、二氯靛酚钠、TNBT、碘硝基氯化四氮唑蓝中的一种；

所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液、CAPS缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、碳酸钾-碳酸氢钠缓冲液中的一种；

所述缓冲液的pH为8.0-11.0。

如图1所示，添加有上述甘油三酯的检测试剂的检测试纸，包括从下到上依次层叠设置的反应底层1、反应层2、滤血层3、毛细进样层4和亲水层5；甘油三酯的检测试剂涂覆在反应层2的上表面。

所述反应底层1为长条片状薄板，所述反应底层1上设有反射检测孔6。

所述反应底层1采用聚氯乙烯、聚酰胺酯、聚碳酸酯和聚酯中的任意一种材质制成，所述反应底层1的厚度为0.2mm。

所述反应层2为长条片状薄膜，所述反应层2的宽度与反应底层1的宽度一致且长度小于反应底层1的长度；所述反应层2上设有反应区7，所述反应区7为环形槽，所述反应区7的环形槽的中心与反射检测孔6的中心对应设置。

所述滤血层3为长条片状薄膜，所述滤血层3的尺寸与反应层2大小一致，所述滤血层3上设有滤血区8，所述滤血区8为环形槽，所述滤血区8的环形槽与反应区7的环形槽位置对应。

所述毛细进样层4上表面沿长度方向设有两条双面胶带9，所述毛细进样层4上表面在两条双面胶带9之间形成沟道，所述毛细进样层4的沟道内设有扩散孔10，所述扩散孔10的直径与反射检测孔6的直径相同，毛细进样层4沟道上的扩散孔10与滤血区8同心设置。

所述亲水层5为长条片状薄膜，所述亲水层5长度与双面胶带9的长度相同且宽度与两个双面胶带9的间隔宽度相同，所述亲水层5完全覆盖在两个双面胶带9和沟道上。

所述亲水层5为聚酯、聚乙吡咯烷酮制成。

上述添加有甘油三酯的检测试剂的检测试纸的制备方法，具体步骤为：

S1、选取反应底层1，并在反应底层1上加工出反射检测孔6；

S2、将设置有反应区7的反应层2通过双面胶粘贴在反应底层1上，并确保反应区7与反射检测孔6中心对齐；

S3、按照配比配制甘油三酯的检测试剂，将配制好的甘油三酯的检测试剂用点液机滴加到反应层2的反应区7，每孔加样量为1μl，滴完液进行干燥，干燥温度为37℃，干燥时间为20min；

S4、在反应层2上贴上滤血层3，确保滤血层3上的滤血区8与反应区7对齐；

S5、在滤血层3上贴上毛细进样层4，再将两个长条的双面胶带9贴于毛细进样层4的上表面，两个长条的双面胶带9之间形成狭长的沟道，确保毛细进样层4沟道上的扩散孔10与滤血区8同心设置；

S6、将亲水层5与双面胶带9粘合，使得亲水层5覆盖整个沟道以及双面胶带9；

S7、最后进行分切即得甘油三酯的检测试纸。

具体实施例1：

一种甘油三酯的检测试剂包括0.5KU/ml的脂蛋白脂肪酶、0.3KU/ml的黄递酶、0.32KU/ml的甘油脱氢酶、5mmol/L的辅酶Ⅰ和2mmol/L的氯化硝基四氮唑蓝，还包含质量分数为0.2%的TritonX-100溶液、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的pH为8.9。

具体实施例2：

一种甘油三酯的检测试剂包括1.0KU/ml的脂蛋白脂肪酶、0.4KU/ml的黄递酶、0.64KU/ml的甘油脱氢酶、10mmol/L的辅酶Ⅰ和4mmol/L的氯化硝基四氮唑蓝，还包含质量分数为0.2%的TritonX-100溶液、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的pH为8.9。

具体实施例3：

一种甘油三酯的检测试剂包括1.05KU/ml的脂蛋白脂肪酶、0.5KU/ml的黄递酶、0.94KU/ml的甘油脱氢酶、15mmol/L的辅酶Ⅰ和6mmol/L的氯化硝基四氮唑蓝，还包含质量分数为1%的TritonX-100溶液、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的pH为8.9。

分别用添加有具体实施例1、2、3中甘油三酯的检测试剂的检测试纸去测试7.03mmol/L、6.46 mmol/L、5.17 mmol/L、3.54 mmol/L、2.03 mmol/L和0.55 mmol/L的对比例甘油三酯血清样本（上述对比例中的甘油三酯浓度是用全自动生化分析仪测定），测试方法为：在检测试纸上滴加3μL血清样本，2min后，读取590nm的光强度AD值，从 AD基值中扣除AD值得到ΔAD值，根据样本浓度绘制标准曲线并得到回归方程。

测试结果如表1所示，

甘油三酯浓度与ΔAD值的标准曲线如图2所示，图2可以看出本发明的检测试纸可以测试0.5-7.0mmol/L范围的甘油三酯浓度，测试结果相关性达到0.998。

实施例1对应的回归方程为：

y = 170.25x + 1406.5 R² = 0.9992

实施例2对应的回归方程为：

y = 242.97x + 956.35 R² = 0.9982

实施例3对应的回归方程为：

y = 184.1x + 1570.5 R² = 0.9991

按照同样的方法测试对比例全血样本（全血样本实际甘油三酯浓度是用全自动生化分析仪测定），将ΔAD值结果带入上述回归方程，计算得到样本测试浓度，结果如表2所示:

从上表可以看出，采用本发明检测试纸得到的甘油三酯测试浓度与全自动生化分析仪测定得到的样本实际浓度接近，证明本检测试纸能获得较好的检测效果。

本发明干化学检测采用甘油脱氢酶的比色测试路线，采用的显色物质催化生成不溶性蓝色产物，所产生的显色的强度与甘油三酯的浓度相关，区别于通常所采用的脂蛋白酯酶、甘油激酶、甘油磷酸氧化酶偶联Trinder反应。本发明采用的显色物质是一种稳定的显色剂，因此不需要添加多种保护剂，测试结果受到其他物质的干扰影响较小，试纸检测更为稳定。

上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。