阅读说明：本技术 Irm1基因在制备抑制植物叶片生长的制剂中的应用 (Application of IRM1 gene in preparation of preparation for inhibiting plant leaf growth ) 是由 黄腾波 张志伟 王凤攀 于 2020-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明属于植物基因调控技术领域,具体涉及IRM1基因在制备抑制植物叶片生长的制剂中的应用。本发明经实验发现,通过将IRM1 T-DNA插入突变体表型,所得IRM1内源功能缺失的突变体拟南芥植株的莲座叶比野生型拟南芥植株的莲座叶更大,说明IRM1基因是一个可以抑制植物叶片生长和叶片细胞分裂的基因,可用于制备抑制植物叶片生长及细胞分裂的制剂,达到调控植物叶片器官大小的目的,对进一步完善植物调控器官大小的分子机制、通过遗传手段改良作物器官大小具有重要意义。(The invention belongs to the technical field of plant gene regulation and control, and particularly relates to application of an IRM1 gene in preparation of a preparation for inhibiting plant leaf growth. Experiments show that the rosette leaves of the obtained IRM1 mutant arabidopsis thaliana plant with the deletion of the endogenous function are larger than those of a wild arabidopsis thaliana plant by inserting IRM 1T-DNA into the mutant phenotype, so that the IRM1 gene is a gene capable of inhibiting the growth of plant leaves and the division of leaf cells, can be used for preparing a preparation for inhibiting the growth of the plant leaves and the division of the plant cells, achieves the aim of regulating and controlling the sizes of plant leaf organs, and has important significance for further perfecting a molecular mechanism for regulating and controlling the sizes of the plant organs and improving the sizes of crop organs by a genetic means.)

IRM1基因在制备抑制植物叶片生长的制剂中的应用

技术领域

本发明属于植物基因调控技术领域，具体涉及IRM1基因在制备抑制植物叶片生长的制剂中的应用，IRM1基因在制备抑制植物叶片细胞***的制剂中的应用，一种促进植物叶片生长的方法，以及一种促进植物叶片细胞***的方法。

背景技术

植物细胞作为构成植物体的基本单元，在植物由种子萌发逐渐发育成成熟个体的过程中发挥重要作用，植物器官的发生与生长都与细胞***和细胞体积扩增密切相关。目前关于模式植物拟南芥叶片的发育已有较多研究，通常认为在拟南芥叶片生长发育早期，细胞***活性最高。随着发育进程的逐步推进，细胞***活性减弱，细胞过渡进入体积扩增阶段，最终叶片停止生长。因此，拟南芥叶片形态大小是由细胞***活性、体积扩增速率和二者的过渡时期进程共同决定。近些年来，科学界在细胞生长发育的机制上已经有了一些进展，发现了一系列通过调节细胞生长而影响器官发育的多个基因。例如由GRF基因家族和GRF-INTERACTING FACTOR(GIF)基因通过维持细胞增殖来调节叶片器官大小；JAG基因通过影响细胞周期来抑制拟南芥叶片和花瓣形成锯齿状边缘；SLC/AGO1基因调控拟南芥叶片细胞***与定向伸长，在叶表皮细胞中促进细胞突起形成，从而抑制细胞过度生长；TOR基因在叶片细胞中的表达水平调控着叶片的大小以及泛素结合蛋白DA1和E3泛素连接酶BIG-BROTHER(BB)通过促进细胞增殖来限制器官大小。这些调控因子均对叶片的生长发育起着重要作用。尽管如此，人们对植物器官大小的内在调控机制的认识还很有限。

发明内容

本发明的目的是提供IRM1基因在制备抑制植物叶片生长的制剂中的应用，IRM1基因在制备抑制植物叶片细胞***的制剂中的应用，一种促进植物叶片生长的方法，以及一种促进植物叶片细胞***的方法，旨在提供一种新的调控植物叶片生长的方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明一方面提供了IRM1基因在制备抑制植物叶片生长的制剂中的应用。

本发明另一方面提供了IRM1基因在制备抑制植物叶片细胞***的制剂中的应用。

本发明再一方面提供了一种促进植物叶片生长的方法，其是抑制植物基因组中IRM1基因的表达，得到低表达IRM1基因的植物突变体或不表达IRM1基因的植物突变体。

本发明最后一方面提供了一种促进植物叶片细胞***的方法，其是抑制植物基因组中IRM1基因的表达，得到低表达IRM1基因的植物突变体或不表达IRM1基因的植物突变体。

本发明经实验发现，通过将IRM1 T-DNA***突变体表型，所得IRM1内源功能缺失的突变体拟南芥植株的莲座叶比野生型拟南芥植株的莲座叶更大，说明IRM1基因是一个可以抑制拟南芥叶片生长的基因。同时，由于拟南芥是模式植物，因此在IRM1基因可以抑制拟南芥叶片生长的基础上，可知其也可以抑制其它植物的叶片生长，可用于制备抑制植物叶片生长的制剂，达到调控植物叶片器官大小的目的，对进一步完善植物调控器官大小的分子机制、通过遗传手段改良作物器官大小具有重要意义。

本发明经实验发现，通过IRM1 T-DNA***突变体表型，对所得IRM1内源功能缺失的拟南芥突变体植株的叶片细胞面积进行统计，结果显示突变体拟南芥植株的叶片细胞平均面积相对于野生型拟南芥植株更大，但是差异不具有显著性。由于拟南芥叶片形态大小是由细胞***活性、体积扩增速率以及两者的过渡时期进程共同决定，因此可知IRM1基因是一个抑制拟南芥叶片细胞***的基因。同时，由于拟南芥是模式植物，因此在IRM1基因可以抑制拟南芥叶片细胞***的基础上，可知其也可以抑制其它植物叶片的细胞***，可用于制备抑制植物叶片细胞***的制剂，以调控植物叶片器官的大小。

本发明通过抑制植物基因组中IRM1基因的表达，得到低表达IRM1基因的植物突变体或不表达IRM1基因的植物突变体，该低表达IRM1基因的植物突变体或不表达IRM1基因的植物突变体的叶片比未抑制植物基因组中IRM1基因表达的野生型叶片更大。因此，通过该方法可以促进植物叶片的生长，获得叶片器官较大的植株。

由于IRM1基因是一个抑制植物叶片细胞***的基因，本发明通过抑制植物基因组中IRM1基因的表达，得到低表达IRM1基因的植物突变体或不表达IRM1基因的植物突变体。其中，该低表达IRM1基因的植物突变体或不表达IRM1基因的植物突变体的叶片细胞***活动不再受到IRM1基因的抑制，比野生型植物叶片的细胞***更快，因此，通过该方法可以促进植物叶片细胞的***。

附图说明

图1为本发明实施例生长四周的Col-1和irm1突变体拟南芥植株的照片；

图2为本发明实施例对Col-1和irm1突变体拟南芥植株进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳分离核酸的结果图；

图3为本发明实施例通过qRT-PCR对Col-1和irm1突变体拟南芥植株的IRM1基因表达水平进行鉴定的结果；

图4为本发明实施例对正常生长4周的Col-1和irm1突变体拟南芥植株第5片莲座叶的细胞进行扫描电镜轮廓描绘结果图；

图5为本发明实施例对正常生长4周的Col-1和irm1突变体拟南芥植株第5片莲座叶的下表皮中间部位细胞进行扫描电镜检测的照片及细胞面积大小比例结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

在本发明的描述中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

需要理解的是，本发明实施例中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本发明实施例相关组分的含量按比例放大或缩小均在本发明公开的范围之内。具体地，本发明实施例中所述的重量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。

另外，除非上下文另外明确地使用，否则词的单数形式的表达应被理解为包含该词的复数形式。术语“包括”或“具有”旨在指定特征、数量、步骤、操作、元件、部分或者其组合的存在，但不用于排除存在或可能添加一个或多个其它特征、数量、步骤、操作、元件、部分或者其组合。

本发明实施例提供了IRM1基因在制备抑制植物叶片生长的制剂中的应用。

经实验发现，通过将IRM1 T-DNA***突变体表型，所得IRM1内源功能缺失的突变体拟南芥植株(即irm1突变体)的莲座叶比野生型拟南芥植株的莲座叶更大，说明IRM1基因是一个可以抑制拟南芥叶片生长的基因。同时，由于拟南芥是模式植物，因此在IRM1基因可以抑制拟南芥叶片生长的基础上，可知其也可以抑制其它植物的叶片生长，可用于制备抑制植物叶片生长的制剂，达到调控植物叶片器官大小的目的。

IRM1基因(INCREASED RESISTANCE TO MYZUS PERSICAE 1)，在拟南芥基因组的位置编号为AT5G65040，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

IRM1基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)：

ataaaaataaaacaatattatctctataattagattctcccattctttttctttaaataactttgttcttcttctcttcttcctcccctttactacacacttcttcttttttcttcagaaagaaagaaagacagagagagagagagaagatggtgttaggaaagcgtcatggatcactgatcaagagaacaactagcatgaagatgatcacactcgatacacccacgatctatgacgcatctcagccgtccgatcatctaacctttcatcaacaccctcacaatccgatggtggtgatggctagtaactacgatgatttcttgaagacttgtagtctctgcaatcgaagtctctgccatcatcgtgacatttacatgtataggtacgattttatttactttttattttgtaaattttataaacgtaattaacccttcacacaatttgaaatgatatgttttgatcatggttgtatgctatatagttttaatgaatatttttttgtatatattgaatcgtttttgtagagggaacaacgcattttgtagcttagaatgcagggagaagcaaattaagctggacgagaaaaaagcgaaaaccggcttcgtaacatcgaagaaaccaattcgtatttagttgatcatctatgatctaaaatgataacgatagtttttccttatgagtaaaatgaatatgtttttgcgtttcgtgtacaagaatgatgaaaattaagagagaaaaatgagactaaatgagtgtagtgatcatatagtaatgggacttcataagcatgatttgatttgttcgtgtgatttgtttctttgtgatgtgtaatatgtaatgtaatatcaatgttgatgtatattcaggtggtcttcttagttcttactacttgtcgtaacatataaagatatttagtaaacgtactctgattttataatatcagatggaccgtttcttaaatggacttagaaaatagaatttgtgatagtgatcagttctgag

本发明实施例还提供了IRM1基因在制备抑制植物叶片细胞***的制剂中的应用。

经实验发现，通过IRM1 T-DNA***突变体表型，对所得IRM1内源功能缺失的拟南芥突变体植株的叶片细胞面积进行统计，结果显示突变体拟南芥植株的叶片细胞平均面积相对于野生型拟南芥植株更大，但是差异不具有显著性。由于拟南芥叶片形态大小是由细胞***活性、体积扩增速率以及两者的过渡时期进程共同决定，因此可知IRM1基因是一个抑制拟南芥叶片细胞***的基因。同时，由于拟南芥是模式植物，因此在IRM1基因可以抑制拟南芥叶片细胞***的基础上，可知其也可以抑制其它植物叶片的细胞***，可用于制备抑制植物叶片细胞***的制剂，以调控植物叶片器官的大小。

本发明实施例还提供了一种促进植物叶片生长的方法，其是抑制植物基因组中IRM1基因的表达，得到低表达IRM1基因的植物突变体或不表达IRM1基因的植物突变体。

本发明实施例通过抑制植物基因组中IRM1基因的表达，得到低表达IRM1基因的植物突变体或不表达IRM1基因的植物突变体，该低表达IRM1基因的植物突变体或不表达IRM1基因的植物突变体的叶片比未抑制植物基因组中IRM1基因表达的野生型叶片更大。因此，通过该方法可以促进植物叶片的生长，获得叶片器官较大的植株。

在一些实施例中，用于抑制植物基因组中IRM1基因的表达的方法包括但不限于基因编辑、基因敲除、基因沉默，或将这些方法组合使用。

本发明实施例还提供了一种促进植物叶片细胞***的方法，其是抑制植物基因组中IRM1基因的表达，得到低表达IRM1基因的植物突变体或不表达IRM1基因的植物突变体。

由于IRM1基因是一个抑制植物叶片细胞***的基因，本发明实施例通过抑制植物基因组中IRM1基因的表达，得到低表达IRM1基因的植物突变体或不表达IRM1基因的植物突变体。其中，该低表达IRM1基因的植物突变体或不表达IRM1基因的植物突变体的叶片细胞***活动不再受到IRM1基因的抑制，比野生型植物叶片的细胞***更快，因此，通过该方法可以促进植物叶片细胞的***。

在一些实施例中，用于抑制植物基因组中IRM1基因的表达的方法包括但不限于基因编辑、基因敲除、基因沉默，或将这些方法组合使用。

为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例IRM1基因在抑制植物叶片生长中的应用的进步性能显著的体现，以下通过具体实施例来举例说明上述技术方案。

实施例

本实施例提供了一种irm1突变体及其鉴定方法和鉴定结果。

1.拟南芥培养条件及实验整体流程

配制1/2MS固体培养基，对Col-0种子和irm1突变体种子(购自拟南芥种子TAIR网站拟南芥种植资源中心)杀菌消毒后，将种子均匀点在已凝固的培养基中4℃冰箱中冷处理2天，在恒温(22℃左右)培养室中光照培养7天，7天后移苗到营养土中培养。待植物生长2周后取Col-0叶片和irm1突变体叶片进行突变体鉴定，待生长至4周后，取各植株第5片莲座叶进行固定，通过扫描电镜制样后，在电镜下观察统计细胞数目和大小。

2.irm1突变体的鉴定

利用CTAB法从Col-0和irm1突变体植株中，提取DNA样品，通过IRM1基因的上下游引物以及LBb1.3特殊引物进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳分离核酸。

CTAB法从提取DNA样品的具体过程为：分别取2～3片Col-0拟南芥嫩叶和irm1突变体嫩叶放入不同的2ml离心管中，用液氮冷冻并研磨成粉，向管加入1ml的CTAB溶液，摇匀后放入65℃金属浴中加热30min，向管内加入700ml氯仿，室温下轻轻摇匀10min，12000r离心15min，将上清液转入新的离心管中；向上清液中加入420ml的异丙醇并摇匀，12000r离心10min，弃上清，用500ml 75％乙醇清洗沉淀，12000r离心5min，晾干沉淀，加入30～50ul TE(pH 8.0)溶解DNA，得到两个DNA样品作为扩增后续PCR模板。

PCR扩增时，扩增引物如下：IRM1的上下游引物(IRM1-F和IRM1-R)用于扩增Col-0的DNA样品，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2-3所示；LBb1.3特殊引物和IRM1-R用于扩增irm1突变体的DNA样品，LBb1.3特殊引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

IRM1-F的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)：

5'-acgggggactctagaggatccatggtgttaggaaagcgtcatgg-3'

IRM1-R的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)：

5'-gcccttgctcaccatggtaccaatacgaattggtttcttcgatgtt-3'

LBb1.3特殊引物的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)：

5'-attttgccgatttcggaac-3'

扩增从Col-0拟南芥嫩叶中提取的DNA样品的PCR扩增体系如表1所示；扩增从irm1突变体嫩叶中提取的DNA样品的PCR扩增体系如表2所示。PCR扩增的反应条件为：预变性：94℃，5min；变性：94℃，30s；退火：58℃，30s；延伸：72℃，1min，循环34次；最后在72℃下延伸10min，使产物延伸完全，之后再进行琼脂糖凝胶电泳分离核酸。

表1 Col-0 DNA样品的PCR扩增体系

试剂名称	体积(μl)
		Taq mix(2x)	7.5
IRM1-F(10μM)	0.5
		IRM1-R(10μM)	0.5
DNA模板	1
		灭菌水	5.5
总体积	15

表2 irm1突变体DNA样品的PCR扩增体系

琼脂糖凝胶电泳分离核酸的结果如图2所示。通过图2可以看出，在irm1(从左到右6个条带)突变体植株中使用引物(IRM1-F和IRM1-R)检测不到条带，而Col-0阳性对照检测到条带(Col组从左到右第7个条带)；在irm1突变体中，使用检测突变体引物(LB1.3和IRM1-R)能检测到条带(从右到左6个条带)，而阴性对照Col-0(irm1组从右到左第7个条带)是检测不到条带的，表明irm1基因型确实为突变体。

3.qRT-PCR鉴定植株IRM1基因的表达水平

利用天根公司植物总RNA提取试剂盒(DP432)提取irm1突变体RNA，再使用Takara公司的PrimeScript^TM RT reagent Kit(Perfect Real Time)反转录试剂盒进行反转录合成实时荧光PCR用的cDNA序列，然后用Takara公司的TB

Premix Ex Taq^TM(TliRNaseH Plus)试剂盒，通过TB Green嵌合荧光法进行实时荧光PCR。按表3所示组份配制PCR反应体系(冰上操作)：

表3实时荧光PCR反应体系

再使用BIO-RAD CFX96 PCR仪进行qPCR，qPCR扩增程序如表4所示。

表4 qPCR扩增程序

第一步：预变性	第二步：PCR反应	第三步：融解
			Reps：1	Reps：40	95℃，15s
95℃，30s	95℃，5s	60℃，60s
				60℃，30s	95℃，15s

扩增结束后，通过解析Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，对qPCR数据进行处理，并分析各组样品的基因表达水平，分析结果如图3所示。

通过图3可以看出，IRM1基因在imr1突变体植株中的表达水平显著低于Col-0拟南芥植株。

4.扫描电镜拍照

选取正常生长4周的Col-0拟南芥植株和irm1突变体拟南芥植株的第5片莲座叶，经固定并抽真空处理后通过扫描电镜样品制备系统(高真空镀膜机-EMACE600)临界点干燥，并进行喷金之后，使用高分辨扫描电镜(FEI APREO S)观察叶片下表皮中间部位的细胞。所得照片及细胞面积分析结果如图4和图5所示。

通过图4可以看出，在扫描电镜相同大小视野下，绘制细胞轮廓并统计细胞数量，测量细胞面积。统计数据表明，irm1突变体单个细胞平均面积略大于Col-0单个细胞平均面积，但没有显著性差异，表明叶片面积大小差异是IRM1通过影响细胞数量来调控的。

通过图5的扫描电镜的细胞面积统计结果中，irm1突变体叶片(三个重复组)细胞平均面积相对于Col-0(三个重复组)变大，但不显著。因此IRM1基因通过调控拟南芥细胞数量而非细胞大小控制莲座叶器官大小，发挥负调控细胞***和器官生长的作用。通过突变IRM1基因可以达到提高细胞数目和器官大小的目的。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳大学

<120> IRM1基因在抑制植物叶片生长中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1005

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

ataaaaataa aacaatatta tctctataat tagattctcc cattcttttt ctttaaataa 60

ctttgttctt cttctcttct tcctcccctt tactacacac ttcttctttt ttcttcagaa 120

agaaagaaag acagagagag agagagaaga tggtgttagg aaagcgtcat ggatcactga 180

tcaagagaac aactagcatg aagatgatca cactcgatac acccacgatc tatgacgcat 240

ctcagccgtc cgatcatcta acctttcatc aacaccctca caatccgatg gtggtgatgg 300

ctagtaacta cgatgatttc ttgaagactt gtagtctctg caatcgaagt ctctgccatc 360

atcgtgacat ttacatgtat aggtacgatt ttatttactt tttattttgt aaattttata 420

aacgtaatta acccttcaca caatttgaaa tgatatgttt tgatcatggt tgtatgctat 480

atagttttaa tgaatatttt tttgtatata ttgaatcgtt tttgtagagg gaacaacgca 540

ttttgtagct tagaatgcag ggagaagcaa attaagctgg acgagaaaaa agcgaaaacc 600

ggcttcgtaa catcgaagaa accaattcgt atttagttga tcatctatga tctaaaatga 660

taacgatagt ttttccttat gagtaaaatg aatatgtttt tgcgtttcgt gtacaagaat 720

gatgaaaatt aagagagaaa aatgagacta aatgagtgta gtgatcatat agtaatggga 780

cttcataagc atgatttgat ttgttcgtgt gatttgtttc tttgtgatgt gtaatatgta 840

atgtaatatc aatgttgatg tatattcagg tggtcttctt agttcttact acttgtcgta 900

acatataaag atatttagta aacgtactct gattttataa tatcagatgg accgtttctt 960

aaatggactt agaaaataga atttgtgata gtgatcagtt ctgag 1005

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 2

acgggggact ctagaggatc catggtgtta ggaaagcgtc atgg 44

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 3

gcccttgctc accatggtac caatacgaat tggtttcttc gatgtt 46

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 4

attttgccga tttcggaac 19