抑制OsHIS1基因表达的植物连锁表达载体及其构建方法和应用

文档序号：1138355 发布日期：2020-10-09 浏览：3次 >En<

阅读说明：本技术 抑制OsHIS1基因表达的植物连锁表达载体及其构建方法和应用 (Plant-linked expression vector for inhibiting OsHIS1 gene expression and construction method and application thereof ) 是由韶也赵炳然袁定阳彭彦余东吕启明毛毕刚柏连阳袁隆平于 2020-07-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抑制OsHIS1基因表达的植物连锁表达载体,其包括抑制OsHIS1基因表达的元件、育性恢复基因元件、花粉致死基因元件和荧光标记基因元件。还公开了该植物连锁表达载体的构建方法,其得到的植物连锁表达载体转化不育系后,可以通过β三酮类除草剂杀死色选漏检的含有转基因成分的繁殖系,转基因效果精准,除杂效率高。本发明还公开了该植物连锁表达载体在第三代杂交水稻制种或机械化混播混收制种中的应用,可以有效规避第三代杂交水稻制种或机械化混播混收制种使用不育系因色选漏检带来的杂交制种及获得的杂交种子转基因污染风险,操作简单、高效。(The invention discloses a plant-linked expression vector for inhibiting OsHIS1 gene expression, which comprises an element for inhibiting OsHIS1 gene expression, a fertility restorer gene element, a pollen lethal gene element and a fluorescent marker gene element. The obtained plant linked expression vector can kill a breeding line containing transgenic components which is missed in color selection by beta triketone herbicide after being transformed into a sterile line, and has accurate transgenic effect and high impurity removal efficiency. The invention also discloses application of the plant linkage expression vector in third generation hybrid rice seed production or mechanized mixed sowing mixed harvesting seed production, can effectively avoid hybrid seed production and obtained hybrid seed transgenic pollution risk brought by sterile line color selection omission in third generation hybrid rice seed production or mechanized mixed sowing mixed harvesting seed production, and is simple and efficient to operate.)

技术领域

本发明属于杂交水稻育种技术领域，尤其涉及一种抑制OsHIS1基因表达的植物连锁表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

我国水稻杂种优势利用技术的发展经历了三个时代。第一代杂交水稻是以细胞质(核质互作)雄性不育系为遗传工具的三系法杂交水稻，三系不育系育性稳定，但杂交配组受恢保关系局限。第二代杂交水稻是以光温敏核不育系为遗传工具的两系法杂交水稻，克服了父母本组配不自由的问题；但因不育系育性受外界光温条件影响存在制种失败的风险。第三代杂交水稻以普通核不育系(即遗传工程核不育系)作为遗传工具利用杂种优势，克服了第一代、第二代技术存在的技术瓶颈，兼具有不育系育性稳定、配组自由双重优点，是杂交水稻技术发展方向。

遗传工程核不育系的繁殖和分选是第三代杂交水稻的核心技术，现已实现了遗传工程不育系种子的批量繁殖和胚乳荧光分选技术(参见专利CN201210426678.7)。为了使不育系色选过程中万无一失的筛除含有转基因成分的繁殖系，也有相关专利在原有胚乳荧光标记的基础上引入了颖壳颜色这一双重保险，通过两次色选进一步提高不育系的纯度(参见专利CN201910699895.5，CN201910699890.2)。然而在实际色选过程中，由于色选机器存在一定的色选误差，这种方法仍然会在不育系中掺杂进含有转基因的繁殖系，这对不育系进一步杂交制种带来了转基因污染的风险。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种抑制OsHIS1基因表达的植物连锁表达载体及其构建方法和应用，通过构建抑制OsHIS1基因表达以及其他功能基因结合的植物连锁表达载体，结合色选技术和除草剂，可以提高第三代杂交水稻不育系及其杂交种子的纯度。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种抑制OsHIS1基因表达的植物连锁表达载体，其包括抑制OsHIS1基因表达的元件、育性恢复基因元件、花粉致死基因元件和荧光标记基因元件。

上述的连锁表达载体，优选的，所述抑制OsHIS1基因表达的元件包括CRISPRi沉默元件或RNAi沉默元件。CRISPRi(聚类的规则间隔的短回文重复序列干扰)是利用无活性的dCas9蛋白和可定制的单个向导RNA(sgRNA)共表达，dCas9与转录阻遏物结构域的偶联可以强有力地沉默多个目标内源基因的表达。

更优选的，所述CRISPRi沉默元件由所述植物除草剂抗性基因的CIRSPRi靶点双链通过酶切连接反应连入载体pHdzCas9-KRAB后得到，所述植物除草剂抗性基因的CIRSPRi靶点双链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

更优选的所述RNAi沉默元件由植物除草剂抗性基因的CDS序列和其反向互补序列以及Linker序列通过酶切连接反应一起连入载体pEGRNAi后得到，所述CDS序列和其反向互补序列之间由Linker序列隔开；所述CDS序列如SEQ ID NO.3所示，所述反向互补序列如SEQID NO.4所示，所述Linker序列如SEQ ID NO.5所示。

优选的，所述花粉致死基因元件包括如SEQ ID NO.7所示的Pg47启动子序列、如SEQ ID NO.1所示的ZMAA1基因cDNA序列和如SEQ ID NO.8所示的IN2-1终止子序列；所述荧光标记基因元件包括如SEQ ID NO.9所示的1tp启动子序列、如SEQ ID NO.2所示的DsRed基因cDNA序列和如SEQ ID NO.10所示的PINII终止子序列；所述育性恢复基因元件包括EAT1基因(Os04g0599300)、PTC1基因(Os09g0449000)、TDR基因、CYP704B2(Os02g0120500)基因(Os03g0168600)或PTB1基因(Os05g0145000)，其中，所述EAT1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，所述PTC1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述TDR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述CYP704B2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述PTB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

基于一个总的发明构思，本发明提供一种上述植物连锁表达载体的构建方法，包括如下步骤：首先，构建抑制OsHIS1基因表达的元件，然后将所述抑制OsHIS1基因表达的元件通过重组反应连入至少含有育性恢复基因元件、花粉致死基因元件、荧光标记基因元件的植物三元连锁表达载体中，即得到所述植物连锁表达载体。

上述的构建方法，优选的，所述抑制OsHIS1基因表达的元件包括CRISPRi沉默元件或RNAi沉默元件；

所述RNAi沉默元件的构建方法包括如下步骤：首先，分别扩增水稻OsHIS1中CDS序列和其反向互补序列以及Linker序列，然后将扩增产物通过酶切连接反应一起连入载体pEGRNAi中，所述CDS序列和其反向互补序列之间由Linker序列隔开，即得到所述RNAi沉默元件；

所述CRISPRi沉默元件的构建方法包括如下步骤：首先，将如SEQ ID NO.11和SEQID NO.12所示的两条核苷酸单链等量混合，经过变性、退火后形成具有粘性末端的CIRSPRi靶点双链，然后将所述CIRSPRi靶点双链用Bsa1酶通过酶切连接反应连入载体pHdzCas9-KRAB中，即得到所述CRISPRi沉默元件。

更优选的，扩增所述CDS序列的正反引物分别如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示，扩增所述反向互补序列的正反引物分别如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示，扩增所述Linker序列的正反引物分别如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示。

优选的，所述重组反应的反应过程如下：包含育性恢复基因、花粉致死基因和荧光标记基因的三元连锁表达载体400ng，***抑制植物除草剂抗性基因表达的元件120ng，5×CE II Buffer 4μl，Exnase II 2μl，加ddH₂O至20μl，然后37℃下反应30min。

基于一个总的发明构思，本发明还提供一种上述植物连锁表达载体在第三代杂交水稻制种或机械化混播混收制种中的应用。

上述的应用，优选的，包括如下步骤：

(1)将所述植物连锁表达载体转化入抗β三酮类除草剂的不育系中，获得对β三酮类除草剂敏感的繁殖系；

(2)使所述步骤(1)得到的繁殖系自交结实，其自交后代中包括含有转基因元件的繁殖系和不含转基因元件的不育系，经过色选机筛选，将发荧光的繁殖系种子与不发荧光的不育系种子分开；

(3)采用β三酮类除草剂对所述步骤(2)色选机筛选后的不育系种子进行除杂，去除色选漏检的含有四元转基因元件的繁殖系种子，经过除杂后得到的不育系种子进一步进行第三代杂交水稻制种或机械化混播混收制种。

优选的，所述步骤(1)中，所述植物连锁表达载体通过农杆菌介导转化入抗β三酮类除草剂的不育系中；所述步骤(2)中，所述自交后代中含有的转基因元件的繁殖系和不含所述转基因元件的不育系数量各占一半；所述步骤(3)中，采用β三酮类除草剂对色选机筛选得到的不育系种子进行除杂的方式具体包括：采用β三酮类除草剂对所述不育系种子进行包衣、在所述不育系种子浸种催芽过程中添加β三酮类除草剂或在所述不育系种子播种、种植后在田间喷施β三酮类除草剂。

优选的，所述β三酮类除草剂包括磺草酮(Sulcotrione)、硝磺草酮(Mesotrione)、双环磺草酮(benzobicylon)、环磺酮(tembotrione)和呋喃磺草酮(tefuryltrione)中的任意一种或几种。OsHIS1基因是水稻内源基因，它赋予水稻对β-三酮类除草剂抗性，该基因功能缺失后，并不会对水稻正常生长造成影响，但会使水稻对β-三酮类除草剂敏感。

本发明的技术方案是基于以下原理：将抑制OsHIS1基因表达的元件、育性恢复基因元件、花粉致死基因元件和荧光标记基因元件4个紧密连锁的基因元件转入不育系得到携带转基因的繁殖系杂合单株，携带转基因的杂合单株在自交结实过程中，携带转基因的花粉粒因花粉致死基因的作用使其败育而不能参与受精，而没有携带转基因的花粉粒与雌配子(携带转基因和未携带转基因的雌配子各一半)正常受精而结实，得到携带转基因的繁殖系和未携带转基因的不育系后代。由于携带转基因的繁殖系中还含有荧光标记基因，能够通过色选技术进行识别分选，将发荧光的繁殖系种子与不发荧光的不育系种子初步分开。然而，由于色选技术存在一定误差，色选后仍然会在不育系中掺杂进含有转基因的繁殖系，此时由于携带转基因的繁殖系中含有抑制OsHIS1基因表达的元件，使得繁殖系对β-三酮类除草剂敏感，通过采用β-三酮类除草剂喷施、浸种或进行包衣处理，可以高效去除掺杂进不育系中的转基因繁殖系，进而提高了不育系(雌、雄性不育父母本)及其杂交种子的纯度。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明开发了一个植物连锁表达载体，将抑制OsHIS1基因表达的元件与育性恢复基因、花粉致死基因和荧光标记基因形成植物连锁表达载体转化不育系后，抑制OsHIS1基因表达的元件可以有效抑制水稻OsHIS1基因的表达，使水稻对β-三酮类除草剂敏感，结合育性恢复基因、花粉致死基因和荧光标记基因的作用，可以通过β三酮类除草剂杀死色选漏检的含有转基因成分的繁殖系，转基因效果精准，除杂效率高。

2、本发明的应用方法，可以提高不育系(雌、雄性不育父母本)及其杂交种子的纯度，用于第三代杂交水稻制种或机械化混播混收制种，可有效规避因色选漏检带来的杂交制种转基因污染风险。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的植物连锁表达载体应用方法操作流程示意图；

图2是OsHIS1-RNAi沉默元件pEGRNAiPubi-H-OsHIS1的结构示意图；

图3是OsHIS1-CRISPRi沉默元件pHdzCas9-KRAB-OsHIS1的结构示意图；

图4是植物三元连锁表达载体pDsRed-PTC-ZMAA的结构示意图；

图5是四元连锁表达载体pDsRed-PTC-ZMAA-OsHisRNAi的结构示意图；

图6是四元连锁表达载体pDsRed-PTC-ZMAA-OsHisCRISPRi的结构示意图；

图7是植物三元连锁表达载体pDsRed-PTB-ZMAA的结构示意图；

图8是四元连锁表达载体pDsRed-PTB-ZMAA-OsHisRNAi的结构示意图；

图9是四元连锁表达载体pDsRed-PTB-ZMAA-OsHisCRISPRi的结构示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种抑制OsHIS1基因表达的植物连锁表达载体，其包括OsHIS1-RNAi沉默元件、育性恢复基因PTC1元件、花粉致死基因ZMAA1元件和荧光标记基因DsRed元件。

其构建方法包括如下步骤：

(1)设计引物扩增水稻OsHIS1(Os02g0280700)中CDS片段(如SEQ ID NO.3所示)、反向互补序列(如SEQ ID NO.4所示)与人工合成的Linker序列(如SEQ ID NO.5所示，北京擎科公司)，分别扩增以上三个片段；

a)扩增水稻OsHIS1中CDS片段的引物为(下划线引物为扩增SEQ ID NO.3的正反引物，下划线之前的序列为内切酶Bsa1(NEB公司)识别位点与接头)：

OsHIS1-RNAi-1F:Actag ggtctcGcacc GAGAGTTTTTCAACCAACCAATC(如SEQ IDNO.17所示)，

OsHIS1-RNAi-1R:Actag ggtctcTGCAG CTGAAAGATTCAGGATGGTCAGG(如SEQ IDNO.18所示)；

b)扩增反向互补序列的引物为(下划线引物为扩增SEQ ID NO.4的正反引物，下划线之前的序列为内切酶Bsa1(NEB公司)识别位点与接头)：

OsHIS1-RNAi-2F:Actag ggtctcGGCTT CTGAAAGATTCAGGATGGTCAGG(如SEQ IDNO.19所示)，

OsHIS1-RNAi-2R:Actag ggtctcTACCG GAGAGTTTTTCAACCAACCAATC(如SEQ IDNO.20所示)；

c)扩增Linker序列的引物为(下划线引物为扩增SEQ ID NO.5的正反引物，下划线之前的序列为内切酶Bsa1(NEB公司)识别位点与接头)：

Linker-F:Actag ggtctcGCTGCAGGTAAATTTCTAGTTTTTCTC(如SEQ ID NO.21所示)，

Linker-R:Actag ggtctcTAAGCTTCTGTAACTATCATCATCA(如SEQ ID NO.22所示)；

PCR反应体系为：2x PCRbuffer 25μl，2mM dNTPs 10μl，F-Primer：1.5μl，R-Primer：1.5μl，KOD FX：1μl，Template：1μl，加ddH₂O至50μl；

PCR反应程序：

(2)将扩增后得到的三个片段通过酶切-连接反应一起连入RNAi沉默载体pEGRNAi(武汉艾迪晶生物科技有限公司)，水稻OsHIS1的CDS片段和反向互补序列的之间由Linker序列隔开，构建成pEGRNAiPubi-H-OsHIS1(如图2)，即得到OsHIS1-RNAi沉默元件；

酶切-连接反应体系：10×CutSmart Buffer 1.5μl，10mMATP 1.5μl，空载质粒30ng，干扰片段30ng/每个片段，Bsa I-HF 10U，T4 DNAligase 35U，加H₂O至15μl；

(3)设计引物包含***载***置同源臂，以pEGRNAiPubi-H-OsHIS1载体质粒为模板，扩增OsHIS1-RNAi沉默元件，同时设计引物扩增植物三元连锁表达载体pDsRed-PTC-ZMAA(图4，由湖南杂交水稻研究中心袁定阳课题提供，CN110250000A，含有育性恢复基因PTC1元件、花粉致死基因ZMAA1元件、荧光标记基因DsRed元件)，其中，育性恢复基因PTC1的序列(如SEQ ID NO.13所示)元件包括PTC1自身启动子序列、编码区基因组序列和终止子序列；花粉致死基因ZMAA1元件包括Pg47启动子(如SEQ ID NO.7所示)、ZMAA1基因cDNA序列(如SEQ ID NO.1所示)和IN2-1终止子序列(如SEQ ID NO.8所示)；荧光标记基因DsRed元件包括1tp启动子序列(如SEQ ID NO.9所示)、DsRed基因cDNA序列(如SEQ ID NO.2所示)和PINII终止子序列(如SEQ ID NO.10所示)；

a)扩增OsHIS1-RNAi沉默元件引物(下划线部分为***载***置同源臂)：

正向引物：5'-ACCGAGCTCGAATTCGACCGGTGCAGCGTGACCCGGTC-3'(如SEQ ID NO.23所示)，

反向引物：5'-AGCTTGTCGATCGACAGATCATCTAGTAACATAGATGACACCGCG-3'(如SEQ IDNO.24所示)；

b)扩增线性化pDsRed-PTC-ZMAA载体引物(下划线部分与***序列两端同源)：

正向引物：5'-GATCTGTCGATCGACAAGCTCG-3'(如SEQ ID NO.25所示)，

反向引物：5'-CGGTCGAATTCGAGCTCGG-3'(如SEQ ID NO.26所示)；

分别扩增OsHIS1-RNAi沉默元件与线性化pDsRed-PTC-ZMAA载体，PCR反应体系为：2x PCR buffer 25μl，2mM dNTPs 10μl，F-Primer：1.5μl，R-Primer：1.5μl，KOD FX：1μl，Template：1μl，加ddH₂O至50μl；

PCR反应程序：

(4)利用同源重组方法(ClonExpress II One Step Cloning Kit，VazymeBiotech)将OsHis-RNAi沉默元件通过重组反应连入线性化的pDsRed-PTC-ZMAA中，构建成四元连锁表达载体pDsRed-PTC-ZMAA-OsHisRNAi(如图5)；

重组反应：线性化pDsRed-PTC-ZMAA载体400ng，***片段OsHis-RNAi沉默元件120ng，5×CE II Buffer 4μl，Exnase II 2μl，加ddH₂O至20μl，37℃ 30min。

实施例2：

一种抑制OsHIS1基因表达的植物连锁表达载体，其包括OsHIS1-CRISPRi沉默元件、育性恢复基因PTC1元件、花粉致死基因ZMAA1元件和荧光标记基因DsRed元件。

其构建方法包括如下步骤：

(1)设计水稻OsHIS1(Os02g0280700)基因CIRSPRi的靶点(北京擎科生物科技公司)：

ggcaATGGCTGACGAGTCATGGA(如SEQ ID NO.11所示)，

aaacTCCATGACTCGTCAGCCAT(如SEQ ID NO.12所示)；

(2)将步骤(1)中合成的互补配对的两条核苷酸单链等量混合后，经过90℃变性3min和20℃退火5min后形成具有粘性末端的靶点双链，用Bsa1酶切CRISPRi沉默载体pHdzCas9-KRAB(购于addgene公司后经水稻启动子改造，http://www.addgene.org/)，然后将靶点双链通过酶切连接反应连入pHdzCas9-KRAB载体，构建成pHdzCas9-KRAB-OsHIS1(如图3)，即得到OsHIS1-CRISPRi沉默元件；

酶切连接反应：10×CutSmart Buffer 1.5μl，10mM ATP 1.5μl，pHdzCas9-KRAB30ng，靶点双链30ng/每个片段，BsaI-HF 10U，T4 DNA ligase 35U，加H₂O至15μl；

(3)设计引物包含***载***置同源臂，以pHdzCas9-KRAB-OsHIS1载体质粒为模板，扩增OsHIS1-CRISPRi沉默元件，同时设计引物扩增植物三元连锁表达载体pDsRed-PTC-ZMAA(图4，由湖南杂交水稻研究中心袁定阳课题提供，CN110250000A，含有育性恢复基因PTC1元件、花粉致死基因ZMAA1元件、荧光标记基因DsRed元件)，其中，育性恢复基因PTC1的序列(如SEQ ID NO.13所示)元件包括PTC1自身启动子序列、编码区基因组序列和终止子序列；花粉致死基因ZMAA1元件包括Pg47启动子(如SEQ ID NO.7所示)、ZMAA1基因cDNA序列(如SEQ ID NO.1所示)和IN2-1终止子序列(如SEQ ID NO.8所示)；荧光标记基因DsRed元件包括1tp启动子序列(如SEQ ID NO.9所示)、DsRed基因cDNA序列(如SEQ ID NO.2所示)和PINII终止子序列(如SEQ ID NO.10所示)；

a)扩增OsHIS1-CRISPRi沉默元件引物(下划线部分为***载***置同源臂)：

正向引物：5'-ACCGAGCTCGAATTCGACCGCCTGCAGGTCAACATGGTGG-3'(如SEQ IDNO.27所示)，

反向引物：5'-AGCTTGTCGATCGACAGATCAGCACCGACTCGGTGCCA-3'(如SEQ ID NO.28所示)；

b)扩增线性化pDsRed-PTC-ZMAA载体引物(下划线部分与***序列两端同源)：

正向引物：5'-GATCTGTCGATCGACAAGCTCG-3'(如SEQ ID NO.29所示)，

反向引物：5'-CGGTCGAATTCGAGCTCGG-3'(如SEQ ID NO.30所示)；

分别扩增OsHIS1-CIRPSRi沉默元件与线性化pDsRed-PTC-ZMAA载体，PCR反应体系为：2x PCRbuffer 25μl，2mM dNTPs 10μl，F-Primer：1.5μl，R-Primer：1.5μl，KOD FX：1μl，Template：1μl，加ddH₂O至50μl；

PCR反应程序：

(4)利用同源重组方法(ClonExpress II One Step Cloning Kit，VazymeBiotech)将OsHis-CRISPRi沉默元件通过重组反应连入线性化的pDsRed-PTC-ZMAA中，构建成四元连锁表达载体pDsRed-PTC-ZMAA-OsHisCRISPRi(如图6)；

重组反应：线性化pDsRed-PTC-ZMAA载体400ng，***片段OsHis-CRISPRi沉默元件240ng，5×CE II Buffer 4μl，Exnase II 2μl，加ddH₂O至20μl，37℃30min。

实施例3：

一种抑制OsHIS1基因表达的植物连锁表达载体，其包括OsHIS1-RNAi沉默元件、育性恢复基因PTB1元件、花粉致死基因ZMAA1元件和荧光标记基因DsRed元件。