阅读说明：本技术 一种多重甲基化特异性pcr引物设计方法及系统 (Design method and system of multiple methylation specific PCR primers ) 是由 易吉 李泽卿 于 2020-05-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种多重甲基化特异性PCR引物设计方法及系统,本发明实施步骤包括根据用户需求设置参数,对目标甲基化位点进行引物设计及筛选,然后对筛选出的多个甲基化位点引物对两两进行配对并检查兼容性,选择数量最大的可兼容的多重引物组合,最后对设计完成的多重引物组合进行评价,并决定是否需要重新设计引物。本发明能实现超长长度序列的多重甲基化特异性PCR引物设计,能有效减少单对引物内部之间和多对引物之间dimer/hairpin等二级结构的出现以及在基因组中的非特异性扩增,设计出的引物特异性强,提高了多重甲基化特异性PCR实验测试过程的可操作性和准确度,同时大大提高了工作效率。(The invention discloses a design method and a system of a multiple methylation specific PCR primer, which comprises the implementation steps of setting parameters according to user requirements, carrying out primer design and screening on a target methylation site, pairing a plurality of screened methylation site primer pairs pairwise and checking compatibility, selecting the compatible multiple primer combination with the largest number, evaluating the designed multiple primer combination, and determining whether the primer needs to be redesigned. The invention can realize the design of the multiple methylation specific PCR primers of the super-long sequence, can effectively reduce the occurrence of secondary structures such as dimer/hairpin and the like between the interiors of single pair of primers and between multiple pairs of primers and the non-specific amplification in a genome, has strong specificity of the designed primers, improves the operability and the accuracy of the multiple methylation specific PCR experiment testing process, and simultaneously greatly improves the working efficiency.)

一种多重甲基化特异性PCR引物设计方法及系统

技术领域

本发明涉及DNA甲基化检测领域，尤其涉及一种多重甲基化特异性PCR引物设计方法及系统。

背景技术

人类表型与人类基因组突变的关系自人类基因组计划等研究开展以来逐步变得清晰。在2015年约有8800万个突变(8470万个单核苷酸突变、360万个短片段***或缺失)以及6个结构变异已经被鉴别。2001年人类医学遗传学在线数据库中(OMIM^TM)已经有13005个条目是关于人类基因组突变与人类疾病的相关研究结果。人类基因组突变已经逐渐应用于人类生活中，例如药物指导、药物耐药性检测、产前检测以及肿瘤检测等领域。

表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传包括有DNA甲基化(DNA methylation)、基因组印记(genomic imprinting)、基因沉默(gene silencing)、核仁显性、休眠转座子激活和RNA编辑(RNA editing)等。研究表明，表观遗传学生物学标记也可以作为疾病的指标，提示疾病风险或人体的健康状态。DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA甲基化标记已经广泛应用于医学及健康领域。卢煜明等人利用胎儿染色体21上的某些CpG岛显示与位于母体染色体21上相应CpG岛不同的甲基化模式，在胎儿出生前提前检测胎儿是否患有21号染色体三体综合征(先天愚型)(CN101535502A)。此外，Septin9基因甲基化检测已经被认定为肠癌筛查的金标准(CN201810326484.7，CN108048570A，CN105861672A，CN201610948298.8，CN201710285809.7)。随着人类以及其他生物的全基因组甲基化测序以及全基因组甲基化图谱的广泛开展，越来越多甲基化位点被鉴别为临床或生物学表型特异性位点。癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)计划已经完成了约11000多个样本、30多种癌症的全基因组甲基化图谱，每种癌症都存在大量临床意义的甲基化位点可以用来指导肿瘤的检测以及预防。

甲基化位点的检测方法包括全基因组测序、全基因组甲基化图谱、多基因甲基化捕获测序、荧光定量PCR、甲基化特异性PCR以及甲基化扩增产物测序等。但是，全基因组测序、全基因组甲基化图谱、多基因甲基化捕获测序方法是针对超过1000个以上甲基化位点的检测；而荧光定量PCR、甲基化特异性PCR以及甲基化扩增产物测序等方法是针对于1～2个目标甲基化位点进行检测，目前的DNA甲基化特异性PCR引物设计软件MethPrimer、Methyl Primer Express工具都是针对单位点进行引物设计的。因此，目前多个甲基化位点的检测需要针对多个目标片段设计大量引物，经过多次实验反复筛选才有可能实现，工作量大，耗时长。多重甲基化特异性PCR不但能减少实验量、提高工作效率，还能降低样本量需求，提高技术可行性。然而，由于基因组DNA通过亚硫酸盐转换后，未甲基化C转换为T，基因组复杂性降低，导致引物复杂性降低，引物二聚体、二级结构以及非特异性扩增增加，更加增加了多重甲基化特异性PCR引物设计的难度，并且常规的普通多重PCR引物设计软件无法适用于多重甲基化特异性PCR引物设计。目前，缺乏一种能够针对多个甲基化位点，设计多重PCR引物，并保障单对引物内部之间以及多对引物之间的无dimer/hairpin等二级结构、在基因组中特异性扩增的系统和方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种多重甲基化特异性PCR引物设计方法及系统，能有效地减少单对引物内部之间以及多对引物之间的dimer/hairpin等二级结构，减少单对引物内部之间以及多对引物之间在染色体中的非特异性扩增，降低了多重甲基化特异性PCR实验测试过程中的强度和难度，提高工作效率，以达到高效准确检测多个甲基化位点的目的。

本发明的技术方案是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种多重甲基化特异性PCR引物设计方法，包括如下步骤：

S000-参数配置，对参数局进行设置，生成引物设计环境；

S100-引物设计及筛选，对目标甲基化位点进行引物设计，并对设计后引物进行筛选；

S200-多重引物组合计算，对多个引物中引物对两两进行配对，检查两两引物对之间兼容性，选择数量最大的可兼容的多重引物组合；

S300-引物评价及重设计，对设计完成的多重引物组合进行评价，并决定是否需要重新设计引物。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述步骤S000包括如下步骤：

S001、获取目标位点信息，并创建目标位点；

S002、获取并建立引物需求参数信息，将引物需求参数信息绑定到目标位点中；

S003、获取参考序列，并将参考序列进行CT转换后绑定到目标位点上；

S004、获取用户定义的屏蔽位点；

S005、获取用户定义的屏蔽区域；

S006、根据所述步骤S001-S005所获取的参数内容，生成引物设计环境，包括位点序列、局部环境参数以及全局环境参数，并将各环境参数传递至所述步骤S100。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述步骤S100包括如下步骤：

S101-引物设计，从所述步骤S000中接收引物设计环境，设计生成相应引物；

S102-CG位点筛选，将接收自步骤S101的引物进行是否含有CG位点以及末端C位点的检查，并将不合格引物删除；

S103-Dimer筛选，对存在Dimer结构的引物进行筛选；

S104-Hairpin筛选，对存在Hairpin结构的引物进行筛选；

S105-屏蔽位点筛选，对末端位于用户定义的屏蔽位点的引物进行筛选；

S106-屏蔽区域筛选，对末端位于用户定义的屏蔽区域的引物进行筛选；

S107-引物内部非特异性筛选，对引物内部可能在参考序列中扩增出多个非特异性区域的引物进行筛选，并将合格引物以及单条引物在参考序列中的潜在结合位点信息传递至所述步骤S200。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述步骤S200包括如下步骤：

S201-单引物对特异性评估，对通过步骤S100筛选出的合格引物及其在参考序列中的潜在结合位点进行计算，评估每对引物的特异性，筛选出最高特异性引物对(Seedprimer pair)，并将除该引物对相应位点外的其他位点的所有引物归于第一其他引物集合列表并传递给步骤S202；

S202-双引物对间Dimer评估，将从步骤S201获取的第一其他引物集合列表中的引物逐一与步骤S201生成的最高特异性引物对间进行Dimer评估，筛选出无Dimer结构的引物对，得到第二其他引物集合列表并传递给步骤S203；

S203-双引物对间非特异性评估，将从步骤S202获取的第二其他引物集合列表中的引物逐一与步骤S201生成的最高特异性引物对间进行非特异性评估，筛选出与最高特异性引物对在参考序列中无非特异性扩增的引物对，得到第三其他引物集合列表并传递给步骤S204；

S204-多重引物兼容性评估，如果第三其他引物集合列表中引物对对应位点数大于1，则继续将第三其他引物集合列表发送至步骤S201进行循环操作；如果第三其他引物集合列表中引物对对应位点数等于1，则将第三其他引物集合列表发送至步骤S201进行最高特异性引物对筛选，并将所有循环的最高特异性引物对整合成能够兼容的多重引物对组合，发送至步骤S300；如果第三其他引物集合列表引物对对应位点数等于0，则直接将所有循环的最高特异性引物对整合成能够兼容的多重引物对组合，发送至所述步骤S300。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述步骤S300中，对所述步骤S200传递的可兼容的多重引物组合进行评价，如果引物对数目过少或未包含必要位点，则对位点、引物参数进行修改，然后传递至步骤S000重新设计；如果多重引物组合符合要求，但尚有部分目标位点未包含在内，则将未包含的目标位点重新输入步骤S000，对这些位点重新设计引物，形成新的一套多重引物组合。

第二方面，本发明提供了一种计算机设备，所述计算机设备被编程以执行本发明第一方面所述的多重甲基化特异性PCR引物设计方法的步骤；或者所述计算机设备的存储介质中存储有被编程以执行本发明第一方面所述多重甲基化特异性PCR引物设计方法的计算机程序。

第三方面，本发明提供了一种计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质中存储有被编程以执行本发明第一方面所述的甲基化特异性PCR引物设计方法的计算机程序。

第四方面，本发明提供了一种多重甲基化特异性PCR引物设计系统，包括参考序列CT转换及参数设置模块、引物设计及筛选模块、多重引物组合模块和报告模块，具体如下：

参考序列CT转换及参数设置模块，用于将参考序列进行C->T转换，并根据用户需求设置目标位点、引物长度等参数，生成引物设计环境；

引物设计及筛选模块，用于对目标位点进行引物设计，并根据用户需求筛选合格引物；

多重引物组合模块，用于对多个甲基化位点的引物进行统一考察，筛选出在基因组中无非特异性扩增、无二级结构的多重引物组；

报告模块，用于对所有执行过程进行记录及监测，根据用户需求生成过程执行报告文件，包括引物设计报告、筛选报告和多重组合报告等等，为用户进一步筛选引物以及更改参数提供帮助及支持。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述参考序列CT转换及参数设置模块包括参考序列CT转换子模块、参数设置子模块和环境生成子模块，具体如下：

参考序列CT转换子模块，用于对参考序列进行C->T的转换，对于基因组未甲基化的C会被转换为T，而甲基化的C保持不变，并且由于基因组存在正负两条链，因而需要对参考序列正链进行非CpG位点C->T转换，对参考序列负链进行非CpG位点C->T转换后再进行反向互补；

参数设置子模块，用于对引物设计及筛选过程的参数进行提前设置，所述参数包括目标位点名称和在参考序列上的位置、引物设计长度、引物的生成数量、GC含量、退火温度及引物筛选中应当跳过的区域及位点；

环境生成子模块，用于根据设置参数生成引物设计所需要的目标区域序列以及参数格式，生成该引物设计环境后，即可传入所述引物设计及筛选模块。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述引物设计及筛选模块包括引物设计、CG位点筛选、Dimer筛选、Hairpin筛选、屏蔽位点筛选，屏蔽区域筛选以及引物对内部非特异性筛选等子模块，具体如下：

引物设计子模块，用于根据所述参考序列CT转换及参数设置模块传入的引物设计环境进行引物设计；

CG位点筛选子模块，用于对设计后引物中是否含有可能造成扩增不平衡的CG位点进行评估，并去除可能存在扩增不平衡的引物对；

Dimer筛选子模块，用于对设计后引物中是否含有可能造成扩增效率低以及出现无效引物二聚体情况的Dimer二级结构进行评估，并去除可能存在扩增效率低或出现无效引物二聚体情况的引物对；

Hairpin筛选子模块，用于对设计后引物中是否含有可能造成扩增效率低的Hairpin二级结构进行评估，并去除可能存在扩增效率低的引物对；

屏蔽位点筛选子模块，用于对设计后引物中是否含有用户定义的屏蔽位点进行评估，并去除含有用户定义的屏蔽位点的引物对；

屏蔽区域筛选子模块，用于对设计后引物中是否含有用户定义的屏蔽区域进行评估，并去除含有用户定义的屏蔽区域的引物对；

引物对内部非特异筛选子模块，用于对设计后引物中是否能在转换后参考序列中扩增出多个区域(即非特异性扩增)进行评估，并去除可能含有非特异性扩增特征的引物对。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述多重引物组合模块包括单引物对特异性评估、双引物对间Dimer评估、双引物对间非特异评估以及多引物兼容性评估子模块，具体如下：

单引物对特异性评估子模块，用于对单引物对所包含的正反向两条引物在参考序列中的结合位点进行评估，并给出评估值；

双引物对Dimer评估子模块，用于对两个引物对间是否存在可能造成扩增效率低以及出现无效引物二聚体情况的Dimer二级结构进行评估，并记录两个引物对间的兼容情况；

双引物对非特异评估子模块，用于对两个引物对间是否在转换后参考序列中扩增出多个区域(即非特异性扩增)进行评估，并记录两个引物对间的兼容情况；

多引物兼容性评估子模块，用于根据所述单引物对特异性评估子模块给出的评估值由小到大，使用所述双引物对Dimer评估子模块和所述双引物对非特异评估子模块对引物间的兼容情况进行评估，并且运用最短距离法等统计学方法计算出目标位点中数量最大的可兼容的多重引物组合。

本发明的多重甲基化位点扩增引物设计方法及系统相对于现有技术具有以下有益效果：

(1)本发明通过对参考序列进行定义以及进行甲基化位点检测所必须的甲基化CT转换，提供了一种新的甲基化特异性PCR引物设计思路，使基于超长长度的参考序列(>1Mb)的甲基化引物设计成为可能；

(2)本发明包含的CG位点筛选子模块，能够避免引物中存在甲基化转换状态无法确定的位点，从而避免引物出现差异性扩增的问题，使引物不受参考序列上甲基化状态的影响，全面特异地扩增出目标位点；

(3)本发明包含的Dimer筛选子模块、Hairpin筛选子模块能够避免引物对内部出现二级结构，保证了合格引物的扩增效率，减少实验验证过程中出现的二聚体以及引物效率降低的问题；

(4)由于PCR扩增的复杂性，参考基因组部分区域和位点可能会影响用户的分子实验扩增或后续步骤例如测序建库等效果，本发明提供的屏蔽位点筛选子模块与屏蔽区域筛选子模块，使用户设计引物便利性增加，提供给用户更多可操作性；

(5)本发明系统提供在全参考序列上引物对内部非特异性筛选功能，目前尚未有任何甲基化软件能够实现本功能，该功能能够在根本上防止引物在实验过程中的非特异性，将引物验证的实验工作量减少90％，能极大提高工作效率；

(6)本发明提供一种多引物兼容性评估方法，运用优选引物法以及多引物对之间的Dimer和非特异性评估法，模拟实际分子生物学实验过程中多引物对的反应过程，减少多引物对之间的二级结构以及在参考序列中的非特异性扩增，减少实际分子生物学实验中的异常扩增，提高实验过程中的扩增效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的多重甲基化特异性PCR引物设计系统的结构框图。

图2为本发明的多重甲基化特异性PCR引物设计系统工作方法的流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

本实施例提供了一种多重甲基化特异性PCR引物设计系统，如图1所示，该系统包括参考序列CT转换及参数设置模块、引物设计及筛选模块、多重引物组合模块和报告模块这四大模块。

一、参考序列CT转换及参数设置模块，用于将参考序列进行C->T转换，并根据用户需求设置目标位点、引物长度等参数，生成引物设计环境。其具体可以包括以下3个子模块：

(1)参考序列CT转换子模块，即对参考序列进行C->T的转换，对于基因组未甲基化的胞嘧啶会被转换为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，并且由于基因组存在正负两条链，因而需要对参考序列正链进行非CpG位点C->T转换，对参考序列负链进行非CpG位点C->T转换后再进行反向互补；

(2)参数设置子模块，即对引物设计及筛选过程的参数进行提前设置，所述参数包括目标位点名称和在参考序列上的位置、引物设计长度、引物的生成数量、GC含量、退火温度及引物筛选中应当跳过的区域及位点；

(3)环境生成子模块，即根据CT转换后的参考序列和预设参数生成引物设计所需要的目标区域序列以及参数格式，即可将该引物设计环境传入引物设计及筛选模块。

应当理解的是，以上所述引物设计及筛选过程的参数中引物筛选时应当跳过的区域和位点是用户考虑到PCR扩增的复杂性而自定义的引物筛选过程中需要屏蔽的区域和位点，以免设计的引物影响PCR扩增效果或后续测序建库等实验。

二、引物设计及筛选模块，用于对目标位点进行引物设计，并根据用户需求筛选合格引物。其具体可以包括以下7个子模块：

(1)引物设计子模块，即根据环境生成子模块传入的引物设计环境进行引物设计；

(2)CG位点筛选子模块，即对设计后引物中是否含有可能造成扩增不平衡的CG位点进行评估，并去除可能存在扩增不平衡的引物对；

(3)Dimer筛选子模块，即对设计后引物中是否含有可能造成扩增效率低以及出现无效引物二聚体情况的Dimer二级结构进行评估，并去除可能存在扩增效率低或出现无效引物二聚体情况的引物对；

(4)Hairpin筛选子模块，用于对设计后引物中是否含有可能造成扩增效率低的Hairpin二级结构进行评估，并去除可能存在扩增效率低的引物对；

(5)屏蔽位点筛选子模块，用于对设计后引物中是否含有用户定义的屏蔽位点进行评估，并去除含有用户定义的屏蔽位点的引物对；

(6)屏蔽区域筛选子模块，用于对设计后引物中是否含有用户定义的屏蔽区域进行评估，并去除含有用户定义的屏蔽区域的引物对；

(7)引物对内部非特异筛选子模块，用于对设计后引物中是否能在转换后参考序列中扩增出多个区域(即非特异性扩增)进行评估，并去除可能含有非特异性扩增特征的引物对。

应当理解的是，合格引物是通过CG位点筛选、Dimer筛选、Hairpin筛选、屏蔽位点筛选、屏蔽区域筛选以及引物对内部非特异筛选这六重筛选条件逐一筛选后得到的，其中Dimer子模块、Hairpin筛选子模块、屏蔽位点筛选子模块和屏蔽区域筛选子模块可替换为其他可选择模块，也可以根据用户实际需求在屏蔽区域筛选子模块后添加更多条件筛选子模块。

三、多重引物组合模块，用于对多个甲基化位点的引物进行统一考察，筛选出在基因组中无非特异性扩增、无二级结构的多重引物组。其具体可以包括以下4个子模块：

(1)单引物对特异性评估子模块，用于对各单引物对所包含的正反向两条引物在参考序列中的结合位点分别进行评估，并给出评估值；

(2)双引物对Dimer评估子模块，用于对两个引物对间是否存在可能造成扩增效率低以及出现无效引物二聚体情况的Dimer二级结构进行评估，并记录两个引物对间的兼容情况；

(3)双引物对非特异评估子模块，用于对两个引物对间是否在转换后参考序列中扩增出多个区域(即非特异性扩增)进行评估，并记录两个引物对间的兼容情况；

(4)多引物兼容性评估子模块，用于根据所述单引物对特异性评估子模块给出的评估值由小到大，使用所述双引物对Dimer评估子模块和所述双引物对非特异评估子模块对引物间的兼容情况进行评估，并且运用最短距离法等统计学方法计算出目标位点中数量最大的可兼容的多重引物组合。

四、报告模块，用于对所有执行过程进行记录及监测，根据用户需求生成过程执行报告文件，为用户进一步筛选引物以及更改参数提供帮助及支持。

应当理解的是，所述过程执行报告文件包括引物设计及筛选过程中各个环节形成的文字、图形或列表报告，具体包括：执行环境生成子模块所生成的环境参数具体列表；执行引物设计子模块所生成的引物设计报告，其中包含引物设计失败原因；执行各个筛选子模块所生成的引物筛选报告，记录筛选结果详情；执行多引物兼容性评估子模块所生成的多引物对兼容性报告；以及所有执行过程的进度监测情况。

此外，需要说明的是，以上所描述的系统实施例仅仅是示意性的，并不对本发明的保护范围构成限定，在实际应用中，本领域的技术人员可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的，此处不做限制。

基于本发明实施例提供的系统实现多重甲基化特异性PCR引物设计，结合图2，图2为所述引物设计系统工作方法的流程图。

本实施例中，多重甲基化特异性PCR引物设计方法，包括如下步骤：

S000-参数配置，对参数局进行设置，生成引物设计环境；

S100-引物设计及筛选，对目标甲基化位点进行引物设计，并对设计后引物进行筛选；

S200-多重引物组合计算，对多个引物中引物对两两进行配对，检查两两引物对之间兼容性，选择数量最大的可兼容的多重引物组合；

S300-引物评价及重设计，对设计完成的多重引物组合进行评价，并决定是否需要重新设计引物。

进一步地，所述步骤S000包括如下步骤：

S001、获取目标位点信息，并创建目标位点；

S002、获取并建立引物需求参数信息，将引物需求参数信息绑定到目标位点中；

S003、获取参考序列，并将参考序列进行CT转换后绑定到目标位点上；

S004、获取用户定义的屏蔽位点；

S005、获取用户定义的屏蔽区域；

S006、根据所述步骤S001-S005所获取的参数内容，生成引物设计环境，包括位点序列、局部环境参数以及全局环境参数，并将各环境参数传递至所述步骤S100。

应当理解的是，执行参考序列CT转换子模块可以实现所述步骤S003的过程，执行参数设置子模块可以实现步骤S001、S002、S004和S005的过程，执行环境生成子模块可以实现步骤S006的过程。

进一步地，所述步骤S100包括如下步骤：

S101-引物设计，通过执行引物设计子模块，从所述步骤S000中接收引物设计环境，使用Primer3.0软件进行引物设计生成；

S102-CG位点筛选，通过执行CG位点筛选子模块，将接收自步骤S101的引物进行是否含有CG位点以及末端C位点的检查，并将不合格引物删除；

S103-Dimer筛选，通过执行Dimer筛选子模块，对存在Dimer结构的引物进行筛选、剔除；

S104-Hairpin筛选，通过执行Hairpin筛选子模块，对存在Hairpin结构的引物进行筛选、剔除；

S105-屏蔽位点筛选，通过执行屏蔽位点筛选子模块，对末端位于用户定义的屏蔽位点的引物进行筛选、剔除；

S106-屏蔽区域筛选，通过执行屏蔽区域筛选子模块，对末端位于用户定义的屏蔽区域的引物进行筛选、剔除；

S107-引物内部非特异性筛选，通过执行引物对内部非特异筛选子模块，对引物内部可能在参考序列中扩增出多个非特异性区域的引物进行筛选、剔除，将最后得到的合格引物以及单条引物在参考序列中的潜在结合位点信息传递至所述步骤S200。

进一步地，所述步骤S200包括如下步骤：

S201-单引物对特异性评估，通过执行单引物对特异性评估子模块，对通过步骤S100筛选出的合格引物及其在参考序列中的潜在结合位点进行计算，评估每对引物的特异性，筛选出最高特异性引物对(Seed primer pair)，并将除该引物对相应位点外的其他位点的所有引物归于第一其他引物集合列表并传递给步骤S202；

S202-双引物对间Dimer评估，通过执行双引物对Dimer评估子模块，将从步骤S201获取的第一其他引物集合列表中的引物逐一与步骤S201生成的最高特异性引物对间进行Dimer评估，筛选出无Dimer结构的引物对，得到第二其他引物集合列表并传递给步骤S203；

S203-双引物对间非特异性评估，通过执行双引物对非特异评估子模块，将从步骤S202获取的第二其他引物集合列表中的引物逐一与步骤S201生成的最高特异性引物对间进行非特异性评估，筛选出与最高特异性引物对在参考序列中无非特异性扩增的引物对，得到第三其他引物集合列表并传递给步骤S204；

S204-多重引物兼容性评估，如果第三其他引物集合列表中引物对对应位点数大于1，则继续将第三其他引物集合列表发送至步骤S201进行循环操作；如果第三其他引物集合列表中引物对对应位点数等于1，则将第三其他引物集合列表发送至步骤S201进行最高特异性引物对筛选，并将所有循环的最高特异性引物对整合成能够兼容的多重引物对组合，发送至步骤S300；如果第三其他引物集合列表引物对对应位点数等于0，则直接将所有循环的最高特异性引物对整合成能够兼容的多重引物对组合，发送至所述步骤S300。

应当理解的是，所述最高特异性引物对是针对某一个目标甲基化位点所在区域的特异性结合能力最强的唯一一对引物。

进一步地，所述步骤S300中，对所述步骤S200传递的可兼容的多重引物组合进行评价，如果引物对数目过少或未包含必要位点，则对位点、引物参数进行修改调整，然后传递至步骤S000重新设计；如果多重引物组合符合筛选要求，但尚有部分目标位点未包含在内，则将未包含的目标位点重新输入步骤S000，对这些位点重新设计引物，形成新的一套多重引物组合；如果多重引物组合符合筛选要求，且包含所有目标位点，即满足用户所有需求，则多重甲基化特异性PCR引物设计过程结束。

本实施例还提供了一种计算机设备，所述计算机设备被编程以执行本实施例上述的多重甲基化特异性PCR引物设计方法的步骤；或者所述计算机设备的存储介质中存储有被编程以执行本实施例上述的多重甲基化特异性PCR引物设计方法的计算机程序。

本实施例还提供了一种计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质中存储有被编程以执行本实施例上述的甲基化特异性PCR引物设计方法的计算机程序。

本发明实施例提出的多重甲基化特异性PCR引物设计方法及系统，能实现超长长度序列的甲基化特异性引物设计，并有效地减少单对引物内部之间以及多对引物之间的dimer/hairpin等二级结构，减少单对引物内部之间以及多对引物之间在基因组中的非特异性扩增，降低了多重甲基化特异性PCR实验测试过程中的强度和难度，大大提高了工作效率，以达到高效准确地检测多个甲基化位点的目的。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。