具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

需要说明的是，如果不冲突，本发明实施例中的各个特征可以相互组合，均在本发明的保护范围之内。另外，虽然在装置示意图中进行了功能模块的划分，在流程图中示出了逻辑顺序，但是在某些情况下，可以以不同于装置示意图中的模块划分，或流程图中的顺序执行所示出或描述的步骤。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

适用于无机磷测定的方法有磷钼酸还原法/非还原法、原子吸收分光光度法、酶法、染料结合法流动注射分析法和同位素稀释质谱法等。

磷钼酸还原法是以三氯醋酸沉淀血清样本中的蛋白质，再在无蛋白的血清滤液中加入钼酸铵试剂，钼酸铵与检测样本中的无机磷结合生成磷钼酸；再以硫酸亚铁为还原剂，将磷钼酸还原成蓝色化合物，并进行比色测定。不去除血清样本中的蛋白质时，需在试剂中加入非离子型表面活性剂以避免混浊。磷钼酸非还原法则不需要使用还原剂，在340nm或325nm波长直接测定无机磷与钼酸铵作用形成的复合物。磷钼酸还原法需要除去检测样本中的蛋白质或添加表面活性剂，操作步骤繁琐，误差大。磷钼酸非还原法虽然显色稳定且操作简便，但易受到脂血、黄疸和溶血等干扰因素的影响，导致检测结果不准确。

酶法检测试剂盒主要组成成分中包含酶原料，而酶原料本身易失活，存在试剂盒易失效等问题；且检测结果容易受到检测样本中其他物质的干扰。例如，以嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和黄嘌呤氧化酶(XOD)偶联，并使用过氧化物酶(POD)作为指标的无机磷检测试剂盒，检测结果容易受到胆红素和尿酸等还原性物质的干扰。且目前血清磷主要采用各种大型全自动生化分析仪进行检测，存在设备价格高、操作复杂、配套设施要求高、检测等待时间长等缺点。

基于此，本发明实施例提供一种无机磷测定试剂球，将无机磷检测试剂制备为可放置于微流控芯片内的冻干试剂球，不需依赖大型全自动生化分析仪，可实现在病人身边快速诊断，具有测试时间短、操作简便等优点。同时，可以有效解决抗坏血酸、胆红素、血红蛋白、甘油三酯、尿酸和肌酐对无机磷检测结果的影响。为了便于读者理解本发明，下面结合具体的实施例进行说明。

本发明实施例提供一种无机磷检测试剂，该无机磷检测试剂包括第一试剂球和第二试剂球，其中，第一试剂球由第一试剂制备而成，第二试剂球由第二试剂制备而成。

第一试剂包括以下组分：

所述第二试剂包括以下组分：

其中，缓冲液是指由弱酸及其盐、弱碱及其盐组成的混合溶液，能够维持反应体系PH值的相对稳定。本发明实施例中的缓冲液包括第一缓冲液和第二缓冲液，第一缓冲液或第二缓冲液包括二(2—羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)缓冲液、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(ACES)缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)缓冲液、2-(二乙醇氨基)乙磺酸(BES)缓冲液和4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液中的一种。PIPES缓冲液、MOPSO缓冲液和HEPES缓冲液为两性离子(Good’s)缓冲液。Good’s缓冲液具有很好的PH稳定性及高度极性，对多种化学试剂和酶为惰性，不参加且不干扰生物化学反应过程。其中，HEPES缓冲液的主要成分是4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸，PH缓冲范围是6.8-8.2，在PH7.2-7.4范围内具有较好的缓冲能力，能较长时间控制恒定的PH范围。本实施例中，当第一缓冲液和/或第二缓冲液的浓度达到20-100mmol/L时缓冲能力较好。

赋形剂能够赋予无机磷检测试剂良好的外观，使无机磷检测试剂疏松多孔，易于复溶。赋形剂主要包括多元醇类、糖类、氨基酸类、无机盐类以及蛋白质和肽类赋形剂。多元醇类赋形剂包括甘油、山梨醇、甘露醇、肌醇、侧金盏花醇、乙二醇和聚乙二醇等。糖类赋形剂包括单糖类赋形剂、二糖类赋形剂和多糖类赋形剂；其中，单糖类赋形剂包括葡萄糖；二糖类赋形剂包括蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖等；多糖类赋形剂包括水溶性淀粉、麦芽糊精和葡聚糖等，葡聚糖可以是葡聚糖1万、葡聚糖2万、葡聚糖4万或葡聚糖7万中的一种或多种。氨基酸类赋形剂包括：谷氨酸钠、脯氨酸、赖氨酸和丙氨酸等；无机盐类赋形剂包括：碳酸钙、硫酸锰、胆酸钠和乙酸钠等；蛋白质和肽类赋形剂包括粘多糖蛋白、酪蛋白或牛血清蛋白等。本发明实施例中的赋形剂包括第一赋形剂和第二赋形剂，且第一赋形剂和第二赋形剂为任意合适的赋形剂。

进一步地，在一些实施例中，为了赋予第一试剂球更好的外观和复溶性，本发明实施例中的第一赋形剂或第二赋形剂为甘露醇、海藻糖、葡聚糖四万或葡聚糖一万中的至少一种。

本发明实施例中的氧化型辅酶可以是氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)或氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)。

本发明实施例提供的无机磷测定试剂球的检测原理如下：在麦芽糖磷酸化酶的作用下，检测样本中的无机磷与麦芽糖反应生成1-磷酸葡萄糖。1-磷酸葡萄糖在磷酸葡萄糖变位酶(PGM)和/或其辅酶的作用下形成6-磷酸葡萄糖。6-磷酸葡萄糖又在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的作用下被氧化为6-磷酸葡萄糖酸，同时氧化型辅酶(NAD(P)⁺)被还原为还原型辅酶(NAD(P)H)，导致340nm处吸光度的上升，且吸光度的变化与检测样本中无机磷的含量相关，由此可计算待测样品中无机磷的含量。反应方程式具体如下：

在一些实施例中，无机磷检测试剂还包括稳定剂，稳定剂用于提高酶的稳定性，例如，用于提高氧化型辅酶、β-磷酸葡萄糖变位酶、麦芽糖磷酸化酶和/或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的稳定性。本发明实施例中的稳定剂包括第一试剂中的第一稳定剂和第二试剂中的第二稳定剂，且第一稳定剂和第二稳定剂包括甘油、牛血清白蛋白、丙二醇-单甲醚、4-甲基苯硼酸、氯化镁、氯化锂、硫酸铵、乙二胺四乙酸、谷氨酸盐或还原型谷胱甘肽中的至少一种。

具体地，在一些实施例中，当第一试剂和/或第二试剂最适宜的PH值为6.5-7.5时，无机磷检测试剂中各种酶的活性最好。PH偏小(呈酸性)或偏大(呈碱性)都会使酶蛋白变性而失活。PH值的改变会影响酶活性中心的必须基团的解离程度，同时还会影响反应底物和辅酶的解离程度，从而影响酶分子对底物分子的结合和催化。只有在PH值范围在6.5-7.5内时，酶、底物和辅酶的解离状态，才最适宜它们相互结合，并发生催化作用，从而使上述反应①-③中酶的反应速率达到最大值。

具体的，在一些实施例中，为了提高无机磷检测试剂的测试精度、稳定性和抗干扰能力，第一试剂包括20-100mmol/L的PIPES缓冲液、1-10g/L的乙二胺四乙酸、1-10g/L的甘油、20-50g/L的麦芽糖、20-50g/L氧化型辅酶I(NAD+)和100-200g/L海藻糖；第二试剂包括20-100mmol/L的PIPES缓冲液、1-10g/L的乙二胺四乙酸、10-20KU/L的β-磷酸葡萄糖变位酶、10-20KU/L的麦芽糖磷酸化酶和20-40KU/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、100-150g/L的海藻糖和20-50g/L的葡聚糖一万。在另一些实施例中，第一试剂具体包括20-100mmol/L的Bis-Tris缓冲液、1-10g/L的牛血清白蛋白、20-50g/L的麦芽糖、20-50g/L的氧化型辅酶II和100-200g/L的甘露醇；第二试剂具体包括20-100mmol/L的Bis-Tris缓冲液、1-10g/L的牛血清白蛋白、10-20KU/L的β-磷酸葡萄糖变位酶、10-20KU/L的麦芽糖磷酸化酶、20-40KU/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、50-100g/L的葡聚糖四万和50-100g/L的甘露醇。本实施例中，无机磷检测试剂测试精度高，与Abaxis试剂盘相关性好，对抗坏血酸、胆红素、血红蛋白、甘油三酯、尿酸和肌酐均具有较强的抗干扰能力；且无机磷检测试剂在37℃条件下避光存储8天，以及在2-8℃避光环境中贮存15个月后，检测结果相对偏差的绝对值仍小于10％，满足使用要求。

本发明实施例还提供一种无机磷检测芯片，用于检测血清中无机磷的含量，该检测芯片包括芯片本体和上述无机磷检测试剂。芯片本体上开设有比色孔，无机磷检测试剂收容于比色孔中。无机磷的检测方法为：通过稀释液将血清样本稀释，将稀释后的血清样本填充到比色孔中，待稀释后的血清样本与比色孔中的无机磷检测试剂充分反应后，采用分光光度计测试所述比色孔中溶液的吸光度值。

在一些实施例中，检测芯片还包括样本孔、稀释液孔、样本槽、稀释液槽、样本定量槽、稀释液定量槽和混合槽。使用该检测芯片进行测试时，无需对样本进行离心处理即可进行检测，因此，血清、血浆和全血等检测样本都可以用于检测。具体可以通过移液器将血清样本从样本孔将加入样本槽，再撕开稀释液槽的封口膜，采用离心的方式使预存的稀释液从稀释槽进入稀释液定量槽，使血清样本从样本槽进入样本定量槽，以及使稀释液定量槽中的稀释液和样本定量槽中的血清样本进入混合槽，以通过稀释液稀释血清样本。再通过离心的方式使混合槽中稀释后的血清样本填充到比色孔中，待稀释后的血清样本与比色孔中的无机磷检测试剂充分反应后，采用分光光度计测试所述比色孔中溶液的吸光度。具体的，稀释液可以是蒸馏水。

本发明实施例提供了一种无机磷检测试剂，继承了酶法选择性好、灵敏度高及可实现自动化分析的优点。本发明将液体试剂制备为可放置于微流控检测芯片内的冻干试剂球，不需依赖大型全自动生化分析仪，可实现在病人身边快速诊断，具有测试时间短和操作简便等优点。

本发明实施例还提供一种无机磷检测试剂的制备方法，该方法包括如下步骤：

S11、获取试剂第一试剂和第二试剂；

在一些实施例中，第一试剂的配置过程具体如下：在容器中加入适量的蒸馏水，称取缓冲液成分，待缓冲液溶解完全后依次加入麦芽糖、氧化型辅酶，调节pH至6.5-7.5，最后加入赋形剂，再定容获得第一试剂。在一些实施例中，第二试剂的配置过程具体如下：在容器中加入适量的蒸馏水，称取缓冲液成分，待缓冲液溶解完全后依次加入β-磷酸葡萄糖变位酶、麦芽糖磷酸化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，调节pH至6.5-7.5，最后加入赋形剂，再定容获得第二试剂。本实施例中第一试剂和第二试剂的各组分配比请参照上述无机磷检测试剂实施例。

S12、分别将第一试剂和第二试剂的液滴滴入液氮中，以使第一试剂和第二试剂的液滴分别凝结成第一冰球和第二冰球；

例如，可以通过点胶机将第一试剂(或第二试剂)的液滴滴在液氮中，使液滴在液氮中凝结成第一冰球(或第二冰球)。本领域技术人员可以根据实际需要调整滴入液氮中的第一试剂(或第二试剂)的液滴的大小，并通过控制液滴的大小来调整(或第二冰球)的体积。可选的，在一些实施例中，为了确保无机磷检测试剂的复溶效果，第一冰球和第二冰球的体积为2.5-3.5μl、例如，可以是2.5μl、3μl或3.5μl。

S13、分别对第一冰球和第二冰球进行冷冻干燥得到第一冻干试剂球和第二冻干试剂球。

本实施例中，分别将第一冰球和第二冰球置于真空冷冻干燥机进行冷冻干燥形成无机磷检测试剂，待氮气复压后将无机磷检测试剂收集并保存在干燥的铝瓶中。

冷冻干燥是指将含水的试剂原料预先进行降温冻结成固体，在低温减压条件下利用水的升华性能，使试剂原料低温脱水而达到干燥目的的一种干燥方法。冷冻干燥后，第一试剂和第二试剂中的各原料组分留在冻结时的冰架中，因此，冷冻干燥后的无机磷检测试剂疏松多孔，且其体积与冻干前基本保持不变。由于无机磷检测试剂干燥前始终处于冻结状态，同时冰晶均匀分布于试剂原料各组份中。升华过程中，各组份不会因脱水而发生浓缩现象。故冷冻干燥后的无机磷检测试剂呈海绵状疏松多孔，极易溶于水而恢复原状。

为进一步阐述本发明的技术方案，以下提供本发明无机磷检测试剂和检测芯片的若干实施例。

实施例1：

本实施例体提供的无机磷检测芯片中无机磷检测试剂的原料组分包括：

第一试剂的各组分如下：

PIPES缓冲液20mmol/L；

乙二胺四乙酸1g/L；

甘油10g/L；

麦芽糖50g/L；

氧化型辅酶I 20L；

海藻糖100g/L；

第一试剂pH的值为6.7。

第二试剂的各组分如下：

PIPES缓冲液100mmol/L；

乙二胺四乙酸10g/L；

β-磷酸葡萄糖变位酶10KU/L；

麦芽糖磷酸化酶10KU/L；

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶20KU/L；

海藻糖150g/L；；

葡聚糖一万50g/L；

第二试剂的pH值为6.7。

实施例2：

本实施例与实施例1的区别如下：

第一试剂的各组分如下：

Bis-Tris缓冲液100mmol/L；

牛血清白蛋白10g/L；

麦芽糖25g/L；

氧化型辅酶II 50g/L；；

甘露醇120g/L；

第一试剂的pH值为7.0。

第二试剂的各组分如下：

Bis-Tris缓冲液100mmol/L；

牛血清白蛋白1g/L；

β-磷酸葡萄糖变位酶20KU/L；

麦芽糖磷酸化酶20KU/L；

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶40KU/L；

葡聚糖四万50g/L；

甘露醇 80g/L；

第二试剂的pH值为7.0。

下面结合表格对本发明实施例1所得的无机磷检测芯片的性能进行说明。需要说明的是，通过vp10便携式生化分析仪测定37℃下，注入血清样本的测定芯片吸光度的变化值。使用英国朗道公司提供的校准品进行定标，可计算得到血清样本中无机磷的浓度。

(1)、精密度测试：采用本发明实施例1提供的检测芯片测试已知无机磷浓度为1.45mmol/L的血清样本中的无机磷浓度20次，并通过以下公式计算测得浓度值的平均值标准差(SD)和变异系数(CV)：

其中，X_i为第i次测得浓度值，n为测试次数。

得到测试同一血清样本20次获得的测得浓度值的平均值 标准差SD＝0.034，变异系数CV＝2.44％。通常，若标准差较大，代表大部分测试结果和其平均值之间差异较大；若标准差较小，则代表这些测试结果较接近平均值。

(2)、准确度测试：采用本发明实施例1提供的检测芯片测试已知无机磷浓度为2.27mmol/L的血清样本三次，获取测得的无机磷浓度值，计算出3次测得无机磷浓度值的平均值为2.22mmol/L，相对偏差为-2.06％。

(3)、临床相关性分析：

采用本发明实施例1提供的检测芯片与Abaxis试剂盘同时测定对多个无机磷浓度不同的血清样本的无机磷含量。相应的测得无机磷浓度值(单位mmol/L)如表一所示，表一中，X列数值为Abaxis试剂盘测得的血清样品中的无机磷浓度，Y列数值为本发明实施例1提供的检测芯片测得的血清样品中的无机磷浓度。例如，对于1号血清样本，采用为Abaxis试剂盘测试的无机磷浓度为3.84mmol/L，而采用本发明实施例1提供的无机磷检测芯片测试的1号血清样本中的无机磷浓度为3.99mmol/L。

本发明实施例提供的检测芯片与Abaxis试剂盘的两组测试结果之间的相关方程如下：

y＝0.9956x+0.0193

相关系数R＝0.9955，相关系数越接近1代表两组数据之间的相关性越强。因此，本发明实施例提供的检测芯片与Abaxis试剂盘的测试结果相关性强。

表一：无机磷检测试剂盒的临床相关系分析表。

(4)、线性范围测试

测试方法如下：用接近线性范围([0.2，7]mmol/L)上限的高浓度(活性)样本和接近线性范围下限的低浓度(活性)样本，按表二所示，将高浓度检测样本和低浓度检测样本以不同比例混合成6个稀释浓度的检测样本。由于低浓度(活性)样本难以收集，可以以生理盐水代替。

表二：

采用本发明实施例1提供的检测芯片分别测试6个血清样本的无机磷浓度，每个血清样本测试3次，分别求出6个血清样本中无机磷测得浓度值的平均值(y_i)。以每个样本稀释后的浓度(x_i)为自变量，以每个样本的测得浓度值均值(y_i)为因变量求出线性回归方程。按公式(4)计算线性回归的相关系数R；公式(4)如下：

其中，n为测定样品的数量，x_i为稀释浓度，y_i为测定结果的平均值。

如图2所示，得到的线性回归方程为y＝0.9985x+0.0343，相关系数R＝0.9995。

通常，当试剂盒检测无机磷浓度在[0.2，7]mmol/L区间内的检测样本时，其线性相关系数R≥0.990，则满足要求。故，本发明实施例提供的无机磷检测试剂具备线性范围宽的特点。

(5)、热稳定性测试

在8％空气湿度环境中，将本发明实施例1提供的无机磷检测试剂装入芯片本体内形成多个检测芯片，并装入铝箔袋进行密封。

将实施例1提供的多个检测芯片在37℃避光环境中贮存0、2、3、4、6和8天后，分别对英国朗道公司提供的两组校准品(样本1和样本2)中的无机磷浓度进行多次检测，以分析多次检测的结果的平均值和相对偏差(单位为mmol/L)，从而分析检测芯片的检测准确度，检测结果请参阅表三和表四。为了确保检测结果的准确度，相对偏差的绝对值应在±10.0％以内。

表三和表四分别为存储不同时间后的检测芯片对样本1和样本2中无机磷浓度检测3次的检测结果，以及计算出的检测结果的平均值和相对偏差，其中，各个表中的靶值为相应地为样本1和样本2中无机磷的实际浓度。为了确保检测结果的准确度，相对偏差的绝对值应在10.0％以内。从表三和表四中可以看出，本发明实施例提供的检测芯片在37℃环境中储存2、3、4、6或8天后检测结果的相对偏差的绝对值仍在±10.0％以内，因此，本实施例提供的检测芯片热稳定性好。

表三：热稳定性分析表。

表四：热稳定性分析表。

(6)、长期稳定性测试

将实施例1提供的多个检测芯片在2-8℃避光环境中贮存0、3、6、9、12和15个月后，分别对英国朗道公司提供的两组校准品(样本3和样本4)中的无机磷浓度进行多次检测，以分析多次检测的结果的平均值和相对偏差(单位为mmol/L)，从而分析检测芯片的检测准确度，检测结果请参阅表五和表六。

表五：长期稳定性分析表。

表六：长期稳定性分析表。

表五和表六分别为存储不同时间后的检测芯片对样本3和样本4中无机磷浓度检测3次的检测结果，以及计算出的检测结果的平均值和相对偏差，其中，各个表中的靶值为相应地为样本3和样本4中无机磷的实际浓度。从表五和表六中可以看出，本发明实施例提供的检测芯片在2-8℃环境中储存3、6、9、12和15个月后，检测结果的相对偏差的绝对值仍在±10.0％以内，因此，本实施例提供的检测芯片的长期稳定性好，在环境中长期储存后仍能确保其检测结果的准确性。

(7)抗干扰能力测试

取同批次同一患者的新鲜血清样本，分为对照组和实验组，其中，对照组无人为添加的干扰物，而实验组分别添加如表七所示的6种干扰物质。采用本发明实施例提供的无机磷检测芯片，分别对实验组和对照组的检测样本进行检测。每个检测样本重复检测三次，检测结果取平均值。对照组无机磷的测得浓度为2.27mmol/L，实验组的测定结果表七。

表七：抗干扰能力分析表。

表七中相对偏差(％)＝(实验组的测得值－对照组的测得值)/对照组测得值×100％。从表七可以看出，实验组测得的无机磷的浓度与对照组测得的无机磷的浓度之间的偏差均不超过±10.0％。本发明实施例提供的无机磷检测试剂和检测芯片对抗坏血酸、胆红素、血红蛋白、甘油三酯、尿酸和肌酐均具有较强的抗干扰能力。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明，它们没有在细节中提供；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。