阅读说明：本技术 环糊精在涉及磷脂失调的疾病和病症中的用途 (Use of cyclodextrins in diseases and conditions involving phospholipid dysregulation ) 是由 K·M·维托斯基 于 2018-08-28 设计创作，主要内容包括：本公开提供了某些组合物和方法,其可用于治疗和/或预防恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症,诸如癌症、阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症、佩吉特氏病或其它衰老方面,诸如动脉粥样硬化或2型糖尿病。在一些这样的实施例中,提供了含有至少一种环糊精活性剂(诸如α-环糊精)或其类似物或衍生物的组合物。在一些实施例中,该组合物为HP-aCD和癸酸钠或辛酸钠的包合物。(The present disclosure provides certain compositions and methods useful for treating and/or preventing malignant, neurodegenerative, cardiovascular, metabolic, inflammatory, autoimmune, or viral diseases or disorders, such as cancer, alzheimer's disease, parkinson's disease, multiple sclerosis, paget's disease, or other aspects of aging, such as atherosclerosis or type 2 diabetes. In some such embodiments, compositions are provided that contain at least one cyclodextrin active agent (such as alpha-cyclodextrin) or an analog or derivative thereof. In some embodiments, the composition is a clathrate of HP-aCD and sodium caprate or sodium caprylate.)

环糊精在涉及磷脂失调的疾病和病症中的用途

相关申请

本申请要求于2018年6月3日提交的美国临时申请第62/679,912号、于2018年3月15日提交的美国临时申请第62/643,694号、于2017年11月15日提交的美国临时申请第62/586,826号、于2017年10月17日提交的美国临时申请第62/573,658号和于2017年9月28日提交的美国临时申请第62/565,053号以及于2017年8月28日提交的美国临时申请第62/551,193号的优先权的权益。上述申请的全部内容通过引用整体并入。

背景技术

随着人口老龄化，与年龄有关的病况、错误！未找到参考源、癌症和神经退行性疾病的患病率增加，然而预防或治疗这些病况的干预缺乏或具有不期望的副作用。目前，美国约有500万人患有阿尔茨海默病，约有100万人患有帕金森病。随着预期寿命的增加，神经退行性疾病或病症的患病率也增加。65岁以上的人中有10％的人，以及75岁以上的人中有15％的人患有阿尔茨海默病。阿尔茨海默病也不成比例地影响女性，其占患有阿尔茨海默病的美国人的三分之二。与白种人社区相比，阿尔茨海默病也更可能影响非裔美国人和西班牙裔社区的成员。患有阿尔茨海默病的患者几乎无治疗选择。BACE1抑制剂的最近3期研究均已失败。类似地，患有帕金森病的患者最初受益于运动症状的治疗(左旋多巴)，但随时间的流逝变得无反应。

恶性疾病或病症的治疗也受到限制，并具有许多缺点。治疗通常包括对可能已经扩散的癌细胞的局部治疗(例如：在乳腺癌中进行或不进行放射的手术，在***癌中进行手术或放射)和辅助全身治疗(激素治疗、化疗和生物制剂)。放射疗法和化疗通常引起显著的副作用，包括但不限于恶心和脱发。***癌的激素疗法包括抗雄激素。对于一些激素受体阳性形式的乳腺癌，选择性***受体调节剂(SERM)，诸如他莫昔芬和雷洛昔芬，以及芳香酶抑制剂，诸如依西美坦和阿那曲唑，可以干扰疾病进展。单克隆抗体，诸如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗(pertuzumab)，被批准用于治疗HER2阳性癌症。对于具有三重阴性(不存在***、孕酮和Her2/neu受体)的患者，治疗选择是有限的。

神经退行性病症和恶性肿瘤之间的共同点为溶酶体功能障碍。溶酶体功能障碍涉及多种病症和疾病，包括遗传疾病。在一些情况下，高水平的内吞作用已被认为是恶性肿瘤和神经退行性过程的病因中的多效性因素，包括但不限于内吞作用在癌症中的作用，以及“失调的(deranged)”内吞作用在阿尔茨海默病中的作用，其中内吞途径异常先于Aβ沉积，并且内吞作用的抑制减少了淀粉样前体蛋白(“APP”)内化并立即在体内降低了Aβ水平。

虽然对早期生命有益，但是高水平的内吞作用可能随着年龄而变得有害。已在动脉粥样硬化、脂肪性肝炎和囊性纤维化中发现了增大的巨噬细胞，并且受损的磷脂外流增加了脂质在巨噬细胞中的累积。在自身免疫性疾病，诸如系统性红斑狼疮(SLE)、炎性肠病和关节炎中已观察到早期内吞途径的激活。磷酸肌醇的减少抑制了自身免疫性疾病。PI3K信号传导的抑制已显示有益于炎性/自身免疫性疾病和血液恶性肿瘤。总而言之，脂筏的失调与衰老导致的生活质量差有关。

在遗传疾病中已经提到了调节内吞作用的磷酸肌醇(PIP)，特别是，已显示PI3K抑制剂在多种炎性和自身免疫性疾病中有效。然而，抑制或激活单个磷酸酶或激酶的多种尝试均未能成功治疗。因此，尽管有强有力的证据表明内吞/胞饮作用参与所有这些疾病以及PIP的参与，但仍缺乏有效的内吞调节剂。

因为“脱轨的内吞作用(derailed endocytosis)”与癌症、神经退行性疾病和其它“病理性病况”有关，所以防止癌症转移的相同治疗也有望防止未降解的大分子在神经退行性疾病和其它许多其它与年龄有关的病况中累积，包括经由巨胞饮作用在动脉粥样硬化中形成泡沫细胞。然而，缺乏调节内吞作用的有效治疗。因此，需要有效治疗涉及溶酶体途径功能障碍的病症和疾病的症状。

广泛作用的[细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)]抑制剂产生了非常令人失望的结果，并且仅少数患者受益于磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂。最近，已经提出HP-α-CD可用于治疗癌症，但是不仅从癌症中提取胆固醇而且从外毛细胞中提取胆固醇，可能导致永久性听力损失。

2-羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)作为食品添加剂通常被认为是安全的(GRAS)，并且经常用作肠胃外使用的赋形剂以与亲脂性药物形成水溶性化合物。肠胃外和鞘内HP-β-CD已用于治疗C型尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease type C，NPC)，其中其功能是从溶酶体中提取过量胆固醇(一种脂质分子)。由于胆固醇涉及许多其它过程，包括细胞生长，HP-β-CD也被建议用于治疗各种癌症。在大多数情况下，已提出了[HP-β-]CD的胆固醇消耗，尽管确切的作用机制仍未得到证实。

尚未认识到，α-环糊精及其衍生物(诸如羟丙基-α-环糊精(HP-α-CD))可以有效地治疗恶性肿瘤和神经退行性疾病，而无不希望的副作用，诸如由β-环糊精引起的毛发和听力损失。

发明内容

通过将计算生物统计学和决策策略应用于来自全基因组关联研究(GWAS)的数据，已经鉴定了功能相关的基因集合，并确定了由包含由PI循环产生的磷酸肌醇(PIP)控制的内吞作用涉及某些类型癌症(诸如乳腺癌或***癌)的转移过程。在这点上，确定乳腺癌风险不仅由DNA损伤修复基因(诸如BRCA1/2)的(罕见的)变异引起，而且更普遍地由PI循环的整体失调所致，并且已知由PI循环控制的内吞作用是癌细胞局部扩散、迁移和侵袭的关键组分。参见例如实施例1。因此，一方面，本文提供靶向PI循环的方法，其作为用于治疗受试者中引起功能障碍溶酶体途径和/或升高的内吞作用、吞噬作用或胞饮作用的疾病或病况的手段，其中该疾病或病况可由例如通过本文所述的新GWAS方法(参见例如，实施例1)鉴定的基因或基因组合的异常表达引起。这样的疾病或病况包括例如乳腺癌(BC)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、多发性硬化症(MS)、冠状动脉疾病(CAD)和C型尼曼-皮克病(NPC)。参见例如，实施例2、3和6至8。

已知对癌症、神经退行性和几种其它年龄相关疾病的动物模型有作用的治疗剂为β-环糊精。这些包括例如，甲基-β-环糊精(MβCD)和2-羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)。参见例如，J Membr Biol.2011年5月，241(1)：1-10；The Journal of Experimental Medicine，209(13)，2501-13，以及实施例4中阐述的讨论。传统上，β-环糊精被认为会从细胞膜和/或细胞器中除去和提取胆固醇(Chol)。例如，胆固醇的清除和/或直接与Aβ或α-突触核蛋白结合被认为是β-环糊精在AD和PD中的作用模式。参见The Journal of ExperimentalMedicine，209(13)，2501-13。尽管β-环糊精具有治疗潜力，但它们是耳毒性的，即引起耳部损伤，其可导致永久性听力损失。参见J Assoc Res Otolaryngol，16(5)，599-611。

这里，第一次鉴定了PI循环的含义和溶酶体功能疾病的遗传结果(参见例如，实施例1)，胆固醇的清除不再被认为是环糊精(诸如β-环糊精)发挥功能的主要机制。参见例如，实施例1。相反，我们的数据显示环糊精通过清除磷脂起作用，从而调节内吞作用。例如，已发现α-环糊精(α-CD)在乳腺癌中恢复脱轨的的内吞作用，以及在PD和AD中恢复失调的内吞作用。参见例如，实施例9。还发现α-CD在溶解磷脂方面比β-CD更有效(参见实施例10和11)，并且毒性更小，且在防止人肿瘤细胞迁移方面更有效(参见实施例12)。因此，一方面，本文提供了使用α-环糊精(例如，甲基-α-环糊精(MαCD)或2-羟丙基-α-环糊精(HP-α-CD))治疗患有涉及溶酶体功能损伤的疾病、病症或病况的受试者的方法。本文描述了这样的疾病和病症，包括例如，乳腺癌(BC)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、多发性硬化症(MS)、冠状动脉疾病(CAD)和C型尼曼-皮克病(NPC)。

除了上述发现之外，还认识到，α-环糊精(例如，HP-α-CD)从肠的吸收可以通过与脂肪酸的络合而改善。例如，已经证明，HP-α-CD和中链脂肪酸的包合物显著改善了吸收。参见实施例14。相应地，一方面，本文提供了包含α-环糊精(例如，HP-α-CD)和中链脂肪酸(例如，癸酸)的药物组合物，及其用于治疗涉及溶酶体功能损伤的疾病或病症的用途。本文描述了这样的疾病和病症，包括例如，乳腺癌(BC)、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、多发性硬化症(MS)、冠状动脉疾病(CAD)和C型尼曼-皮克病(NPC)。

在另一方面，进一步鉴定了包含α-环糊精(例如，HP-α-CD)和中链脂肪酸(例如，癸酸)的药物组合物可用于治疗抗炎性疾病。参见例如，实施例15。因此，一方面，本文提供了用于治疗炎性疾病的包含α-环糊精(例如，HP-α-CD)和中链脂肪酸(例如，癸酸)的药物组合物。

下面和本申请的

具体实施方式

和实施例部分中进一步描述了其它方面。本专利申请的每个部分中的描述旨在结合其它部分来阅读。此外，在本专利申请的每个部分中描述的各种实施例可以以各种不同的方式组合，并且所有这样的组合旨在落入本公开的范围内。

一方面，本公开提供一种治疗受试者的恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症的方法，该方法包含向该受试者施用有效量的环糊精(例如，α-环糊精(α-CD))，或其类似物或衍生物(例如，2-羟丙基-α-环糊精(HP-α-CD))，其单独施用或与一种或多种其它活性剂组合施用。在另一方面，本公开提供了包含α-CD或其类似物或衍生物(例如，2-羟丙基-α-环糊精(HP-α-CD))的组合物，其用于治疗上皮癌(癌(carcinoma))或治疗帕金森病、阿尔茨海默病或亨廷顿病。一方面，包含HP-α-CD的组合物进一步包含中长度链脂肪酸(MCFA)，例如具有6至12个碳原子的脂族尾的脂肪酸。一方面，该组合物中的HP-α-CD和中长度链脂肪酸(MCFA)形成包合物。在这样的包合物中，MCFA是HP-α-CD的客体(guest)。在一种中，组合物中的MCFA为癸酸盐或其盐，诸如癸酸钠。

一方面，本公开提供一种改善受试者的恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症的一种或多种指标或症状的方法，该方法包含向表现出恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症的一种或多种指标或症状的受试者施用有效量的α-CD或其类似物或衍生物(例如，2-羟丙基-α-环糊精(HP-α-CD))，其单独施用或与一种或多种其它活性剂组合施用。合适的指标包括，但不限于，血液检查(包括，但不限于，循环肿瘤DNA和/或***特异性抗原)结果、X射线评估、身体检查(包括，但不限于，可触知的肿瘤)结果、精神病学评估或用于组织学评估和/或激素受体状态测定的组织活检。一方面，症状或指标选自由以下组成的群组：生存率、无病生存率、无远处转移生存率、血液检查(包括，但不限于，循环肿瘤DNA和***特异性抗原)结果、X射线评估、身体检查(包括，但不限于，可触知的肿瘤)结果或用于组织学评估的组织活检。在一个实施方案中，“改善”包含在一种或多种指标或症状的测量中增加至少1％。另一方面，本公开提供了一种组合物，其包含α-CD错误！未找到参考源。，或其类似物或衍生物(例如，2-羟丙基-α-环糊精(HP-α-CD))，用于治疗上皮癌(癌)或治疗帕金森病、阿尔茨海默病或亨廷顿病。一方面，包含HP-α-CD的组合物进一步包含中长度链脂肪酸(MCFA)，例如具有6至12个碳原子的脂族尾的脂肪酸。一方面，该组合物中的HP-α-CD和中长度链脂肪酸(MCFA)形成包合物。在这样的包合物中，MCFA为HP-α-CD的客体。在一种中，组合物中的MCFA是癸酸盐或其盐，如癸酸钠。

在一些实施方案中，本公开涉及一种在有需要的受试者中恢复鞘磷脂合成的方法，该方法包含施用环糊精(例如，α-环糊精(α-CD))，或其类似物或衍生物(例如，2-羟丙基-α-环糊精(HP-α-CD))，其单独施用或与一种或多种其它活性剂组合施用。一方面，本公开提供了一种改善受试者的恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症的一种或多种指标或症状的方法，该方法包含向表现出恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症的一种或多种指标或症状的受试者施用有效量的α-CD错误！未找到参考源。，或其类似物或衍生物(例如，2-羟丙基-α-环糊精(HP-α-CD))，单独或与一种或多种其它活性剂组合。合适的指标包括，但不限于，血液检查(包括，但不限于，循环肿瘤DNA和/或***特异性抗原)结果、X射线评估、身体检查(包括，但不限于，可触知的肿瘤)结果、精神病学评估或用于组织学评估和/或激素受体状态测定的组织活检。一方面，症状或指标选自由以下组成的群组：生存率、无病生存率、无远处转移生存率、血液检查(包括，但不限于，循环肿瘤DNA和***特异性抗原)结果、X射线评估、身体检查(包括，但不限于，可触知肿瘤)结果或用于组织学评估的组织活检。在一个实施方案中，“改善”包含在一种或多种指标或症状的测量中增加至少1％。

一方面，本公开提供了一种在有需要的受试者中治疗和/或预防局灶节段性肾小球硬化(FSGS)和肾病性肿胀(nephrotic swelling)的方法，该方法包含向受试者施用有效量的α-环糊精(α-CD)，或其类似物或衍生物(例如，2-羟丙基-α-环糊精(HP-α-CD))，其单独施用或与一种或多种其它活性剂组合施用。在一些实施方案中，本公开涉及一种在有需要的受试者中治疗和/或预防由过量或功能障碍的鞘脂分解代谢引起的肾脏损伤的方法，该方法包含向受试者施用有效量的α-环糊精(α-CD)，或其类似物或衍生物(例如，2-羟丙基-α-环糊精(HP-α-CD))，其单独施用或与一种或多种其它活性剂组合施用。在一些实施方案中，本公开涉及一种在有需要的受试者中恢复鞘磷脂合成的方法，该方法包含施用α-环糊精(α-CD)，或其类似物或衍生物(例如，2-羟丙基-α-环糊精(HP-α-CD))，其单独施用或与一种或多种其它活性剂组合施用。

在其它实施方案中，本文所述的组合物包含本领域已知的吸收增强剂，该吸收增强剂包括，但不限于，胆汁盐(甘胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、夫西地酸钠、甘氨脱氧胆酸钠、牛磺双氢褐霉素钠)、表面活性剂(月桂基硫酸钠、溶血磷脂酰胆碱、磺基琥珀酸二辛酯钠、laurenth-9、聚山梨酯、聚乙二醇-8-月桂酸酯、甘油单月桂酸酯、甘油单辛酸酯/癸酸酯、甘油二辛酸酯/癸酸酯、皂苷)、脂肪酸和衍生物(脱水山梨糖醇月桂酸酯、癸酸钠、蔗糖棕榈酸酯、月桂酰胆碱、肉豆蔻酸钠、棕榈酰基肉碱)、甘油酯(磷脂、己酸单甘油酯(monohexanoin)、中链甘油酯)、螯合剂(乙二胺四乙酸盐(EDTA)、EDTA二钠)、水杨酸酯(水杨酸、甲氧基水杨酸钠、乙酰水杨酸)、聚合物或多糖(壳聚糖和壳聚糖衍生物、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚卡波非、羧甲基纤维素钠及其衍生物、菊粉、果胶、硫酸软骨素)、其它(氮酮、苯扎氯铵、吩噻嗪、硝酸供体、薄荷醇)、更新的(闭合小带毒素(zonula occludentoxin)、聚-L-精氨酸、大豆衍生物葡糖苷、胞二磷胆碱(citicholine)、氨基酸肽)。参见Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes，1788(4)，892-910；Internationaljournal of pharmaceutics，447(0)，75-93；J Appl Pharmacol Sci，2(7)，34-39。

在一些实施方案中，环糊精以每两周约2500mg/kgα-CD(约700mg/kg/d)的剂量施用于受试者，相同剂量HP-β-环糊精用于患有NPC的两名儿童“一年以上，无明显副作用”，“靶向浓度为0.1至1.0mM”。(IND 104,114和104,116，批准日期：2009-04-13)。在其它实施方案中，剂量将随时间调整至不引起患者肾或溶血的最高剂量。在一些实施方案中，环糊精，诸如α-CD，以至少约100mg，至少约200mg，至少约500mg，至少约1,000mg，至少约2,000mg，至少约5,000mg或至少约10,000mg的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，环糊精，诸如α-CD，每天以约1至约10,000mg，约1至约7,500mg，约1至约5,000mg，约1至约2,500mg，约1至约1,000mg，约1至约500mg，约1至约200mg，约200至约10,000mg，约200至约4,000mg，约200mg至约2,000mg，约200至约1,000mg，或约200至约500mg的剂量施用于受试者。在一些这样的实施方案中，上述各剂量为mg/kg/天。在本专利申请的具体实施方式部分中提供了可以使用的其它剂量。

在一些实施方案中，干预是在未表现出疾病特异性指标或症状的受试者中预防恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症，但该受试者的指标属于危险亚群(at-risk subpopulation)除外。在一些实施方案中，该指标将是年龄。在一些实施方案中，该指标将是年龄超过30、40或50岁。

在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗或预防受试者中的恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症的方法，该方法包含向受试者施用有效量的减少细胞外磷脂的药物。在一些实施方案中，该恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症将是上皮癌(癌)。在一些实施方案中，该恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症将是乳腺癌。在另一实施方案中，该恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症将是阿尔茨海默病。在一些实施方案中，该恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症将是帕金森病。在一些实施方案中，该恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症将是亨廷顿病。在一些实施方案中，该恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

在一些实施方案中，本公开提供治疗的各种组合，包括药物组合物。在一些实施方案中，环糊精与包含细胞毒性干预、受体拮抗剂、单克隆抗体、放射疗法、肿瘤组织去除等的已建立的药物、放射或手术干预联合使用。

在一个实施方案中，受试者是人。在另一个实施方案中，受试者是成年人。在一些实施方案中，受试者需要治疗和/或已经被鉴定为具有发展由溶酶体功能障碍引起的一种或多种细胞缺陷引起的疾病或病症的风险。

在一些实施方案中，组合物包含HP-α-CD和盐(诸如癸酸钠)的包合物。

附图说明

图1：环糊精，包括羟丙基环糊精。可以实现多达n×3取代度，可能具有许多位置异构体和区域异构体。R的取代基包括，但不限于，H(母体)、甲基(包括无规甲基化的)、丁基、2-羟丙基(HP)、乙酰基、琥珀酰基、葡糖基、麦芽糖基、羧甲基醚、磷酸酯、简单聚合物或羧甲基。典型的CD在环中含有6(α-CD)、7(β-CD)或8(γ-CD)D-葡萄糖单体，形成可以将客体分子容纳到其疏水腔中的锥形。

图2：胆固醇与α-CD和n相互作用的聚类分析。环糊精对HaCaT角质形成细胞增殖的影响。温育48小时后，相对于对照标准化的至少六个独立测量值的平均值。顶部：ATP测定，底部：PicoGreen测定)。W6：α-CD，W6：β-CD，W7s HP：HP-β-CD。改进自Hipler,U.C.等人，(2007)“环糊精在体外对HaCaT角质形成细胞增殖的影响(Influence of cyclodextrinson the proliferation of HaCaT keratinocytes in vitro)”，J Biomed Mater Res A，83(1)，70-9。

图3A至图3C：脂质释放的特异性I。用环糊精处理的完整红细胞(3B)或鬼形红细胞(ghost erythrocyte)(3A和3C)释放磷脂(3A)、胆固醇(3B)和蛋白质(3C)。(○)α-环糊精；(●)β-环糊精；(Δ)γ-环糊精。改进自(Ohtani Y，Irie T等人，(1989)，European Journalof Biochemistry，186：17-22)。

图4A至图4B：脂质释放的特异性II。4A)在各种浓度的α-CD和β-CD存在下温育2小时后，从脑毛细血管内皮细胞(BCEC)释放的胆固醇。结果表示为与对照相比从BCEC释放的胆固醇的百分比。每个百分比是三个不同过滤器的平均值，代表两个独立实验系列。4B)分别在0.5、5和50mM的α-CD和β-CD存在下温育2小时后，从BCEC释放的磷脂酰胆碱(PC)(浅柱)和鞘磷脂(暗柱)。结果表示为与对照相比从BCEC释放的磷脂的百分比。每个百分比是三个不同过滤器的平均值，代表两个独立实验系列。改进自(Monnaert V，Tilloy S等人，(2004)，Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，310：745-51)。

图5：MβCD，而非αCD保护A2E免受氧化。双类维生素(bisretinoid)A2E是在眼脂褐素提取物中鉴定出的第一种化合物。通过5μM A2E溶液的UV可见吸收光谱的变化监测A2E免受氧化的保护。(5A)在所示环糊精(12mM)存在下，蓝光照射之前(●)和之后(○)的A2E氧化状态。(5B)在室温下在黑暗中在环糊精存在下温育后，在时间0(●)和1天(○)的A2E氧化状态。改进自(Nociari MM，Lehmann GL等人，(2014)Proceedings of the National Academyof Sciences，111：E1402-E8)。

图6：CGEM的ssGWAS结果的QR曲线图。“空(null)”投影(水平)终止于单个染色体的凸投影端点的中值处。垂直线右侧的基因高于研究特异性基因组范围意义的界限。界限下方(左侧)的区域仅用于描述目的。

图7 CGEM的muGWAS结果的QR曲线图。(参见图1：环糊精，包括羟丙基环糊精。可以实现多达n×3取代度，可能具有许多位置异构体和区域异构体。R的取代基包括但不限于H(母体)、甲基(包括无规甲基化的)、丁基、2-羟丙基(HP)、乙酰基、琥珀酰基、葡糖基、麦芽糖基、羧甲基醚、磷酸酯、简单聚合物或羧甲基。典型的CD在环中含有6(α-CD)、7(β-CD)或8(γ-CD)D-葡萄糖单体，形成可以将客体分子容纳到其疏水腔中的锥形。

图2：胆固醇与α-CD和n相互作用的聚类分析。环糊精对HaCaT角质形成细胞增殖的影响。温育48小时后，相对于对照标准化的至少六个独立测量值的平均值。顶部：ATP测定，底部：PicoGreen测定)。W6：α-CD，W6：β-CD，W7s HP：HP-β-CD。改进自Hipler,U.C.等人，(2007)“环糊精在体外对HaCaT角质形成细胞增殖的影响(Influence of cyclodextrinson the proliferation of HaCaT keratinocytes in vitro)”，J Biomed Mater Res A，83(1)，70-9。

图3A至图3C：脂质释放的特异性I。用环糊精处理的完整红细胞(3B)或鬼形红细胞(ghost erythrocyte)(3A和3C)释放磷脂(3A)、胆固醇(3B)和蛋白质(3C)。(○)α-环糊精；(●)β-环糊精；(△)γ-环糊精。改进自(Ohtani Y，Irie T等人，(1989)，European Journalof Biochemistry，186：17-22)。

图4A至图4B：脂质释放的特异性II。4A)在各种浓度的α-CD和β-CD存在下温育2小时后，从脑毛细血管内皮细胞(BCEC)释放的胆固醇。结果表示为与对照相比从BCEC释放的胆固醇的百分比。每个百分比是三个不同过滤器的平均值，代表两个独立实验系列。4B)分别在0.5、5和50mM的α-CD和β-CD存在下温育2小时后，从BCEC释放的磷脂酰胆碱(PC)(浅柱)和鞘磷脂(暗柱)。结果表示为与对照相比从BCEC释放的磷脂的百分比。每个百分比是三个不同过滤器的平均值，代表两个独立实验系列。改进自(Monnaert V，Tilloy S等人，(2004)，Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，310：745-51)。

图5：MβCD，而非αCD保护A2E免受氧化。双类维生素(bisretinoid)A2E是在眼脂褐素提取物中鉴定出的第一种化合物。通过5μM A2E溶液的UV可见吸收光谱的变化监测A2E免受氧化的保护。(5A)在所示环糊精(12mM)存在下，蓝光照射之前(●)和之后(○)的A2E氧化状态。(5B)在室温下在黑暗中在环糊精存在下温育后，在时间0(●)和1天(○)的A2E氧化状态。改进自(Nociari MM，Lehmann GL等人，(2014)，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences，111：E1402-E8)。

图，图例)

图8 EPIC的ssGWAS结果的QR曲线图。(参见图1：环糊精，包括羟丙基环糊精。可以实现多达n×3取代度，可能具有许多位置异构体和区域异构体。R的取代基包括，但不限于，H(母体)、甲基(包括无规甲基化的)、丁基、2-羟丙基(HP)、乙酰基、琥珀酰基、葡糖基、麦芽糖基、羧甲基醚、磷酸酯、简单聚合物或羧甲基。典型的CD在环中含有6(α-CD)、7(β-CD)或8(γ-CD)D-葡萄糖单体，形成可以将客体分子容纳到其疏水腔中的锥形。

图2：胆固醇与α-CD和n相互作用的聚类分析。环糊精对HaCaT角质形成细胞增殖的影响。温育48小时后，相对于对照标准化的至少六个独立测量值的平均值。顶部：ATP测定，底部：PicoGreen测定)。W6：α-CD，W6：β-CD，W7s HP：HP-β-CD。改进自Hipler,U.C.等人，(2007)“环糊精在体外对HaCaT角质形成细胞增殖的影响(Influence of cyclodextrinson the proliferation of HaCaT keratinocytes in vitro)”，J Biomed Mater Res A，83(1)，70-9。

图3A至图3C：脂质释放的特异性I。用环糊精处理的完整红细胞(3B)或鬼形红细胞(ghost erythrocyte)(3A和3C)释放磷脂(3A)、胆固醇(3B)和蛋白质(3C)。(○)α-环糊精；(●)β-环糊精；(△)γ-环糊精。改进自(Ohtani Y，Irie T等人，(1989)，European Journalof Biochemistry，186：17-22)。

图4A至图4B：脂质释放的特异性II。4A)在各种浓度的α-CD和β-CD存在下温育2小时后，从脑毛细血管内皮细胞(BCEC)释放的胆固醇。结果表示为与对照相比从BCEC释放的胆固醇的百分比。每个百分比是三个不同过滤器的平均值，代表两个独立实验系列。4B)分别在0.5、5和50mM的α-CD和β-CD存在下温育2小时后，从BCEC释放的磷脂酰胆碱(PC)(浅柱)和鞘磷脂(暗柱)。结果表示为与对照相比从BCEC释放的磷脂的百分比。每个百分比是三个不同过滤器的平均值，代表两个独立实验系列。改进自(Monnaert V，Tilloy S等人，(2004)，Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，310：745-51)。

图5：MβCD，而非αCD保护A2E免受氧化。双类维生素(bisretinoid)A2E是在眼脂褐素提取物中鉴定出的第一种化合物。通过5μM A2E溶液的UV可见吸收光谱的变化监测A2E免受氧化的保护。(5A)在所示环糊精(12mM)存在下，蓝光照射之前(●)和之后(○)的A2E氧化状态。(5B)在室温下在黑暗中在环糊精存在下温育后，在时间0(●)和1天(○)的A2E氧化状态。改进自(Nociari MM，Lehmann GL等人，(2014)，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences，111：E1402-E8)。

图，图例)

图9 EPIC的muGWAS结果的QR曲线图。(参见图1：环糊精，包括羟丙基环糊精。可以实现多达n×3取代度，可能具有许多位置异构体和区域异构体。R的取代基包括，但不限于，H(母体)、甲基(包括无规甲基化的)、丁基、2-羟丙基(HP)、乙酰基、琥珀酰基、葡糖基、麦芽糖基、羧甲基醚、磷酸酯、简单聚合物或羧甲基。典型的CD在环中含有6(α-CD)、7(β-CD)或8(γ-CD)D-葡萄糖单体，形成可以将客体分子容纳到其疏水腔中的锥形。

图2：胆固醇与α-CD和n相互作用的聚类分析。环糊精对HaCaT角质形成细胞增殖的影响。温育48小时后，相对于对照标准化的至少六个独立测量值的平均值。顶部：ATP测定，底部：PicoGreen测定)。W6：α-CD，W6：β-CD，W7s HP：HP-β-CD。改进自Hipler,U.C.等人，(2007)“环糊精在体外对HaCaT角质形成细胞增殖的影响(Influence of cyclodextrinson the proliferation of HaCaT keratinocytes in vitro)”，J Biomed Mater Res A，83(1)，70-9。

图3A至图3C：脂质释放的特异性I。用环糊精处理的完整红细胞(3B)或鬼形红细胞(ghost erythrocyte)(3A和3C)释放磷脂(3A)、胆固醇(3B)和蛋白质(3C)。(○)α-环糊精；(●)β-环糊精；(Δ)γ-环糊精。改进自(Ohtani Y，Irie T等人，(1989)，European Journalof Biochemistry，186：17-22)。

图4A至图4B：脂质释放的特异性II。4A)在各种浓度的α-CD和β-CD存在下温育2小时后，从脑毛细血管内皮细胞(BCEC)释放的胆固醇。结果表示为与对照相比从BCEC释放的胆固醇的百分比。每个百分比是三个不同过滤器的平均值，代表两个独立实验系列。4B)分别在0.5、5和50mM的α-CD和β-CD存在下温育2小时后，从BCEC释放的磷脂酰胆碱(PC)(浅柱)和鞘磷脂(暗柱)。结果表示为与对照相比从BCEC释放的磷脂的百分比。每个百分比是三个不同过滤器的平均值，代表两个独立实验系列。改进自(Monnaert V，Tilloy S等人，(2004)，Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，310：745-51)。

图5：MβCD，而非αCD保护A2E免受氧化。双类维生素(bisretinoid)A2E是在眼脂褐素提取物中鉴定出的第一种化合物。通过5μM A2E溶液的UV可见吸收光谱的变化监测A2E免受氧化的保护。(5A)在所示环糊精(12mM)存在下，蓝光照射之前(●)和之后(○)的A2E氧化状态。(5B)在室温下在黑暗中在环糊精存在下温育后，在时间0(●)和1天(○)的A2E氧化状态。改进自(Nociari MM，Lehmann GL等人，(2014)，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences，111：E1402-E8)。

图，图例)

图10 PBCS的ssGWAS结果的QR曲线图。(参见图1：环糊精，包括羟丙基环糊精。可以实现多达n×3取代度，可能具有许多位置异构体和区域异构体。R的取代基包括，但不限于，H(母体)、甲基(包括无规甲基化的)、丁基、2-羟丙基(HP)、乙酰基、琥珀酰基、葡糖基、麦芽糖基、羧甲基醚、磷酸酯、简单聚合物或羧甲基。典型的CD在环中含有6(α-CD)、7(β-CD)或8(γ-CD)D-葡萄糖单体，形成可以将客体分子容纳到其疏水腔中的锥形。

图2：胆固醇与α-CD和n相互作用的聚类分析。环糊精对HaCaT角质形成细胞增殖的影响。温育48小时后，相对于对照标准化的至少六个独立测量值的平均值。顶部：ATP测定，底部：PicoGreen测定)。W6：α-CD，W6：β-CD，W7s HP：HP-β-CD。改进自Hipler,U.C.等人，(2007)“环糊精在体外对HaCaT角质形成细胞增殖的影响(Influence of cyclodextrinson the proliferation of HaCaT keratinocytes in vitro)”，J Biomed Mater Res A，83(1)，70-9。

图3A至图3C：脂质释放的特异性I。用环糊精处理的完整红细胞(3B)或鬼形红细胞(ghost erythrocyte)(3A和3C)释放磷脂(3A)、胆固醇(3B)和蛋白质(3C)。(○)α-环糊精；(●)β-环糊精；(△)γ-环糊精。改进自(Ohtani Y，Irie T等人，(1989)，European Journalof Biochemistry，186：17-22)。

图4A至图4B：脂质释放的特异性II。4A)在各种浓度的α-CD和β-CD存在下温育2小时后，从脑毛细血管内皮细胞(BCEC)释放的胆固醇。结果表示为与对照相比从BCEC释放的胆固醇的百分比。每个百分比是三个不同过滤器的平均值，代表两个独立实验系列。4B)分别在0.5、5和50mM的α-CD和β-CD存在下温育2小时后，从BCEC释放的磷脂酰胆碱(PC)(浅柱)和鞘磷脂(暗柱)。结果表示为与对照相比从BCEC释放的磷脂的百分比。每个百分比是三个不同过滤器的平均值，代表两个独立实验系列。改进自(Monnaert V，Tilloy S等人，(2004)，Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，310：745-51)。

图5：MβCD，而非αCD保护A2E免受氧化。双类维生素(bisretinoid)A2E是在眼脂褐素提取物中鉴定出的第一种化合物。通过5μM A2E溶液的UV可见吸收光谱的变化监测A2E免受氧化的保护。(5A)在所示环糊精(12mM)存在下，蓝光照射之前(●)和之后(○)的A2E氧化状态。(5B)在室温下在黑暗中在环糊精存在下温育后，在时间0(●)和1天(○)的A2E氧化状态。改进自(Nociari MM，Lehmann GL等人，(2014)，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences，111：E1402-E8)。

图，图例)

图11 PBCS的muGWAS结果的QR曲线图。(参见图1：环糊精，包括羟丙基环糊精。可以实现多达n×3取代度，可能具有许多位置异构体和区域异构体。R的取代基包括，但不限于，H(母体)、甲基(包括无规甲基化的)、丁基、2-羟丙基(HP)、乙酰基、琥珀酰基、葡糖基、麦芽糖基、羧甲基醚、磷酸酯、简单聚合物或羧甲基。典型的CD在环中含有6(α-CD)、7(β-CD)或8(γ-CD)D-葡萄糖单体，形成可以将客体分子容纳到其疏水腔中的锥形。

图2：胆固醇与α-CD和n相互作用的聚类分析。环糊精对HaCaT角质形成细胞增殖的影响。温育48小时后，相对于对照标准化的至少六个独立测量值的平均值。顶部：ATP测定，底部：PicoGreen测定)。W6：α-CD，W6：β-CD，W7s HP：HP-β-CD。改进自Hipler,U.C.等人，(2007)“环糊精在体外对HaCaT角质形成细胞增殖的影响(Influence of cyclodextrinson the proliferation of hacat keratinocytes in vitro)”，J Biomed Mater Res A，83(1)，70-9。

图3A至图3C：脂质释放的特异性I。用环糊精处理的完整红细胞(3B)或鬼形红细胞(ghost erythrocyte)(3A和3C)释放磷脂(3A)、胆固醇(3B)和蛋白质(3C)。(○)α-环糊精；(●)β-环糊精；(△)γ-环糊精。改进自(Ohtani Y，Irie T等人，(1989)，European Journalof Biochemistry，186：17-22)。

图4A至图4B：脂质释放的特异性II。4A)在各种浓度的α-CD和β-CD存在下温育2小时后，从脑毛细血管内皮细胞(BCEC)释放的胆固醇。结果表示为与对照相比从BCEC释放的胆固醇的百分比。每个百分比是三个不同过滤器的平均值，代表两个独立实验系列。4B)分别在0.5、5和50mM的α-CD和β-CD存在下温育2小时后，从BCEC释放的磷脂酰胆碱(PC)(浅柱)和鞘磷脂(暗柱)。结果表示为与对照相比从BCEC释放的磷脂的百分比。每个百分比是三个不同过滤器的平均值，代表两个独立实验系列。改进自(Monnaert V，Tilloy S等人，(2004)，Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，310：745-51)。

图5：MβCD，而非αCD保护A2E免受氧化。双类维生素(bisretinoid)A2E是在眼脂褐素提取物中鉴定出的第一种化合物。通过5μM A2E溶液的UV可见吸收光谱的变化监测A2E免受氧化的保护。(5A)在所示环糊精(12mM)存在下，蓝光照射之前(●)和之后(○)的A2E氧化状态。(5B)在室温下在黑暗中在环糊精存在下温育后，在时间0(●)和1天(○)的A2E氧化状态。改进自(Nociari MM，Lehmann GL等人，(2014)，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences，111：E1402-E8)。

图，图例)

图12：PI循环。磷脂酰肌醇(PI)循环。磷脂酰肌醇(PI)由肌醇(由HMIT进口)和磷脂酸(PA)(经由CDP-DAG)合成，其可以由溶血磷脂酸(LPA)、PC或(胞质)磷脂酰丝氨酸(PS)合成，或由IP₃和DAG拯救(salvage)。它也可以由1-酰基GPI合成。箭头：PIP在3位、4位或5位被PI激酶磷酸化(从左到右)，并被大量磷酸酶水解(从右到左)。此GWAS中与BC相关的基因突出显示为反向(粗体：aGWS)。中心的宽箭头表示参与EEC的PIP序列。六边形：PI/PIP；PM：质膜，CCV：网格蛋白包被的囊泡，UCV：未包被的囊泡，EE：早期内体，LE：晚期内体，LY：溶酶体。反向基因名称表示与磷脂酰肌醇信号传导和/或内吞作用相关的基因。粗体箭头表示与内吞作用相关的PIP。

图13A和图13B：涉及muGWAS的基因与内吞作用过程(图13A)和胞吐作用/溶酶体功能阶段(图13B)的已知关系。方框：本公开内容中通过内/外胞吐阶段鉴定的基因：网格蛋白包被的囊泡(CCV)和E3泛素化的形成，失活整联蛋白(快速再循环)与活性整联蛋白的分离(慢速再循环)，分泌、溶酶体和(慢速)再循环途径之间的分选，以及溶酶体降解。下划线的基因分别是已知的乳腺癌启动子和抑制子。网格蛋白介导的内吞作用(CME)始于异源四聚体网格蛋白衔接子复合体AP-2与网格蛋白在富含PI(4,5)P₂的质膜(PM)位点的共组装。AP-2在其开放构象中募集网格蛋白和其它内吞蛋白，其中许多也与PI(4,5)P₂结合。网格蛋白包被的凹坑(CCP)成熟可伴随SHIP-2介导的PI(4,5)P₂至PI(4)P的去磷酸化。PI(3,4)P₂的合成对于PX-BAR结构域蛋白SNX9在收缩CCP处的组装是必需的，并且可能与PI(4,5)P₂经由突触小泡磷酸酶水解成PI(4)P并行发生，从而通过网格蛋白依赖性募集和活化PI3KC2α(一种II类PI3激酶)来促进辅助蛋白依赖性囊泡脱膜。PI(3,4)P₂最终可以通过4-磷酸酶INPP4A/B(内体GTP酶Rab5的效应物)在途中转化为PI(3)P，然后进入内体。改编自Posor,Y.，Eichhorn-Grunig,M.，和Haucke,V，(2015)“内吞作用中的磷酸肌醇(Phosphoinositidesin endocytosis)”，Biochim Biophys Acta，1851(6)，794-804。在早期内体(EE)中，对β1整联蛋白进行分选。失活的整联蛋白进行快速“短环”再循环；活性整联蛋白进入晚期内体(EE)/多囊体(MVB)，用于缓慢的“长组”再循环(RAB11)，溶酶体变性(除非被RAB25/CLIC3拯救)，或经由RAB9介导的跨高尔基体网络(TGN)分泌。表皮生长因子受体的快速再循环驱动增殖，因此可以预期图8a中的功能获得突变。参见Tomas,Alejandra,Futter,Clare E.,和Eden,Emily R，(2014)“EGF受体运输：信号传导和癌症的后果(EGF receptortrafficking:consequences for signaling and cancer)”，Trends in Cell Biology，24(1)，26-34。溶酶体和突触小泡胞吐作用具有许多相似性。内溶酶体定位的PIP可以调节溶酶体运输(部分来源于Kegg途径hsa04144和hsa04721)。改编自Samie,M.A.和Xu,H，(2014)“溶酶体胞吐作用和脂质储存病症(Lysosomal exocytosis and lipid storagedisorders)”，J Lipid Res，55(6)，995-1009。参见Bohdanowicz,M.和Grinstein,S，(2013)“磷脂在内吞作用、吞噬作用和巨胞饮作用中的作用(Role of phospholipids inendocytosis,phagocytosis,and macropinocytosis)”，Physiol Rev，93(1)，69-106；Hesketh,G.G.等人，(2014)“VARP通过与逆转运复合体直接相互作用被募集到内体上，其中它们一起在输出到细胞表面中起作用(VARP is recruited on to endosomes by directinteraction with retromer,where together they function in export to the cellsurface)”，Dev Cell，29(5)，591-606；Mosesson,Yaron,Mills,Gordon B.,和Yarden,Yosef(2008)，“脱轨的内吞作用：癌症的新兴特征(Deraled endocytosis：an emergingfeature of cancer)”，Nat Rev Cancer，8(11)，835-50；Schmid,Sandra L.和Mettlen,Marcel(2013)，“细胞生物学：脂质开关和交通控制(Cell Biology：Lipid Switches andTraffic Control)”，Nature，499(7457)，161-62。

图14：肿瘤细胞通过组织屏障迁移和侵袭的内吞机制。该图显示了游动细胞，其前进的片状伪足定向移动(箭头)。示意性地显示了粘着斑(FA)，并且整联蛋白异二聚体存在于其上。细胞迁移需要极化的内吞作用和FA复合物的运输。整联蛋白内化由发动蛋白和蛋白激酶(诸如FAK和蛋白激酶Cα(PKCα))控制，发动蛋白由微管(未示出)激活。质膜的网格蛋白和小窝蛋白1(CAV1)包被结构域都参与整联蛋白的内化。一旦在早期内体(EE)中，整联蛋白可被分选以在溶酶体中降解，通过RAB4依赖性途径再循环到质膜，或转运到核周再循环隔室(PNRC)。从PNRC的再循环需要Rab11家族成员，诸如RAB25，并且对于一些整联蛋白异二聚体，还需要蛋白激酶B(PKB)-GSK3β(糖原合酶激酶-β)轴，ARF6或PKC的某些同种型。人肿瘤通常异常表达RAB25，显示生长因子诱导的整联蛋白异二聚体的特异性所有组成成分，或呈现异常稳定的微管，其促进整联蛋白的运输。FAK、整联蛋白、RAB25和PKB具有与肿瘤发生相关的功能和/或在人肿瘤中显示异常表达。改进自Mosesson,Yaron,Mills,Gordon B.,和Yarden,Yosef(2008)，“脱轨的内吞作用：癌症的新兴特征(Deraled endocytosis:anemerging feature of cancer)”，Nat Rev Cancer，8(11)，835-50。

图15：阿尔茨海默病(AD)中的EEC。APP在ER中合成，转运至TGN，并经由分泌囊泡***质膜。细胞表面APP可以内化到内体中，从中可以将其再循环回到细胞表面或递送到溶酶体用于降解。在EE内，酸性环境有利于Aβ的产生，Aβ可以在溶酶体中被组织蛋白酶降解，在EE中累积，或经由胞吐作用释放到胞外空间。改进自Chen,X.等人，(2014)“改变的胆固醇细胞内运输和散发性AD的病理标志的发展(Altered Cholesterol IntracellularTrafficking and the Development of Pathological Hallmarks of Sporadic AD)”，JParkinson Dis Alzheimers Dis，1(1)。

图16：帕金森病(PD)中的EEC。内吞进入后，货物(cargo)被运输到早期内体。由此，货物可以直接或经由再循环内体再循环回到质膜。另选地，货物可以保留在EE中其将形成LE/MVB，并与溶酶体融合以降解。同时，货物在EE和跨高尔基体网络(TGN)之间运输。这些过程的改变导致功能障碍的溶酶体和对细胞有毒的未降解大分子的累积。改编自Schreij,A.M.，Fon,E.A.和McPherson,P.S，(2015)“内膜运输和神经退行性疾病(Endocyticmembrane trafficking and neurodegenerative disease)”，Cell Mol Life Sci。

图17：动脉粥样硬化(CAD)中的巨胞饮。随着内吞进入，LDL被转运至溶酶体进行降解。溶酶体过程的缺陷导致LDL的累积。巨噬细胞(MΦ)变成泡沫细胞，其累积形成动脉粥样硬化斑。

图18A至18C：癌症(A)、AD/PD(B和CAD(C)中的溶酶体功能障碍。公开的结果表明，跨疾病的溶酶体功能障碍的重叠遗传危险因素，导致溶酶体清除

降低，并且在癌症中，整联蛋白从溶酶体的恢复增加。

图19：病毒“劫持(Hijacking)”内吞作用。病毒颗粒依赖于网格蛋白介导的内吞作用进入细胞。CCV：网格蛋白包被的囊泡。改进自(Blaising J,Polyak SJ等人，(2014)Antiviral research，107：84-94)中的图2。

图20：AD小鼠细胞中的MβCD。MβCD(MbetaCD)引起α分泌酶裂解产物C83(A)水平的增加，和细胞内APPsβ(A和B)水平的降低。APPsα水平在来自MβCD处理细胞的培养基中增加，而APPsβ水平无变化(C和D)。(改编自(Cole SL,Grudzien A等人，(2005)J Biol Chem，280：18755-70))。

图21：错误！未找到参考源。a-Syn的清除。错误！未找到参考源。介导的a-syn聚集体的清除并不取决于错误！未找到参考源。的能力以改变胆固醇水平。未处理或用错误！未找到参考源。(1mM)或错误！未找到参考源。胆固醇复合物(1mM)处理24小时的H4/a-syn-GFP细胞。报告代表性图像。图21A)使用FLAG特异性抗体的TFEB亚细胞定位的免疫荧光显微镜分析。比例尺表示10μm。图21B)a-syn-GFP荧光显微镜分析。比例尺代表20μm。改进自(Kilpatrick K,Zeng Y等人，(2015)PLoS One，10：e0120819)图6。

图22：小鼠脑内胆固醇累积。未酯化的胆固醇(UC)在不同CD处理的3周龄小鼠脑细胞中的累积。未经菲律宾菌素染色的新皮质背侧荧光显微照片检测UC。皮层用罗马数字标记。实际上，未经处理的Npc1^-/-小鼠中的所有神经元显示UC的阳性细胞质染色(白斑)，而Wt小鼠中的那些神经元是阴性的。HPβCD显示UC储存的高度有效减少。HPαCD UC储存虽然明显减少，但作者报道为“基本上相当于未经处理的小鼠”。改进自(Davidson CD,Fishman YI等人，(2016)，Ann Clin Transl Neurol，3：366-80，图1)。

图23：溶酶体贮积病中的CD。应用溶酶体红色荧光探针(lysotracker red)染色的环糊精的作用表明ML111成纤维细胞中溶酶体的增大。Wolman(LAL)，TSD，Fabry(GLA)，Farber(AC)，MPSIIB：粘多糖II型B(NAGLU)，NPA：A型尼曼-皮克(ASM)，HBCD：HPβCD(Kleptose)。根据发明人的观点，“其它[环糊精]没有那么深远的影响”(McKew J，ZhengWEI等人(2014))。然而，被忽略的是，6mM错误！未找到参考源。(MBCD剂量的1/5)的作用比8mM HPβCD的作用更深远。改进自(McKew J，Zheng WEI等人，(2014))。

图24：胞饮作用/吞噬作用/内吞作用：在所有三种加工途径中，巨胞饮作用、吞噬作用和内吞作用通过PI循环和溶酶体功能障碍以相同方式调节，导致具有不需要功能的底物被排出。参见Sole-Domenech，S.等人，(2016)“健康、衰老和阿尔茨海默病期间小神经胶质细胞中的内吞途径(The endocytic pathway in microglia during health,aging andAlzheimer's disease)”，Ageing Res Rev，32，89-103，图1。

图25：HPβCD治疗激活自噬。HPβCD激活自噬。错误！未找到参考源。的施用导致转录因子EB TFEB的活化。当从细胞质转移到细胞核时，TFEB调节参与溶酶体和自噬体的生物发生和融合的基因的表达。结果，错误！未找到参考源。施用导致自噬底物蜡样脂色素的清除增加。然而，错误！未找到参考源。改善TFEB激活的机制尚不清楚(改编自(Song W，Wang F等人，(2014)，J Biol Chem，289：10211-22))。

图26：HP-β-环糊精活化TFEB。

图27：多发性硬化症(MS)中的吞噬作用/内吞作用。MS病因的恶性循环始于健康髓鞘的小神经胶质细胞吞噬髓磷脂的探针。如果溶酶体(LY)失去丢弃所有这些探针的能力，则其中的一些作为T细胞和B细胞的抗原呈递，然后其穿过血脑屏障以激活外周MΦ。然后这些MΦ渗透CNS并且胞吞髓磷脂用于破坏。改进自Luo,C.等人(2017)“小神经胶质细胞在多发性硬化症中的作用(The role of microglia in multiple sclerosis)”，Neuropsychiatr Dis Treat，13，1661-67；Salter,M.W.和Stevens,B.(2017)“小神经胶质细胞正在成为脑部疾病的核心参与者(Microglia emerging as central players inbrain disease)”，Nat Med，23(9)，1018-27。AD和Rett综合征涉及等效机制。参见Prinz,M.和Priller,J.(2014)“分子时代中的小神经胶质细胞和脑巨噬细胞：从起源到神经精神疾病(Microglia and brain macrophages in the molecular age:from origin toneuropsychiatric disease)”，Nat Rev Neurosci，15(5)，300-12。

图28：甲基-β环糊精(MβCD)恢复表面张力。具有BLES(27mg/ml BLES，在对照CBS缓冲液(方格条)中、50％w/w FFA(油酸[，OA])中或在(MβCD)对照CBS缓冲液(水平条)或含有40mg/ml(MβCD)的缓冲液(实心黑色条)中)的动态循环20期间的最小表面张力。(**p≤0.01，***p≤0.001)。具有FFA或(MβCD)的BLES显示出明显的损伤，其在(MβCD)存在下被修复为正常功能。在这些实验中，胆固醇以非常低的浓度(约2.1％)存在。改进自补充图S6(Gunasekara L，Al-Saiedy M等人，(2017)，Journal of cystic fibrosis:officialjournal of the European Cystic Fibrosis Society)。

图29：HaCaT增殖。环糊精对HaCaT角质形成细胞增殖的影响。温育48小时后，相对于对照标准化的至少六个独立测量值的平均值。顶部：ATP测定，底部：PicoGreen测定)。W6：α-CD，W6：β-CD，W7s HP：HP-β-CD。改进自Hipler,U.C.等人，(2007)“环糊精在体外对HaCaT角质形成细胞增殖的影响(Influence of cyclodextrins on the proliferation ofHaCaT keratinocytes in vitro)”，(J Biomed Mater Res A，83(1)，70-9。

图30：HaCat半胱天冬酶3/7活性。环糊精对自发永生化非整倍体人(HaCat)角质形成细胞半胱天冬酶3/7活性的影响。温育(24小时)后相对于对照和蛋白质含量标准化的(至少六个独立测量值)的平均值。W6：α-CD，W6：β-CD，W7s HP：HP-β-CD。改进自Hipler,U.C.等人，(2007)“环糊精在体外对HaCaT角质形成细胞增殖的影响(Influence ofcyclodextrins on the proliferation of HaCat keratinocytes in vitro)”，J BiomedMater Res A，83(1)，70-9。

图31：HaCaT乳糖脱氢酶。环糊精对自发永生化非整倍体人(HaCaT)角质形成细胞乳糖脱氢酶(LDH)的影响。温育(48小时)后相对于对照和蛋白质含量标准化的(至少六个独立测量值)的平均值。W6：α-CD，W6：β-CD，W7s HP：HP-β-CD。改进自Hipler,U.C.等人，(2007)“环糊精在体外对HaCaT角质形成细胞增殖的影响(Influence of cyclodextrins on theproliferation of HaCaT keratinocytes in vitro)”，J Biomed Mater Res A，83(1)，70-9。

图32：羟丙基-环糊精(HP-CD)提高溶解度。HP-CD增强脂质的表观溶解度。表示为“0”的柱表示在等渗磷酸盐缓冲盐水中的表观溶解度；由α、β和γ表示的那些代表在相同盐水中的溶解度，但各自补充有浓度为5％(w/w)的HP-CD。改进自：(Irie T，Fukunaga K等人(1992)J Pharm Sci，81：524-8)，图1。

图33：错误！未找到参考源。和β-CD)的肾毒性。EMA(以及其它一些作者)对大鼠中与肠胃外施用错误！未找到参考源。和β-CD)相关的类似风险的2017年评估是基于一项单一研究(Frank DW，Gray JE等人，(1976)，Am J Pathol，83：367-82)。

图34：CD的耳毒性。通过12周龄听觉脑干反应(ABR)记录评估不同CD的耳毒性。单个小鼠的听力阈值图揭示了除了HPγCD外，用特定CD治疗的小鼠的微小可变性，其中听力阈值更易变。改进自(Davidson CD，Fishman YI等人，(2016)，Ann Clin Transl Neurol，3：366-80，图5B)。

图35：环糊精对乳腺癌细胞创伤愈合。水平虚线表示分别在1mM和4mM时HPαCD中伤口愈合的抑制。以MCF-7和MDA-MB-231作为(固定的)块显示HPαCD对HPβCD的ANOVA P值：

1mM HPαCD对1mM HPβCD，p＝.0001

1mM HPαCD对2mM HPβCD，p＝.0252

4mM HPαCD对4mM HPβCD，p＝.0442

(改进自(Wittkowski KM，Dadurian C等人，(2018)，PLoS One，13：e0199012)。

图36：伤口愈合试验：改进自Cell Biolabs Inc.，Assay CBA-120。

图37：PL选择性的影响：HP-α-CDs*仅清除PC和PS(以及可能的PI)，但既不清除PA，也不清除溶血磷脂，包括但不限于LPC和LPA。(背景：图7的左上角)

图38A和图38B：通过治疗的BCa体重(A)和肿瘤体积(B)。示出了单独的曲线和中值。图38A：底部的和曲线中的“+”表示由于未知原因死亡。图38B：HP-α-CD和错误！未找到参考源。都是有效的(总治疗效果，日*治疗(D*T)<.001，以小鼠作为随机因子的ANOCA)。HP-α-CD比错误！未找到参考源。更有效(成对治疗效果，日*治疗(D*T|a：b)＝.0258，以小鼠作为随机因子的ANOCA)。

图39：BCa肺与肝转移。P值来自经由多元数据的u统计量对双变量(肺脏/肝脏)数据进行成对对比(Wittkowski KM，Lee E等人，(2004)，Stat Med，23：1579-92)。

图40：BCa血浆细胞因子。各个P值来自两个样品t检验p(b)：HPbCD v.溶媒，p(a)：HPaCD相对溶媒，p(a：b)：HPaCD相对HPbCD。经由多变量数据的u统计量来计算所有六种细胞因子的总P值(Wittkowski KM，Lee E等人，(2004)，Stat Med，23：1579-92)。

图41：HTT小鼠：体重。估计值为平均值±SD，总体和性别的治疗*日交互作用(P(T*D))的P值(F：雌性，M：雄性)源自混合模型ANOVA，其中小鼠为随机因子。

图42：SOD1小鼠：体重。估计值为平均值±SD，总体和性别的治疗*日交互作用(P(T*D))的P值(F：雌性，M：雄性)源自混合模型ANOVA，其中小鼠为随机因子。

图43：晨尿的FPLC：HP-α-CD从摄取包合物(完整环)后的晨尿中回收，但未修饰的HP-α-CD(开口环)未被***。服用包合物后，更多的磷脂(主要是PC，但也可能是PE)被***，但胆固醇(Chol)没有被***(不出所料)，任何溶血PL也没有被***(出乎意料)。

图44：晨尿的FPLC II：A：这：与图43A类似，这图显示更多的包合物从肠中吸收(左侧类别2，与建议用作渗透增强剂的混悬液相比，更多的磷脂酰胆碱被提取到尿液中，以获得从肠道吸收的大分子(Tuvia,Shmuel等人(2014)“新型混悬液配方经由瞬时和可逆转运机制增强大分子的肠道吸收(A Novel Suspension Formulation Enhances IntestinalAbsorption Of Macromolecules Via Transient and Reversible TransportMechanisms)”，Pharmaceutical Research，31(8)，2010-21.)。

图45：βCD临床功效的体内证据。βCD在BC、PD、AD、CAD、SLE/ALS/MS，CF/IPF、NAFLD/NASH和T2DM的动物模型中的功效始终归因于βCD清除胆固醇(Chol，虚线箭头)的能力，这带来了现在众所周知的胆固醇介导的耳毒性的风险。然而，很少解释胆固醇减少应该改善各种表型的机制。临床结果还显示在这些疾病中的几种中磷脂上调。然而，βCD也清除磷脂(Px)，因此也下调PI循环(中心)，这直接有益于各种疾病表型(实线箭头)。

图46：HPαCD恢复LY功能：已显示HPβCD激活转录因子EB(TFEB)，但其作用机制尚不清楚(Song W，Wang F等人，(2014)，J Biol Chem，289：10211-22；Sardiello M(2016)，AnnN Y Acad Sci，1371：3-14；Moors TE，Hoozemans JJ等人，(2017)，Mol Neurodegener，12：11；Kilpatrick K，Zeng Y等人，(2015)，PLoS One，10：e0120819)。意外的遗传学结果经尿液分析结果证实，改编自(Sardiello M(2016)，Ann N Y Acad Sci，1371：3-14；Moors TE，Hoozemans JJ等人，(2017)，Mol Neurodegener，12:11；Medina DL,Ballabio A，(2015)，Autophagy，11：970-1；Kim S,Choi KJ,等人，(2016)，Sci Rep，6：24933；Martini-StoicaH,Xu Y等人，(2016)，Trends Neurosci，39:221-34)。

具体实施方式

本公开部分地基于发现某些疾病相关的基因集合，该发现基于对三组独立的乳腺癌遗传数据的再分析，这三组独立的乳腺癌遗传数据可从美国国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health)的dbGaP集合获得用于分析。这种再分析与以前的分析不同，它使用了一种新颖的计算生物统计学方法。Transl Psychiatry，4，e354。如实施例中详细描述的，该方法(Wittkowski 2008)解决了以下四个要点(使用传统的生物信息学方法对同一数据进行的先前分析未能考虑的)：(i)危险等位基因与发病率之间的非相加关系，(ii)顺式上位相互作用，(iii)显著性与次要等位基因频率或“MAF”之间的相关性，以及(iv)非随机化偏差。其还解决了二倍体长度的多重性调整(multiplicity adjustment for diplotypelength)，这是由于使用宽位点方法(wide-locus approach)引起的问题。通过解决这些问题，相同的策略先前鉴定了孤独症特异性基因的两个新集合。Transl Psychiatry，4，e354。

本文提供的基因的一个集合(图，左上角)包含8个基因，其作用包括提供具有其底物PI的磷脂酰肌醇(PI)循环。在AD中，“PI是可以在痴呆症状发作前两年的多达90％的病例中准确预测记忆丧失的10种血清脂质之一”。Biochim Biophys Acta，1851(8)，1066-82。第二基因簇包含与内吞作用直接相关联的基因，内吞作用是由PI磷酸酶(PIP)控制的过程(表5，栏PI/EC)。这些阶段包括，但不限于，网格蛋白包被的囊泡和早期内体(磷脂酰肌醇(PI)循环的内陷和形成。磷脂酰肌醇(PI)由肌醇(由HMIT进口)和磷脂酸(PA)(经由CDP-DAG)合成，其可以由溶血磷脂酸(LPA)、PC或(胞质)磷脂酰丝氨酸(PS)合成，或由IP3和DAG拯救。其也可以由1-酰基GPI合成。箭头：PIP在3位、4位或5位被PI激酶磷酸化(从左到右)，并被大量磷酸酶水解(从右到左)。此GWAS中与BC相关的基因突出显示为反向(粗体：aGWS)。中心的宽箭头表示参与EEC的PIP序列。六边形：PI/PIP；PM：质膜，CCV：网格蛋白包被的囊泡，UCV：未包被的囊泡，EE：早期内体，LE：晚期内体LY：溶酶体。反向基因名称表示与磷脂酰肌醇信号传导和/或内吞作用相关联的基因。粗体箭头表示与内吞作用相关联的PIP。

)。基于这一发现，本公开部分地提供了癌症治疗的焦点从控制细胞生长，甚至在老年受试者中涉及许多重要功能的过程，转变到更多地控制细胞的迁移和侵袭，主要在产前和出生后早期发育期间相关的过程。基于这些发现，如本文详细描述的，在一些实施方案中，本公开提供了用于通过调节PI循环及其活性来治疗恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症的组合物和方法。此外，在一些实施方案中，并且部分基于PI的参与，本公开提供可用于治疗恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症的组合物和方法，该疾病或病症在例如成年期期间，其中细胞迁移(包括神经元生长)大部分已停止，而细胞生长(诸如，毛发、皮肤的生长)仍在继续，并且其中其它细胞机制可能以年龄依赖性方式下降。

在另一部分中，本公开基于对公开的发现的解释的再评估，其通常被认为断言α-CD与β-环糊精一样具有肾毒性，尽管β-环糊精主要表现出肾毒性，但它的水溶性比α-CD低得多，因此形成在大鼠肾脏中见到的长细胞质晶体的风险更高。例如，HaCaT细胞增殖、半胱天冬酶活性和乳糖脱氢酶表明，αCD对βCD的毒性较低(通常在更安全的HPβCD水平)。

总之，“[食品添加剂专家联合]委员会(JECFA)通过该化合物在动物中的相对低毒性以及毒性低于β-环糊精的事实得到了重新确认，对于β-环糊精可进行人耐受性的研究”。WHO/JECFA食品添加剂系列(WHO/JECFA Food Additive Series)48，1030(2001)。

在另一实施方案中，通过降低递送速率进一步降低肾毒性，该方法包含每天重复剂量，Am J Pathol，83(2)，367-82，经由蠕动泵在数小时内施用药物，Pitha,J和Szente,L(1982)，“肠胃外应用中的环糊精和同类药物(Cyclodextrins and Congeners inParenteral Applications)”，Proceedings of the First International Symposium onCyclodextrins(Springer荷兰)，457-66，或经由植入的药物递送系统连续施用药物。

本公开的一些主要实施方案描述于本申请的以上发明内容部分以及实施例、附图和权利要求中。该具体实施方式部分提供了与本公开的组合物和方法相关的附加描述，并且旨在结合本专利申请的所有其它部分来阅读，包括本申请的发明内容、实施例、附图和权利要求部分。

I.缩写和定义

缩写“aCD”和“αCD”是指α-环糊精。

缩写“AD”是指阿尔茨海默病。

缩写“AKT”是指蛋白激酶B。

缩写“bCD”和“βCD”是指β-环糊精。

缩写“Ca”是指钙。

缩写“CD”是指环糊精。

缩写“CDK”是指细胞周期蛋白依赖性激酶。

缩写“CGEM”是指易感性的癌症遗传标记。

缩写“Chr”是指染色体。

缩写“dbGaP”是指基因型和表型数据库。

缩写“DNA”是指脱氧核糖核酸

缩写“EC”是指内吞作用。

缩写“EE”指早期内体。

缩写“EPIC”是指欧洲对癌症的前瞻性研究。

缩写“ER”是指内质网

缩写“FAK”是指粘着斑激酶。

缩写“Fc”是指可结晶的片段

缩写“gCD”和“γCD”是指γ-环糊精。

缩写“GPCR”是指G蛋白偶联受体。

缩写“GWAS”是指全基因组关联研究。

缩写“GRAS”是指通常认为是安全的。

缩写“HA”是指透明质酸

缩写“HER2/neu”是指受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2。

缩写“HLA”指人白细胞抗原。

缩写“HP”是指羟丙基。

缩写“HPaCD”和“HPαCD”是指羟丙基-α-环糊精。

缩写“HPbCD”和“HPβCD”是指羟丙基-β-环糊精。

缩写“IND”是指研究中的新药。

缩写“IPV”是指p值的倒数。

缩写“i.v.”指静脉内。

缩写“LD”是指连锁不平衡。

缩写“LD₅₀”是指半数致死剂量。

缩写“LE”指晚期内体。

缩写“MAF”指次要等位基因频率。

缩写“MAP”是指丝裂原活化蛋白。

缩写“mTOR”是指雷帕霉素的机械靶标。

缩写“muGWAS”是指多元u统计GWAS。

缩写“NIH”是指美国国立卫生研究院。

缩写“NPC”是指C型尼曼-皮克病。

缩写“PBCS”是指波兰乳腺癌病例对照研究。

缩写“PD”是指帕金森病。

缩写“PI”是指磷脂酰肌醇。

缩写“PIP”是指磷脂酰肌醇磷酸酯

缩写“PIP”是指PI(4)P。

缩写“PIP2”是指PI(4,5)P₂。

缩写“PIP3”是指PI(3,4,5)P₃。

缩写“PM”是指质膜。

缩写“PKB”指蛋白激酶B。

缩写“PKC”指蛋白激酶C。

缩写“QQ”是指“分位数-分位数”。

缩写“QR”是指“分位数排序”。

缩写“RTK”是指受体酪氨酸激酶。

缩写“s.c.”指皮下。

缩写“SNP”是指单核苷酸多态性。

缩写“ssGWAS”是指单SNP全基因组关联研究。

缩写“TSC”是指结节性硬化症。

除非明确指出相反，否则本说明书和权利要求书中所用的不定冠词“一(a)”和“一(an)”应理解为意指“至少一个”。

在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应当理解为意指如此结合的要素(即，在一些情况下结合地存在而在其它情况下分离地存在的要素)中的“一个或两个”。除了由“和/或”子句具体标识的要素之外，可以任选地存在其它要素，除非清楚地相反指示，否则与具体标识的那些要素相关或无关。因此，作为非限制性示例，当与诸如“包含”的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的引用可以在一个实施方案中指代不含B的A(任选地包括除B以外的要素)；在另一个实施方案中，指代不含A的B(任选地包括除A以外的要素)；在又一个实施方案中，指代A和B(任选地包括其它要素)；等。

如本文说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为具有与上文定义的“和/或”相同的含义。例如，当将列表中的项目分开时，“或”或“和/或”应被解释为包括性的，即包括多个要素或要素列表中的至少一个，但也包括多于一个，并且任选地包括其它未列出的项目。只有清楚地相反指示的术语，诸如“仅一个01”或“恰好其中的一个”，或当在权利要求中使用时，“由……组成”将指的是包括多个要素或要素列表中恰好一个要素。通常，本文所用术语“或”当在权利要求中使用时，当在排他性术语，“任一”，“其中一个”，“仅一个”或“恰好一个”，“基本上由……组成”之前时，应当仅被解释为指示排他性替换(即，“一个或另一个但不是两个”)，应当具有专利法领域的一般含义。

本文所用的术语“约”是指可测量的值，诸如量、持续时间等，其意在涵盖特定值的+/-20％，+/-10％，+/-5％，+/-1％，+/-0.9％，+/-0.8％，+/-0.7％，+/-0.6％，+/-0.5％，+/-0.4％，+/-0.3％，+/-0.2％或+/-0.1％的变化，因为这些变化适于执行所公开的方法。

如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”涵盖旨在临床结果的期望变化的各种活动。例如，如本文所用，术语“治疗(treat)”涵盖恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症等(诸如癌症，包括，但不限于，，或神经退行性疾病，包括，但不限于，帕金森病和阿尔茨海默病，或冠状动脉疾病，包括，但不限于，动脉粥样硬化，或消化病症，包括，但不限于，2型糖尿病)的一种或多种临床指标或症状的任何可检测的改善。例如，这样的术语涵盖缓解(alleviating)、减轻、改善、缓解(relieving)、减少、抑制、预防或减缓至少一种临床指标或症状，预防其它临床指标或症状，减少或减缓一种或多种临床指标或症状的进展，引起一种或多种临床指标或症状的消退，缓解由疾病或病症引起的病症等。如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”涵盖预防性治疗和治疗性治疗。一方面，“治疗(treat)”，“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指治疗性治疗。在预防性治疗的情况下，本文提供的方法和组合物可预防性地用于尚未表现出疾病或病症的任何明确或可检测的临床指标或症状但被认为处于发展疾病或病症(诸如恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症)的风险中的受试者。在治疗性治疗的情况下，本文提供的方法和组合物可用于已经表现出疾病或病症(诸如恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症)的一种或多种临床指标或症状的受试者。在恶性或神经退行性疾病或病症的情况下，医学从业者和本领域技术人员已知各种临床指标和症状。

本文所用的术语“预防(prevent)”或“预防(preventing)”涵盖阻止疾病、病症或症状开始，以及减少或减缓疾病或病症的进展或恶化。例如，“预防”乳腺癌或***癌包括，但不限于，抑制癌细胞的形成或抑制恶性生长的转移。

术语“恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症”在本文中根据其在本领域中的常规用法使用，并且包括，但不限于，恶性病症，诸如癌、乳腺癌、***癌、乳腺恶性肿瘤和***恶性肿瘤，以及神经退行性疾病和病症，诸如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病以及“一系列病症，包括脑过度生长综合征，[和]腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth)神经病”。Biochim Biophys Acta，1851(8)，1066-82。

如本文所用，术语“癌症”或“过度增殖性疾病”是指以细胞过度增殖为特征的那些疾病和病症。过度增殖性疾病的示例包括所有形式的癌症、牛皮癣、瘤形成和增生。

术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，是指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选为人。哺乳动物包括，但不限于，鼠类、猿类、人类、农场动物、牛、猪、山羊、绵羊、马、狗、竞技动物(sport animal)和宠物。体内获得或体外培养的组织、细胞及其后代也涵盖在术语受试者的定义中。在一些实施方案中，在整个说明书中还使用术语“受试者”来描述从中获取细胞样品的动物或已经施用了所公开的细胞或核酸序列的动物。在一些实施方案中，该动物为人。对于特定受试者(例如，人)特异性的那些病况的治疗，术语“患者”可以互换使用。在本公开的说明书的一些情况下，术语“患者”将是指患有特定疾病或病症的人类患者。在一些实施方案中，受试者可以是从其分离或提供了内皮细胞样品的非人类动物。术语“哺乳动物”涵盖人类和非人类，包括但不限于人类，非人灵长类、犬、猫、鼠、牛、马、山羊和猪。

本文所用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现或有助于实现一种或多种所需临床结果的本文所述活性剂的量，诸如上文“治疗”描述中所述的那些，并且还包括治疗由溶酶体功能障碍引起的任何溶酶体贮积病。在任何个体情况下，合适的“有效”量可以使用本领域已知的标准技术确定，诸如剂量递增研究。在一些实施方案中，如本文所用，术语“治疗有效量”是指对于癌症而言，有效改善或预防症状，缩小肿瘤大小，预防癌症从非转移性疾病发展为转移性疾病，或延长治疗癌症或神经退行性疾病的患者的存活的活性剂或剂组合的量。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。

在一些实施方案中，环糊精或其衍生物或其药学上可接受的盐可以与其它治疗剂和/或包括放射疗法的治疗方案的一部分共同施用。

“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适用于与受试者(诸如，人和其它哺乳动物)的组织接触而无不适当的毒性、刺激、过敏反应等并与合理的益处/风险比相称的组分。这些包括，但不限于，由联邦或州政府的管理机构或除美国以外的国家中的相应机构批准或管制批准的组分，或在美国药典或其它公认的药典列出的用于动物以及在一方面用于人的组分。

“药学上可接受的盐”是指本公开的化合物的盐，其是药学上可接受的并且具有本公开的化合物的所需的药理学活性。特别地，这样的盐是无毒的，可以是无机或有机酸加成盐和碱加成盐。具体地，药学上可接受的无毒酸包括盐酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸、磷酸、草酸、二氯乙酸等。药学上可接受的无毒碱包括诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化胆碱、碳酸钠等。

术语“药学上可接受的载体”是指无毒的载体(carrier)、佐剂或溶媒(vehicle)，其不破坏与其一起配制的化合物的药理学活性。可用于本文所述组合物中的药学上可接受的载体、佐剂或溶媒包括，但不限于，离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白(诸如人血清白蛋白)，缓冲物质(诸如磷酸盐)，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸、水、盐或电解质的部分甘油酯混合物(诸如硫酸鱼精蛋白)，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素基物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。

治疗剂的共同施用可以顺序或同时进行。在一些实施方案中，环糊精或其衍生物或其药学上可接受的盐与多于一种其它治疗剂共同施用。化学治疗剂的示例包括常见的细胞毒性或细胞抑制药物，诸如：甲氨蝶呤(氨甲蝶呤)、多柔比星(阿霉素)、柔红霉素、胞嘧啶***糖苷(cytosinarabinoside)、依托泊苷、5-4-氟尿嘧啶、美法仑、苯丁酸氮芥和其它氮芥(例如环磷酰胺)、顺铂、长春地辛(和其它长春花生物碱)、丝裂霉素和博来霉素。其它化学治疗剂包括：嘌呤硫素(purothionin)(大麦粉寡肽)、大分子霉素(macromomycin)、1,4-苯醌衍生物和三亚胺醌(trenimon)。抗癌抗体(诸如赫赛汀)和毒素也是其它另外的治疗剂的示例。

治疗方案可以包括按任意顺序或同时连续施用环糊精或其衍生物或其药学上可接受的盐和开始放射治疗。本领域技术人员可以容易地制定合适的放射治疗方案。CarlosA Perez和Luther W Brady：Principles and Practice of Radiation Oncology，第2版。JB Lippincott Co，Phila，1992描述了可用于本公开的放射疗法方案和参数，其全部内容通过引用并入本文。

当用作联合疗法的一部分时，可以调节抑制剂的治疗有效量，使得该量小于如果在没有其它治疗程序的情况下使用时有效所需的剂量。

在一些实施方案中，在用本文所述的药物组合物治疗之前进行手术干预。

本公开还涉及通过使所述癌细胞与治疗有效量的环糊精接触来减少癌细胞中外泌体数目的方法。

本文所用的术语“药物组合物”是指包含至少一种本文所述的活性剂(诸如例如(α-CD))和一种或多种适用于药物递送的其它组分(诸如药学上可接受的载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂、赋形剂等)的组合物。在一些实施方案中，本公开涉及一种药物组合物，其包含α-CD或其诸如HPα-CD的衍生物以及一种或多种脂肪酸和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，本公开涉及一种药物组合物，其包含α-CD或其诸如HPα-CD的衍生物以及一种或多种脂肪酸，使得α-CD或其诸如HPα-CD的衍生物以及一种或多种脂肪酸形成包合物。在一些实施方案中，该药物组合物包含重量百分比为约10％的α-CD或其衍生物和重量百分比为约90％的脂肪酸。在一些实施方案中，该药物组合物包含重量百分比为约20％的α-CD或其衍生物和重量百分比为约80％的脂肪酸。在一些实施方案中，该药物组合物包含重量百分比为约30％的α-CD或其衍生物和重量百分比为约70％的脂肪酸。在一些实施方案中，该药物组合物包含重量百分比为约40％的α-CD或其衍生物和重量百分比为约60％的脂肪酸。在一些实施方案中，该药物组合物包含重量百分比为约50％的α-CD或其衍生物和重量百分比为约50％的脂肪酸。在一些实施方案中，该药物组合物包含重量百分比为约60％的α-CD或其衍生物和重量百分比为约40％的脂肪酸。在一些实施方案中，该药物组合物包含重量百分比为约70％的α-CD或其衍生物和重量百分比为约30％的脂肪酸。在一些实施方案中，该药物组合物包含重量百分比为约80％的α-CD或其衍生物和重量百分比为约20％的脂肪酸。在一些实施方案中，该药物组合物包含重量百分比为约90％的α-CD或其衍生物和重量百分比为约10％的脂肪酸。在一些实施方案中，该药物组合物包含重量百分比为约5％至约15％的脂肪酸。在一些实施方案中，该药物组合物包含重量百分比为约85％至约95％的α-CD或其衍生物。

本文所用的术语“活性剂”是指旨在用于本文所述的组合物和方法中并且旨在具有生物活性的分子，例如出于治疗恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症的目的。术语“活性剂”旨在包括具有生物活性或可转化为生物活性形式的分子。例如，术语“活性剂”包括前药和/或分子，所述前药和/或分子是无活性的或缺乏预期的生物活性，但可转化为具有活性或具有预期的生物活性的形式。

如本文所用，术语“样品”通常是指有限数量的某物，其旨在类似于并代表更大量的该物。在本公开中，样品是采集、拭子、刷洗、刮擦、活组织检查、取出的组织或手术切除，以用于检验疾病或病症(诸如恶性或神经退行性疾病或病症)的临床指标。在一些实施方案中，样品取自被认为患有恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症的患者或受试者。在一些实施方案中，将认为含有疾病或病症(诸如恶性或神经退行性疾病或病症)的临床指标的样品与已知不含有疾病或病症(诸如恶性或神经退行性疾病或病症)的一种或多种临床指标的对照样品进行对比。在一些实施方案中，将被认为含有疾病或病症(诸如恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症)的临床指标的样品与已知不含有疾病或病症(诸如恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症)的临床指标的对照样品进行对比。在一些实施方案中，将被认为含有疾病或病症(诸如恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症)的临床指标的样品与含有疾病或病症(诸如恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症)的相同临床指标的对照样品进行对比。

本文所用的术语“清除(scavenge)”意指吸收或化学结合并转运至错误！未找到参考源。肾脏用于***。

术语“盐”是指与无机和/或有机酸形成的酸式盐，以及与无机和/或有机碱形成的碱式盐。这些酸和碱的示例是本领域普通技术人员公知的。这样的酸加成盐通常将是药学上可接受的，尽管非药学上可接受的酸的盐可用于所述化合物的制备和纯化在讨论中。实施方案的盐包括由盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、甲磺酸和苯磺酸形成的盐。

在一些实施方案中，包含一种游离碱或其盐、对映异构体或外消旋体的组合物的盐可以通过使游离碱或其盐、对映异构体或外消旋体与一或多个当量的合适的酸反应而形成。在一些实施方案中，本公开的药学上可接受的盐是指具有至少一个碱性基团(basicgroup)或至少一个碱性基团(basic radical)的氨基酸。在一些实施方案中，本公开的药学上可接受的盐包含形成酸加成盐的游离氨基、游离胍基、吡嗪基或吡啶基。在一些实施方案中，本公开的药学上可接受的盐是指氨基酸，其为主题化合物与(例如)无机酸(诸如，盐酸、硫酸或磷酸)或与合适的有机羧酸或磺酸的酸加成盐，该有机羧酸或磺酸例如脂肪族一元或二元羧酸(诸如三氟乙酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、羟基马来酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸或草酸)，或氨基酸(诸如精氨酸或赖氨酸)，芳族羧酸(诸如苯甲酸、2-苯氧基-苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、水杨酸、4-氨基水杨酸)，芳族脂族羧酸(诸如扁桃酸或肉桂酸)，杂芳族羧酸(诸如烟酸或异烟酸)，脂族磺酸(诸如甲烷磺酸、乙烷磺酸或2-羟基乙烷磺酸)，或芳族磺酸(例如苯磺酸、对甲苯磺酸或萘磺酸)。当存在几个碱性基团时，可以形成一元酸或多元酸加成盐。该反应可以在盐不溶于其中的溶剂或介质中进行，或在盐溶于其中的溶剂中进行，例如水、二恶烷、乙醇、四氢呋喃或***，或在溶剂混合物中进行，其可以在真空中或通过冷冻干燥去除。该反应也可以是置换过程或可以在离子交换树脂上进行。在一些实施方案中，盐可以是患者生理耐受的那些盐。根据本公开的盐可以以其无水形式或以水合结晶形式(即，与一个或多个水分子络合或结晶)存在。

术语“可溶的”或“水溶性的”是指高于1/100,000(mg/ml)的溶解度。物质或溶质的溶解度是可完全溶解在特定质量的溶剂(诸如水)中的物质的最大质量。另一方面，“实际不溶的”或“不溶的”是指1/10,000(mg/ml)或更小的水溶性。水溶性或可溶性物质包括例如聚乙二醇。在一些实施方案中，本文所述的多肽与聚乙二醇结合以更好地溶解包含所述肽的组合物。

如本文所用，“同源性”百分比或“序列一致性”是通过使用用于***两个序列(blZseq)的独立可执行BLAST引擎程序来确定的，这两个序列可以使用默认参数从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)ftp位点检索(Tatusova和Madden，FEMS Microbiol Lett，1999，174，247-250；其全部内容通过引用并入本文)。

另外的定义和缩写在本专利说明书的其它地方提供或者是本领域公知的。

II.附加说明

恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症是涉及沿共同途径的许多基因的复杂疾病。例如，心血管疾病和痴呆是2型糖尿病的已知合并症。部分基于磷酸肌醇PI(3,4,5)P₃和PI(3,4)P₂在恶性和神经疾病中上调的发现，参见BiochimBiophys Acta，1851(8)，1066-82，并激活Akt信号传导。参见Cell Signal，20(4)，684-94；Journal of Lipid Research，50(Suppl)，S249-S54；Cancer Cell，28(2)，155-69。广泛认为PI信号传导涉及癌症生长和神经退行性。此外，INPP4B被称为某些癌症的抑制剂，也作为其它癌症的危险因素，包括但不限于乳腺癌和胰腺癌。参见Oncotarget，7(1)，5-6；TrendsMol Med，21(9)，530-32。PI3K信号传导还暗示衰老、认知能力下降和阿尔茨海默病。参见Exp Gerontol，48(7)，647-53。还有，“迄今为止，单一药剂PI3K抑制剂的临床结果是适度的(clinical results with single-agent PI3K inhibitors have been modest todate)”，Annu Rev Med，67，11-28，部分原因是传统GWAS在很大程度上未能阐明PI信号传导导致癌症和神经退行性疾病的确切机制。

根据本文给出的结果，恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症以及阿尔茨海默病和帕金森病、动脉粥样硬化和2型糖尿病的特征在于磷脂酰肌醇(PI)周期内的活动过度。在一些方面，本公开提供了治疗恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症、心血管疾病、代谢疾病和帕金森病或阿尔茨海默病的方法，其包含向受试者施用一种或多种治疗有效量的活性剂，该活性剂靶向PIP以引起内吞/胞吐作用的变化，从而引起细胞迁移和蛋白质(包括，但不限于，APP、tau和α-突触核蛋白)的浸润或加工的抑制或降低。这样的活性剂可以特异性靶向特定的PIP或可以非特异性地作用于几种不同种类或类型的PIP以引起活性的广泛降低。此外，这样的活性剂可以是，例如，已在人类中安全用于其它适应症，并且可以被重定用于治疗恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症的化合物或药物。

环糊精的其它建议用途是用于治疗神经退行性疾病，包括，但不限于神经元蜡样脂褐质沉积症(neural ceroid lipofuscinoses)(J Biol Chem，289(14)，10211-22)、帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、额颞叶痴呆(FTD)和亨廷顿病(HD)、中风(Neuroreport，23(3)，134-8；Arch Med Res，45(8)，711-29)、动脉粥样硬化(J Pharm Sci，81(6)，524-8；SciTransl Med，8(333)，333ra50)、脂肪肝疾病(Int J Mol Sci，16(9)，21056-69)，呼吸系统疾病，包括，但不限于，囊性纤维化(Gunasekara,L.等人，(2017)“小儿囊性纤维化中的肺表面活性剂功能障碍：脂质替代药物的机理和逆转(Pulmonary surfactant dysfunction inpediatric cystic fibrosis:mechanisms and reversal with a lipid-sequesteringdrug)”，J Cyst Fibros)、哮喘和肺病(Cataldo等人的US 9034846 B2；Biochim BiophysActa，1859(10)，1930-40)、2型糖尿病和胰岛素耐受性(Am J Physiol Endocrinol Metab，308(4)，E294-305)，以及保护免受病毒或细菌感染(Physiological Reviews，93(3)，1019-137；J Virol，78(1)，33-41)。

预期的遗传疾病包括，但不限于，肌肉和角膜营养不良或肌管神经病，癌症，包括，但不限于，白血病(ALL，AML，CML)和淋巴瘤(NHL)、癫痫症和血栓形成。参见Biochimie，125，250-58。与PIP失调有关的神经疾病包括，但不限于，弗里德赖希共济失调(Friedreich’sataxia)、腓骨肌萎缩症变性神经病、肾小管病变(renal tubolopathies)(眼脑肾综合征(Oculocerebrorenal syndrome of Lowe,Dent’s disease)、Andersen-Tawil综合征、粘脂质贮积症、多发性硬化症、Yunis-Varon综合征、肌萎缩侧索硬化和纤毛疾病(ciliopathies)。参见Biochim Biophys Acta，1851(8)，1066-82。与PIP失调有关的其它疾病是骨质疏松症，癌症(包括，但不限于，***、平滑肌肉瘤、胃癌、腺癌、肺癌)、心脏肥大和自身免疫性疾病(包括，但不限于，类风湿性关节炎)、躁郁症和精神***症。Falasca,Marco(编)，(2012)，磷酸肌醇和疾病(Phosphoositides and Disease)，ed.Peter K.Vogt(微生物学和免疫学当前主题(Current Topics in Microbiology and Immunology)，Dordrecht：Springer)。

本发明人预期本文公开的环糊精可用于预防和治疗转移，转移是恶性病症最致命的方面。例如，乳腺癌是女性中最常见的非皮肤恶性肿瘤。2015年，新诊断出231.840名美国妇女，估计310万名乳腺癌幸存者在美国存活。J Clin Oncol，34(6)，611-35。它是仅次于肺癌的第二大致命疾病，导致死亡40,290例，65岁前死亡17,010例。“有一级亲属(母亲、姐妹或女儿)有乳腺癌病史的妇女患乳腺癌的可能性是没有这家族史的妇女的两倍”。美国癌症协会(American Cancer Society)(2015)，癌症事实和图2015(Cancer Facts&Figures2015)(Atlanta：美国癌症协会)。这些结果暗示，癌症风险的大部分是遗传的，然而已知的DNA损伤修复基因BRCA1/BRCA2/PALB2和MRE11A/RAD50/NBN/RINT1以及PIK3CA/PTEN的复合物(目前认为其主要参与生长)仅解释了10％的发病率。反过来，***癌是男性中最常见的癌症。2015年，新诊断出美国男性220.800人，死亡27,540人。已知许多上皮癌(来源于内胚层或外胚层组织，包括，但不限于，乳腺癌、***癌、肺癌、胰腺癌和结肠癌)具有共同的危险因素。例如，“[乳腺和***]均需要性腺类固醇用于其发育，并且源自它们的肿瘤通常是激素依赖性的，并具有显著的潜在生物学相似性”。Nat Rev Cancer，10(3)，205-12。已知***癌与乳腺癌遗传连锁。“在一级家庭成员中诊断的***癌增加了妇女罹患乳腺癌的风险”。Cancer，121(8)，1265-72。AR和BRCA2是与两种形式的癌症相关的许多基因之一。分别参见Drug discovery today.Disease mechanisms，9(1-2)，e19-e27和Asian JAndrol，14(3)，409-14。

已知许多其它疾病涉及溶酶体中功能丧失突变，其中许多内吞分子需要降解。在所有情况下，可通过减少需要降解的内吞物质的量来改善疾病表型(MPS：粘多糖病，NCL：神经元蜡样脂褐质沉积症，MLD：异染性脑白质营养不良)：

ABCA2：听神经瘤；ABCB9：急性髓系白血病(AML)；ACP2：酸性磷酸酶缺乏、圆锥角膜、肌萎缩侧索硬化、毛发缺乏、阿米巴病；ACP2：溶酶体酸性磷酸酶缺乏、圆锥角膜、肌萎缩侧索硬化8、阿米巴病；ACP5：脊椎软骨发育不良(spondyloenchondrodysplasia)、骨巨细胞瘤、毛细胞白瘤、牙齿吸收；AGA：天冬氨酰葡糖胺尿(aspartylglucosaminuria)、岩藻糖苷沉积症(fucosidosis)；AP3B1：Hermansky-Pudlak综合征、眼皮肤白化病、储备池血小板病；AP3B2：副肿瘤性神经障碍；ARSA：MLD，芳基硫酸酯酶a缺乏、多发性硫酸酯酶缺乏、粘膜硫酸化(mucosulfatidosis)；ARSB：MPS VI，芳基硫酸酯酶b缺乏、粘膜硫酸化；ASAH1：Farber脂肪肉芽肿病、(Kugelberg-Welander)脊髓性肌萎缩、(Erdheim-Chester)脂肪肉芽肿病；ATP13A2/PARK9:：NCL 12，Kufor-Rakeb综合征、痉挛性截瘫78、青少年发作性帕金森病；ATP6AP2：智力低下(Mol Cell Neurosci，66(PtA)，21-28)；帕金森综合征伴痉挛、淋巴细胞性脉络丛膜脑膜炎；ATP6V0A1：下壁心肌梗塞(inferior myocardial infarction)；ATP6V0A2：皱纹皮肤综合征、皮肤松弛症、骨髓病性贫血；ATP6V0A4：肾小管酸中毒、髓质海绵肾；CD164：常染色体显性遗传性耳聋、花粉过敏、***癌；CLC7：骨硬化病；CLN1/PPT1：NCL、巴登氏病、Santavuori-Haltia；CLN11/GRN：NCL、额颞叶痴呆、原发性进行性失语；CLN3：NCL、继发性角膜水肿、Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病；CLN4/DNAJC5：NCL、CLN4疾病；CLN5：NCL；CLN5：NCL、芬兰晚期婴儿(Finnish late infantile)；CLN6：NCL、库夫斯病(Kufs disease)；CLN7：NCL、黄斑营养不良、神经性病症、抑郁性神经症；CLN8：诺尔癫痫(Norther epilepsy)、进行性精神发育迟缓/土耳其晚期婴儿；CTNS：肾病性胱氨酸病、范可尼综合征；CTSA：半乳糖唾液酸贮积症(galactosialidosis)、糖蛋白累积病(glycoproteinosis)、***性输卵管炎、磷酸丙糖异构酶缺乏、天冬氨酰葡糖胺尿(aspartylglucosaminuria)；CTSB：胆囊闭塞、回肠癌、胰腺炎、冬季角膜溶解性红斑、乳腺癌、阿尔茨海默病；CTSC：掌跖角化-牙周破坏综合征、Haim-munk综合征、牙周炎、掌跖角化病、光化性角化病；CTSD：NCL、骨软骨肉瘤、子宫内膜透明细胞腺癌、乳腺疾病、帕金森病(Parnetti 2017)；CTSE：胃腺癌、罗道病、组织细胞增生症；CTSF：NCL、Kufs病、运动不能性缄默、睁眼昏迷(coma vigilans)、支睾吸虫病、东方肝吸虫病；CTSG：掌跖角化-牙周破坏综合征、皮肤肥大细胞病、化脓性根尖周炎、血管炎、韦格纳肉芽肿病；CTSH：甲状腺危象、间歇性暴发性疾病、发作性睡病、纤维脑膜瘤、肌萎缩侧索硬化；CTSK：脓囊症(pycodystostosis)、超敏性肺炎、骨硬化、骨髓炎、骨巨细胞瘤；CTSL：外阴基底细胞癌、小汗腺顶体瘤(eccrine acrospiroma)、姜片虫病(fasciolopsiasis)、气管癌、直肠乙状结肠交界瘤；CTSO：乳腺癌；CTSS：下颌癌、非化脓性中耳炎、尾蚴性皮炎、上皮下黏液性角膜营养不良、颌癌；CTSW：自身免疫性萎缩性胃炎；CTSZ：泪囊炎；DNASE2：钙化性腱炎、类风湿性关节炎；FUCA1：岩藻糖苷沉积症、血管角化瘤、粘脂沉积症III、喉气管炎；GAA：糖原贮积病II(Pompe病)、酸性麦芽糖酶缺乏、Danon病、α-1,4-葡萄糖苷酶缺乏；GALC：克拉伯病、脑白质营养不良；GALNS：MPS IV、软骨骨营养不良、施艾氏综合征(Scheie syndrome)、Kniest发育不良；GBA：戈谢病(Gaucher disease)、假戈谢病(pseudo Gaucher disease)、GBA相关性帕金森病；GLA：法布里病、痉挛-成束综合征(cramp-fasciculation syndrome)、血管角质瘤、MPS VII；GLB1：gm1-神经节苷脂沉积症、MPS IVb；GM2A：GM2-神经节苷脂沉积症、泰-萨二氏病、山德霍夫氏病(Sandhoff-disease)、粘脂沉积症IIα/β、I-细胞病(I-cell disease)；GNPTAB：粘脂沉积症2、粘脂沉积症3、MPS 3a；GNPTG：粘脂沉积症III、假Hurler多营养不良、构音障碍；GNS：MPS III、多发性硫酸酯酶缺乏、粘液硫酸化；GUSB：MPS VII、胎儿水肿、坏死性溃疡性牙龈炎、胆总管结石；GUSB：Sly病、MSP VII、胎儿水肿、坏死性溃疡性牙龈炎、胆总管石病；HEXA：泰-萨二氏病、gm2神经节苷脂沉积症；HEXB：山德霍夫氏病、粘脂沉积症IV、鞘脂沉积症；HGSNAT：MPS IIIc、MPS IIIb、色素性视网膜炎、克鲁尔-布西综合征；HYAL1：MPSIX、膀胱癌、***癌；IDS：MPS II、Hunter综合征；IDUA：MPS I、施艾氏综合征、Hurler综合征；IGF2R：肝细胞癌、粘脂沉积症II、细胞内含物病(inclusiojn-cell disease)、结肠直肠癌；LAAT1/PQLC2：胱氨酸病；LAMP1：Salla病、Hermansky-Pudlak综合征、溶酶体酸性磷酸酶缺乏、噬血细胞综合征；LAMP2：Danon病、心肌病、心房静止、糖原贮积病Ⅱ、溶酶体酸性磷酸酶缺乏；LAMP3/CD63：Hermansky-Pudlak综合征、黑素瘤、魁北克血小板紊乱、肥大细胞病、Schwarzman现象；LAMP4/CD68/SCARD1：(乳腺)颗粒细胞瘤、滤泡树突状细胞肉瘤、细菌性食管炎、腋窝脂肪瘤；LAPTM4A：疼痛障碍；LAPTM4B：肝细胞癌；LGMN：血吸虫病；LIMP2/SCARB2：进行性肌阵挛性癫痫、Unverricht-Lundborg病、手齿口病(hand-tooth-and-mouthdisease)、肌阵挛；LIPA：沃尔曼病、胆固醇酯贮积病、脾脓肿、家族性高胆固醇血症；LITAF：腓骨肌萎缩症遗传性神经病；LMBRD1：甲基丙二酸尿症和高胱氨酸尿症、cblf型、肝炎、钴胺传递蛋白II缺乏；LYPLA3/PLA2G15：；LYST：Chedliak-Higashi综合征、剥脱综合征、Hermansky-Pudlak综合征、dichromatosis symmetrica；M6PR：MPS IIIa、粘脂沉积症II、NCL、尼曼-皮克病；MANB：甘露糖苷沉积症(α/β)；MCOLN1：粘脂沉积症IV、共济失调性脑瘫、鞘脂沉积症、斜视、粘脂蛋白-1缺乏；NAGA：Kanzaki病、Schindler病、神经轴突营养不良、血管角质瘤；NAGLU：MPS III、腓骨肌萎缩症疾病、急性肾盂肾炎；NAGPA：家族性持续性口吃、构音障碍、MPS IIIb、言语障碍、糖尿病性肾病；NAPSA：卵巢透明细胞腺纤维瘤、Krukenberg/肺腺/肺腺(Bishop 2010)/卵巢透明细胞/癌、恶性纤维间皮瘤；NEU1：唾液腺病(sialidosis)、胎儿水肿、3型副流感病毒；NPC1/2：尼曼-皮克病C1/2；PSAP：非典型戈谢病、合并saposin缺乏、MLD、克拉伯病；PSEN1(Lee 2015、Sato 2017)：额颞叶痴呆、阿尔茨海默病3、家族性反常性痤疮(familial acne inversa)、扩张型心肌病；RAB27A：Griscelli综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症、Chedliak-Higashi综合征；RAB7：腓骨肌萎缩症疾病2b(Mol Cell Neurosci，66(PtA)，21-28)；无脉络膜、脊髓痨、NCL；SGSH：MPS III、Klver-Bucy综合征、Sanfillipo综合征；SLC11A1：Buruli溃疡、结核病、伤寒；SLC11A2：小细胞性贫血、铁血黄素沉着症、贫血；SLC17A5/SIALIN：salla病、唾液酸贮积障碍、sialuria、肝片吸虫病；SMPD1：尼曼-皮克病、酸性鞘磷脂酶缺乏、自恋型人格障碍；SORT1：细胞内含物病、I细胞病、心肌梗死；SUMF1：多发性硫酸酯酶缺乏、MLD、脊髓小脑共济失调、MPS VI；TPP1：NCL、脊髓小脑共济失调、Bielschowsky-Jansky病。

A)活性剂

如在本申请的实施例和其它部分中进一步描述的，可用于本方法的试剂可降低细胞可获得的磷脂的浓度，所述细胞包括但不限于神经元和肿瘤细胞。在一个实施方案中，所述试剂是环糊精。在另一个实施方案中，环糊精是α-CD。在又另一个实施方案中，试剂是羟丙基-(HP-α-CD)。在一些实施方案中，所述试剂是α-CD或HP-α-CD的包合物。在一些实施方案中，所述试剂是α-CD或HP-α-CD与脂肪酸的包合物。本文所用的“脂肪酸”意指具有饱和或不饱和的长脂族链的羧酸。在一些实施方案中，脂族链的长度为约3至约70个碳原子。在一些实施方案中，脂族链的长度为10至约30个碳原子。在一些实施方案中，脂肪酸具有一个或多个具有一个或多个取代基的支链或非支链脂族链。在一些实施方案中，脂肪酸在其脂族链中包含约6至约22个碳原子。在一些实施方案中，每个碳原子之间的任何一个键可以是顺式或反式构型。

环糊精是在纤维素的细菌消化过程中形成的天然化合物。它们不能被普通淀粉酶水解，但可以被肠道菌群发酵。它们的再吸收差，一般认为口服施用是安全的(GRAS)。在2004年12月22日，错误！未找到参考源。α-CD被宣布为GRAS，“可在除肉类和禽类外某些食品中使用以用于补充纤维，作为调味剂的载体或稳定剂(调味助剂)，作为色素、维生素和脂肪酸的载体或稳定剂并改善饮料的口感的”(GRN第155号，2016年11月更新为GRN 678，以反映预期的第90个百分位数，摄入量为420mg/kg，或在70千克时约为30g/d)。α-CD专著包括在美国药典/国家处方集(USP/NF25)、欧洲药典(EP 6.0)和药物赋形剂手册。当在各种食品中或在各种食品上使用时，环糊精不需要低于40CFR 180.950的耐受性。(FR 70 128 287802005-07-06)。2017年10月9日，环糊精”被欧洲委员会纳入关于“人类使用的医疗产品的标签和包装单张中的权宜成分(Expedients in the labeling and package leaflet ofmedical products for human use)”的指南附录中。

环糊精是由(D-葡萄糖)6个(α-CD)、7个(β-环糊精)或8个(γ-环糊精)糖分子组成的化合物，这些糖分子以具有亲脂性内表面和亲水性外表面的环形(截锥形)结合在一起(图17)。这些特征的组合使得它们适合作为溶解亲脂性药物的便利手段。任何羟基的取代，甚至被疏水部分取代，将导致水溶性的显著增加。溶解度增加的主要原因是化学处理经常将结晶的环糊精转变为异构体衍生物的无定形混合物。例如，β-环糊精的水溶性随着甲基化程度的增加而增加。当约三分之二的羟基(即21个中的14个)被甲基化时，获得最高的溶解度。与β-CD相比，错误！未找到参考源。显著改善了水溶性(表1，另请参见表3)。

表1：选定的环糊精的物理化学性质

对于肠胃外递送，“β-环糊精在大鼠、兔、狗和人中的稳态分布体积与每种物种的细胞外液体积非常吻合，表明没有涉及深层隔室或池中的存储(the steady-state volumeof distribution for β-cyclodextrin...in rats,rabbits,dogs,and humanscorresponds well with the extracellular fluid volume of each species,suggesting that no deep compartments or storage in pools are involved)”。JPharm Sci，86(2)，147-62。“α-环糊精和β-环糊精几乎完全以完整形式***到尿液中(α-and β-cyclodextrin are excreted almost completely in an intact form into theurine)”J Pharm Sci，86(2)，147-62。通过环的边缘(rim)上的R基团的取代获得的普通环糊精(图，(Brewster ME，Loftsson T(2007)，Advanced Drug Delivery Reviews 59：645-66))包括但不限于甲基(包括无规甲基化的)CH₃，2-羟丙基(错误！未找到参考源。)：CH₂CHOHCH₃、磺基丁基醚(CH₂)₄SO₃Na⁺、乙酰基、琥珀酰基、葡糖基、麦芽糖基、羧甲基醚、磷酸酯、简单聚合物或羧甲基。由于取代基的数目及其位置都会影响[环糊精]分子的物理化学性质，诸如其水溶性和络合能力，因此所列出的每种衍生物应当被视为一组密切相关的[环糊精]衍生物。

“已经对CD进行化学修饰以增加其亲水活性，希望改善的溶解度将消除[大鼠]的肾毒性(Chemical modifications have been made to CDs to increase theirhydrophilic activity with the hope that the improved solubility wouldeliminate the renal toxicity[in rats].)”。(Irie T，Uekama K(1997)J Pharm Sci，86：147-62)“取代形成羟基的任何氢键，甚至通过疏水部分诸如甲氧基和乙氧基官能团，将导致水溶性的显著增加。这些衍生物中溶解度增加的主要原因是化学处理经常将结晶环糊精转化为异构衍生物的无定形混合物。(Substitution of any of the hydrogen bondforming hydroxyl groups,even by hydrophobic moieties such as methoxy andethoxy functions,will result in a dramatic increase in watersolubility....The main reason for the solubility enhancement in thesederivatives is that chemical manipulation frequently transforms thecrystalline cyclodextrins into amorphous mixtures of isomeric derivatives.)”(Loftsson T，Brewster ME(1996)，J Pharm Sci，85：1017-25)“例如，β-环糊精的水溶性……随着甲基化程度的增加而增加。当三分之二的羟基(即21个中的14个)被甲基化时，溶解度最高。(For example,the aqueous solubility ofβ-cyclodextrin...increaseswith increasing degree of methylation.The highest solubility is obtained whentwo-thirds of the hydroxyl groups(i.e.,14of 21)are methylated.)”(Loftsson T，Brewster ME(1996年)，J Pharm Sci，85：1017-25)。β-CD的羟烷基衍生物2-羟丙基-b-环糊精(HP-b-CD)大大改善了水溶性(表3)，而1g/kg的β-环糊精在大鼠中引起严重的肾病(表2)，相同剂量的HP-β-环糊精不会引起不良的临床体征(Gould S，Scott RC(2005)，FoodChem Toxicol，43：1451-9)。

通过取代错误！未找到参考源。环边缘上的R基团获得的常见环糊精(图17，(Brewster ME，Loftsson T(2007)，Advanced Drug Delivery Reviews，59：645-66))包括，但不限于，

甲基(包括无规甲基化的)：CH₃，

2-羟丙基(HP)：CH₂CHOHCH₃，

磺基丁基醚：(CH₂)₄SO₃Na⁺

乙酰基，

琥珀酰基，

葡糖基，

麦芽糖基，

羧甲基醚，

磷酸酯，

简单聚合物，或

羧甲基。

“由于取代基的数目及其位置都会影响环糊精分子的物理化学性质，诸如其水溶性和络合能力，所以所列出的每种衍生物应当被认为是一组密切相关的环糊精衍生物。(Since both the number of substitutes and their location will affect thephysicochemical properties of the cyclodextrin molecules,such as theiraqueous solubility and complexing abilities,each derivative listed should beregarded as a group of closely related cyclodextrin derivatives.)”(LoftssonT，Brewster ME(1996)，J Pharm Sci，85：1017-25)

Cycolab和Wacker AG销售合适的环糊精，其也可用于本文所述的方法中。根据待治疗的体征、症状和/或疾病，活性剂可以与环糊精(直接或经由同双官能或异双官能交联剂)偶联。例如，当递送NSAID可治疗疼痛时，可以使用α、β和/或γ环糊精的吡罗昔康衍生物。在另一非限制性示例中，在多发性硬化症的治疗中，环糊精和/或HP环糊精可以(直接或使用交联剂)偶联至可注射药物(例如，Avonex(干扰素β-1a)、倍泰龙(Betaseron)(干扰素β-1b)、克帕松(Copaxone)(醋酸格拉替雷)、Extavia(干扰素β-1b)、Glatopa、Plegridy(聚乙二醇干扰素β-1a)、Rebif(干扰素β-1a)、Zinbryta(达克珠单抗))、口服药物(例如，Aubagio(特立氟胺)、Gilenya(芬戈莫德)、Tecfidera(富马酸二甲酯))或输注药物(例如，Lemtrada(阿仑单抗)、Novantrone(米托蒽醌)、Orevus(奥瑞珠单抗)、Tysabri(那他珠单抗))。

关于偶联到每个环糊精上的活性剂的数目，应当理解，每种环糊精可以偶联到一种或多种活性剂上，例如，每个α-D-吡喃葡萄糖苷单元偶联一种。因此，α-环糊精可以与一种、两种、三种、四种、五种或六种活性剂偶联。α-环糊精可以与一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种活性剂偶联。α-环糊精可以与一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种活性剂偶联。交联剂的长度应选择为允许所需数量的活性剂与该大小的这样的活性剂偶联。与各环糊精偶联的各活性剂可以相同或不同。在本发明主题的另一个实施方案中，HP-环糊精的一个或多个羟丙基被活性剂取代。

作为活性剂的替代或补充，环糊精和/或HP-环糊精可以任选地与载体偶联。载体包括纳米颗粒(例如，金纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、碳纳米颗粒等)、脂质体(或用于制备脂质体的表面活性剂)、聚合物(合成的和天然的(碳水化合物、肽/蛋白质、核酸)，及其杂化物和/或组合)，以及其它环糊精。

有利地是，如果环糊精/HP-环糊精被递送至每个细胞，则将环糊精偶联至载体可增加载荷。不希望受特定假设的限制，将环糊精和/或环糊精衍生物偶联到载体上也可将细胞摄取的机制改变为内体摄取。因此，环糊精和任何活性剂将被递送至溶酶体，其中需要将根据本发明主题的环糊精与脂质复合。

特别是β-环糊精在水中的低溶解度通常导致固体环糊精络合物的沉淀。“此外，β-和δ-环糊精在仲OH基团之间形成分子内氢键，这不利于与周围水分子形成氢键，从而[导致]低水溶性。”(Loftsson T，Brewster ME(1996)，J Pharm Sci，85：1017-25)。

仅部分与表1的不同物理化学特性有关，错误！未找到参考源。，β-CD和γ-CD环糊精具有显着不同的生化功能，因此具有不同的用途。

仅γ-CD可被胰淀粉酶和唾液水解，并在小肠中快速代谢和吸收。

β-CD和γ-CD可以以至多1：1摩尔比结合脂肪，但是错误！未找到参考源。可以结合其重量9倍的脂肪。

空腔相对分子的大小是使用环糊精的主要决定因素。β-CD(和γ-CD，程度较小)，但错误！未找到参考源。可以结合甾醇(包括胆固醇)和类固醇，因为这些分子太大而无法适合错误！未找到参考源。的较小空腔。

甲基化的β-CD对细胞膜的常见成分具有高亲和力，因此具有极强的溶血作用，而错误！未找到参考源。对人红细胞具有非常低的作用。

通过特别设计的γ-CD衍生物舒更葡糖(八-(6-脱氧-6-S-巯基丙酰基-γ-环糊精钠盐)逆转神经肌肉阻断药物罗库溴铵的作用以防止残余麻痹。

对于环孢菌素A，使用错误！未找到参考源。和γ-CD的混合物来提高药物溶解度而不引起眼刺激。

只有错误！未找到参考源。可以通过环境友好的共沉淀法提取金。(Liu ZC，Samanta A等人，(2016)，Journal of the American Chemical Society，138：11643-53)

环糊精之间差异的“完全”列表表明，由一种环糊精观察到的作用不能外推到其它环糊精。事实上，仅有少数示例，其中不止一种环糊精用于相同的应用：

例如，使用错误！未找到参考源。

作为

的活性成分；较小的错误！未找到参考源。将捕获过少恶臭分子。

以从全蛋、牛奶中去除胆固醇，较小的错误！未找到参考源。不适合胆固醇

使用错误！未找到参考源。

在基于严格的素食主义的椰子奶粉(UK)作为酪蛋白酸钠替代品的食品中

在粉末状酒精中

在辅酶Q10/L-肉碱添加剂中与必需的α-亚油酸形成复合物

治疗用途也是高度特异性的。在一个与年龄相关的应用中(Nociari MM，LehmannGL等人，(2014年)，Proceedings of the National Academy of Sciences，111：E1402-E8)，证明，错误！未找到参考源。可以结合脂褐素组分A2E，而错误！未找到参考源。不能(仅部分与表1的不同物理化学特性有关，错误！未找到参考源。，β-CD)，以及γ-CD环糊精具有显著不同的生化功能，因此具有不同的用途。

仅γ-CD可被胰淀粉酶和唾液水解，并在小肠中快速代谢和吸收。

β-CD和γ-CD可以以至多1：1摩尔比结合脂肪，但是错误！未找到参考源。可以结合其重量9倍的脂肪。

空腔相对分子的大小是使用环糊精的主要决定因素。β-CD(和γ-CD，程度较小)，但错误！未找到参考源。可以结合甾醇(包括胆固醇)和类固醇，因为这些分子太大而无法适合错误！未找到参考源。的较小空腔。

甲基化的β-CD对细胞膜的常见成分具有高亲和力，因此具有极强的溶血作用，而错误！未找到参考源。对人红细胞具有非常低的作用。

通过特别设计的γ-CD衍生物舒更葡糖(八-(6-脱氧-6-S-巯基丙酰基-γ-环糊精钠盐)逆转神经肌肉阻断药物罗库溴铵的作用以防止残余麻痹。(Booij LH(2009)Anaesthesia 64 Suppl 1:31-7)

对于环孢菌素A，使用错误！未找到参考源。和γ-CD的混合物来提高药物溶解度而不引起眼刺激。

对于鼻内胰岛素，DMβCD和错误！未找到参考源。是有效的增强剂，但是γ-CD、β-CD和HPβCD不是(Merkus FW，Verhoef JC等人，(1991)Pharm Res 8：588-92；Shao Z，Krishnamoorthy R等人，(1992)，Pharmaceutical Research，9：1157-63)。

补充错误！未找到参考源。而非β-CD可以减少apoE-KO小鼠的主动脉粥样硬化病变，尽管补充β-CD而非错误！未找到参考源。可以减少肠道脂质的吸收。(Sakurai T，Sakurai A等人，(2017)Mol Nutr Food Res 61)

只有错误！未找到参考源。可以通过环境友好的共沉淀法提取金。(Liu ZC，Samanta A等人，(2016)，Journal of the American Chemical Society，138：11643-53)

环糊精之间差异的非限制性列表表明，由一种环糊精观察到的作用不能外推到其它环糊精。事实上，仅有少数示例，其中不止一种环糊精用于相同的应用：

例如，使用错误！未找到参考源。

作为

的活性成分；较小的错误！未找到参考源。将捕获过少恶臭分子。

以从全蛋、牛奶中去除胆固醇，较小的错误！未找到参考源。不适合胆固醇

使用错误！未找到参考源。

在基于严格的素食主义的椰子奶粉(UK)作为酪蛋白酸钠替代品的食品中

在粉末状酒精中

在辅酶Q10/L-肉碱添加剂中与必需的α-亚油酸形成复合物

治疗用途也是高度特异性的。在一个与年龄相关的应用中(Nociari MM，LehmannGL等人，(2014年)，Proceedings of the National Academy of Sciences，111：E1402-E8)，证明，错误！未找到参考源。可以结合脂褐素组分A2E，而错误！未找到参考源。不能(图错误！未找到参考源。)。

很少，如果有几种环糊精与相同类型的底物一起使用，则证明它们的功能是高度特异性的，尽管它们包含糖环。最重要的差异之一是这些糖的数目：“环糊精-脂质复合物：大小问题。(Cyclodextrin-Lipid Complexes:Size Matters)”(Szente L，Fenyvesi E(2017)Structural Chemistry，28：479-92)

细胞毒性/溶血

对于肠胃外递送，“在大鼠、兔子、狗和人类中，β-环糊精的稳态分布量与每种物种的细胞外液量非常吻合，表明没有涉及深层隔室或池中的存储。(the steady-statevolume of distribution for β-cyclodextrin...in rats,rabbits,dogs,and humanscorresponds well with the extracellular fluid volume of each species,suggesting that no deep compartments or storage in pools are involved.)”(IrieT，Uekama K(1997)J Pharm Sci 86：147-62)“α-环糊精和β-环糊精几乎完全以完整形式***到尿液中(α-and β-cyclodextrin are excreted almost completely in an intactform into the urine)”(Irie T，Uekama K(1997)J Pharm Sci，86：147-62)对于胃肠外施用，环糊精仍可能引起两种类型的不良事件。首先，它们可以在肾细胞中累积，引起肾毒性。其次，在递送亲脂性药物后，它们在水相中形成“一种新的含有脂质的隔室(或池)，其中[细胞脂质]化合物[被]提取到其中(a new lipid-containing compartment(or pool)in theaqueous phase into which[cellular lipid]compounds[are]extracted)”，J PharmSci，86(2)，147-62，其可以引起溶血。

肠胃外环糊精的肾毒性显示于1976年。在大鼠中，α-和β-CD的LD₅₀分别测定为1008和788mg/kg，相同的最小剂量通过光学显微镜从单一剂量观察变化。“重复施用肾毒性剂量的[β-环糊精]导致广泛的肾病(Repeated administration of nephrotoxic doses[of β-cyclodextrin]resulted in extensive nephrosis.)”。Am J Pathol，83(2)，367-82。在每天1、2、4或7次注射0.1g/kgα-环糊精的大鼠中肾病不明显；每天施用0.225g/kgβ-环糊精，连续4天，在一只大鼠中发现了光学显微损伤。每日注射0.45g/kgβ-环糊精导致严重的肾病并且没有死亡。所有接受0.9g/kgβ-环糊精的大鼠在4天内死亡，[仅]1只在用1.0g/kgα-环糊精治疗2天后死亡(Nephrosis was not apparent in rats given 1,2,4,or 7 dailyinjections of 0.1g/kgα-cyclodextrin；light microscopic lesions were found inone rat given 0.225g/kg β-cyclodextrin daily for 4days.Daily injections of0.45g/kg β-cyclodextrin resulted in severe nephrosis and produced nodeaths.All rats given 0.9g/kg β-cyclodextrin died within 4days and[only]1diedafter 2days of treatment with 1.0g/kgα-cyclodextrin.)"。Am J Pathol，83(2)，367-82"(详见表2)。总之，

只有一只大鼠死于1.000α-CD的日剂量，而所有大鼠死于0.900β-环糊精的日剂量。

仅对β-环糊精进行电子显微镜检查。因此，不清楚α-CD是否也引起晶体和超微结构改变，或者该结果是否是β-环糊精(18.5)相对于α-CD(145.0)在水中溶解度较低的结果。

表2：环糊精对大鼠的毒性

Am J Pathol，83(2)，367-82。

图例：

“----”未完成，

“*”这篇论文关于哪种药物引起LD₅₀尚不明确，

另请参见Ribeek，Prinsen，引用于(http://www.inchem.org/documents/jecfa/jecmono/v48je10.htm)

特别是β-环糊精在水中的低溶解度通常导致固体环糊精络合物的沉淀。“此外，β-环糊精和δ-环糊精在仲OH基团之间形成分子内氢键，这不利于与周围水分子形成氢键，从而[导致]低水溶性(In addition,β-and δ-cyclodextrin form intramolecularhydrogen bonds between secondary OH groups,which detracts from hydrogen bondformation with surrounding water molecules[resulting in]low aqueoussolubilities)"。J Pharm Sci，85(10)，1017-25。

在远交啮齿动物的四项研究中(Riebeck 1990a/b/c，Prinsen 1991a，如WHOhttp://www.inchem.org/documents/jecfa/jecmono/v48je10.htm所引用的)，对死亡和存活动物的肉眼检查，“没有显示治疗相关的改变(did not reveal treatment-relatedalterations)”(Riebeck 1990a/b/c)或“显示淡肾皮质(revealed a pale renalcortex)”(Prinsen 1991a)。

尽管仅对β-环糊精进行电子显微镜检查，而对α-环糊精未进行电子显微镜检查，但摘要并未区分两种环糊精，因此，现在通常认为α-CD至少与β-环糊精一样具有肾毒性：

“早期研究显示母体CD的肾毒性[Frank等人，1976]...(Early studies showingthe nephrotoxicity of the parent CDs[Frank等人，1976]...)”参见J Pharm Sci，86(2)，147-62，第147页(引自Am J Pathol，83(2)，367-82)。

“肠胃外施用后α-CD和β-CD的肾毒性[Frank等人，1976]...已有文献记载[Irie和Uekama，1997；Thompson 1997(仅综述)；Gould和Scott 2005(仅β-CD)](The renaltoxicity of α-CD and β-CD after parenteral administration[Frank etal.1976]...have been well documented[Irie and Uekama,1997；Thompson 1997(review only)；Gould and Scott 2005(β-CD only)].)”。参见Toxicol Pathol，36(1)，30-42，第31页(引自J Pharm Sci，86(2)，147-62；Am J Pathol，83(2)，367-82；Food ChemToxicol，43(10)，1451-9)。

“肠胃外施用后α-CD和β-CD都显示肾毒性(Bothα-CD andβ-CD showed renaltoxicity after parenteral administration.)”。参见人类药品委员会(Committee forHuman Medicinal Products，CHMP)(2014)，“用作赋形剂的环糊精的背景审查(Backgroundreview for cyclodextrins used as excipients)”，欧洲药品管理局(EurpeanMedications Agency)，EMA/CHMP/333892/2013，第9页。

“发现β-CD家族(天然，HPβCD和RAMEβ)[……]毒性低于α-CD家族(天然，HPαCD和RAMEα)[Monnaert等人，2004](β-CD family(native,HPβCD and RAMEβ)was found[...]less toxic thanα-CD family(native,HPαCD and RAMEα)[Monnaert et al.2004].)”。Molecules，21(12)。

“α-CD在三种天然CD中毒性最大(α-CD is the most toxic among the threenative CDs.)”。Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，310(2)，745-51。

然而，当剂量"‘尖峰(spike)'扩散到6-8小时时，1g/kg的剂量不仅没有导致动物死亡，而且与对照相比，该剂量甚至不影响幼年动物的生长——没有毒性作用的明显迹象。(‘spike’was spread to 6-8hours...[d]oses of 1g/kg not only did not result inanimal deaths,but the dose did not even influence the growth of the younganimals compared to controls–a clear sign of lack of toxic effects.)”(Szejtli等人，1981)与后一结果一致，“然而迄今为止，在人类中没有由环糊精引起的肾损伤的病例(so far,however,there are no cases of kidney injury caused by cyclodextrinsin humans.)”。人类药品委员会(CHMP)(2014)，“用作赋形剂的环糊精的背景审查”，欧洲药品管理局，EMA/CHMP/333892/2013，还参见表4。

α-CD在环孢菌素滴眼剂中也具有良好的耐受性。Transplant Proc，21(1Pt 3)，3150-2。

“已经对CD进行化学修饰以增加其亲水活性，希望改善的溶解度将消除[大鼠]的肾毒性(Chemical modifications have been made to CDs to increase theirhydrophilic activity with the hope that the improved solubility wouldeliminate the renal toxicity[in rats])”。J Pharm Sci，86(2)，147-62。“任何形成羟基的氢键的取代，甚至被疏水部分诸如甲氧基和乙氧基官能团取代，将导致水溶性的显著增加。在这些衍生物中溶解度增强的主要原因是化学处理经常将结晶环糊精转化为异构体衍生物的无定形混合物(Substitution of any of the hydrogen bond forminghydroxyl groups,even by hydrophobic moieties such as methoxy and ethoxyfunctions,will result in a dramatic increase in water solubility....The mainreason for the solubility enhancement in these derivatives is that chemicalmanipulation frequently transforms the crystalline cyclodextrins intoamorphous mixtures of isomeric derivatives.)"。J Pharm Sci，85(10)，1017-25。“例如，β-环糊精的水溶性...随着甲基化程度的增加而增加。当三分之二的羟基(即21个中的14个)被甲基化时，获得最高的溶解度(For example,the aqueous solubility of β-cyclodextrin...increases with increasing degree of methylation.The highestsolubility is obtained when two-thirds of the hydroxyl groups(i.e.,14 of 21)are methylated.)”。J Pharm Sci，85(10)，1017-25。β-CD的羟烷基衍生物2-羟丙基-b-环糊精(HP-b-CD)显著改善水溶性(表3)。尽管1g/kgβ-环糊精在大鼠中引起严重肾病(表2)，但相同剂量的HP-β-环糊精不会引起不良的临床体征。Food Chem Toxicol，43(10)，1451-9。

通过取代α-CD环边缘上的R基团获得的常见环糊精(图17，J Pharm Sci，85(10)，1017-25)包括，但不限于：

甲基(包括无规甲基化的)：CH₃，

2-羟丙基(HP)：CH₂CHOHCH₃，

磺基丁基醚：(CH₂)₄SO₃Na⁺

乙酰基，

琥珀酰基，

葡糖基，

麦芽糖基，

羧甲基醚，

磷酸酯，

简单聚合物，或

羧甲基。

“由于取代基的数目及其位置都会影响环糊精分子的物理化学性质，诸如其水溶性和络合能力，所以所列出的每种衍生物应当被认为是一组密切相关的环糊精衍生物(Since both the number of substitutes and their location will affect thephysicochemical properties of the cyclodextrin molecules,such as theiraqueous solubility and complexing abilities,each derivative listed should beregarded as a group of closely related cyclodextrin derivatives.)”。J PharmSci，85(10)，1017-25。在一些实施方案中，本公开涉及包含α-CD衍生物的药物组合物，所述α-CD衍生物是以上鉴定的化合物中的任一种。在一些实施方案中，本公开涉及包含具有图1的式的α-CD衍生物的药物组合物，其中每个R独立地选自H、CH2CH3和CH2CH(OH)CH3并且n＝0。在一些实施方案中，本公开涉及包含具有图1的式的2α-CD或α-环糊精衍生物的药物组合物，其中每个R独立地选自H、CH2CH3和CH2CH(OH)CH3，并且每1个脂肪酸分子n＝0个分子，其中所述脂肪酸是本文公开的脂肪酸中的任一种或多种。在一些实施方案中，本公开涉及本文公开的任何方法，其中向有需要的受试者施用的药物组合物不含β或γ-环糊精和/或其衍生物。

表3：所选环糊精的特性

摘自J Pharm Sci，85(10)，1017-25；(Loftsson和Brewster 2010)，J PharmPharmacol，68(5)，544-55。

^*保达新(Prostavasin)80mg/d×4wk(NCT00596752)@649.3μg CD/每20μg前列地尔(caverjet标签)

^$Nat Rev Drug Discov，3(12)，1023-35。

^ahttp://cyclolab.hu/index.php/standard-grade—cyclodextrins/HPaCD

尽管1g/kgβ-环糊精在大鼠中可引起严重的肾病(表1)，但相同剂量的HP-β-环糊精不会引起不利的临床症状[Food Chem Toxicol，43(10)，1451-9]。

“口服313mg/kg ¹⁴C-BCD后8小时，在1,000μg血液中检测到3μg BCD(8hours afteroral administration of 313mg/kg ¹⁴C-BCD 3μg of BCD was detected in 1000μg ofblood.)”。

除了上述环糊精衍生物之外，Pocono Enterprise LLC以CAVCON品牌销售几种环糊精产品。除了羟丙基HP-β-环糊精、磺基丁基醚-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精和甲基-β-环糊精外，CAVCON还销售单-(6-氨基-6-脱氧)-β-环糊精、七(6-氨基-6-脱氧)-β-环糊精、单-(6-巯基-6-脱氧)-β-环糊精、六-(6-巯基-6-脱氧)-α-环糊精、七-(6-巯基-6-脱氧)-β-环糊精、八-(6-巯基-6-脱氧)-γ-环糊精、单-(6-(二亚乙基三胺)-6-脱氧)-β-环糊精、单-(6-((三亚乙基四胺)-6-脱氧)-β-环糊精、单-(6-(四亚乙基五胺)-6-脱氧)-β-环糊精、单-(6-对甲苯磺酰基)-β-环糊精、单-(6-乙二胺-6-脱氧)-β-环糊精、单-(6-(1,6-六亚甲基二胺)-6-脱氧)-β-环糊精、单-6-叠氮基-6-脱氧-β-环糊精、羧甲基-β-环糊精、六-(6-碘-6-脱氧)-α-环糊精、七(6-碘-6-脱氧)-β-环糊精和八-(6-碘-6-脱氧)-γ-环糊精。与活性剂和聚合物连接的市售环糊精包括水杨酸-羟丙基-β-环糊精复合物、薄荷醇-羟丙基-β-环糊精复合物、香草醛-β-环糊精复合物、吡罗昔康-β-环糊精、交联的可溶性β环糊精聚合物和β环糊精表氯醇共聚物。Cyclolab也销售合适的环糊精，其也可用于本文所述的方法中。

应当理解，这些示例性环糊精衍生物中的几种包括可用于将环糊精与其它活性剂连接的官能团。例如，巯基环糊精可以与马来酰亚胺官能化的活性剂和/或交联剂(均官能或异官能交联剂，例如，双马来酰亚胺乙烷、1,4-双马来酰亚胺丁烷、双马来酰亚胺己烷、三(2-马来酰亚胺乙基)胺、1,8-双马来酰亚胺基-二甘醇、1,11-双马来酰亚胺基-三甘醇、N-α-马来酰亚胺基乙酰基-氧基琥珀酰亚胺酯、SM(PEG)24、琥珀酰亚胺基碘乙酸酯，可得自Thermo Fisher Scientific)。有利地是，含二硫化物的接头，诸如二硫代双马来酰亚胺乙烷和琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯，可以通过还原剂裂解。

胺官能化的环糊精(例如，二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、乙二胺、六亚甲基二胺衍生物等)可以与NHS酯反应以形成酰胺键。用对甲苯磺酰基和碘离去基团官能化的环糊精可以进行亲核取代反应。叠氮化物官能化的环糊精可以与炔烃进行Huisgen环加成反应(铜催化的或不含铜的，例如，使用环辛炔)。不受限制地，羧甲基可以进一步反应形成酰胺键和酯键。在一些实施方案中，本公开涉及药物组合物，其包含α-环糊精结构中任何上述衍生物。

基于待治疗的体征、症状和/或疾病，选择与环糊精(直接或经由同双官能交联剂或异双官能交联剂)偶联的活性剂。例如，当递送NSAID可治疗疼痛时，可以使用α、β和/或γ环糊精的吡罗昔康衍生物。在另一非限制性示例中，在多发性硬化症的治疗中，环糊精和/或HP环糊精可以(直接或使用交联剂)偶联至可注射药物(例如，Avonex(干扰素β-1a)、倍泰龙(干扰素β-1b)、克帕松(醋酸格拉替雷)、Extavia(干扰素β-1b)、Glatopa、Plegridy(聚乙二醇干扰素β-1a)、Rebif(干扰素β-1a)、Zinbryta(达克珠单抗))、口服药物(例如，Aubagio(特立氟胺)、Gilenya(芬戈莫德)、Tecfidera(富马酸二甲酯))或输注药物(例如，Lemtrada(阿仑单抗)、Novantrone(米托蒽醌)、Orevus(奥瑞珠单抗)、Tysabri(那他珠单抗))。

在本发明主题的另一个实施方案中，活性剂治疗佩吉特氏病。例如，佩吉特氏病的治疗包括：阿仑膦酸盐(Fosamax)、伊班膦酸盐(Boniva)、帕米膦酸盐(Aredia)、利塞膦酸盐(Actonel)和唑来膦酸(Zometa，Reclast)。

关于偶联到每个环糊精上的活性剂的数目，应当理解，每个环糊精可以偶联到一种或多种活性剂上，例如，每个α-D-吡喃葡萄糖苷单元偶联一种。因此，α-环糊精可以与一种、两种、三种、四种、五种或六种活性剂偶联。α-环糊精可以与一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种活性剂偶联。α-环糊精可以与一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种活性剂偶联。交联剂的长度应选择为允许所需数量的活性剂与该大小的这样的活性剂偶联。与各环糊精偶联的各活性剂可以相同或不同。在本发明主题的另一个实施方案中，HP-环糊精的一个或多个羟丙基被活性剂取代。

作为活性剂的替代或补充，环糊精和/或HP-环糊精可以任选地与载体偶联。载体包括纳米颗粒(例如，金纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、碳纳米颗粒等)、脂质体(或用于制备脂质体的表面活性剂)、聚合物(合成的和天然的(碳水化合物、肽/蛋白质、核酸)，及其杂化物和/或组合)，以及其它环糊精。

有利地是，如果环糊精/HP-环糊精被递送至每个细胞，则将环糊精偶联至载体可增加载荷。不希望受特定假设的限制，将环糊精和/或环糊精衍生物偶联到载体上也可将细胞摄取的机制改变为内体摄取。因此，环糊精和任何活性剂将被递送至溶酶体，其中需要将根据本发明主题的环糊精与脂质复合。

细胞毒性/溶血

磷脂和胆固醇(细胞膜的主要结构单元)都是脂质。因此，当静脉内给予环糊精而未填充其亲脂腔时(或在已经递送亲脂药物之后)，环糊精可以潜在地从膜中提取磷脂和胆固醇。“已经证明几种CD在不同类型的细胞中引起细胞裂解，这表明这种作用并非特定于细胞类型[(Irie和Uekama 1997)](Several CDs have been demonstrated to cause celllysis in different types of cells,indicating that the effect is not cell-typespecific[(Irie and Uekama 1997)].)”Toxicol Pathol，36(1)，30-42(引自J PharmSci，86(2)，147-62)。

特别地，已知CD可诱导红细胞上的膜内陷的形状变化，并且在较高浓度下，以β-CD>α-CD>γ-CD的顺序诱导人红细胞的溶血。(Irie等人，1982)，即，α-CD的溶血活性低于β-CD和HP-β-CD。参见J Pharm Sci，86(2)，147-62，图6。此外，β-CD在去除膜胆固醇时诱导人角质形成细胞中半胱天冬酶依赖性凋亡细胞死亡，而α-CD和HP-β-CD对于这种类型的细胞不具有凋亡作用。参见Toxicol Pathol，36(1)，30-42。

类似地，发现HP-α-CD和麦芽糖基-α-CD对异质人上皮结肠直肠腺癌(Caco-2)细胞的细胞毒性低于α-CD。参见Biol Pharm Bull，24(4)，395-402；Molecules，20(11)，20269-85。

从这些观察结果中，HP-环糊精不仅具有较小的肾毒性，而且具有较小的细胞毒性/溶血作用。

2-羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)用作许多亲脂性药物(包括神经甾体allopregnanolol)的权宜(expedient)/溶剂。环糊精α-CD已被批准，并用作治疗***功能障碍的海绵体内注射前列地尔(一种***素)的权宜。

然而，总体上较小的细胞毒性可能不够。2010年的一项研究表明，HP-β-CD在剂量为4-8g/kg时在猫中引起永久性听力损失，对使用环糊精作为药物而非权宜(较小剂量)引起关注。参见Pediatr Res，68(1)，52-6。

在2014年，观察到神经甾体allopregnanolol在C型尼曼-皮克病(NPC)中的报道益处事实上是由于溶剂2-羟丙基-β-环糊精(HP-β-环糊精)。参见Journal of LipidResearch，55(8)，1609-21。已证明治疗剂量的β-环糊精从细胞组分中提取胆固醇，而不是如前所述从细胞膜中提取胆固醇。2015年9月，对患有C1型尼曼-皮克病的神经系统疾病的患者进行了2-羟丙基-β-环糊精的2b/3期研究。ClinicalTrials.Gov，(2016-03-06)，NCT02534844。问题是，是否能够在避免耳毒性风险(“死或聋？”)的同时保留治疗NPC的益处。

几种CD的溶血活性与其溶解胆固醇的能力之间存在正相关，”J Pharm Sci，86(2)，147-62，表明耳毒性可能与从外毛细胞提取胆固醇直接相关。

本文报道的遗传研究结果表明，乳腺癌(包括转移)的进展部分是由于甘油磷脂(LPC、PC、PS、PA)过度转化成PI(PI循环的底物)引起的，PI循环通过使磷酸肌醇可用来调节内吞作用。(LPC还参与了循环性纤维化中表面活性剂抑制作用，其中“LPC或FFA介导的表面活性剂抑制作用被MβCD逆转，甚至在相对不存在胆固醇的情况下[可能反映出]MβCD隔绝除胆固醇之外的非甾族脂质的能力(LPC or FFA mediated surfactant inhibition wasreversed by MβCD,even in the relative absence of cholesterol[likelyreflecting]the capacity of MβCD to sequester non-steroidal lipids in additionto cholesterol.)”)。Gunasekara,L.等人(2017)“小儿囊性纤维化中的肺表面活性剂功能障碍：脂质隔绝药物的机制和逆转(Pulmonary surfactant dysfunction in pediatriccystic fibrosis:Mechanisms and reverse with a lipid-sequestering drug)”，JCyst Fibros。

所有环糊精都具有清除磷脂的能力。然而，β-环糊精常常被选择，而非α-CD，因为它们可以用作更多(更大)药物的权宜。较小的α-CD(只有6个淀粉分子，图18)对较小的磷脂具有较高的特异性，因为胆固醇不适合α-CD的较小空腔(图1)。参见European Journal ofBiochemistry，186(1-2)，17-22；Journal of Lipid Research，55(8)，1609-21。提取磷脂、胆固醇和蛋白质的特异性见错误！未找到参考源。23。参见European Journal ofBiochemistry，186(1-2)，17-22。在磷脂中，α-CD比鞘脂更有效地清除甘油脂，诸如甘油脂。特别地，已知α-CD在PI的肌醇头部或sn-2链周围形成复合物。参见J Pharm Sci，86(8)，935-43。因此，α-CD经由PI循环特异性下调用于调节内吞的底物，从而以比β-环糊精更高的特异性下调内吞作用。与胆固醇相比，HPαCD保留了α-CD对磷脂的偏爱。

β-环糊精的耳毒性被认为是由β-环糊精剥夺了它需要在外毛细胞中起作用的胆固醇的动力素(prestin)引起的。参见Biophysical Journal，103(8)，1627-36；Sci Rep，6，21973。由于α-CD的空腔对于胆固醇太小，因此α-CD及其衍生物(包括，但不限于HP-α-CD)避免了耳毒性。

据报道，长期肠胃外施用HP-β-CD(200mg/kg)降低骨矿物质密度(BMD)，这与骨吸收增加有关，而CD-二膦酸盐缀合物，阿仑膦酸盐-β-CD(ALN-β-CD)显示是骨合成代谢的。参见Toxicol Pathol，40(5)，742-50；Biomaterials，29(11)，1686-92。

B)用α-CD或其衍生物或盐治疗癌症患者，

本公开的几个实施方案包括使用α-环糊精和/或其衍生物或药学上可接受的盐。

本公开的实施方案特别可用于治疗患有癌症的个体，所述癌症被鉴定为具有一种或多种具有异常高的内吞作用或胞吐作用速率的细胞，或者在一些实施方案中，具有功能障碍的PI循环。在一些实施方案中，用于治疗患有癌症的受试者的方法包括以下步骤：首先将癌症鉴定为具有高的内吞作用或胞吐作用速率，或在一些实施方案中，具有功能障碍的PI循环，然后向这样的受试者施用治疗有效量的环糊精。在一些优选的实施方案中，通过PET成像，优选使用荧光标签、抗体或鉴定表6b的氨基酸序列或与表6b的氨基酸序列具有至少70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同源性的氨基酸序列中的突变的其它试剂，将癌症鉴定为具有高的内吞作用或胞吐作用速率，或在一些实施例中，具有功能障碍的PI循环。在一些实施例中，在体外迁移试验中，环糊精在浓度小于4mM，3mM，2mM或1mM的情况下可有效清除50％以上的细胞中的磷脂。在一些实施方案中，在体外细胞迁移试验中，以约1mM的浓度，环糊精或其衍生物或其盐可有效抑制大于50％的细胞中的细胞迁移。在一些实施方案中，在体外细胞迁移试验中，环糊精或其衍生物或盐或包合物在约0.5至约1.5mM的浓度下有效减少大于50％的细胞中的细胞迁移。

在本公开的一些实施方案中，用于治疗已被鉴定患有癌症的个体的方法包括向这样的个体施用治疗有效量的环糊精或其衍生物或盐，已知在体外迁移试验中，所述环糊精或其衍生物或盐在小于1mM的浓度下可在大于50％的细胞中有效抑制细胞迁移。在一些优选的实施方案中，在体外细胞迁移试验中，在小于约1.5mM的浓度下，环糊精或其衍生物或盐在大于50％的细胞中有效抑制细胞迁移。在一些优选的实施方案中，在体外细胞迁移试验中，环糊精或其衍生物或盐在约1mM的浓度下在大于约50％，60％，70％，80％或90％的细胞中有效抑制细胞迁移。在一些优选的实施方案中，在施用环糊精或其衍生物或盐之前，癌症被证实是包含一种或多种细胞的癌症，所述细胞的特征在于异常高的内吞作用或胞吐作用速率，或者在一些实施方案中，所述细胞的特征在于功能障碍的PI循环。这样做的优选方法是PET成像、样品(如活组织检查)的聚合酶链式反应(PCR)。

提供了用于抑制甚至部分抑制癌细胞转移的方法。该方法包含向癌细胞递送有效抑制细胞迁移的量的环糊精或其衍生物或盐。在体外细胞迁移试验中，所用环糊精或其衍生物或盐在小于约2mM或约1.5mM的浓度下有效减缓癌细胞在大于50％的细胞中的迁移。在一些实施方案中，在体外细胞迁移试验中，环糊精或其衍生物或盐在小于1.5mM的浓度下在大于50％的细胞中有效抑制细胞迁移。在一些优选的实施方案中，在体外细胞迁移试验中，环糊精或其衍生物或盐在浓度为1.0mM或约小于1.0mM的浓度下在大于50％的细胞中有效抑制细胞迁移。在一些实施方案中，治疗同时降低了治疗的耳毒性。

本公开的实施方案特别可用于治疗患有癌症的患者，所述癌症患有具有异常高的内吞作用或胞吐作用速率的癌细胞，或在一些实施方案中具有功能障碍的PI循环。这样的癌症包括大多数癌症，并且通常排除来自与脂质产生相关的组织的那些癌症(例如肝癌)和涉及脂肪细胞的癌症。具有异常高的内吞作用或胞吐作用速率的癌细胞，或在一些实施方案中，功能障碍的PI循环的癌细胞，通常限于上皮细胞来源的癌症。在一些实施方案中，癌症来自乳腺、结肠、肺或***的上皮细胞。因此，本文所述的一些方法涉及治疗癌症患者的方法，所述癌症具有异常高的内吞作用或胞吐作用速率，或在一些实施方案中具有功能障碍的PI循环，其中该方法包含向这样的患者或受试者施用治疗有效量的环糊精的步骤。在优选的实施方案中，已知在体外细胞迁移试验中，环糊精或其衍生物或盐在小于2mM的浓度下在大于50％的细胞中有效减缓细胞迁移。在一些优选的实施方案中，在体外细胞迁移试验中，环糊精或其衍生物或盐在小于1.5mM的浓度下在大于约50％，60％，70％，80％或90％的细胞中有效诱导细胞凋亡。具有异常高的内吞作用或胞吐作用速率的癌细胞，或在一些实施方案中具有功能障碍的PI循环的癌细胞通常具有表5b的酶的功能障碍和/或在其微环境周围代谢和/或摄取高水平的磷脂。在一些优选的实施方案中，在施用环糊精或其衍生物或药学上可接受的盐之前，癌症被证实特征在于异常高的内吞作用或胞吐速率的癌症，或者在一些实施方案中，具有功能障碍的PI循环的癌症。这样做的优选方法是样品的PET成像、PCR或免疫组织化学。

提供了预防或抑制癌细胞转移速率的方法，该癌细胞的特征在于异常高的内吞作用或胞吐作用速率，或在一些实施方案中，功能障碍的PI循环。该方法包含向癌细胞递送有效减少细胞迁移的量的环糊精或其衍生物或药学上可接受的盐。在体外细胞迁移试验中，所使用的环糊精或其衍生物或药学上可接受的盐在小于1.5mM的浓度下在大于约50％，60％，70％，80％或90％的细胞中有效抑制或降低细胞迁移速率。在一些优选的实施方案中，在体外细胞迁移试验中，本文公开的治疗在小于1.1mM的浓度下在大于约50％，60％，70％，80％或90％的细胞中有效抑制或降低细胞迁移速率。在一些优选的实施方案中，在体外细胞迁移试验中，本文公开的治疗在小于约1.0mM的浓度下在大于约50％，60％，70％，80％或90％细胞中有效抑制或降低的细胞迁移速率。

在一些实施方案中，本文公开的任何方法均不施用环糊精，所述环糊精在施用于受试者时清除胆固醇。

环糊精的生产相对简单，并且涉及用一组容易获得的酶处理普通淀粉。通常，环糊精糖基转移酶(CGTase)与α-淀粉酶一起使用。首先通过热处理或使用α-淀粉酶液化淀粉，然后加入CGTase用于酶转化。CGTase可以合成所有形式的环糊精，因此转化产物产生三种主要类型的环状分子的混合物，其比例严格取决于所用的酶：每种CGTase具有其自身的特征(113：7合成比例)。三种类型环糊精的纯化利用分子的不同水溶性：水溶性非常差的β-CD(18.5g/l或16.3mM)(在25℃下)可以容易地通过结晶回收，而更可溶的α-和γ-CD(分别为145和232g/l)通常通过昂贵且耗时的色谱技术纯化。作为选择，“络合剂”可以在酶促转化步骤中加入：这样的试剂(通常是有机溶剂，如甲苯、丙酮或乙醇)与所需环糊精形成络合物，随后沉淀。络合物的形成驱使淀粉向沉淀环糊精的合成转化，从而富集其在最终产物混合物中的含量。Wacker Chemie AG使用专用酶，其可以特异性地产生α-、β-或γ-环糊精。这对于食品工业是非常有价值的，因为只有α-和γ-环糊精可以在没有每日摄入限制的情况下被食用。

B)药物组合物和施用途径

在一些实施方案中，本公开提供组合物，其包含本文所述的任何一种或多种活性剂(单独或组合)，例如用于治疗恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症。例如，在一些实施方案中，本公开提供了包含环糊精或其类似物或衍生物的组合物，例如用于治疗其细胞表现出溶酶体贮积功能障碍的乳腺癌或***癌。

在一些实施方案中，本公开提供组合物，其包含本文所述的任何一种或多种活性剂(单独或组合)，例如用于治疗恶性或神经退行性疾病或病症。例如，在一些实施方案中，本公开提供了包含环糊精或其类似物或衍生物的组合物，例如用于治疗乳腺癌或***癌。

本公开提供的药物组合物包括其中活性成分(例如，本文所述的化合物，包括实施方案或示例)以治疗有效量(即，以有效实现其预期目的的量)含有的组合物。对于特定应用有效的实际量尤其取决于所治疗的病况。当在治疗疾病的方法中施用时，这样的组合物将含有有效量的活性成分以实现所需结果，例如调节靶分子(例如，PIP、PIP2、PIP3)的活性，和/或减少、消除或减缓疾病症状(例如，恶性、心血管或代谢病症或神经退行性，诸如阿尔茨海默病或帕金森病的症状)的发展。本公开化合物的治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文的详细公开。

药物组合物可以由本领域普通技术人员用根据选择的施用方式选择的组合物配制。合适的药物载体描述于最新版的Remington′s Pharmaceutical Sciences，A.0501(本领域的标准参考文献)。

施用药物组合物可以使用本领域技术人员已知的各种方法中的任一种来实现或进行。全身制剂包括设计用于注射(例如，皮下、静脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)施用的那些，以及设计用于经皮、经粘膜、口服或肺部施用的那些。在一些实施方案中，本文公开的有效量的药物组合物的施用不限于任何特定的递送系统，并且包括但不限于肠胃外(包括皮下、静脉内、髓内、关节内、肌内或腹膜内注射)、直肠、局部、透皮、肌肉或口服(例如，以胶囊、混悬液或片剂)施用。在一些实施方案中，对有需要的受试者的施用以单剂量或重复施用，并且以多种生理学上可接受的盐形式中的任一种，或与作为药物组合物的一部分的可接受的药物载体或添加剂一起进行。在一些实施方案中，使用任何合适的且生理上可接受的盐形式或标准药物制剂技术、剂量和赋形剂。在一些实施方案中，施用步骤包含将组合物或药物组合物通过静脉内、肌内、局部、皮内、粘膜内、皮下、舌下、口服、***内、海绵体内、眼内、鼻内、直肠内、胃肠内、导管内、鞘内、硬膜下、硬膜外、心室内、肺内、脓肿内、关节内、囊内、心包下、腋窝、子宫内、胸膜腔内、腹膜内、经粘膜或经皮施用。本文所述的药物组合物可以通过多种途径施用，包括口服、口腔、舌下、直肠、透皮、皮下、静脉内、肌内、鞘内、腹膜内和鼻内。(Gaurav Tiwari，Ruchi Tiwari和Awani K.Rai，递送系统中的环糊精：应用(Cyclodextrins in delivery systems:applications)，J Pharm BioalliedSci.2010Apr-Jun；2(2)：72-79.)根据预期的递送途径是口服的还是肠胃外的，活性剂可以配制成组合物，例如可注射的、局部的或口服的组合物。液体形式的组合物可包括合适的水性或非水性载体，其具有缓冲剂、悬浮剂和分配剂、着色剂、调味剂以及本领域已知的其它合适成分。组合物的固体形式可包括例如粘合剂、赋形剂、润滑剂、着色剂、调味剂以及本领域已知的其它合适成分。本文所述的活性剂和药物组合物也可以以缓释形式或从本领域已知的缓释药物递送系统施用。

药物组合物可以取决于疾病或病况并且取决于施用是预防还是治疗疾病或病况。例如，用于预防几种疾病或病况(包括，但不限于，癌症)的施用可以是口服施用，没有渗透增强剂，并且剂量较低。施用对于表现出癌症(例如三阴性结阳性乳腺癌)症状的受试者，施用可以是非肠道的、区域选择性的，并且以更高的剂量。靶向方法可包括，但不限于，与叶酸盐或抗叶酸剂(甲氨蝶呤、培美曲塞)组合。组合包括，但不限于，具有或不具有接头的酯化。对表现出神经退行性疾病症状的受试者的施用可以是鞘内施用，无渗透增强剂和靶向修饰。

在一些实施方案中，本公开的组合物是包含一种或多种如本文所述的活性剂以及一种或多种适用于药物递送的常规使用的组分(诸如，载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂、赋形剂等)的药物组合物，该组分可以被置于药物制剂的形式中。这样的制剂的非限制性示例包括溶液、霜剂、凝胶、凝胶乳剂、胶冻剂、糊剂、洗剂、油膏、喷雾剂、软膏剂、粉剂、固体混合物、气雾剂、乳剂(例如，油包水或水包油)、凝胶水溶液、水溶液、混悬液、搽剂、酊剂和适于局部施用的贴剂。适当时，本文所述的药物组合物和制剂可以方便地以离散的单位剂型存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。这样的方法包括使活性剂与液体载体、固体基质、半固体载体、细分的固体载体或其组合结合的步骤，然后，如果需要，将产品成形为所需的递送系统。药物组合物或制剂的单位剂型优选含有预定量的活性剂和经计算产生所需治疗效果的其它成分，诸如有效量的治疗有效量。典型的单位剂型包括，例如，液体组合物的预填充的、预定量的安瓿或注射器，或固体组合物的丸剂、片剂、胶囊等。

对于肠胃外施用，环糊精或其衍生物可以例如与药学上可接受的肠胃外溶媒或药学上可接受的载体一起配制成溶液、混悬液、乳液或冻干粉末。这样的溶媒或载体的示例是水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、5％人血清白蛋白、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏溶液和不挥发性油、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂(甘油磷脂)、花生油或芝麻油。也可以使用脂质体和非水载体(诸如不挥发油)。溶媒或冻干粉末可含有添加剂，其保持等渗性(例如，氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(例如，缓冲液和防腐剂)。制剂通过常用技术灭菌。肠胃外剂型可以用水或其它无菌载体制备。例如，通过将1.5重量％的活性成分溶解在0.9％氯化钠溶液中来制备适于注射施用的肠胃外组合物。另选地，可以将溶液冻干，然后在施用前用合适的溶剂重构。

药学上可接受的载体是本领域技术人员所熟知的，包括，但不限于，约0.01至约0.1M或约0.05M磷酸盐缓冲液或约0.8％盐水。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，诸如基于林格氏葡萄糖的那些等。另外，这样的药学上可接受的载体可以是水溶液或非水溶液、混悬液和乳液。非水溶剂的示例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。水性载体包括水、乙醇、醇/水溶液、甘油、乳液或混悬液，包括盐水和缓冲介质。

可以使用常规的药物赋形剂和混合技术制备药物组合物。口服剂型可以是用于待治疗患者口服摄取的酏剂、糖浆剂、片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、混悬剂等。典型的固体载体可以为惰性物质，诸如乳糖、淀粉、葡萄糖、纤维素制品诸如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；造粒剂；粘合剂，硬脂酸镁、磷酸二钙、甘露醇等。可以使用常规包封方法制备胶囊形式的组合物。例如，可以使用标准载体制备含有活性成分的小丸，然后填充至硬明胶胶囊中；另选地，可以使用任何合适的药物载体(例如，水性树胶、纤维素、硅酸盐或油)制备分散体或混悬液，然后将分散体或混悬液填充至软明胶胶囊中。典型的液体口服赋形剂包括乙醇、甘油(glycerol)、甘油(glycerin)、非水溶剂例如聚乙二醇，油或带有悬浮剂、防腐剂、调味剂或着色剂的水等。所有赋形剂可以根据需要使用制备剂型领域技术人员已知的常规技术与崩解剂、稀释剂、润滑剂等混合。如果需要，可以加入崩解剂，诸如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，诸如海藻酸钠。如果需要，固体剂型可以用标准技术包糖衣或包衣，包括，但不限于，使用壳聚糖，以靶向胃肠道的特定区域。对于口服液体制剂(诸如例如混悬剂、酏剂和溶液剂)，合适的载体、赋形剂或稀释剂包括水、乙二醇、油、醇等。另外，可以加入调味剂、防腐剂、着色剂等。

对于口腔施用，本公开的组合物可以采取以常规方式配制的片剂、锭剂等的形式。化合物也可以配制成直肠或***组合物，诸如栓剂或灌肠剂。典型的栓剂制剂包含粘合剂和/或润滑剂，诸如聚合二醇、甘油酯、明胶或可可脂或其它低熔点植物或合成蜡或脂肪。对于通过吸入施用，根据本公开使用的化合物可以使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体)方便地以来自加压包装或喷雾器的气溶胶喷雾的形式递送。在加压气雾剂的情况下，可以通过提供递送计量量的阀来确定剂量单位。用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒可以配制成含有化合物和合适的粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。甚至观察到较大的βCD也适用于吸入。参见ArchMed Res，45(8)，711-29。

制剂也可以是贮库制剂，其可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射施用。在这样的实施方案中，化合物可以与合适的聚合物或疏水材料(例如作为在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂一起配制，或作为微溶性衍生物，例如作为微溶性盐配制。

另选地，可以采用其它药物递送系统。脂质体和乳剂是众所周知的可以使用的递送载体的示例。也可以采用某些有机溶剂(诸如二甲亚砜)，尽管通常以更高的毒性为代价。另外，化合物可以使用持续释放系统递送，诸如含有治疗剂的固体聚合物的半渗透性基质。已经建立了各种缓释材料，并且是本领域技术人员所公知的。根据其化学性质，缓释胶囊可以释放化合物数周，直至超过100天。根据治疗剂的化学性质和生物稳定性，可以采用用于蛋白质稳定的其它策略。

本文所述的化合物还可以配制成用于通过快速浓注或连续输注进行肠胃外施用，并且可以以单位剂量形式存在，例如安瓿、小瓶(vials)、小体积输注或预填充注射器，或存在于具有添加的防腐剂的多剂量容器中。

还可以存在防腐剂和其它添加剂，诸如例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。所有载体可以根据需要使用本领域已知的常规技术与崩解剂、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂等混合。

C)剂量

可以基于在人或其它哺乳动物中进行的研究来计算本文所述的活性剂的剂量，以确定活性剂的功效和/或有效量(参见下文E节，临床结果)。施用的剂量和频率或时机可以通过本领域已知的方法确定，并且可以取决于多种因素，诸如活性剂的药物形式和施用途径，以及患者特征，包括年龄、体重或影响药物代谢的任何医学病况的存在。

在一个实施方案中，剂量可以作为单剂量施用。在另一个实施方案中，可以在一段时间内以多个剂量施用剂量，例如以特定的间隔施用，诸如每天、每两周、每周、每月等。在另一个实施方案中，剂量将为700mg/kg/d(表4，2010-04-15)。在另一个实施方案中，剂量将随时间增加直到观察到肾脏或细胞毒性的早期迹象，在这种情况下，剂量水平将降低到先前的良好耐受水平。

在一个实施方案中，活性剂的剂量为至少10mg，至少20mg，至少30mg，至少40mg，至少50mg，至少75mg，至少约100mg，至少125mg，至少150mg，至少175mg，至少200mg，至少225mg，至少250mg，至少275mg，至少300mg，至少325mg，至少350mg，至少375mg，至少400mg，至少425mg，至少450mg，至少475mg，至少500mg，至少550mg，至少600mg，至少650mg，至少700mg，至少750mg，至少800mg，至少850mg，至少900mg，至少950mg，至少1000mg，至少1,200mg，至少1,500mg，至少2,000mg，至少2,500mg，至少3,000mg，至少4,000mg，至少5,000mg，至少7,500mg，至少10,000mg，至少15,000mg，至少20,000mg或至少25,000mg。在一些这样的实施方案中，上述剂量是mg/天或mg/kg/天。在另一个实施方案中，活性剂的剂量为1至10,000mg，1至7,500mg，1至5,000mg，1至2,500mg，1至1,000mg，1至500mg，1至250mg，250至10,000mg，250至5,000mg，250至1,000mg，250至500mg，500至10,000mg，500至5,000mg，500至1,000mg的范围。在一些实施方案中，上述剂量为mg/天或mg/kg/天。

在一个实施方案中，可以施用单剂量。在另一个实施方案中，可以在一段时间内施用多个剂量，例如以特定的间隔施用，诸如每天4次，每天2次，每天1次，每周1次，每月1次，14天4次，21天2次，每月2次，21天4次，每月4次，或每月、每21天、每14天、或每周5、6、7、8、9、10、11、12次或更多次，等等。

在一个实施方案中，静脉内或鞘内施用的剂量可以是5,600mg/kg/wk或400mg/wk(表4)。

表4：Hempel双子剂量调整

引自Hastings C(2009-02-22)Addi和Cassi羟丙基-β-环糊精计划。慈悲应用临床研究。第2版治疗计划(Hastings C(2009-02-22)Addi and Cassi Hydroxy-Propyl-Beta-Cyclodextrin Plan.Compassionate Use Clinical Study.Treatment Plan Version#2)

http://addiandcassi.com/wordpress/wp-content/uploads/2009/09/FDA-Submission-for-Addi-an d-Cassi-Cyclodextrin-Treatment-Plan.pdf

NPC:http://www.nnpdf.org/cyclodextrin.html

D)受试者

本文所述的方法和组合物可用于在需要这样的治疗的任何受试者中治疗或预防恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症。在一个实施方案中，受试者为人。应注意，虽然在一些实施方案中，待治疗的受试者为绝经后妇女，但在其它实施方案中，本文所述的治疗方法不旨在限于这样的受试者。相反，在一些实施方案中，受试者可以是任何年龄，从新生儿到老年人。在一些实施方案中，可能期望治疗年轻受试者，例如小婴儿，特别是在家族史或遗传测试指示该受试者处于发展成恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症的风险的情况下。类似地，在一些实施方案中，可能期望治疗更年长的受试者，特别是在这些受试者开始表现出恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症的指标或症状的情况下。

本文所述的方法和组合物可用作预防性治疗或治疗性治疗。对于预防性治疗，本文提供的方法和组合物可预防性地用于尚未表现出恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症的任何明确或可检测的临床指标或症状但被认为有发展为恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症诸如MS、***癌或乳腺癌，或以功能障碍溶酶体为特征的疾病的风险的受试者。接受α-CD预防性治疗的受试者，例如，可能不表现出MS、***癌或乳腺癌，或以功能异常溶酶体为特征的疾病的任何临床指标或症状。在治疗性治疗的情况下，本文提供的方法和组合物可用于已表现出疾病或病症(诸如，MS、***癌或乳腺癌，或以功能异常溶酶体为特征的疾病)的一种或多种临床指标或症状的受试者。接受针对MS、***癌或乳腺癌，或以功能障碍溶酶体为特征的疾病的治疗性治疗的受试者，例如，可能已经临床诊断患有MS、***癌或乳腺癌，或以功能障碍溶酶体为特征的疾病，或可能另外表现出MS、***癌或乳腺癌，或以功能障碍溶酶体为特征的疾病的一种或多种临床指标或症状。在一些实施方案中，本公开涉及治疗癌症的方法，所述癌症包含在附图或说明书中鉴定的任何基因中缺乏或基本上缺乏的细胞，使得那些基因的有限表达或缺乏表达导致溶酶体功能障碍。

在一个实施方案中，可以将受试者鉴定为处于发展成恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症的风险中。在一个实施方案中，受试者具有恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症的家族病史。在一个实施方案中，受试者具有与恶性、神经退行性、心血管、代谢、炎性、自身免疫性或病毒性疾病或病症相关的一种或多种遗传风险因子，例如与PIP循环相关的基因中的基因突变。

E)临床结果

在一些实施方案中，本文提供的治疗方法(其包含，例如，向受试者施用有效量的根据本公开的组合物)导致或旨在实现癌症的一种或多种临床指标或症状的可检测改善，包括，但不限于，改变生长、迁移或侵袭。在本公开的一些实施方案中，改善的症状或指标选自由以下组成的群组：生存、无病生存、无远处转移生存、血液测试结果(包括，但不限于，循环肿瘤DNA和***特异性抗原)、X射线评估、身体检查结果(包括，但不限于，可触知的肿瘤)或用于组织学评估的组织活检。

为了确定个体中最高耐受剂量，将收集和分析全血计数和血清化学。血清化学可包括，但不限于，评估电解质、碳酸氢盐、葡萄糖、BUN、肌酸酐、镁、磷酸盐、肝酶(AST和ALT)、总蛋白、白蛋白、胆红素和碱性磷酸酶。此外，可以获得完整的脂质组，并且可以用显微镜评价红细胞的形状。可以测量骨密度以鉴定骨质疏松症的早期征兆。

本文所述的组合物和方法仅是说明性的，而非限制性的。本领域技术人员将理解，上述具体组合物和方法可以进行各种组合或修饰，并且本文所述的组合物和方法的所有这样的组合和修饰可以用于实施本公开。此外，在以下非限制性实施例中以及在以下权利要求书中进一步描述本公开的某些实施方案。

所有出版物，包括专利申请和期刊文章，通过引用整体并入本文。

相关专利

在AD的背景下，之前已宣布需要降低磷酸(PA)(美国专利8,288,378)(T.-W.Kim等人2012b)：“降低PA水平的试剂包括，但不限于，二酰甘油激酶抑制剂、磷脂酶D1抑制剂和/或磷脂酶D2抑制剂。[……][这样的试剂]的非限制性示例包括，但不限于，针对磷脂酶D1或D2或二酰甘油[sic]的siRNA(Agents which decrease PA levels include,but are notlimited to,an inhibitor of diacylglycerol kinase,an inhibitor ofphospholipase D1,and/or an inhibitor of phospholipase D2.[...]Non-limitingexamples of[such agents]include,but are not limited to,siRNA directed towardphospholipase D1 or D2 or diacylgerycerol[sic].)”。(美国专利8,288,378)(T.-W.Kim等人，2012b)未给出这样的试剂，该文献未被引用。

实施例

实施例1：PI循环是抗乳腺癌转移的药物靶标

在Trans Psychiatry，4，e354中进一步描述了用于获得实施例1中给出的结果的方法，其通过引用整体并入本文。

人类基因组计划完成后几乎十年，尚未实现全基因组联合研究(GWAS)所希望的科学和医学进展。将样品大小扩大到成千上万个受试者大大增加了数据收集的持续时间和成本，并且在非随机研究中，可能有点反常地增加假阳性的风险。该实施例描述了将新颖的计算生物统计学方法与微调到GWAS的探索性的决策策略相结合。随着这些方法学的进步，疾病相关的功能基因簇现在可以仅从几百个狭窄限定的病例的研究中提出。

尽管家族性乳腺癌是乳腺癌或***癌的已知危险因素的病史证明具有高度的遗传力，但一般人群中乳腺癌或***癌的遗传危险因素仍不清楚。如本文所述，来自三个独立群体(可从NIH's dbGaP获得)的数据使用遗传结构广泛位点数据的u-统计进行分析以探索上位性。为了解释(非随机)全基因组关联研究(GWAS)中系统的但与疾病无关的差异，以及为了在重叠的遗传区域中进行多重测试，采用了“全基因组显著性”的新的研究特异性标准。Trans Psychiatry，4，e354。在所有三项研究中，与内吞作用不同阶段相关的基因均丰富了研究结果，证实了以下假设：通过PI循环控制内吞作用与转移相关，因为这一过程将乳腺癌或***癌转变为致命性疾病。

这里使用的方法已经在儿童失神癫痫中得到验证，然后产生了关于预防孤独症中的缄默症(mutism)的新的可检验的假设。参见Pharmacogenomics，14(4)，391-401；TranslPsychiatry，4，e354。随着这些关于乳腺癌的研究中的附加证据以及来自更多研究的遗传数据已经公开，所描述的计算生物统计学方法将促进个性化医学和对比有效性研究。近十年来收集的遗传数据最终可以深刻地了解许多常见疾病的机理基础，II期和III期试验的亚组分析现在可以启发不良事件的危险因素和药物开发的新方向。

乳腺癌或***癌是死亡率最高的癌症。然而，对更常见的疾病形式的遗传风险因素仍然知之甚少。

受试者

该研究被适当地批准。没有人类参与者参与该研究。

本文所述的结果基于美国和欧洲乳腺癌的三项研究。这些研究包括以下数据：

(1)癌症易感性遗传标记(Cancer Genetic Markers of Susceptibility，CGEM)乳腺癌全基因组关联研究(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gap/cgi-bin/study.cgi？study_id＝phs000147.v3.p1)，其包括1145个病例/1142例对照。参见NatureGenetics，39(7)，870-74。

以及来自乳腺癌和***癌群组联盟(Breast and Prostate Cancer CohortConsortium)中***受体阴性乳腺癌的巢式病例对照和一个病例对照研究的两个子研究(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gap/cgi-bin/study.cgi？study_id＝phs000812.v1.p1)，两者都包括在(Garcia-Closas等人，2013)：

(2)欧洲前瞻性癌症调查(European Prospective Investigation into Cancer，EPIC)511例***受体阴性病例和500例对照，以及

(3)波兰乳腺癌病例对照研究(Polish Breast Cancer Case-Control Study，PBCS)543例***受体阴性病例(229例三阴性)和511例对照。^a

方法

ssGWAS：消除非信息性或低质量的SNP后，使用单变量数据的u-统计(也称为Mann-Whitney检验，其相当于Wilcoxon秩和检验)进行传统的ssGWAS。参见Annals ofMathematical Statistics，18(1)，50-60；Biometrics，1，80-83。通过构造，本分析结果与传统Cochran-Armitage趋势检验结果非常接近。参见Biometrics，11(3)，375-86。

注释：已证明，可用的注释文件不足以适当地区分距离太远或足够近以至于可能与涉及的SNP或区域相关的基因(或基因的剪接变体)。另一方面，二倍体型可能跨越基因或其调节区之外的LD阻断，在这种情况下，不太可能鉴定变异的功能含义。而且，可能没有足够的信息可用于确定基因的功能，在这种情况下，资助将不能用于鉴定功能相关基因的集合。因此，从网格/云基础结构返回的结果仍然需要手动检查以解决关于注释的歧义。

宽位点方法(Wide-locus approach)。为了克服以前单SNP GWAS(ssGWAS)应用于常见疾病时出现的一些缺点，在分析过程的不同阶段结合了几种策略。针对多达6个相邻SNP的宽位点作为主要结果，并且基于具有基因型结构(μGWAS)的结构化多变量数据的u-统计，应用与先前儿童期失神癫痫和孤独症研究中相同的非参数GWAS方法。参见Annals ofMathematical Statistics，19，293-325；Pharmacogenomics，14(4)，391-401；TranslPsychiatry，4，e354。为了避免假发现，排除含有具有已知功能或邻近其5'末端的基因的连锁不平衡(LD)区外的位点。也排除了仅受单个SNP高度影响的位点，除非该SNP涉及多于一个的研究或涉及先前的研究。

信息内容：与传统的回归方法相比，muGWAS提供了“信息内容”的内在测量，其可用于突出具有高重要性但低信息内容的区域作为可能的人工产物。在下面的曼哈顿图中，除非存在其它支持证据，诸如先前报道的与乳腺癌或其它癌症相关的邻近SNP，否则具有低信息内容的高度显著结果以红色突出并排除(用白色划掉)。一些信息含量低的区域由单个SNP占优势，或者涉及跨越LD区段而不在基因或其调节区内的二倍型(diplotype)。如果将窗口移动一个SNP导致显著性的大的(超过100倍)变化，也可以排除二倍型。值得注意的是，这些人工干预不能导致假阳性结果，并且当前的研究旨在形式化更多的这些规则以便于解释和避免假阴性结果。

MAF显著性相关性：对于任何有限的样本大小，u-或秩检验的显著性是有限的。因此，只有具有足够高MAF的SNP才能获得更显著的结果。用2,500,000个排列的表型进行ssGWAS模拟，对比了各种MAF大小相同的两组。排列分布的1-10^-5分位数从预期的s＝-log₁₀p＝5.26(通常满足MAF>.33)截止值下降至4.9(n＝1,000个受试者)，4.7(n＝500)和4.5(n＝300)，对于0.05的MAF。对于7.5水平，偏差预计会更大。由于这种MAF显著性相关，在“没有SNP与性状相关(no SNP is associated with the trait)”的无效假设下，ssGWAS QQ图中的预期对角线(JAMA，299(11)，1335-44)变成在对角线之下朝向末端下降的预期曲线。Transl Psychiatry，4，e354。

从>10⁸个排列估计期望的s值(-log₁₀(p))分布以获得1-10^-7.5分位数的稳定估计既不实用，也不足以避免用于有限测试的SNP的有偏选择。由于MAF显著性相关，当对比观察到的表型时，任何SNP“显著”也更可能是随机表型排列的“显著”。Transl Psychiatry，4，e354。

非随机化偏差：这种弯曲通常未被认识到的原因是GWAS受试者基于其结果被确定性地分类(例如，非口头对比口头)，而不是随机分配干预(如在临床试验中)。然而，预期许多确定性分类的群体在既不涉及感兴趣的状况也不涉及共同祖先因素(其可能通过分层来解释)的方面系统地不同。当来自使用有限测试的向下趋势和来自确定性选择的向上偏差相似时，除了暗示“真实关联”的位点之外，s值可能仍然看起来遵循对角线。JAMA，299(11)，1335-44。

二倍型长度的多重调节：对于重叠二倍型的多变量测试，估计的分位数-秩(QR)曲线需要整体升高到对角线之上，以说明在相同SNP周围进行的多个测试。因为这些测试中的大多数是高度依赖的，所以所估计的QR曲线与所估计的QQ曲线相比的高度(图6至图11)是有限的，但距离可能随疾病和群体而变化。Transl Psychiatry，4，e354。

投影QR曲线：传统QQ曲线的对角线不依赖于任何数据，包括最高“有效”数据。因为预期绝大多数SNP与疾病无关，所以预期s值最多部分符合对角线(除了最显著的结果之外)。直接类推，多变量测试的QR曲线应当是“平滑的”，向上的偏差表示“真实关联”，其可以是疾病相关的或无关的。基于上述基本原理和上述模拟结果，可以根据s值的平滑投影来估计每个染色体的投影QR曲线(顶点)的最高点，所述s值的平滑投影是在截断投影具有单调增加所需的尽可能多的最高值之后，并且保守地对于有限的测试是非正二阶导数。参见JAMA，299(11)，1335-44。对数据的拟合也减少了人群分层的影响。参见JAMA，299(11)，1335-44。(为了方便计算，选择局部加权多项式回归，如在S+(TIBCO Software Inc.)中所实现的loess，平滑(……度＝2，族＝“高斯”)(S+(TIBCO Software Inc.)as‘loss.smooth(…degree＝2,family＝”gaussian”)))。参见Journal of the American StatisticalAssociation，83(403)，596-610。

估计的全基因组QR顶点：尽管染色体在其相关和不相关风险因子的含量方面可能有所不同(参见，例如，自身免疫性疾病中的HLA区域)，但预期随机误差在所有染色体上具有相同的分布。因此，可以将期望的WG顶点估计为s值与投影的最小偏差的染色体之间的(WinSorized)中值投影顶点。(这里，基于最大范数和稳健性的中值选择十条染色体，但是确定最佳数目的策略(包括“最优性”的标准)仍有待确定.)Trans Psychiatry，4，e354。

估计的QR曲线：然后将每个染色体的估计曲线计算为该染色体s值的loess投影，其中用估计的WG顶点代替尽可能多的最高值，直到曲线的顶点处于或低于该水平。应用于WG投影(QR图，右下角)，该过程产生估计的WG曲线。参见Journal of the AmericanStatistical Association，83(403)，596-610。模拟结果证明，来自表型排列的估计的低方差以及它们的中值顶点与从观察到的s值估计的WinSorized中值顶点的相似性。TranslPsychiatry，4，e354。

研究特异性基因组范围的意义：对于旨在确认与表型相关的单个SNP的研究，“确认性”范例需要调整多样性。参见American Statistician，34(1)，23-25。当应用于GWAS时，这些调节通常基于“常规的”固定的0.05水平，而与I型相对于II型错误的研究规模或相对风险无关(参见(Fisher RA(1956)，第358页)和(Gigerenzer G(2004)Psychol Sci 15：286-7)用于讨论)，以及1,000,000个独立SNP的假设，与芯片密度无关(Pearson TA，Manolio TA(2008)JAMA299：1335-44)。从单个SNP转移到重叠的二倍型增加了任何形式多样性调节对具有可疑生物学有效性的假设的依赖性。Transl Psychiatry，4，e354。

然而，与大多数GWAS一样，本实施例中描述的研究并不旨在证实有关特定SNP的假设。相反，本文所述的研究旨在从>40,000个(假)基因中挑选可能的候选物，这些基因的相对重要性和上位相互作用尚不清楚。由于图形程序对于这样的“探索性”研究特别有用，因此选择QR图来指导解释。参见Tukey,John W.(1977)，Exploratory data analysis(Reading，Mass.：Addison-Wesley)。s值偏离估计曲线的精确截止值是未知的。当“知识[是]至多近似[，]是正确问题的近似答案(含十个模糊点)，比错误问题的精确答案要[好得多]，它可以总是精确的”(Tukey JW(1962)Ann Math Stat 33：1-&，第13-14页)。因此，提出了一种启发式方法，其依赖于比量化特定错误率的典型尝试更少的不现实假设。TranslPsychiatry，4，e354。

需要估计期望的WG曲线，s值具有复杂的依赖性结构，并且对于给定的样本大小，适当的显著性水平(α)是未知的。因此，提出了一种仅基于弱假设的启发式决策规则。在长期运行中，人们将期望在顶点以上的大多数s值在任何α>0(一致性)处是显著的，并且具有最强关联的区域在被包括时具有最高的几率(无偏差)。对于特定的α，可以降低截止值，但是为了考虑估计顶点的方差，需要将其升高。作为折衷，所估计的WG顶点被建议作为研究专用GWS的截止点。Transl Psychiatry，4，e354。

分位数-秩(QR)图：按照选择过程的惯例，p值主要用于对位点进行排序的目的。由于尚未确认关于特定位点的特定假设，因此对探索“QQ图”的特征作为判定标准的传统方法进行了修改和形式化。对于重叠二倍型的多变量检验，在单变量WG排列假设下的传统“QQ图”中预期的直线变成曲线，因为每个SNP进行多种检验。即使所执行的检验次数显著增加，与QQ线相比，QR曲线中所示的s值增加(图7相对图6，图9相对图8，图11相对图10)是有限的，因为大多数检验是高度依赖的。Transl Psychiatry，4，e354。

全基因组排列偏差：为了估计s值的预期分布，可以用随机表型排列平均重复运行的结果。然而，由于每个μGWAS分析在具有GPU使能的节点的网格/云上可能需要>100,000小时，因此需要>108次复制来估计1-10^-7.5分位数的仿真可能是不可行的。来自WG排列的估计(包括计算上有效的近似)受到由于受试者基于其结果被分类而引起的偏差的影响(例如，非口头相对口头)，而不是随机地分配干预(如在临床试验中)，从而预期这些组在与感兴趣的状况和共同的祖先因素都不相关的方面系统性地不同。对于二进制结果，显著结果也不能仅由几个‘异常值’引起，使得显著性与高MAF(ssGWAS)或分数的低偏度(μGWAS)相关。因此，在观察到的表型之间具有显著等位基因型差异的区域在随机表型排列中也具有更大的显著可能性。Transl Psychiatry，4，e354。

选择性染色体置换：提议的选择染色体置换方法的使用减少了这种偏差。虽然染色体在疾病相关和不相关危险因素的含量方面可能有所不同，但预期随机误差在所有染色体上具有相同的分布。因此，当确定排列分布时，通过排除包含高重要性区域的染色体来减少上述偏差。特别地，每个染色体的预期分布的终点可以从loess投影估计到截断后的p值，以确保单调增加和非正二阶导数。类似地，从具有s值分布与loess投影的最小最大偏差的有限组(例如10个)染色体的中值估计预期分布的终点。Transl Psychiatry，4，e354。

偏差的形式QR截止值：然后将每个染色体的期望分布的估计计算为个体染色体数据的loess拟合，其中在高端用期望端点代替足够数量的结果，直到曲线被缩减到该水平，除非初始loess拟合已经保持低于该目标水平。当应用于WG数据时，相同的过程产生WG分布的估计。模拟结果证明，基于表型的随机排列的估计的低方差，并且它们的中值与从观察到的数据获得的分布的估计非常相似。Transl Psychiatry，4，e354，

结果

先前已知的CGEM结果：传统上，每次研究中GWAS通常仅鉴定了少量SNP。先前对CGEMS数据的ssGWAS分析在趋势分析中涉及两个位点：

chr10：124,992,475rs10510126：6.15BUB3，(长EST not5未鉴定)

chr10：123336180rs1219648：5.49FGFR2

123341314rs2420946 5.46FGFR2

ssGWAS结果：单SNP GWAS证实这些发现的水平基本上分别为6.20和5.57。参见Nature Genetics，39(7)，870-74。许多其它结果在以前公开的分析中被忽略，因为p值没有达到“固定基因组范围显著性”的传统水平(通常为7.5)。从ssGWAS QR图(CGEM：

图1：环糊精，包括羟丙基环糊精。可以实现多达n×3取代度，可能具有许多位置异构体和区域异构体。R的取代基包括，但不限于，H(母体)、甲基(包括无规甲基化的)、丁基、2-羟丙基(HP)、乙酰基、琥珀酰基、葡糖基、麦芽糖基、羧甲基醚、磷酸酯、简单聚合物或羧甲基。典型的CD在环中含有6(α-CD)、7(β-CD)或8(γ-CD)D-葡萄糖单体，形成可以将客体分子容纳到其疏水腔中的锥形。

图2：胆固醇与α-CD和n相互作用的聚类分析。环糊精对HaCaT角质形成细胞增殖的影响。温育48小时后，相对于对照标准化的至少六个独立测量值的平均值。顶部：ATP测定，底部：PicoGreen测定)。W6：α-CD，W6：β-CD，W7s HP：HP-β-CD。改进自Hipler,U.C.等人，(2007)“环糊精在体外对HaCaT角质形成细胞增殖的影响(Influence of cyclodextrinson the proliferation of HaCaT keratinocytes in vitro)”，J Biomed Mater Res A，83(1)，70-9。

图3A至图3C：脂质释放的特异性I。用环糊精处理的完整红细胞(3B)或鬼形红细胞(ghost erythrocyte)(3A和3C)释放磷脂(3A)、胆固醇(3B)和蛋白质(3C)。(○)α-环糊精；(●)β-环糊精；(△)γ-环糊精。改进自(Ohtani Y，Irie T等人，(1989)，European Journalof Biochemistry，186：17-22)。

图4A至图4B：脂质释放的特异性II。4A)在各种浓度的α-CD和β-CD存在下温育2小时后，从脑毛细血管内皮细胞(BCEC)释放的胆固醇。结果表示为与对照相比从BCEC释放的胆固醇的百分比。每个百分比是三个不同过滤器的平均值，代表两个独立实验系列。4B)分别在0.5、5和50mM的α-CD和β-CD存在下温育2小时后，从BCEC释放的磷脂酰胆碱(PC)(浅柱)和鞘磷脂(暗柱)。结果表示为与对照相比从BCEC释放的磷脂的百分比。每个百分比是三个不同过滤器的平均值，代表两个独立实验系列。改进自(Monnaert V，Tilloy S等人，(2004)，Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，310：745-51)。

图5：MβCD，而非αCD保护A2E免受氧化。双类维生素(bisretinoid)A2E是在眼脂褐素提取物中鉴定出的第一种化合物。通过5μM A2E溶液的UV可见吸收光谱的变化监测A2E免受氧化的保护。(5A)在所示环糊精(12mM)存在下，蓝光照射之前(●)和之后(○)的A2E氧化状态。(5B)在室温下在黑暗中在环糊精存在下温育后，在时间0(●)和1天(○)的A2E氧化状态。改进自(Nociari MM，Lehmann GL等人，(2014)，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences，111：E1402-E8)。

图，EPIC：图，以及PBCS：图)用于研究特异性基因组范围显著性的截止之上的许多基因适合参与膜信号传导(GPCR、Fc受体、生长因子受体、离子通道)或核过程(细胞周期控制、转录、剪接)的范例(参见表5，Mbrn和Ncls列)。

muGWAS结果：在muGWAS(CGEM：图7，EPIC：图10，以及PBCS：图8)中，与膜信号传导和核过程相关的基因的比例甚至高于ssGWAS。此外，已知在磷脂酰肌醇(PI)循环(图12)或内吞作用(图13A)中起作用的一组基因突出。

表5：研究鉴定基因。研究；IPV6/IPV1：-log10(p值)，以muGWAS/ssGWAS表示；Mbrn：膜相关基因(GPCR、Fc受体、HA、RTK、离子通道)，PI/EC：磷脂酰肌醇信号传导/内吞作用，MPK：MAP激酶，Ncls：核(细胞周期控制、转录、剪接)。每个研究中的行的顶块：具有在muGWAS中基因组范围显著性的研究特异性水平之上的二倍型的基因(CGEM：5.29，图6；EPIC：5.71，图8；PBCS：5.13，图10)；每项研究中的中心行块：在muGWAS的前41中具有二倍型的其它基因；每项研究中的底部行块：在ssGWAS中具有高于研究特异性水平的全基因组显著性的SNP的基因(CGEM：4.03，图6；EPIC：4.00，图8；PBCS：3.84，图10)；也涉及muGWAS的基因的ssGWAS结果显示在muGWAS结果旁边；黑色正方形：已知的乳腺癌基因(来自http://www.genecards.org)；方框基因名称表示相同基因(粗体，PRKCQ，MEGF11)的复制或属于相同家族的密切相关基因(ATP8A1/ATP8B1，AGPAT3/AGPAT4，BMP7/BMPR1B)的复制。

表5：(续)

表5：(续)

验证(相同的基因内区域)：PRKCQ(chr 10)通过CGEM中的muGWAS(mu：6.70，ss：3.47，表明研究特异性基因组范围的显著性)和EPIC中的ssGWAS(mu：5.26，ss：3.87*)是显著的。在两个群体中都涉及相同的区域(chr10：6,540,724-6,573,883)。相反，在PBCS中，在该区域(<2.00)中没有关联，这与不同群体中乳腺癌的不同危险因素的概念一致。验证(相同基因)：MEGF11涉及CGEM和PBCS两者。EPIC中MEGF11甚至升高(3.31)。单个SNP在任一群体中是高度有影响的，但它不是同一SNP(CGEM：rs189155，PBCS：rs12903880，EPIC：rs333554)。所有三个SNP都位于编码区中，但它们不在LD中。在MEGF11(rs1477798)中的另一个SNP与结肠直肠癌有关。参见PLoS One，7(5)，e38175。验证(类似功能)：在复杂疾病中，人群在存在于每个人群中的危险因素方面可能有所不同。特别地，由具有相似功能的不同基因赋予的风险比例可有所不同，并且即使涉及相同的基因，风险也可能与不同的SNP相关。

一对功能相关基因显示在ssGWAS中突出(表5)：

BMPR1B(CGEM)–BMP7(EPIC)

在muGWAS结果(表5)中，还有另外三对功能相关基因：

ATP8B1(CGEM)–ATP8A1(EPIC)

MEGF11(CGEM,PBCS)

AGPAT4(CGEM)–AGPAT3(EPIC)

已知PI3K、PTEN和SYNJ2中的突变与乳腺癌有关。

通常认为涉及的机制是PI(3,4,5)P₃和PI(3,4)P₂下游AKT/TSC/mTOR生长途径的失调。该分析的结果指向涉及PI循环的另外三个点(图12)：

PI(4,5)P2(SCARB2，UNC13C，STXBP1，SDCBP2，MEGF11，SYT17，N4BP3，VAV3)和

PI(3)P(NLRP4，EEA1，RAB32)，以及

PI(ATP8A1，ATP8B1，SLC5A3，AGPAT3，AGPAT4，ANXA4)的总体活化。

除了CHMP7、RAPGEF4和EEA1之外，所有这些基因先前已经显示与乳腺癌相关(http://www.genecards.org)。

新发现是，乳腺癌风险不仅由以下的多种变异所赋予：

涉及导致癌症易感性的核过程的基因，和

参与提供生长信号的膜过程的基因，

以及通过增加以下来连接两者的一些特定变化

PI(3,4,5)P₃(PTEN中的功能损失，PI3K中的功能增益)，

PI(3,4)P₂(SYNJ1/2或INPPL1中的功能增益)，或

PI(3)P(INPP4B中的功能增益)，

但通过PI循环的整体失调，其包括

磷脂酰肌醇(PI)(涉及AGPAT3、AGPAT4和SLC5A3)的进入，以及

磷脂酰丝氨酸/磷脂酰胆碱(PS/PC)(涉及ATP8A1、ATP8B1和ANXA4)的进入，

以及作为细胞迁移和侵袭的重要组成部分的内吞作用。已知内吞作用受PI信号传导控制，这与在给出的结果中鉴定的基因一致：

在质膜阶段(PM，8个基因)；

在早期内体阶段(EE，四个基因)，和

在晚期内体阶段(LE，两个基因)。

在一些实施方案中，受试者患有疾病或病症，其特征在于通过上述公开的任何一种基因或基因组合的缺陷表达的功能障碍溶酶体途径。

讨论

这里使用的方法与传统GWAS的不同之处在于所使用的统计方法和决策策略。为了解决GWAS特有的统计方法挑战，该新方法

(a)避免对特定显性程度做出假设。

(b)得出以下事实：与疾病位点相邻的两个SNP均应位于LD中，除非它们被重组热点隔开。

(c)可以区分属于相同标记组的SNP，但它们沿着染色体的顺序不同。

(d)说明相同区域内具有相似作用的不同疾病位点和统计方法内的复合杂合性(而不是通过目测在具有高度显著性的区域内寻找多个SNP)，以及

(e)提供可用于确定结果优先级的附加信息(“信息内容”)。

使用决策规则来说明

(a)GWAS是非随机化的，

(b)目的是选择基因集合，知道一些基因必须具有效果，而不是测试根本没有基因具有效果的假设，

(c)在估算p值的预期分布时考虑MAF中的差异，并且

(d)调整相关重叠二倍型的检验。

CAE中μGWAS的验证证明了μGWAS鉴定调节已知疾病途径的基因的能力，而传统的ssGWAS仅鉴定了单个SNP(在假基因中)。随后应用于孤独症中的缄默症证实了μGWAS鉴定两个独立群体中与相同生物学功能相关的基因簇的能力。参见Pharmacogenomics，14(4)，391-401；Transl Psychiatry，4，e354。

通过单独使用这种新的决策规则和传统的单SNP GWAS，“显著”基因的数目在这里考虑的三个研究的每一个中都从零上升到>20。使用新的决策规则在ssGWAS中看到的基因组包括与新的PI循环途径相关的基因的一半。然后，新的非参数宽位点方法添加参与PI循环的另一半基因。

PI循环对于真核细胞中的许多细胞功能(包括***成熟、受精和胚胎发生，细胞生长，细胞骨架动力学，膜运输和核事件)至关重要。参见Philos Trans R Soc Lond BBiol Sci，320(1199)，415-26；Biochemistry，49(2)，312-7。因此，PI循环被严格控制并不令人惊讶。特别地，PI(4.5)P2、PI(4)P、PI(3,4)P2和PI(3)P被三种激酶和三组磷酸酶紧密调控。参见Biochim Biophys Acta，1851(8)，1066-82。磷酸酶的不同子集(图，方框)抵消了激酶的作用，进一步降低了特定磷酸酶的任何变化可能对整个系统的影响。因此，修改这种严格调控的系统的状态的特定干预可能不足以实现持续的效果。

“PtdIns(3,4,5)P3和PtdIns(3,4)P2可能是细胞达到和维持恶性状态所必需的(both PtdIns(3,4,5)P₃ and PtdIns(3,4)P₂ are likely required for a cell toachieve and sustain a malignant state)”已经被制定为“两个PIP假设(two PIPhypothesis.)”。参见Ann N Y Acad Sci，1217，1-17。这里给出的结果表明，不仅需要PI(3)P，而且焦点进一步移向整个PI循环。这个新的焦点对于药物的开发具有直接的意义。

线性(PI-PIP-PIP2-PIP3)PI系统的模型提示抑制PI3K作为降低沿着AKT/TSC/mTOR生长途径的活性的策略。然而，只有一小部分患者受益于通过阻断PI3K阻断该线性途径。参见Science Translation Medicine，7(283)，283ra51-83ra51。渥曼青霉素和其它阻断PI3K的药物的有限成功与PI循环不仅补偿天然的，而且补偿特定点的药物紊乱的能力一致。

已知高水平的PI(3,4,5)P3、PI(3,4)P2和PI(3)P都与癌症的阴性结果相关。“磷脂酰肌醇(PI)丰度的改变是癌症的特征。各种PI标记正常细胞和恶性细胞中不同膜的身份(Altered abundance of phosphatidyl inositides(PIs)is a feature ofcancer.Various PIs mark the identity of diverse membranes in normal andmalignant cells.)”。Sengelaub,Caitlin A.等人，(2015)“PTPRN2和PLCβ1通过PI(4,5)P2依赖性肌动蛋白重塑促进转移性乳腺癌细胞迁移(PTPRN2 and PLCβ1promote metastaticbreast cancer cell migration through PI(4,5)P2-dependent actin remodeling)”，The EMBO Journal。围绕PI(4,5)P2–PI(4)P–PI(3,4)P₂–PI(3)P途径紧密调控的PI循环的模型表明PI活性的总体下调作为比阻断激酶或磷酸酶的个体或对更成功的策略来校正涉及PI循环的过度活化。

乳腺癌和***癌本身都不是致命的；转移扩散到其它器官导致癌症相关死亡。如在涉及细胞毒性药物的治疗中所见，减少细胞生长通常引起副作用(恶心，脱发……)，而不一定降低转移的风险，因为生长和转移可由不同途径调控。

为了转移，“肿瘤细胞必须形成活动的和侵入性的表型(tumor cells mustdevelop motile and invasive phenotypes.)”。已知细胞迁移需要内吞作用。参见ColdSpring Harbor Perspectives in Biology，5(12)。作为“生长因子受体的缺陷性囊泡运输，以及基于整联蛋白和钙粘着蛋白的粘附复合物的不平衡再循环，在过去的5年中作为多层面的标志出现(defective vesicular trafficking of growth factor receptors,aswell as unbalanced recycling of integrin-and cadherin-based adhesioncomplexes,has emerged in the past 5years as a multifaceted hallmark)”，“脱轨的内吞作用(derail[ing]endocytosis)”已被建议作为预防癌症转移的策略。Nat RevCancer，8(11)，835-50。与内吞作用运输相关的信号转导途径的激活(图13a和b)对于肿瘤细胞迁移至关重要。因此，选择性靶向内吞作用运输和信号传导可能潜在地允许开发新的癌症治疗剂以预防转移。OncTarget，7(1)，5-6；参见图13A和图13B：涉及muGWAS的基因与内吞作用过程(图13A)和胞吐作用/溶酶体功能阶段(图13B)的已知关系。方框：本公开内容中通过内/外胞吐阶段鉴定的基因：网格蛋白包被的囊泡(CCV)和E3泛素化的形成，失活整联蛋白(快速再循环)与活性整联蛋白的分离(慢速再循环)，分泌、溶酶体和(慢速)再循环途径之间的分选，以及溶酶体降解。下划线的基因分别是已知的乳腺癌启动子和抑制子。网格蛋白介导的内吞作用(CME)始于异源四聚体网格蛋白衔接子复合体AP-2与网格蛋白在富含P1(4,5)P2的质膜(PM)位点的共组装。AP-2在其开放构象中募集网格蛋白和其它内吞蛋白，其中许多也与PI(4,5)P2结合。网格蛋白包被的凹坑(CCP)成熟可伴随SHIP-2介导的PI(4,5)P2至PI(4)P的去磷酸化。PI(3,4)P2的合成对于PX-BAR结构域蛋白SNX9在收缩CCP处的组装是必需的，并且可能与PI(4,5)P2经由突触小泡磷酸酶水解成PI(4)P并行发生，从而通过网格蛋白依赖性募集和活化PI3KC2α(一种II类PI3激酶)来促进辅助蛋白依赖性囊泡脱膜。PI(3,4)P2最终可以通过4-磷酸酶INPP4A/B(内体GTP酶Rab5的效应物)在途中转化为PI(3)P2，然后进入内体。改编自Posor,Y.，Eichhorn-Grunig,M.和Haucke,V，(2015)“内吞作用中的磷脂酰肌醇(Phosphoinositides in endocytosis)”，Biochim Biophys Acta，1851(6)，794-804。在早期内体(EE)中，对β1整联蛋白进行了分选。失活的整联蛋白进行快速“短环”再循环；活性整联蛋白进入晚期内体(EE)/多囊体(MVB)，用于缓慢的“长组”再循环(RAB11)，溶酶体变性(除非被RAB25/CLIC3拯救)，或经由RAB9介导的跨高尔基体网络(TGN)分泌。表皮生长因子受体的快速再循环驱动增殖，因此可以预期图8a中的功能获得突变。参见Tomas,Alejandra,Futter,Clare E.和Eden,Emily R，(2014)“EGF受体运输：信号传导和癌症的后果(EGF receptor trafficking:consequences for signaling and cancer)”，Trends in Cell Biology，24(1)，26-34。溶酶体和突触小泡胞吐作用具有许多相似性。内溶酶体定位的PIP可调节溶酶体运输(部分来源于Kegg途径hsa04144和hsa04721)。改编自Samie,M.A.和Xu,H，(2014)“溶酶体胞吐作用和脂质储存病症(Lysosomal exocytosis andlipid storage disorders)”，J Lipid Res，55(6)，995-1009。参见Bohdanowicz,M.和Grinstein,S，(2013)“磷脂在内吞作用、吞噬作用和巨胞饮作用中的作用(Role ofphospholipids in endocytosis,phagocytosis,and macropinocytosis)”，Physiol Rev，93(1)，69-106；Hesketh,G.G.等人，(2014)“VARP通过与逆转运复合体直接相互作用被募集到内体上，其中它们一起在输出到细胞表面中起作用(VARP is recruited on toendosomes by direct interaction with retromer,where together they function inexport to the cell surface)”，Dev Cell，29(5)，591-606；Mosesson,Yaron,Mills,Gordon B.,和Yarden,Yosef(2008)，“脱轨的内吞作用：癌症的新型特征(Deraledendocytosis：an emerging feature of cancer)”，Nat Rev Cancer，8(11)，835-50；Schmid,Sandra L.和Mettlen,Marcel(2013)，“细胞生物学：脂质开关和交通控制(CellBiology：Lipid Switches and TrafficControl)”，Nature，499(7457)，161-62。

图

实施例2：PI循环中和沿着内吞作用途径的遗传危险因素被认为是乳腺癌中“脱轨的内吞作用”和帕金森病/阿尔茨海默病中“失调的内吞作用”的共同危险因素。

已知AD和PD共有危险因素：已经假设Aβ和α-突触核蛋白相互作用，Neurotox Res，16(3)，306-17；PLoS One，3(9)，e3135，并且在1986年至2010年进行的14项研究的meta分析中发现了AD与PD的“中度关联”，Neuroepidemiology，42(2)，69-80，但是来自两组AD和PDGWAS的单SNP汇总统计学的meta分析(每组归入7,815K SNP)“未导致[SNP]位点增加PD和AD风险的重要证据。”JAMA Neurology，70(10)，1268-76。最近，具有诊断为PD或AD的Lewis体(DLB)的疾病在这些研究中被鉴定为潜在的混杂因子，并且上述结果表明，上述“显著证据”的缺乏可能是由于ssGWAS具有比muGWAS更低的顺式上位效应能力。参见Human MolecularGenetics，23(23)，6139-46；Neurobiol Aging，38，214e7-10。

内吞作用是衰老和神经退行性疾病的病因学的共同组成部分：术语“脱轨的内吞作用”已用于表征BC(Nat Rev Cancer，8(11)，835-50)，AD(Biomed Res Int，2014，167024)和其它“病理病况”(Cold Spring Harb Perspect Biol，2014年8月；6(8)：a016865)的病因学的重要组成部分。“新报道涉及在细胞衰老、寿命和成年发病的神经退行性疾病，包括[PD]和[AD]的形式中改变的[液泡H⁺]-ATP酶活性和溶酶体pH失调。(New reportsimplicate altered[vacuolar H⁺]-ATPase activity and lysosomal pH dysregulationin cellular aging,longevity,and adult-onset neurodegenerative diseases,including forms of[PD]and[AD])”Colacurcio,D.J.和Nixon,R.A.(2016)“溶酶体酸化病症——v-ATP酶在衰老和神经退行性疾病中的新兴作用(Disorders of lysosomalacidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerativedisease)”，Ageing Res Rev；还参见图13、图14和图15。在PD中，“功能性内体的年龄相关病理耗竭可增加对该相同途径中随机分子缺陷的易感性，所述随机分子缺陷在一些个体中可引发恶性循环。[……]。引起疾病的突变聚集在[内体]途径内，并改变受体再循环和/或α-突触核蛋白降解。反过来，α-突触核蛋白累积[……]通过削弱参与内体分选或融合的机制而加剧了有缺陷的内体加工(an age-related pathological depletion of functionalendosomes may increase the susceptibility to stochastic molecular defects inthis same pathway,which in some individuals may trigger[a]vicious circle.[...]Disease causing mutations cluster within[the endosomal]pathway and alterreceptor recycling and/orα-synuclein degradation.In turn,α-synucleinaccumulation[...]exacerbates defective endosomal processing by impairing themachinery involved in the sorting or fusion of endosomes)”。Mol Cell Neurosci，66(PtA)，21-28。在AD中，“加速的内吞作用导致内吞货物在扩大的[LE]内累积并削弱溶酶体功能。[……]病原性内吞作用[……]可以在多种可能的靶标上治疗性地调节。(accelerated endocytosis causes endocytic cargos to accumulate withinenlarged[LEs]and impairs lysosomal functions.[...]Pathogenic endocytosis[...]could be modulated therapeutically at multiple possible targets.)”MolPsychiatry，21(5)，707-16。“[在AD和PD中的]潜在的分子机制仍然不清楚，但是内吞膜运输中的功能障碍是复发的主题，其可以解释神经退行性过程。(The underlying molecularmechanisms[in AD and PD]remain poorly understood,yet dysfunction in endocyticmembrane trafficking is a recurrent theme,which may explain theneurodegenerative process.)”。Schreij,A.M.,Fon,E.A.,和McPherson,P.S.(2015)，“内吞膜运输和神经退行性疾病(Endocytic membrane trafficking and neurodegenerativedisease)”，Cell Mol Life Sci。

BC和AD/PD的流行病学和病原学重叠：BC与PD具有高度的共现性。参见DermatolSurg，42(2)，141-6。癌症降低AD风险的早期报道与不考虑癌症药物的竞争风险和/或治疗效果的统计模型相关。参见J Gerontol B Psychol Sci Soc Sci；Nat Rev Neurol，12(3)，126-26。BC和AD之间关联受限的另一个原因可能是突变可能具有相反的作用，诸如BC(和PD)的功能获得和AD的功能丧失。已报道了重叠遗传风险因子。PD基因PSEN2的突变也在BC和AD中发现。参见Bioinformatics，31(11)，1701-7。在BC(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America，102(23)，8315-20)和PD(IntJ Mol Sci，17(2)，206)中发现了编码AD微管相关蛋白Tau的MAPT突变；观察到DJ-1升高(Cancer Sci，106(7)，938-43)，并且内体LRRK2(Biochem Soc Trans，43(3))中的G₂₀₁₉S突变增加了风险。参见JAMANeurol，72(1)，58-65。然而，“这种联系的病因学仍然是难以解决的(the etiology of this link continues to be elusive)”。Dermatol Surg，42(2)，141-6。

EEC是BC、PD和AD中的常见危险因素：在PD(Biochem Soc Trans，43(3))和AD(MolPsychiatry，21(5)，707-16；Schreij,A.M.，Fon,E.A.和McPherson,P.S，(2015)“内吞膜运输和神经退行性疾病(Endocytic membrane trafficking and neurodegenerativedisease)”，Cell Mol Life Sci.；Molecular Neurodegeneration，9(1)，1-9)中，已知α-突触核蛋白(SNCA，图13A和图13B)和淀粉样β前体蛋白(APP，错误！未找到参考源。15和图13)的内吞作用分别是导致斑块形成的病因学中的关键早期步骤。“影响内吞作用的基因过度表现为AD危险因素[并且]内吞作用相关基因是AD中最早已知的疾病特异性神经元反应。它们在唐氏综合征早期发展，唐氏综合征是与APP的额外拷贝有关的早发性AD的原因([G]enes that influence endocytosis are overrepresented as AD risk factors[and]endocytosis-related genes are the earliest known disease-specific neuronalresponse in AD.They develop early in Down syndrome,a cause of early-onset ADlinked to an extra copy of APP.)”。Mol Psychiatry，21(5)，707-16。

BC(来自上述和已发表的结果)和AD/PD(来自已发表的结果)的遗传风险因子的重叠：大多数与乳腺癌muGWAS中鉴定的PI循环和EEC基因相关的基因(表5，PI/EC栏)已经在BC和AD/PD的先前功能研究和基因表达研究(表6和表7)中鉴定。

表6：BC、PD和AD之间的PI循环重叠。基因：在BC GWAS中鉴定的基因。EEC功能：PI循环和/或EEC中的已知功能。KEGG：KEGG途径(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)，EC：上皮癌(癌)。ND：神经退行性疾病。

表6(续)：表6a基因的序列

表7：BC和PD/AD之间的EEC重叠(图例见表6)

*：来自先前的GWAS。下划线：文献中鉴定的功能相关基因。

实施例3：结合溶酶体功能障碍的升高的内吞作用是BC、AD/PD和CAD中常见的上位性危险因素

内吞作用是许多年龄相关疾病的病因学的已知成分，在BC、PD(Biochem SocTrans，43(3))和AD(Mol Psychiatry，21(5)，707-16；Schreij,A.M.,Fon,E.A.,和McPherson,P.S.(2015)“内吞膜运输和神经退行性疾病(Endocytic membranetrafficking and neurodegenerative disease)”，Cell Mol Life Sci.；MolecularNeurodegeneration，9(1)，1-9)，已知β1-整联蛋白、α-突触核蛋白(SNCA)和淀粉样β前体蛋白(APP)的内吞作用分别是导致斑块形成的病因学中的关键早期步骤。术语“脱轨的内吞作用”和“失调的内吞作用”已用于表征BC(Nat Rev Cancer，8(11)，835-50)、AD(Biomed ResInt，2014，167024)和其它“病理病况”的病因学的重要组成部分。(Cold Spring HarbPerspect Biol.2014年8月；6(8)：a016865)影响内吞作用的基因过多表现为AD危险因素[并且]内吞作用相关基因是AD中最早已知的疾病特异性神经元反应。它们在唐氏综合征早期发展，唐氏综合征是与APP的额外拷贝有关的早发性AD的原因"。Mol Psychiatry，21(5)，707-16。

“新报道涉及在细胞衰老、寿命和成年发病的神经退行性疾病，包括[PD]和[AD]的形式中改变的[液泡H⁺]-ATP酶活性和溶酶体pH失调。(New reports implicate altered[vacuolar H⁺]-ATPase activity and lysosomal pH dysregulation in cellularaging,longevity,and adult-onset neurodegenerative diseases,including forms of[PD]and[AD])”Colacurcio,D.J.和Nixon,R.A.(2016)。“溶酶体酸化病症——v-ATP酶在衰老和神经退行性疾病中的新兴作用(Disorders of lysosomal acidification-Theemerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease)”，Ageing ResRev；还参见图16。在PD中，“功能性内体的年龄相关病理耗竭可增加对该相同途径中随机分子缺陷的易感性，所述随机分子缺陷在一些个体中可引发恶性循环。[……]。引起疾病的突变聚集在[内体]途径内，并改变受体再循环和/或α-突触核蛋白降解。反过来，α-突触核蛋白累积[……]通过削弱参与内体分选或融合的机制而加剧了有缺陷的内体加工(an age-related pathological depletion of functional endosomes may increase thesusceptibility to stochastic molecular defects in this same pathway,which insome individuals may trigger[a]vicious circle.[...]Disease causing mutationscluster within[the endosomal]pathway and alter receptor recycling and/or α-synuclein degradation.In turn,α-synuclein accumulation[...]exacerbatesdefective endosomal processing by impairing the machinery involved in thesorting or fusion of endosomes)”。Mol Cell Neurosci，66(PtA)，21-28。在AD中，“加速的内吞作用导致内吞货物在扩大的[LE]内累积并削弱溶酶体功能。[……]病原性内吞作用[……]可以在多种可能的靶标上治疗性地调节。(accelerated endocytosis causesendocytic cargos to accumulate within enlarged[LEs]and impairs lysosomalfunctions.[...]Pathogenic endocytosis[...]could be modulated therapeuticallyat multiple possible targets.)”Mol Psychiatry，21(5)，707-16。“[在AD和PD中的]潜在的分子机制仍然不清楚，但是内吞膜运输中的功能障碍是复发的主题，其可以解释神经退行性过程。(The underlying molecular mechanisms[in AD and PD]remain poorlyunderstood,yet dysfunction in endocytic membrane trafficking is a recurrenttheme,which may explain the neurodegenerative process.)”。Schreij,A.M.,Fon,E.A.,和McPherson,P.S.(2015)，“内吞膜运输和神经退行性疾病(Endocytic membranetrafficking and neurodegenerative disease)”，Cell Mol Life Sci。

鉴于先前的GWAS无法识别基因的功能相关集合以及对常见疾病病因的新颖见解，基于新颖的GWAS方法(实施例1)的令人惊讶的结果不仅与BC先前结果一致，而且与AD和PD先前结果一致(图15和图16)，而且与涉及溶酶体功能的基因，特别是与溶酶体遗传危险因素重叠的基因(图18A至图18C)一致。

实施例4：βCD恢复癌症中的“脱轨的内吞作用”和PD/AD中的“失调的内吞作用”

体外

大量研究已研究了βCD的体外作用。

Ca：MβCD抑制三种H7 Lewis肺癌细胞系中的侵袭活性，并且高转移的细胞系具有更多的β1整联蛋白(J Biol Chem，281(26)，18145-55)，BC和***癌细胞系比它们的正常对应物对MβCD诱导的细胞死亡更敏感。参见Am J Pathol，168(4)，1107-18；quiz 404-5。特别地，MβCD治疗诱导BC抗性蛋白(BCRP/ABCG2)(J Pharmacol Exp Ther，323(1)，257-64)活性显著降低(40％)，所述BC抗性蛋白转运PS和PC类似物。参见J Biol Chem，282(2)，821-5。在随后的功能研究中，MβCD抑制MDA-MB-241和ZR751BC细胞(BMC Cancer，10，647)的球状体迁移和侵袭以及MCF7 BC细胞的内吞作用(Journal of Cancer Science&Therapy，4(7)，214-22)和迁移(Translational Medicine Communications，1(1)，3)。MβCD对侵袭性比对非侵袭性尿路上皮癌细胞毒性更大(PLoS One，10(9)，e0137878)，在HeLa细胞中干扰RTK-[PIP2]-PI3K-[PIP3]-AKT信号传导(FEBS Lett，589(24Pt B)，4097-105)，并且抑制白血病细胞系的生长(PLoS One，10(11)，e0141946)。

AD：MβCD抑制被携带APP的重组Semliki森林病毒(SFV)感染的大鼠海马神经元Aβ的分泌，(Simons等人，1998)促进非淀粉样α-分泌酶途径，(Kojro等人，2001)，并增加α-分泌酶的活性，同时降低β-分泌酶的活性，从而降低细胞相关APPsβ(错误！未找到参考源。)的水平。“APP的内化受损[……]导致[原文如此]MβCD急性胆固醇耗尽后α-分泌酶裂解增加([I]mpaired internalization of APP[...]is responsible for increased α-secretase cleavage after acute cholesterol depletion by[sic]MβCD)”(Cole等人，2005)。在过表达瑞典突变APP(SwN2a)的N2a细胞中检测到细胞膜胆固醇的累积，并且通过HPβCD治疗降低了膜胆固醇的水平，其显著降低SwN2a细胞中Aβ42的水平，并且这种作用在停药后持续24小时。参见Journal of Experimental Medicine，209(13)，2501-13。PD：在用α-突触核蛋白转染的HeLa细胞中，α-突触核蛋白显示与脂筏共定位。用20mM MβCD温育1小时显著降低了α-突触核蛋白与细胞膜的共定位。(Fortin等人，2004)

体内

通过若干体内研究证实了上述体外发现的相关性。

Ca：MβCD在肿瘤中的浓度高于在其它细胞(除了肾脏和肝脏)中的浓度，并且在BC的小鼠模型中有效(Br J Cancer，78(9)，1165-9)，在植入H7-O Lewis肺癌细胞的小鼠中减少肺转移的数目(J Biol Chem，281(26)，18145-55)，并抑制小鼠原发性渗出性淋巴瘤(PEL)的生长(Biochem Biophys Res Commun，455(3-4)，285-9)。(M-)β-CD已发现可增加抗肿瘤药物的有效性，诸如姜黄素在肺癌小鼠模型(Br J Cancer，107(7)，1083-92)中以及雷洛昔芬在化学诱导的肿瘤小鼠模型中的有效性(Agardan,N.B.等人(2015)“负载雷洛昔芬的脂质体和Cochleate在乳腺癌治疗中的有效性(The Effectiveness of Raloxifene-Loaded Liposomes and Cochleates in Breast Cancer Therapy)”，AAPSPharmSciTech.)。HPβCD对于移植肾癌细胞的小鼠中的肿瘤消退(FEBS Lett，589(24Pt B)，4097-105)和白血病小鼠模型中延长的存活(PLoS One，10(11)，e0141946)在三重组合治疗中是必需的。

AD：胆固醇的清除和/或直接与Aβ或a-突触核蛋白结合也被认为是βCD在AD和PD中的作用模式：“HPβCD减少胆固醇和PL的汇集，[通过]增强清除机制在AD的转基因小鼠模型中具有”神经保护作用[……](HPβCD,which diminishes the pool of both cholesteroland PLs,had“neuroprotective effects[...]in a transgenic mouse model of AD[by]enhancing clearance mechanisms)”。皮下施用HPβCD4个月显著改善了Tg19959小鼠的空间学习和记忆缺陷，减少了Aβ斑沉积，并减少了tau免疫反应性营养不良轴突(DN)。Tg19959小鼠是APP基因中具有2个突变的转基因小鼠，其已经与人类AD相关并且有益效果归因于胆固醇的降低。参见The Journal of Experimental Medicine，209(13)，2501-13。“经由向海马体定向注射[βCD]，降低了大鼠的Aβ1-40/42毒性。(Toxicity of Aβ1-40/42 wasreduced in rats via stereotactical injection[ofβCD]into the hippocampus.)”。CSChem Neurosci，3(11)，807-19。

PD：“用MβCD处理小鼠导致[……]神经元细胞体和突触中α-突触核蛋白的累积减少(Treatment of mice with MβCD resulted in[...]reduced accumulation ofα-synuclein in neuronal cell body and synapses.)”。J Neurochem，98(4)，1032-45。这种“MβCD的可能转录效应(possibly transcriptional effect of MβCD)”，J Neurochem，98(4)，1032-45，被认为与βCD有关，其经由直接相互作用防止α-突触核蛋白离体聚集。Biochemistry，53(25)，4081-3。相反，本文的结果表明，CD通过调节作为病因学中的共同组分的内吞作用起作用，这与癌症中环糊精控制的年龄相关机制相同。

临床/流行病学

虽然动脉粥样硬化和AD是共患的(comorbid)(Y.Song等人，2004)。Framingham队伍的分析也未发现胆固醇水平和AD之间的关联(Z.S.Tan等人，2003)。尽管HPβCD在动物模型中对肿瘤有效，并且在大多数外周和中枢器官系统中耐受性良好，但其显示出在小鼠、猫和一名人类中具有引起永久性听力损失的风险。参见J Assoc Res Otolaryngol，16(5)，599-611；Assoc Res Otolaryngol，16(5)，599-611；Sci Transl Med，7(276)，276ra26；Pediatr Res，68(1)，52-6；Mol Genet Metab，116(1-2)，75-9。据信这种耳毒性是由于剥夺了外毛细胞中动力素的胆固醇(SLC26A5)所致，参见Biophysical Journal，103(8)，1627-36；Sci Rep，6，21973；PLoS Genet，11(9)，e1005500。

机理：从βCD在NPC中的机理和在几种癌症(包括BC(PLoS One，10(11)，e0141946))中观察到的升高的胆固醇水平，，βCD被认为通过降低胆固醇水平来降低乳腺癌(BC)中的癌症生长。早期证据表明这可能不是外泌体研究中出现的情况，外泌体在BC的发展中起关键作用。参见Clin Chem，61(12)，1457-65；Semin Cancer Biol，21(2)，139-46。用MβCD处理MDA-MB-231BC细胞抑制了含有整联蛋白的外泌体的内化，但不依赖于胆固醇，参见Nature，527(7578)，329-35；PloS One，6(9)，e24234。

实施例5：HPβCD通过涉及血清磷脂减少的机制激活自噬溶酶体的形成

“溶酶体基因遗传变异改变了散发性AD病程”。(Whyte等人，2017)自噬与人类口腔疾病有关，包括但不限于“根尖周病变、牙周病和口腔念珠菌病”。(Y.Q.Tan等人，2017)“自噬和其它细胞应激之间的串扰[已经]在ALS的发病机理中被发现，并对调节ALS的自噬[具有]治疗意义(Crosstalk between autophagy and other cellular stresses[havebeen]implicated in ALS pathogenesis[with]therapeutic implications ofregulating autophagy in ALS)。”自噬调节剂ATG16L1始终与炎性肠病(包括但不限于克罗恩病和溃疡性结肠炎)有关。(Pugazhendhi等人，2017)。自噬“正在成为中枢神经系统(CNS)衰老和神经退行性疾病的核心调节剂，[影响疾病]包括缺血/中风、AD、PD和HD，和MS，[……]涉及凋亡细胞的小神经胶质细胞吞噬作用、Aβ、突触物质和髓磷脂碎片，并调节与年龄相关的ND的进程。(is emerging as a core regulator of Central Nervous System(CNS)aging and neurodegeneration,[affecting diseases]including ischemia/stroke,AD,PD,and HD,and MS,[...]involving microglial phagocytosis ofapoptotic cells,Aβ,synaptic material,and myelin debris,and regulate theprogression of age-associated ND.)”(Plaza-Zabala等人，2017)

自噬的激活在PD(Moors等人，2017)、AD、HD和ALS(Moloudizargari等人，2017)中被认为是理想的，但尚无有效的药物可用。“已经证明mTOR是关键的调节子，但不能令人满意地解决其详细机制。”(Y.Chen和Yu 2017)(HPβCD激活自噬。施用错误！未找到参考源。会导致转录因子EB TFEB的活化。在从细胞质转移到细胞核后，TFEB调节参与溶酶体和自噬体的生物发生和融合的基因的表达。结果，错误！未找到参考源。施用导致自噬底物蜡样脂色素的清除增加。然而，对错误！未找到参考源。改善TFEB活化的机制尚不清楚。改编自(SongW，Wang F等人，(2014)，J Biol Chem，289：10211-22))

用HPβCD上调的LC3、SQSTM1/p62和BECN1处理HeLa/TFEB细胞，其中HPβCD上调的LC3对于自噬小泡的形成是必需的，SQSTM1/p62对于货物识别是必需的，BECN1对于自噬小体的形成是必需的。在缺乏TPP1的LINCL成纤维细胞中，HPβCD处理导致以剂量和时间依赖性方式清除蜡样脂质色素。HPβCD处理通过激活转录因子EB(TFEB)导致所有测试的常染色体(LC3、SQSTM1、BECN1)溶酶体基因(GBA、HEXA、LAMP1)的转录上调。“HPβCD处理导致溶酶体生物发生和自噬的协同上调，并增强自噬物质的清除率。(HPβCD treatment results incoordinated up-regulation of lysosome biogenesis and autophagy and enhancedclearance of autophagy]material.)”“HPβCD处理导致TFEB诱导的自噬系统的活化，但是阻断自噬通量的下游步骤(例如阻断ATG7表达)防止了蜡样脂质色素的清除。(HPβCDtreatment results in TFEB-induced activation of the autophagy system,butblockage of downstream steps of the autophagy flux(e.g.blockage of ATG7expression)prevents clearance of ceroid lipopigment.)”“HPβCD激活促存活自噬途径，但不激活细胞凋亡。(HPβCD activates the pro-survival autophagy pathway,butnot apoptosis.)”“最近认识到，自噬的损伤或反常与许多人类疾病的发展和进展有关，所述疾病的范围从神经退行性疾病到癌症。我们的发现将扩展基于HPβCD用于治疗特征在于无效自噬清除和储存物质累积的疾病的用途设计治疗溶液的能力。(It was recentlyappreciated that impairment or deregulation of autophagy is linked to thedevelopment and progression of a number of human diseases ranging fromneurodegenerative diseases to cancer.Our findings will extend the capabilityof designing therapeutic solutions based on the use of HPβCD for thetreatment of diseases characterized by inefficient autophagy clearance andaccumulation of storage material.)”。图25；参见J Biol Chem，289(14)，10211-22。事实上，在具有HPβCD的神经胶质瘤细胞中TFEB的活化经由自噬促进a-syn聚集体的清除。(Kilpatrick等人，2015)

然而，HPβCD激活TFEB的机制，“仍然需要澄清”。(Sardiello 2016)实施例1的令人惊讶的遗传结果提供了这种澄清。已知PI3K抑制剂促进TFEB核易位。(J.Cheng等人，2006)根据新结果，HPβCD清除磷脂降低PI3K活性，并因此以与PI3K抑制剂类似的方式促进TFEB核翻译。

该发现得到其它证据的支持。还已知用芍药苷治疗减轻脊髓延髓肌萎缩(SBMA)小鼠的疾病表型，其中脊髓中的自噬减少。已知芍药苷降低血清脂质，(H.O.Yang等人，2004)，并已在LPC诱导炎症的动物模型中成功测试。(J.Z.Li等人，2013)NAFLD，(Z.Ma等人2017b)胰岛素抗性、(Z.Ma等人2017a)和动脉粥样硬化。(H.Li等人，2017)

源自该意外发现的溶液的第二部分是溶酶体使用Ca作为其主要调节剂TFEB的正反馈。在“饥饿(starvation)”(即溶酶体利用不足)时，(Sardiello 2016)

实施例6：结合溶酶体功能障碍的升高的吞噬作用是多发性硬化症(MS)病因学中的已知组分。

20世纪70年代MS的早期研究报道了“溶酶体中的髓磷脂样物质”和“患病神经胶质细胞合成异常髓磷脂”，尽管“溶酶体反应增加”，包括增加的β-糖苷酶活性和“建议的神经胶质细胞的早期改变作为疾病的基本机制”。J Neurol Sci，19(1)，29-36。据推测“某些获得性外源因子如病毒感染是引发疾病和免疫病理的根本原因(that some acquiredexogenous factor like virus infection is the basic cause which will triggeroff the disease and the immunopathology)。”Z Neurol，203(2)，91-104。

1977年，发现三种溶酶体酶——N-乙酰基-β-d-氨基葡萄糖苷酶(MGEA4，也称为HEXC)、β-半乳糖苷酶(GLB1)和组织蛋白酶D(CTSD)——被上调，在斑块区域中活性最高”。Biochem Soc Trans，5(5)，1416-8；Neuropathol Appl Neurobiol，5(5)，405-15。血清和CSF中的酶水平一般在MS中没有升高。参见Acta Neurol Scand，57(3)，201-15；ActaNeurol Scand，59(1)，23-30。

1980年，提出了“MΦ被刺激以增加溶酶体酶活性，由MS特异性抗原引起的T淋巴细胞的刺激引发”，但是未鉴定出这样的抗原，除了可能涉及“小神经胶质细胞组分”。ClinExp Immunol，42(1)，50-6；Neuropathol Appl Neurobiol，7(3)，169-82。

1983年，提出了“两步脱髓鞘”假说：(1)毒素渗入髓磷脂，其降解产生抗原。(2)抗原激活的MΦ沉淀在髓磷脂中并消化髓磷脂，而毒素仍然是难以捕捉的。参见MedHypotheses，12(2)，129-42；Journal of Neurochemistry，127(1)，7-21。

在1996年，“关于在斑块发展的早期阶段的[活化的]MΦ的来源仍然知之甚少。……了解MS发病机理的关键问题是在脱髓鞘开始时可靠地鉴定能够降解髓磷脂并向T细胞呈递自身抗原的吞噬细胞，[尽管]结果表明，小神经胶质细胞是脱髓鞘早期吞噬细胞的主要群体。(little is known about the source of[activated]MΦs in the earlystages of plaque evolution....A key issue in understanding the pathogenesisof MS is the reliable identification of phagocytes capable of degradingmyelin and presenting autoantigen to T cells at the onset of demyelination,[although]results indicate that microglia are the main population ofphagocytes in the early staged of demyelination.)”Neuropathol Appl Neurobiol，22(3)，207-15。

除了确认HLA-DRB1*15:01为危险因素外，最近对7125例的“meta分析”(George等人，2016)未提供任何可行的见解。

小神经胶质细胞具有与MΦ“相似的转录组模式”；小神经胶质细胞的功能是“在几个小时的过程中扫描整个脑体积”。因此，已经提出小神经胶质细胞功能失调导致CNS病症，并且“靶向失调的机制可以阻止或逆转小神经胶质细胞起作用的神经发育和神经退行性病症。”(Salter和Stevens 2017)在扫描大脑的过程中，小神经胶质细胞靶向底物以被溶酶体降解，或者在病原体的情况下，对其进行加工以进行抗原呈递。“内吞作用、分选、转运、隔室酸化和降解……可以在衰老过程中改变(Endocytosis,sorting,transport,compartmentacidification,and degradation...may be altered during aging)”。(Sole-Domenech等人，2016)

本公开将动脉粥样硬化和法布里病的两个最近发现与MS的病因学联系起来。含有髓磷脂降解产物的泡沫MΦ在活动性多发性硬化症(MS)损伤中大量发现。(Bogie等人，2013)法布里病是一种溶酶体α-半乳糖苷酶A(GLA)缺乏症，常常被误诊为MS(Bottcher等人，2013；Germain 2010)或两种疾病均表现出家族性共病。(Cammarata等人，2015)从对引起动脉粥样硬化(摄入更多LDL，然后溶酶体可处理)和法布里病(缺乏溶酶体半乳糖苷酶活性)中泡沫MΦ的机制的更好理解，“毒素”的性质变得明显。事实上，该过程始于小神经胶质细胞。Z Neurol，203(2)，91-104。当小神经胶质细胞溶酶体不能降解在整个脑扫描过程中被吞噬的所有髓磷脂时，未降解的髓磷脂意外地作为“MS特异性抗原”呈现给等待来自小神经胶质细胞的抗原的T细胞，然后T细胞移动到循环中以激活针对髓磷脂的MΦ。MΦ返回CNS，在那里它们开始错误地内吞髓磷脂(图27)。参见Clin Exp Immunol，42(1)，50-6。

因为该过程与AD、PD和CAD中的相同，所以解决方案是相同的：通过老化小神经胶质细胞减慢髓磷脂的吞噬作用来防止溶酶体“溢出”，因此髓磷脂作为“MS特异性抗原”被呈递给MΦ。此外，在不能防止所有“MS特异性抗原”的情况下，减慢MΦ对髓磷脂的内吞作用来减少脱髓鞘。

为了支持共同的危险因素，MS和血管疾病是共患的。“2型糖尿病、高血压、血脂异常或外周血管疾病在疾病过程中的任一点都可能与残疾的更大进展有关。……然而，作为MS干预的他汀类药物的公开临床试验的结果是冲突的。([H]aving type-2-diabetes,hypertension,dyslipidaemia or peripheral vascular disease at any point in thedisease course may be associated with a greater progression indisability....The results of published clinical trials of statins as anintervention in MS were however conflicting.)”(Tettey等人，2014)

已在Th1介导的疾病(诸如多发性硬化和类风湿性关节炎)中提出了MβCD增强CD30脱落。(von Tresckow等人，2004)

实施例7：作为药物靶标的磷脂

本公开提供了作为药物靶标进入PI循环的磷脂(实施例1)和已证明在AD、PD和CAD模型中和在患有其它溶酶体功能疾病(包括但不限于NPC)的人类中有效的药物(的更安全版本)。

这里提供的结果表明，参与不同患者的基因组合的数目太大，以至于“靶向内吞作用”的目的很可能通过选择性靶向单个或甚至成对的磷酸酶或激酶(表6)或通过靶向受PI循环调节的单个基因(表7)来实现。如上所述，设计PI循环以补偿单个激酶或磷酸酶的失调。基于线性PI-PIP-PIP2-PIP3模型以及Aβ对PA和PIP的作用，提出了针对DGKQ或PLD的siRNA“降低PA水平”，以及使用几种抑制剂(包括Wortmannin)和旨在“增加PIP和/或PIP2的细胞内水平”的活化剂。参见Kim等人的美国专利8,288,378。

然而，下调整个PI循环可以达到减少内吞作用的目的。参与PI和PS/PC进入PI循环的基因的广度表明另一种策略更有效。磷脂的提取降低了磷脂的细胞内浓度，已知磷脂在配体结合(PI(4,5)P2)、凹坑形成(PI(4)P)、囊泡形成(PI(3,4)P2)、与早期内体(PI(3)P)融合以及分选成细胞器(包括参与NCP1(PI(3,5)P2)的溶酶体)期间调节内吞作用。“与内吞作用运输相关的信号转导途径的激活对于肿瘤细胞迁移[和PD/AD中的疾病进展]至关重要。因此，靶向内吞作用运输和信号传导的[……]可能潜在地允许开发预防转移的新癌症治疗剂[和预防PD和AD的抗衰老治疗剂]。(Activation of signal transduction pathwaysassociated with endocytic trafficking is critical for tumor cell migration[and disease progression in PD/AD].As a consequence,[...]targeting endocytictrafficking and signaling could potentially allow for the development ofnovel cancer therapeutics to prevent metastasis[and anti-aging therapeuticsto prevent PD and AD].)”参见Onctarget，7(1)，5-6。

例如，FAK(整联蛋白介导的粘着斑激酶)在肿瘤中过表达和活化，但很少发生突变。(Alanko和Ivaska 2016)FAK抑制剂已经显示减少小鼠中的肿瘤生长、转移和血管生成，并且在非血液癌症(包括，但不限于，胰腺癌、肺癌、间皮瘤和卵巢癌)的早期临床试验中具有混合结果(clinicaltrials.gov)。调节整联蛋白的内吞作用提供了单独或与免疫疗法联合降低整联蛋白介导的粘着斑激酶活性的备选方案。(Symeonides等人，2017)

实施例8：溶酶体功能障碍是多发性硬化症(MS)病因学中的一个已知组分。

20世纪70年代MS的早期研究报道了“溶酶体中的髓磷脂样物质”和“患病神经胶质细胞合成异常髓磷脂”，尽管“溶酶体反应增加”，包括增加的β-糖苷酶活性和“建议的神经 胶质细胞的早期改变作为疾病的基本机制”。J Neurol Sci，19(1)，29-36。据推测“某些获得性外源因子如病毒感染是引发疾病和免疫病理的根本原因(that some acquiredexogenous factor like virus infection is the basic cause which will triggeroff the disease and the immunopathology.)”。Z Neurol，203(2)，91-104。

1977年，发现三种溶酶体酶——N-乙酰基-β-d-氨基葡萄糖苷酶(MGEA4，也称为HEXC)、β-半乳糖苷酶(GLB1)和组织蛋白酶D(CTSD)——被上调，在斑块区域中活性最高”。Biochem Soc Trans，5(5)，1416-8；Neuropathol Appl Neurobiol，5(5)，405-15。血清和CSF中的酶水平一般在MS中没有升高。参见Acta Neurol Scand，57(3)，201-15；ActaNeurol Scand，59(1)，23-30。

1980年，提出了“巨噬细胞被刺激以增加溶酶体酶活性，由MS特异性抗原引起的T淋巴细胞的刺激引发”，但是未鉴定出这样的抗原，除了可能涉及“小神经胶质细胞组分”。参见Clin Exp Immunol，42(1)，50-6；Neuropathol Appl Neurobiol，7(3)，169-82。

1983年，提出了“两步脱髓鞘”假说：(1)毒素渗入髓磷脂，其降解产生抗原。(2)抗原激活的巨噬细胞沉淀在髓磷脂中并消化髓磷脂，而毒素仍然是难以捕捉的。参见MedHypotheses，12(2)，129-42；Journal of Neurochemistry，127(1)，7-21。

在1996年，“关于在斑块发展的早期阶段的[活化的]巨噬细胞的来源仍然知之甚少。……了解MS发病机理的关键问题是在脱髓鞘开始时可靠地鉴定能够降解髓磷脂并向T细胞呈递自身抗原的吞噬细胞，[尽管]结果表明，小神经胶质细胞是脱髓鞘早期吞噬细胞的主要群体。(little is known about the source of[activated]macrophages in theearly stages of plaque evolution....A key issue in understanding thepathogenesis of MS is the reliable identification of phagocytes capable ofdegrading myelin and presenting autoantigen to T cells at the onset ofdemyelination,[although]results indicate that microglia are the mainpopulation of phagocytes in the early staged of demyelination.)”NeuropatholAppl Neurobiol，22(3)，207-15。

除了确认HLA-DRB1*15:01为危险因素外，最近对7125例的“meta分析”(George等人，2016)未提供任何可行的见解。

小神经胶质细胞具有与巨噬细胞“相似的转录组模式”；小神经胶质细胞的功能是“在几个小时的过程中扫描整个脑体积”。因此，已经提出小神经胶质细胞功能失调导致CNS病症，并且“靶向失调的机制可以阻止或逆转小神经胶质细胞起作用的神经发育和神经退行性病症。”(Salter和Stevens 2017)在扫描大脑的过程中，小神经胶质细胞靶向底物以被溶酶体降解，或者在病原体的情况下，对其进行加工以进行抗原呈递。“内吞作用、分选、转运、隔室酸化和降解……可以在衰老过程中改变(Endocytosis,sorting,transport,compartment acidification,and degradation...may be altered during aging)"。(Sole-Domenech等人，2016)

本公开将动脉粥样硬化和法布里病的两个最近发现与MS的病因学联系起来。含有髓磷脂降解产物的泡沫巨噬细胞在活动性多发性硬化症(MS)损伤中大量发现。(Bogie等人，2013)法布里病是一种溶酶体α-半乳糖苷酶A(GLA)缺乏症，常常被误诊为MS(Bottcher等人，2013；Germain 2010)或两种疾病均表现出家族性共病。(Cammarata等人，2015)从对引起动脉粥样硬化(更多LDL，然后溶酶体可处理)和法布里病(缺乏溶酶体……)中泡沫巨噬细胞的机制的更好理解，“毒素”的性质变得明显。事实上，该过程始于小神经胶质细胞。ZNeurol，203(2)，91-104。当小神经胶质细胞溶酶体不能降解在整个脑扫描过程中被吞噬的所有髓磷脂时，未降解的髓磷脂……移动到循环并作为“MS特异性抗原”呈现给T细胞，所述T细胞激活针对髓磷脂的巨噬细胞。参见Clin Exp Immunol，42(1)，50-6。巨噬细胞返回CNS，在那里它们开始错误地内吞髓磷脂(图27)。

因为该过程与AD、PD和CAD中的相同，所以解决方案是相同的：通过老化小神经胶质细胞减慢髓磷脂的吞噬作用来防止溶酶体“溢出”，因此髓磷脂作为“MS特异性抗原”被呈递给巨噬细胞。此外，在不能防止所有“MS特异性抗原”的情况下，减慢巨噬细胞对髓磷脂的内吞作用来减少脱髓鞘。

本公开提供了作为药物靶标的PI循环(实施例1)和已证明在AD、PD和CAD模型中以及在患有不同溶酶体功能疾病(包括但不限于C型尼曼-皮克病)的人类中有效的药物(的更安全版本)。

实施例9：α-环糊精恢复BC中的“脱轨的内吞作用”和PD/AD中的“失调的内吞作用”

本公开提供α-CD及其类似物和衍生物作为可用于治疗年龄相关症况的化合物的非限制性示例，所述病况包括但不限于涉及“脱轨的内吞作用”的病况，“癌症标志”(Mitra等人，2012)也见于神经发育疾病。参见Biochem Soc Trans，43(3)；Biomed Res Int，2014，167024。在本公开的一些实施方案中，α-CD用于治疗年龄相关病况，诸如癌症(包括，但不限于，α-CD)和神经退行性疾病(包括，但不限于，PD或AD)。CD降低了可用的PIP的量，而不直接干扰其分布。

大量研究已研究了甲基-β-环糊精(MβCD)在体外的作用。MβCD抑制了三种H7Lewis肺癌细胞系的侵袭活性，高转移细胞系具有更多的β1整联蛋白(J Biol Chem，281(26)，18145-55)，并且BC和***癌细胞系比它们的正常对应物对MβCD诱导的细胞死亡更敏感。参见Am J Pathol，168(4)，1107-18；quiz 404-5。

特别地，MβCD处理诱导BC抗性蛋白(BCRP/ABCG2)(J Pharmacol Exp Ther，323(1)，257-64)活性显著降低(40％)，所述BC抗性蛋白转运PS和PC类似物。参见J Biol Chem，282(2)，821-5。在随后的功能研究中，MβCD抑制MDA-MB-241和ZR751 BC细胞(BMC Cancer，10，647)的球状体迁移和侵袭以及MCF7BC细胞的内吞作用(Journal of Cancer Science&Therapy，4(7)，214-22)和迁移(Translational Medicine Communications，1(1)，3)。MβCD对侵袭性比对非侵袭性尿路上皮癌细胞毒性更大(PLoS One，10(9)，e0137878)，在HeLa细胞中干扰RTK-[PIP2]-PI3K-[PIP3]-AKT信号传导(FEBS Lett，589(24Pt B)，4097-105)，并且抑制白血病细胞系的生长(PLoS One，10(11)，e0141946)。

通过若干体内研究证实了上述体外发现的相关性。MβCD在肿瘤中的浓度高于在其它细胞(除了肾脏和肝脏)中的浓度，并且在BC的小鼠模型中有效(Br J Cancer，78(9)，1165-9)，在植入H7-O Lewis肺癌细胞的小鼠中减少肺转移的数目(J Biol Chem，281(26)，18145-55)，并抑制小鼠原发性渗出性淋巴瘤(PEL)的生长(Biochem Biophys Res Commun，455(3-4)，285-9)。HPβCD对于移植肾癌细胞的小鼠中的肿瘤消退(FEBS Lett，589(24PtB)，4097-105)和白血病小鼠模型中延长的存活(PLoS One，10(11)，e0141946)在三重组合治疗中是必需的。

在癌症的小鼠模型中，(M-)β-CD已发现可增加抗肿瘤药物的有效性，诸如姜黄素在肺癌小鼠模型(Br J Cancer，107(7)，1083-92)中以及雷洛昔芬在化学诱导的肿瘤小鼠模型中的有效性(Agardan,N.B.等人(2015)“负载雷洛昔芬的脂质体和Cochleate在乳腺癌治疗中的有效性(The Effectiveness of Raloxifene-Loaded Liposomes andCochleates in Breast Cancer Therapy)”，AAPS PharmSciTech.)。由于已发现胆固醇在几种癌症中升高，当与β-环糊精(作为权宜)一起递送时抗肿瘤药物的较高功效归因于较大环糊精在药物释放后清除胆固醇的能力。最近，已提出β-环糊精本身作为药物通过清除黑素瘤(Mohammad等人，2014)和白血病(PLoS One，10(11)，e0141946)小鼠模型中的胆固醇来减少癌症生长。这里提供的遗传学结果与环糊精有效一致，但是用清除磷脂(控制内吞作用)作为降低转移风险的更具体机制的证据代替了先前清除胆固醇(控制癌症生长)的假设。

胆固醇的清除和/或直接与Ab或a-突触核蛋白也被认为是β-环糊精在AD和PD中的作用模式：“HPβCD减少胆固醇和PL的汇集，[通过]增强清除机制在AD的转基因小鼠模型中具有神经保护作用[……](HPβCD,which diminishes the pool of both cholesteroland PLs,had“neuroprotective effects[...]in a transgenic mouse model of AD[by]enhancing clearance mechanisms)”。参见The Journal of Experimental Medicine，209(13)，2501-13。“经由向海马体定向注射[βCD]，降低了大鼠的Ab1-40/42毒性(Toxicity ofAβ1-40/42was reduced in rats via stereotactical injection[ofβCD]into thehippocampus.)”。CS Chem Neurosci，3(11)，807-19。这种作用归因于bCD与Ab相互作用的能力。FEBS Lett，341(2-3)，256-8。类似地，在PD中，“用MβCD处理小鼠导致[……]神经元细胞体和突触中α-突触核蛋白的累积减少(treatment of mice with MβCD resulted in[...]reduced accumulation of α-synuclein in neuronal cell body and synapses)”被视为与β-环糊精有关，以经由直接相互作用防止α-突触核蛋白离体聚集。Journal ofNeurochemistry，98(4)，1032-45；参见Biochemistry，53(25)，4081-3。相反，本公开的结果表明，环糊精通过调节作为病因学中的共同组分的内吞作用起作用，这与癌症中环糊精控制的年龄相关机制相同。

从βCD在NPC中的机理和在几种癌症(包括BC(PLoS One，10(11)，e0141946))中观察到的升高的胆固醇水平来看，βCD被认为通过降低胆固醇水平来减少BC中的癌症生长。早期证据表明这可能不是外泌体研究中出现的情况，外泌体在BC的发展中起关键作用。参见Clin Chem，61(12)，1457-65；Semin Cancer Biol，21(2)，139-46。用MβCD处理MDA-MB-231BC细胞抑制了含有整联蛋白的外泌体的内化，但不依赖于胆固醇。参见Nature，527(7578)，329-35；PLoS One，6(9)，e24234。

尽管HPβCD在动物模型中对肿瘤有效并且在大多数外周和中枢器官系统中耐受性良好，但其显示出在小鼠、猫和一名人类中具有引起永久性听力损失的风险。参见AssocRes Otolaryngol，16(5)，599-611；PLoS One，7(12)，e53280；Assoc Res Otolaryngol，16(5)，599-611；Sci Transil Med，7(276)，276ra26；Pediatr Res，68(1)，52-6；Mol GenetMetab，116(1-2)，75-9。据信这种耳毒性是由于剥夺了外毛细胞中动力素的胆固醇(SLC26A5)。参见Biophysical Journal，103(8)，1627-36；Sci Rep，6，21973；PLoS Genet，11(9)，e1005500。

然而，从我们的结果中出现的PIP循环的作用表明了与胆固醇清除不同的机制。一种不同的机制与先前报道的体内结果一致：CAV1在BC基质中的表达增加了肿瘤迁移和侵袭，并且CAV1是BC细胞特异性地形成侵袭伪足所必需的，其中CAV1敲除无法被胆固醇拯救。参见Cell，146(1)，148-63；Cancer Res，69(22)，8594-602。在脂蛋白耗尽的培养基中生长MDA-MB-231BC细胞导致细胞迁移降低85％。参见Clin Exp Metastasis，28(8)，733-41。LPA激活基于Arf6的并用于肾癌细胞的迁移和侵袭的间充质途径，所述肾癌细胞如同BC细胞一样源自位于上皮导管结构内的细胞。Nat Commun，7，10656。

实施例10：α-CD在溶解磷脂方面比β-CD更有效。

本公开提供α-CD及其类似物和衍生物作为可用于治疗年龄相关病况的化合物的非限制性示例，所述病况包括但不限于涉及“脱轨的内吞作用”的病况，“癌症标志”(Mitra等人，2012)也见于神经发育疾病。参见Biochem Soc Trans，43(3)；Biomed Res Int，2014，167024。在本公开的一些实施方案中，α-CD用于治疗年龄相关病况，例如癌症(包括，但不限于，***癌和乳腺癌)和神经退行性疾病(包括，但不限于，PD或AD)。CD降低了可用的PIP的量，而不直接干扰其分布。

更具体地(通过α-环糊精，六个淀粉分子)调节内吞作用的清除磷脂，而不是(通过较大的β-环糊精，七个糖分子)清除较大的胆固醇分子，避免了胆固醇介导的副作用，包括耳毒性。参见Assoc Res Otolaryngol，16(5)，599-611。“磷脂的丙烯酰基链紧密地装配到最小α-CD的疏水腔中，并且更松散地装配到β-CD和γ-CD的较大内部空间中，而胆固醇的侧链优选地包括在β-CD腔中(The acryl chain of phospholipids fits tightly into thehydrophobic cavity of the smallestα-CD and more loosely into the larger innerspace ofβ-andγ-CDs,whereas the side chain of cholesterol is preferablyincluded in theβ-CD cavity.)”。J Pharm Sci，86(2)，147-62。“环糊精部分去除磷脂……具有α>β>γ的效力。胆固醇……被萃取……最有效的被β-环糊精……而α-环糊精在溶血浓度下的[作用]可忽略不计。(Cyclodextrins partially removedphospholipids...with a potency ofα>β>>γ.Cholesterol...was extracted...mosteffectively byβ-cyclodextrin...,while[the effect]ofα-cyclodextrin wasnegligible even at hemolytic concentrations.)”European Journal ofBiochemistry，186(1-2)，17-22。“β-CD还从红细胞膜上除去蛋白质。(β-CD also removeproteins from erythrocyte membranes.)”J Pharm Sci，86(2)，147-62。

在10mM下，α-环糊精和β-环糊精分别将转铁蛋白的内吞作用降低20％和80％，这被解释为α-环糊精不具有“任何显著作用”。Molecular Biology of the Cell，10(4)，961-74。然而，这里呈现的结果表明，这些结果与生理性更高的30％的磷脂一致，而不是与在该浓度下释放的极端的95％的胆固醇的一致(错误！未找到参考源。)。参见European Journalof Biochemistry，186(1-2)，17-22。此外，即使将α-环糊精的浓度增加到高于10mM也不会增加磷脂的释放，这可能破坏重要功能，而增加β-环糊精的浓度导致蛋白质释放的大量增加。因此，在β-环糊精通过限制可利用的胆固醇而干扰活细胞功能的相同水平下，α-环糊精仅通过减少调节磷脂而将内吞作用降低至正常范围。参见European Journal ofBiochemistry，186(1-2)，17-22。“PIP[也]参与……常见的神经退行性病况(诸如阿尔茨海默氏病)，其随着预期寿命增加而变得更加普遍(PIPs are[also]involved in...commonneurodegenerative conditions such as Alzheimer’s that are becoming morewidespread as life expectancy increases)”。Biochim Biophys Acta，1851(8)，1066-82。已假定β-分泌酶的膜锚定抑制剂是防止APP内吞作用的一种策略。参见Clin ExpImmunol，42(1)，50-6。本文提供的结果通过经由α-CD减弱PI水平来减少总体内吞作用，所述α-CD为抑制β-分泌酶的替代方案，所述β-分泌酶对神经调节蛋白的亲和力高于对APP的亲和力。参见Cell Rep，14(9)，2127-41。

由于环糊精已成功地静脉内和鞘内应用，不同的施用途径可以相对于胶质母细胞瘤与神经退行性疾病用于预防骨和肺转移。

实施例11：α-CD在溶解磷脂方面比β-CD更有效。

材料：α、β和γHP-CD的取代度分别为5.3、5.1和5.4。在样品的制备中，在环氧化物与环糊精的缩合反应中，使用5％(w/w)NaOH作为溶剂和催化剂。放射性脂质购自NENResearch Products，Boston，MA，以及非放射性脂质购自Sigma Chemical Company，St.Louis，MO。参见J Pharm Sci，81(6)，524-8。

方法：用临床诊断试剂盒(Sigma and Wako Chemicals，Dallas，TX)完成脂质的测量。在短暂超声处理过量放射性样品的混悬液(在磷酸盐缓冲的等渗盐水中，pH 7.4；在氩气气氛下的密闭容器中)并通过振荡进行平衡(对于胆固醇，振荡时间为1周；对于胆固醇油酸酯、L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱和三油酰甘油酯，振荡时间为3天)后测量脂质的溶解度。之后，将悬浮液通过膜过滤器(Millex；SLGS，0.25；OS，0.22μm)过滤，并通过液体闪烁计数测量滤液中的放射性。除了使用振荡1天和使用用于测量磷脂的临床试剂盒之外，对鞘磷脂使用相同的方法。这些方法易于产生表面活性化合物在缓冲液中的溶解度的稍高的值，因为滤液富含在空气-缓冲液界面形成的单层表面活性化合物。然而，这些方法适于测量脂质在HP-CD溶液中的溶解度。这一事实是通过对比用上述过滤方法获得的结果和用HP-CD溶液滴定脂质样品的方法获得的结果来确定的，其中溶解的终点是目测确定的。使用相同的滴定法确定胆固醇和胆固醇基甲基醚在HP-β-CD溶液中的溶解程度大致相同。参见J PharmSci，81(6)，524-8。

结果：α、β和γHP-环糊精对五种代表性纯脂类的不同作用显示在图32，HP-β-CD中优先溶解胆固醇，而磷脂最好用HP-α-CD溶解。参见J Pharm Sci，81(6)，524-8。

实施例12：α-CD比β-CD更安全，并且在防止人肿瘤细胞迁移方面更有效。

介绍

公开的结果表明β-CD抑制人MDA-MB 231细胞迁移。参见Translation MedicineCommunications，1(1)，3。这种抑制作用归因于β-CD“消耗胆固醇”的能力。然而，β-CD也消耗磷脂。为了确定抑制迁移是由通常假定的β-CD消耗胆固醇引起的，还是由如本公开的结果所暗示的β-CD消耗磷脂引起的，重复伤口愈合实验，对比MDA-MB 231(CRM-HTB-26，ER^-)和MCF-7(ATCC HTB-2，ER⁺)人乳腺上皮细胞系中HPbCD(Sigma，389145-5G)和HPaCD(Sigma，390690-5G)与对照。

方法：

将细胞在24孔培养板(Cytoselect CBA-120，0.9mm伤口愈合/间隙闭合迁移测定)中培养24小时，伤口愈合***物就位。然后细胞用HPbCD、HPaCD或对照处理2小时。

方案：将具有0.9mmCytoSelect伤口愈合***物的24孔板(CBA-120，Cell BiolabsInc.)在室温下加热10分钟。使用无菌镊子，将所需数量的***物定向在板孔中，使其“伤口区域”沿相同方向排列。在含有10％胎牛血清(FBS)的培养基中产生含有0.5-1.0×10⁶细胞/ml的细胞混悬液。通过将移液管尖端小心地***穿过***物顶部的开口端而将500μL的细胞悬浮液添加到每个孔中。为了优化细胞分散，将250μL的细胞悬浮液添加至***物顶部的开口端的任一侧。将细胞在细胞培养培养箱中培养12-24小时。小心地从孔中取出***物以开始伤口愈合试验。使用无菌镊子从板孔中缓慢地抓取并提起***物。缓慢抽吸并弃去孔中的培养基。用培养基洗涤孔以除去死细胞和碎片。最后，向孔中加入培养基以保持细胞水合。如果孔中仍然有碎片或未附着的细胞，则重复洗涤。当洗涤完成时，加入含有FBS和/或化合物的培养基以继续细胞培养和伤口愈合过程。可以将抑制或刺激细胞迁移的试剂直接加入孔中。在细胞培养温育箱中温育细胞(2小时)，然后用PBS洗涤细胞，然后加入不含化合物的新鲜培养基。在洗涤和固定之前温育12-24小时。除去固定溶液，并向每个孔中加入400μL细胞染色溶液。使染料与细胞在室温下温育15分钟。抽吸并弃去溶液。小心地用去离子水洗涤每个染色孔3次。弃去洗涤液，并使细胞在室温下干燥。在倒置显微镜下观察迁移到伤口区域或从伤口边缘突出的细胞并拍照。确定限定伤口区域的表面积：总表面积＝0.9mm×长度。确定迁移到伤口区域的细胞的表面积：迁移细胞表面积＝细胞迁移长度(mm)×2×长度。闭合百分比(％)＝迁移的细胞表面积/总表面积×100。

为了使偏差最小化，按照表8所示排列孔。

表8：24-孔布局。ri：第i次复制

基于细胞的划痕试验。将细胞在24孔培养板中培养24小时，直到90％至100％浓度。通过200μl黄色微量移液管尖端在培养细胞的上部产生划痕的伤口线。除去培养基后，用PBS洗涤划痕的细胞。将细胞用2mM MbCD培养2小时，除去培养基后，将细胞再培养2，8，12或24小时。所有基于细胞的划痕试验均在抗有丝***试剂阿糖胞苷(ara-c；Sigma)以10'5M的终浓度进行以抑制细胞增殖并仅分析细胞迁移。伤口区域是从图像测量的，所述图像是用Axiovert 100显微镜(Carl Zeiss，Germany)通过Image J Program(NIH，USA)在距间隙的每个伤口区域3个不同位置拍摄的。进行三次独立实验。

使用其它的方法描述于Translational Medicine Communications，1(1)，3，“膜胆固醇的消耗通过一种涉及非经典Wnt信号传导和IL-10分泌的机制减少了乳腺肿瘤细胞的迁移。(Membrane cholesterol deployment reduces breast tumor cell migrationby a mechanism involves non-canonical Wnt signaling and IL-10Secretion.)”Translational Medicine Communications 1：3，和Okada等人(1995)“用β-十四烷基硫酸环糊精抑制人血管平滑肌细胞迁移和增殖。(Inhibition of Human Vascular SmoothMuscle Cell Migration and Proliferation byβ-Cyclodextrin Tetradecasulfate.)”Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，273(2)：948-954，其各自通过引用整体并入本文。

结果

结果示于表9中。在无环糊精的情况下，>80％的伤口被封闭。使用CD，伤口闭合以磷脂依赖性方式被抑制。胆固醇的提取似乎并不抑制伤口闭合，但已显示引起副作用(耳毒性)。

表9：伤口愈合结果。Avg：平均伤口闭合；st_dev：标准偏差。用下划线标出等效剂量(1mM HPaCD，2mM HPbCD)的结果。(*:<0.05)

结果高度一致：

在所有情况下，随着HPaCD或HPaCD浓度的升高，迁移降低。

在所有情况下，HPaCD对迁移的作用均强于HPbCD；1mM HPaCD的抑制作用优于2mMHPaCD的抑制作用。

讨论

在人类两种人类肿瘤细胞系中的结果证实了bCD对细胞迁移的主要作用不是通过清除胆固醇而是通过清除磷脂的假说。本公开已经显示“脱轨的内吞作用”是由遗传风险因素引起的，所述遗传风险因素引起糖磷脂(包括PC)过度流入PI，图35。因此，先前对bCD的研究，由于胆固醇相关的耳毒性的风险而没有进行临床试验，现在可以在避免胆固醇消除之后恢复，而在bCD中观察到的磷脂相关的功效增加。

HPaCD具有与HPbCD相同的毒性，但通常在清除磷脂方面是大约两倍，甚至在清除PC方面更有效。参见Langmuir，29(47)，14631-8；Molecules，20(11)，20269-85；Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics，310(2)，745-51。在患有NPC(表4，MolGenet Metab，108(1)，76-81)的儿童中，高达1,000mg/kg/d HP-β-CD的剂量是良好耐受的。在700mg/kg/d HPbCD已被证明在NPC的肠胃外治疗中是安全的情况下，700mg/kg/d HPaCD现在可以用于继续人类实验，所述人类实验之前当bCD显示具有胆固醇相关的耳毒性时停止了。根据图35的结果，700mg/kg/d的aCD在预防癌细胞迁移方面具有与2,000mg/kg/d bCD相同的功效。

实施例13：α-CD在预防各种溶酶体贮积病细胞系中溶酶体功能障碍方面至少与HP-β-CD一样有效。

实施例13的结果与US 2015/0216895 A1，图5，McKew，John等人的WO2014022841A1中的发现一致，其发现“α-CD、β-CD和γ-CD可以降低胆固醇累积，并且MBCD[M-β-CD]是最有效的(alpha-CD,beta-CD,and gamma-CD can reduce cholesterol accumulation,andMBCD[M-β-CD]was most potent.)”。特别地，作者注意到“α-CD、β-CD和γ-CD可减少NPC细胞中胆固醇的累积[并且]这些CD增加细胞内Ca2⁺和增强胞吐作用(alpha-CD,beta-CD,andgamma-CD can reduce cholesterol accumulation in NPC cells[and]that these CDsincreased intracellular Ca2+and enhanced exocytosis.)”。

尚未意识到，α-CD抗胆固醇贮积病的功效暗示该作用不能归因于胆固醇的清除，因为α-CD不能适合胆固醇。我们的新的遗传学结果显示该作用反而是由磷脂介导的，因此首次解释了为什么约6mMα-CD实际上比约8mM HP-β-CD在减少溶酶体贮积方面更有效(图38-40)。

结果还提供了为什么静脉内HP-β-CD在NPC中有效的解释，即使环糊精和胆固醇都不能穿过血脑屏障。令人惊讶的发现还可以结束当前的静脉内相对鞘内应用HP-β-CD的“战斗”。Science，354(6308)，18-19。由于磷脂更容易穿过血脑屏障，因此口服(从肠吸收)形式的HP-α-CD可防止需要植入鞘内泵或在数小时内静脉内输注施用HP-β-CD以防止在大鼠肾小管中形成细胞质晶体。参见Am J Pathol，83(2)，367-82。

实施例14：HP-α-CD和癸酸钠(C-10脂肪酸)的包合物作为口服药物将磷脂提取到尿液中。

PC和LPC分别与4至5摩尔和3摩尔aCD形成络合物。参见Chem Pharm Bull(Tokyo)，33(6)，2587-90。

共轭亚油酸(CLA)与4至5摩尔aCD形成络合物。参见J Agric Food Chem，50(10)，2977-83。1：4摩尔比的CLA/aCD完全保护CLA免于氧化。参见Nutrition&Metabolism，5(1)，16。

“癸酸(C10)调节Caco-2单层和大鼠和人肠段中紧密连接的细胞旁通透性。……与C10相反，月桂酸(C12)不会诱导紧密连接形态的可检测变化(Capric acid(C10)regulatesthe paracellular permeability of the tight junctions in Caco-2 monolayers andin rat and human intestinal segments....In contrast to C10,lauric acid(C12)did not induce detectable changes in tight junction morphology.)”。C10作用更快，但是13mM C10和75mM C12在40分钟后同样有效。J Pharmacol Exp Ther，284(1)，362-9。

进行随机的n-of-1剂量递增研究，以评估HP-α-CD和癸酸钠(C10脂肪酸，癸酸(capric acid)，癸酸(decanoic acid))的包合物在从血清提取磷脂到尿中的活性。仅在HP-α-CD的最高剂量(44g)下观察到粪便软化，这是已知的副作用，是用较大剂量的α-CD可以预期的。结果示于表10中。

表10：与脂肪酸络合改善了HP-α-CD的活性。口服施用HP-α-CD或HP-α-CD/C10包合物后8小时内磷脂***到尿中。

注：调节：健康受试者中的预期磷脂水平减去2.82μM/L(Saunders等人，1997)。

口服β-CD在哺乳动物中很少被吸收(约1％)；对于较小的α-CD，在口服施用后6至8小时内在尿中发现1.6，2.0和16％。J Pharm Sci，86(2)，147-62；Biol Pharm Bull，19(2)，280-6；Regul Toxicol Pharmacol，39Suppl 1，57-66。表10中，观察到的HP-α-CD的强剂量-反应关系(除了最高剂量，其可能由于粪便软化而受到更快通过的影响)表明，更高的估计对于人类更现实。在大鼠中，相比单独口服施用β-CD的1％，当在含有甘油三酯的栓剂(Witepsol H5)中直肠施用时，至多5％的β-CD被吸收。参见J Pharm Sci，81(11)，1119-25。当β-CD被更水溶性的HP-β-CD代替时，吸收率从5％增加到26％。参见Drug Developmentand Industrial Pharmacy，16(17)，2487-99。

在喂食“西方饮食(Western diet)(21％乳脂)”的LDL-受体敲除小鼠中的公开结果表明，添加“2.1％的”不可吸收的“α-CD(10％的饮食脂肪含量)”使血浆PL降低了17.5％。Metabolism，57(8)，1046-51。未鉴定作用机制。根据以上遗传和体外结果，所观察到的血浆PL的降低不是(或不仅是)由于作者推测的肠中的“饱和脂肪吸收”和“***到粪便中”，而且(也)通过在乳脂肪酸存在下从肠吸收α-CD清除PL并***到尿中。

虽然CD广泛用作吸收增强剂，但本公开使用CD作为活性成分，癸酸钠作为CD的吸收增强剂。本公开利用较小的α-CD，应用先前显示的HP衍生化以增强β-CD的吸收，使用甘油三酯的脂肪酸组分的钠盐作为更有效的吸收增强剂用于在肠中递送。参见J ApplPharmacol Sci，2(7)，34-39；J Pharm Pharmacol，39(11)，887-91。

表10中所示结果证实了，递送新药物HP-α-CD/癸酸钠包合物以减少转移性、神经退行性、代谢和心血管疾病中的内吞作用的策略的新的且非显而易见的组合，产生一种能够将血清磷脂减少临床相关量的干预措施。

包合物不是通过共价跳跃形成的，并且两种组分都是GRAS。α-CD是GRAS并且可作为膳食补充剂获得。脂肪酸“被允许”作为“多用途添加剂”[21CFR 172.860]和作为“消泡剂”[21CFR 173.340]“直接添加到用于人类食用的食物中[21CFR 172.860]”。根据21CFR184.1025(GRAS公告449)，癸酸和辛酸也是GRAS。

进行随机盲法n-of-1PK/PD研究，以证明包合物被吸收并从尿中提取磷脂。对比物质为

HP-α-CD，

HP-α-CD/癸酸钠包合物

HP-α-CD包合物与相同量的癸酸钠包合物(也称为C-10脂肪酸，癸酸(capricacid)，癸酸(decanoic acid))的混合物。

HP-α-CD包合物与由(Tuvia S,Pelled D等人，(2014)Pharmaceutical Research，31：2010-21)提出的油性混悬液的混合物。

每种物质采集6个样品。

在睡觉前的晚上采集样品，并采集尿液样品

结果如图44所示。

实施例15：HP-α-CD/癸酸钠包合物对所选磷脂(PC/PS)相对于PA和LPL的选择性发挥类似于抗炎药物的作用。

不论治疗如何，在大多数MS患者中，无论活性的还是稳定的，sPLA2的炎症活动都在进行。在大鼠中，EAE症状通过抑制sPLA2而减轻。(Cunningham等人，2006)在患有阿尔茨海默病的人的脑脊液中观察到sPLA2活性增加(Chalbot等人，2011)，可作为血-脑脊液屏障通透性增加的标志。(Chalbot等人，2011)AD(和MCI)患者具有“磷脂酶A2(PLA2)异常活性”(Klavins等人，2015)

将晨尿的HPaCD与HPaCD*(HPaCD/癸酸钠包合物)进行对比，证实HPaCD未被再吸收，但包合物的预期分子量为973+194＝1167。(图43)通过包合物显著增加了磷脂PC、PS和PE(mW 730-790)的***，如所预期的。然而，出乎意料的是，PA(675)和SM(650)没有降低，溶血磷脂(460-550)也没有降低。

包合物对PC/PS/PE出乎意料的高特异性意味着包合物不仅降低了PI循环的活性，而且还减轻了炎症。PC被可溶性PLA2***成LPC(其被ATX转化为LPA)和促炎性花生四烯酸(AA)。清除溶血磷脂(LPC，LPA)而不是PC会激活sPLA2，从而增加炎症。相反，仅清除PC使sPLA2丧失其底物，此外，通过增加LPC/PC比率降低sPLA2活性。

sPLA2-IIa激活HER2和HER3，在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、皮肤癌、肝癌和***癌中过度表达，(Z.Dong等人，2014)激活MCF7人BC癌细胞中的EGFR(Hernandez等人，2010)，并且是转移的标志物

“研究者[已经]考虑PLA2可能是比下游酶环加氧酶和脂肪氧合酶更好的治疗靶标(Researchers have been considering PLA2s could be a better therapeutic targetthan the downstream enzymes cyclooxygenase and lipoxygenase[yet])”(Yarla等人，2016)。人PLA2参与二十烷酸(eicosanoic)合成、MΦ的吞噬作用、气道超敏反应、炎症、肿瘤发生(V)和过敏原诱导的哮喘、心肌缺血/再灌注损伤、AA代谢、炎症肿瘤发生、动脉粥样硬化(X)。(Yarla等人，2016)

炎性花生四烯酸的意外减少发挥类似于皮质类固醇(sPLA2抑制)、NSAID(COX抑制)和哮喘药物(LOX和白三烯抑制)的作用，参见图1：环糊精，包括羟丙基环糊精。可以实现多达n×3取代度，可能具有许多位置异构体和区域异构体。R的取代基包括，但不限于，H(母体)、甲基(包括无规甲基化的)、丁基、2-羟丙基(HP)、乙酰基、琥珀酰基、葡糖基、麦芽糖基、羧甲基醚、磷酸酯、简单聚合物或羧甲基。典型的CD在环中含有6(α-CD)、7(β-CD)或8(γ-CD)D-葡萄糖单体，形成可以将客体分子容纳到其疏水腔中的锥形。

图2：胆固醇与α-CD和n相互作用的聚类分析。环糊精对HaCaT角质形成细胞增殖的影响。温育48小时后，相对于对照标准化的至少六个独立测量值的平均值。顶部：ATP测定，底部：PicoGreen测定)。W6：α-CD，W6：β-CD，W7s HP：HP-β-CD。改进自Hipler,U.C.等人，(2007)“环糊精在体外对HaCaT角质形成细胞增殖的影响(Influence of cyclodextrinson the proliferation of HaCaT keratinocytes in vitro)”，J Biomed Mater Res A，83(1)，70-9。

图3A至图3C：脂质释放的特异性I。用环糊精处理的完整红细胞(3B)或鬼形红细胞(ghost erythrocyte)(3A和3C)释放磷脂(3A)、胆固醇(3B)和蛋白质(3C)。(○)α-环糊精；(●)β-环糊精；(△)γ-环糊精。改进自(Ohtani Y，Irie T等人，(1989)European Journalof Biochemistry，186：17-22)。

图4A至图4B：脂质释放的特异性II。4A)在各种浓度的α-CD和β-CD存在下温育2小时后，从脑毛细血管内皮细胞(BCEC)释放的胆固醇。结果表示为与对照相比从BCEC释放的胆固醇的百分比。每个百分比是三个不同过滤器的平均值，代表两个独立实验系列。4B)分别在0.5、5和50mM的α-CD和β-CD存在下温育2小时后，从BCEC释放的磷脂酰胆碱(PC)(浅柱)和鞘磷脂(暗柱)。结果表示为与对照相比从BCEC释放的磷脂的百分比。每个百分比是三个不同过滤器的平均值，代表两个独立实验系列。改进自(Monnaert V，Tilloy S等人，(2004)，Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，310：745-51)。

图5：MβCD，而非αCD保护A2E免受氧化。双类维生素(bisretinoid)A2E是在眼脂褐素提取物中鉴定出的第一种化合物。通过5μM A2E溶液的UV可见吸收光谱的变化监测A2E免受氧化的保护。(5A)在所示环糊精(12mM)存在下，蓝光照射之前(●)和之后(○)的A2E氧化状态。(5B)在室温下在黑暗中在环糊精存在下温育后，在时间0(●)和1天(○)的A2E氧化状态。改进自(Nociari MM，Lehmann GL等人，(2014)Proceedings of the National Academyof Sciences，111：E1402-E8)。

图。因此，aCD作为“婴儿阿司匹林(baby-aspirin)”的替代品出现。

总而言之，aCD减慢了几个在早期生命中必不可少的过程，但在50岁以后可能会导致问题：

在出生前(组织)和出生后早期(神经元)发育期间的细胞迁移，

在生长期间细胞对养分的吸收，以及

先天性免疫(炎症)作为对抗尚未被免疫系统发现的病原体的防御。

在老年人中，这些功能变得不太相关。

实施例16：aCD在穿过血脑屏障(BBB)方面比bCD更有效。

由于磷脂可以容易地穿过BBB，aCD将不需要穿过BBB就可以有效，但是它将有所帮助。公开的数据表明，在体外穿过BBB时，aCD的效率始终是bCD的两倍。温育2小时后，通过BBB转运了16.5-43.0％(相对于6.6-26.7％)(相比之下，咖啡因或烟碱的转运率为96％)。参见Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，310(2)，745-51。这些结果在一项βCD的独立研究中得到证实。(Binkowski-Machut等人，2006)

尽管aCD毒性较大，但HPaCD、bCD、mbCD和HPbCD相似。参见Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics，310(2)，745-51。

实施例17：研究α和β-环糊精对阿尔茨海默病的细胞和小鼠模型神经保护作用的研究设计

摘要。有大量证据表明胆固醇和膜脂质在阿尔茨海默病(AD)发病机理中起关键作用。环糊精(CD)是环状寡糖化合物，并且羟丙基-β-CD(HP-β-CD)广泛用于结合胆固醇。由于CD在与AD共有神经病理学特征的C型尼曼-皮克病中发挥显著的有益作用，因此在AD的细胞和小鼠模型中检测了HP-β-CD的作用。在过量表达瑞典突变体APP(SwN2a)的N2a细胞中检测到细胞膜胆固醇累积，并且通过HP-β-CD处理降低了膜胆固醇的水平。HP-β-CD显著降低SwN2a细胞中Aβ42的水平，并且作用在停药后持续24小时。皮下施用HP-β-CD 4个月显著改善了Tg19959小鼠的空间学***或膜胆固醇没有影响，如使用菲律宾菌素染色和质谱测定的。我们还将确定这些作用对N2a细胞中的β-淀粉样蛋白产生以及Tg19959转基因小鼠体内的β-淀粉样蛋白产生是否具有剂量反应性。因此，这些研究将为进一步在AD患者的临床试验中寻求这一策略提供基础工作和科学理论基础。

关键支持数据的概述。以前，在AD的细胞和小鼠模型中检测羟丙基-βCD(HPβCD)的作用。HPβCD显著降低SwN2a细胞中Aβ42的水平，并且作用在停药后持续24小时。皮下施用HPβCD 4个月显著改善了Tg19959小鼠的空间学***，并且还上调参与胆固醇转运和Aβ清除的基因的表达。这项研究首次表明HPβCD在AD转基因小鼠模型中通过减少Aβ产生和增强清除机制而具有神经保护作用，其表明它可能是AD疾病改变的一种新治疗策略。上调的基因有ABCA1，ABCA1是一种膜转运蛋白，其输出胆固醇和磷脂，并被认为是治疗AD的激动剂肽的靶标。(Bielicki，2016)

最近的结果，Wittkowski,Knut M.等人(已提交)，“内吞作用基因中的复杂多态性提示α-环糊精对抗乳腺癌中的转移(Complex Polymorphisms in Endocytosis GenesSuggest alpha-Cyclodextrin against Metastases in Breast Cancer)”，附录，10(2)，鉴定了涉及乳腺癌的“脱轨的内吞作用”的若干基因，其中大部分(包括ABCA1)已涉及AD的功能和基因表达研究，包括

ATP8A1/ATP8B1(Arch Neurol，65(1)，45-53；International Journal ofMolecular Sciences，14(4)，7897-922；PLOS Genetics，8(8)，e1002853.)。

ANO4(Alzheimers Dement，10(1)，45-52.)。

ABCA1(PLoS One，11(11)，e0166195；Neurobiol Dis，72Pt A，13-21；Alzheimers&Dementia，11(12)，1430-38；Neurobiol Dis，72Pt A，54-60.)。

AGPAT3/AGPAT4(J Alzheimers Dis，23(2)，349-59.)。(Sherva等人，2011)

DGKQ(Zhu,X.C.等人，(2016)“帕金森病GWAS连锁位点与汉族人阿尔茨海默病的关联(Association of Parkinson's Disease GWAS-Linked Loci with Alzheimer'sDisease in Han Chinese)”，Molecular Neurobiology)。

所有这些基因都参与磷脂的转运和代谢，而只有少数参与胆固醇的转运，这表明在上述AD动物模型中观察到的作用可能是磷脂而不是胆固醇减少的结果。

该假说得到两个人乳腺癌细胞系MDA-MB-231(三重阴性)和MCF-7(***受体阳性)的体外实验的支持，显示1mM HPαCD比2mM HPβCD对ER-和ER+肿瘤细胞迁移都更有效(p＝.0252)。参见Wittkowski,Knut M.等人(已提交)，“内吞作用基因中的复杂多态性提示α-环糊精对抗乳腺癌中的转移(Complex Polymorphisms in Endocytosis Genes Suggestalpha-Cyclodextrin against Metastases in Breast Cancer)”，附录，10(2)。

目的1(主要)：为了在过度表达人突变APP的Tg19959小鼠中测试等摩尔HPαCD相对于HPβCD(2,000和4,000mg/kg)和对照对空间学习和记忆缺陷的功效

创新：广泛认为HPβCD通过清除胆固醇发挥其活性，包括其在AD小鼠模型中的活性。参见The Journal of Experimental Medicine，209(13)，2501-13。我们的GWAS结果在体外研究中得到证实，Wittkowski,Knut M.等人(已提交)，“内吞作用基因中的复杂多态性提示α-环糊精对抗乳腺癌中的转移(Complex Polymorphisms in Endocytosis GenesSuggest alpha-Cyclodextrin against Metastases in Breast Cancer)”，附录，10(2)，显示与BC(Nat Rev Cancer，8(11)，835-50)中的功能和表达研究中已发现的暗示脱轨的内吞作用的基因和“驱动散发性和家族性[AD]中的发病机理(driving pathogenesis insporadic and familial[AD])”相关。Biomed Res Int，2014，167024。因此，在先前的体外研究中观察到HPβCD的作用(Translation Medicine Communications，1(1)，3；BMCCancer，10，647)可能确实清除PL，而不是胆固醇。AD中“脱轨/失调的信号传导及相关内吞作用(Derailed/deranged signaling and associated endocytosis)”Biomed Res Int，2014，167024。如果在AD的体外模型中观察到类似结果，则可以寻求靶向PL而非胆固醇的新治疗。

意义：小鼠AD最初的体内阳性结果未进行临床试验，主要是因为HPβCD显示出具有使外毛细胞失去胆固醇而导致永久性听力损失的风险，参见The Journal ofExperimental Medicine，209(13)，2501-13；(S.Takahashi等人，2016)最近的GWAS结果将焦点从胆固醇转移到PL。这又可以为AD开放新的治疗选择，包括HPαCD，其可能比HPβCD更有效，同时避免清除胆固醇而导致永久性听力损失的风险。HPαCD在体外的毒性也低于HPβCD。参见International Journal of Pharmaceutics，101(1-2)，97-103。

方法：我们将检测对APP的裂解，胆固醇和脂质转运基因的表达，Aβ清除以及胆固醇和PL水平的影响。我们将通过检测2种浓度的HPαCD和HPβCD来确定作用是否是剂量反应性的，并通过组织蛋白酶D免疫染色来确定对溶酶体的作用。我们将在每组20只小鼠的五组(对照、HPβCD_2g、HPβCD_4g、HPαCD_2g、HPαCD_4g)中进行这些测试。

缺陷和备选方案：并非以前用HPβCD观察到的所有作用都将由HPαCD复制，差异作用将提供对病因学的新认识。然而，如果HPαCD对HPβCD的作用复制过少，则将不会进一步追究对HPαCD可能成为针对AD的更安全治疗的假设。然而，目的2的结果仍然可以提供新颖见解，导致潜在替代方案。

目的2：为了探讨仅清除PL(HPαCD)相对于清除PL和胆固醇(HPβCD)两者对AD病理在以下中……的相对活性。

目的2a：……在表达瑞典APP突变(膜胆固醇，Aβ产生)的N2a细胞中。

目的2b：……在过度表达人突变APP的Tg19959小鼠中(Aβ沉积、小神经胶质细胞增生、淀粉生成、tau和溶酶体异常、基因表达)

创新：即使HPαCD空间学习和记忆通过改善Aβ和tau病理学，PL相对于胆固醇在AD病因学中的作用有待阐明。

意义：单一药物不可能成为AD的灵丹妙药。机理研究将为设计能够产生靶向胆固醇的更特异药物的研究提供见解。

方法：我们将旨在复制HPβCD减少表达瑞典APP突变的N2a细胞中Aβ产生的成功体外研究，这次使用HPαCD代替HPβCD。为了进一步阐明作用机制，我们将使用菲律宾菌素染色来评估清除PL对膜胆固醇的作用。

缺陷和替代方案：假定胆固醇在AD中的作用，但未知。因此，HPαCD对膜胆固醇和Aβ产生的影响的肯定和否定结果将有助于加深对CD在AD中的作用的理解，并为其它药物的开发提供有价值的见解。

实验设计和方法

基于先前显示4,000mg/kg HPβCD在体外有效的结果以及显示HPαCD在调节EEC方面至少是HPαCD的两倍有效的体外结果，我们将对比HPαCD_2g相对于HPβCD_4g，和HPαCD_2g相对于HPβCD_2g，HPαCD_4g相对于HPβCD_4g，HPαCD_4g相对于HPαCD_2g以及HPαCD_4g相对于HPαCD_2g。参见The Journal of Experimental Medicine，209(13)，2501-13。作为阳性对照，我们将重复先前对比对照相对于HPβCD_4g的结果。

为了防止回归到平均值(赢者诅咒(winner’s curse))并且说明在目的1中的多重性(五项相关对比)，并且确保可以有意义地探索在目的2中的否定结果，我们将样品大小从先前两组研究中的每组10个(α＝.05，功率＝.80，δ＝1.3)增加到5组本研究中的每组20个(α＝.01，功率＝.90)。参见The Journal of Experimental Medicine，209(13)，2501-13。

实验动物。Tg19959小鼠获自George Carlson博士(McLaughlin ResearchInstitute，Great Falls，MT)。通过给FVB×129S6 F1胚胎注射粘粒***物来构建Tg19959小鼠，该粘粒***物含有在仓鼠PrP启动子控制下的具有两个家族性AD突变(KM670/671NL和V717F)的人APP695。所有实验将由威尔·康奈尔医学院(Weill-Cornell MedicalCollege)的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee)批准。

细胞系：用携带670/671瑞典突变(Swedish mutation)(SwN2a)的人APP695稳定转染的小鼠N2a成神经细胞瘤细胞将如先前所述生长(J.Yao等人，2010)。

细胞中的HP-α-CD/HP-β-CD(HP-x-CD)处理。在1XPBS中制备10mM HPxCD储备溶液。用无血清培养基中的HPxCD(5mM)在不同温育时间处理SwN2a和N2a细胞。为了测量Aβ水平，在HPxCD处理后，将在无血清培养基中回收SwN2a细胞5或24小时。

菲律宾菌素染色和分析。在DMSO(50mg/ml)中制备菲律宾菌素并储存在-20℃。将细胞在4％PFA中固定30分钟。对于菲律宾菌素染色，不需要单独透化细胞，因为菲律宾菌素本身透化细胞。将储备溶液用PBS(1：100至1：500)稀释。将细胞在室温下温育15分钟，然后用PBS洗涤3次，每次5分钟。抗褪色试剂(Fluoromount-G，Southernbiotech)将用于封固剂中。使用λex＝360nm和λem＝460nm检测菲律宾菌素。将使用连接到CCD照相机的荧光显微镜，并且使用Metamorph(Molecular Devices)拍摄图像。为了分析图像，我们将使用ImageJ(NIH)在图像上施加70％的阈值，并量化经过和未经CD处理的SwN2a细胞的菲律宾菌素强度的变化。参见Nat Neurosci，9(10)，1265-73。

SwN2a细胞中胆固醇的提取。用和不用CD处理SwN2a细胞的6孔板15分钟。将细胞用Hank's缓冲液洗涤3次，然后加入800μl含有β-谷甾醇(内标，每孔5μgβ-谷甾醇)的己烷/异丙醇(3/2v/v)。在室温下轻轻摇动提取脂质30分钟。将脂质提取物转移到12×75mm硼硅玻璃培养管中；并在氩气下干燥。再次重复提取，每管加入50μl己烷，涡旋，然后转移到玻璃小瓶中进行分离和GC-质谱分析。计算胆固醇/mg蛋白质的水平并绘图。

对小鼠施用环糊精。每周两次皮下注射HPxCD(2,000或4,000mg/kg)处理小鼠。HPxCD将作为在等渗盐水中的20％(w/v)溶液提供，单独的等渗盐水作为对照。HP-x-CD在小鼠中的注射将在P7开始，并且处理的持续时间将是4个月。每组研究20只小鼠。

Morris水迷宫(Morris water maze)。使用Morris水迷宫分析空间学***台位于西北(NW)象限的中部。每天，将小鼠放在北方、东方、南方和西方的4个起始位置旁边并面对盆壁，对应每天4次连续试验。试验的持续时间为60秒，试验间间隔为60分钟。当小鼠在60秒内未能到达平台时，实验人员将其放置在平台上10秒。到达平台之前的等待时间将被记录5天并进行分析。

在采集期的最后一次试验后24小时评估探测试验，从池中取出平台。小鼠将在北侧释放，进行60秒的单次试验，在此期间测量在平台区域花费的时间。还将测量速度。

可见平台测试将进行超过2天，每天4次试验。在该提示试验中，将在平台上添加杆，并在每次试验之间改变其位置。试验的持续时间为60秒，试验间间隔为60分钟。在到达平台之前的等待时间将被记录并平均。

大脑和细胞的样品制备。将小鼠用腹膜内戊巴比妥钠深度麻醉，并用冰冷盐水经心脏灌注。取出大脑并在冰上解剖。一个半球将用于组织学分析，以及另一个半球将用于随后的蛋白质提取或Trizol RNA提取(Invitrogen)。将脑组织在含有1％SDS+0.5％NP-40和蛋白酶抑制剂(Roche)的裂解缓冲液中匀浆，用于蛋白质印迹分析。将细胞匀浆，在Trizol中制备用于RNA提取，并在RIPA缓冲液或1％Triton的PBS溶液中制备用于蛋白质提取。通过BCA蛋白测定(Thermo Scientific)测定蛋白质浓度。

蛋白质印迹分析。用Tricine-SDS凝胶电泳分离含有等量蛋白质的样品，并用iBlot干印迹系统(Invitrogen)转移到PVDF膜上。将膜用在TBS中的5％牛奶/0.1％Tween20在室温下封闭1小时，接着与第一抗体在4℃下温育过夜。使用HRP缀合的第二抗体和增强的化学发光(Thermo Scientific)检测信号。印迹在600dpi扫描，使用Image J(NIH)进行光密度测定。我们将使用以下抗体：小鼠单克隆抗微管蛋白(Sigma，1：10000)，小鼠抗Aβ1-16(6E10)单克隆抗体(Covance，1：1000)，兔抗APP C端抗体(Calbiochem)，HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(1：2000)和山羊抗兔IgG(1：3000)(KPL)。

酶联免疫吸附测定(ELISA)。使用商业ELISA试剂盒(Invitrogen，KHB3441)定量Aβ42水平。按照制造商的方案测量细胞提取物、SwN2a细胞的培养基和小鼠的脑提取物中的Aβ水平。SwN2a细胞的培养基将在稀释剂中以1：1稀释，脑提取物将在稀释剂中以1：10稀释，然后上样到板上用于分析。每个样品将一式两份运行，并且实验将重复至少两次。

免疫组织学。将已经进行行为评估的小鼠用腹膜内戊巴比妥钠深度麻醉，并用冰冷盐水经心灌注。将大脑在PBS中的4％多聚甲醛中后固定至少24小时。将脑组织切成35μm切片，用抗生物素蛋白-生物素复合物过氧化物酶方法免疫染色，并在DAB(二氨基联苯胺)温育5分钟后可视化(Vector，Burlingame，CA，USA)。对于每只动物，将分析5个切片。对于淀粉样蛋白沉积，大脑切片用抗Aβ42兔多克隆抗体AB5078P(1：1000，Chemicon)标记。对于小神经胶质细胞活化，相邻切片也用抗-CD-11b大鼠单克隆抗体(1：100，Serotec)标记。对于磷酸化的tau，将切片用AT8抗体标记(1：500，Thermo Scientific)。对于组织蛋白酶D，将切片用RU4抗体标记(纽约大学医学院/内森·克莱因研究所(New York University Schoolof Medicine/Nathan Kline Institute)的Ralph Nixon博士惠赠)。使用NIH Image 1.63软件(美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)，Bethesda，MD，USA)，计算每0.75mm²被AB5078P免疫反应性淀粉样蛋白斑和被CD-11b免疫反应性反应性小神经胶质细胞占据的面积百分比。

硫黄素-S染色。将来自Tg19959的漂浮切片洗涤，并在1％Triton-PBS中温育15分钟，用PBS洗涤，并用0.05％硫黄素S(ThS)在50％乙醇中的溶液染色5分钟。最后，将切片用50％乙醇洗涤，然后用水洗涤。用荧光显微镜用λex＝488nm检测ThS的荧光。使用Image J确定ThS荧光的面积，并表示为总面积的分数。

通过RT-PCR定量基因。使用Trizol方案(Invitrogen)从4月龄小鼠脑中提取RNA。然后使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，USA)，加入无核酸酶去离子水将总RNA(1μg)逆转录成cDNA。根据制造商的方案进行逆转录。将总共30ng cDNA加载到PCR板的每个孔中。使用ABI Prism7000序列检测系统(Applied Biosystems，USA)通过实时定量PCR对cDNA一式两份进行分析，并用Power SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems，USA)进行检测。引物序列获自以前的出版物。参见Biochim Biophys Acta，1801(8)，831-8；Proc Natl Acad Sci USA，106(7)，2377-82。

ABCA1(Fwd:5’-CGTTTCCGGGAAGTGTCCTA-3’；Rev:5’-GCTAGAGATGACAAGGAGGATGGA-3’),

ABCA2(Fwd:5’-AGTGCTCAGCCTTCGTACAG-3’,Rev:5’-AGGCGCGTACAGGATTTTGG-3’),

ABCG1(Fwd:5’-TTTGAGGGATTTGGGTCTGAAC-3’,Rev:5’-CCCCTTTAATCGTTTTGTCTGCT-3’),

NPC1(Fwd:5’-GGGATGCCCGTGCCTGCAAT-3’；Rev:5’-CTGGCAGCTACATGGCCCCG-3’),

对于每个样品，对于每个mRNA和肌动蛋白，将一式两份地确定达到阈值荧光的循环数Ct。为了确定Tg19959小鼠相对于野生型小鼠中mRNA的相对量，使用2-ΔΔCt方法显示数据。

统计方法。使用具有Scheff型多重对比的广义Friedman/Kruskal-Wallis型秩检验进行组间的不成对对比。Journal of the American Statistical Association，83，1163-70，87：258。将使用R(http://www.cran.r-project.org/)和muStat包(https://cran.r-project.org/package＝muStat)进行计算。

对于目的1的主要结果是复合u分数，其包含

在第5天到达隐藏平台所花费的总时间，和

在平台区域花费的总时间。

为了防止说明(包括目标2)中的伪影(离群值，偏态分布)，我们将结果绘制为盒须(box-and-whiskers)图。参见[0726][0734]Tukey,John W.(1977)，Exploratory dataanalysis(Reading，Mass.：Addison-Wesley)(在第10/90百分位数之外的单个数据，即，每个在顶部和底部的两个极值)。

实施例18：研究α和β环糊精对帕金森病细胞和小鼠模型神经保护作用的研究设计。

据信a-突触核蛋白(a-syn)的聚集在诸如路易体痴呆和帕金森病的病症的发病机理中起关键作用。先前研究(P.Bar-On等人，2006a)的主要目的是确定甲基-b-环糊精(MbCD)是否干扰突触核蛋白病模型中的a-syn累积。参见J Neurochem，98(4)，1032-45。作者研究了MbCD对转染的神经元细胞系和转基因小鼠中a-syn累积的影响。免疫印迹分析显示，MbCD降低了转染细胞的膜部分和去污剂不溶性部分中的a-syn水平。与体外研究一致，用MbCD处理小鼠导致膜组分中a-syn水平降低和神经元细胞体和突触中a-syn累积减少。总之，这些结果被解释为提示使用MbCD的胆固醇和脂质组成的变化可能成为突触核蛋白病的治疗方法。然而，上述示例的结果提示所观察到的效果主要是由于MbCD(其被视为“胆固醇降低剂”)，实际上主要是由于MbCD清除磷脂。在本实施例中，将重复该研究，这次使用HPaCD，而不是MbCD。

MbCD对非tg和hα-syn tg小鼠脑中a-syn水平的影响。将非tg和ha-syn tg小鼠用MbCD(10mM)处理1周，并通过蛋白质印迹和免疫细胞化学进行分析。

实施例19：检测环糊精对乳腺癌疗效的研究设计

因为乳腺癌切除术后的妇女具有明确的诊断，所以HPaCD对抗“脱轨的内吞作用”的临床试验应该在该人群中开始。作为非限制性示例，HP-α-CD用于预防乳腺癌转移的无缝2b/3期临床试验可以在患有以下疾病的妇女群体中进行：

三阴性乳腺癌(他莫昔芬和赫赛汀在该人群中不能很好地发挥作用)，和

腋窝***转移(患者已确定发生转移的趋势)。

无缝设计的2b阶段部分在前80名患者已被观察至少2年并且无盲目性地继续被治疗后以无效为结果，因此他们可以为主要终点做出贡献，其将具有作为结果的远处转移的时间。由于前三年的复发率高，因此仅收集最多5年的数据。参见J Breast Cancer，18(4)，371-7。当最后一位病人被诊治两年后，将对一些后来招募的病人进行行政检查。Gehan试验将用于对比治疗的患者和安慰剂患者。参见Biometrika，52，203-23。

在三年的有效中值观察时间，预期30％的妇女发生远处复发，并且可以检测到发病率降低50％(降至15％)，标准80％功率在5％水平，每组125名受试者。安慰剂对照治疗将在标准护理(化疗、放疗……)之上进行。

据报道，长期肠胃外施用HP-β-CD(200mg/kg)降低大鼠的骨矿物质密度(BMD)(Toxicol Pathol，40(5)，742-50)，该研究应仔细监测

骨密度。

人红细胞比β-CD更好地耐受α-CD。参见WHO/JECFAFood Additive Series，48，1030。从对环糊精的耐受性低于人类的动物研究中，剂量限制因素可能为

肾毒性，和

溶血。

在动物研究中，α-CD仍未显示耳毒性(Ann Clin Transl Neurol，3(5)，366-80)，剂量发现研究应仔细筛选

耳毒性。

实施例20：测试环糊精对FSGS作用的研究设计

在一个方面，本公开提供一种在有需要的受试者中治疗和/或预防局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)和/或肾病性肿胀的方法，该方法包含向该受试者施用有效量的环糊精或其类似物或衍生物，单独施用或与一种或多种其它活性剂组合施用。在一些实施方案中，该组合物为HP-aCD和癸酸钠或辛酸钠的包合物。

将进行一项研究，其中使用Fogo,Semin Nephrol.2003年3月；23(2)：161-71(其通过引用整体并入本文)中提出的模型将有和无包合物的HP-α-CD口服施用于大鼠。包含和不包含HP-α-CD的其它口服制剂也将与HP-α-CD一起进行测试，以测量功效。

其它口服制剂可包括WO2016105465，ORAL COMPOSITIONS FOR INSOLUBLECOMPOUNDS(也通过引用将其全部内容并入本文)中描述的那些。

我们预期HP-α-CD或其类似物或衍生物将有效治疗和/或预防哺乳动物FSGS的发展，或优于没有已知β-环糊精副作用的其它实验化合物。

参考文献

Agalliu,I.,et al.(2015),'Higher frequency of certain cancers in LRRK2G2019S mutation carriers with Parkinson disease:a pooled analysis',JAMANeurol,72(1),58-65.

Agardan,N.B.,et al.(2015),'The Effectiveness of Raloxifene-LoadedLiposomes and Cochleates in Breast Cancer Therapy',AAPS PharmSciTech.

Ahmed,H.and AlSadek,D.M.(2015),'Galectin-3as a Potential Target toPrevent Cancer Metastasis',Clin Med Insights Oncol,9,113-21.

Ahmed,M.R.,et al.(2011),'Ubiquitin ligase parkin promotes Mdm2-arrestin interaction but inhibits arrestin ubiquitination',Biochemistry,50(18),3749-63.

Alanko,J.and Ivaska,J.(2016),'Endosomes:Emerging Platforms forIntegrin-Mediated FAK Signalling',Trends Cell Biol,26(6),391-8.

Alcalay,R.N.,et al.(2016),'SCARB2 variants and glucocerebrosidaseactivity in Parkinson's disease',NPJ Parkinsons Dis,2.

Allen,I.V.(1981),'The pathology of multiple sclerosis--fact,fictionand hypothesis',Neuropathol Appl Neurobiol,7(3),169-82.

Almahariq,M.,et al.(2013),'Anovel EPAC-specific inhibitor suppressespancreatic cancer cell migration and invasion',Mol Pharmacol,83(1),122-8.

American Cancer Society(2015),Cancer Facts&Figures 2015(Atlanta:American Cancer Society).

Anazi,S.,et al.(2016),'Clinical genomics expands the morbid genome ofintellectual disability and offers a high diagnostic yield',Mol Psychiatry.

Antalis,C.J.,et al.(2011),'Migration of MDA-MB-231breast cancer cellsdepends on the availability of exogenous lipids and cholesterolesterification',Clin Exp Metastasis,28(8),733-41.

Antonell,A.,et al.(2015),'Altered Blood Gene Expression of Tumor-Related Genes(PRKCB,BECN1,and CDKN2A)in Alzheimer's Disease',MolecularNeurobiology.

Antoniou,A.C.,et al.(2010),'Common breast cancer susceptibilityalleles and the risk of breast cancer for BRCA1 and BRCA2 mutation carriers:implications for risk prediction',Cancer Res,70(23),9742-54.

Arima,H.,et al.(1992),'Enhanced rectal absorption and reduced localirritation of the anti-inflammatory drug ethyl 4-biphenylylacetate in rats bycomplexation with water-soluble beta-cyclodextrin derivatives and formulationas oleaginous suppository',J Pharm Sci,81(11),1119-25.

Armitage,Peter(1955),'Tests for linear trends in proportions andfrequencies',Biometrics,11(3),375-86.

Armstrong,A.,et al.(2014),'Lysosomal network proteins as potentialnovel CSF biomarkers for Alzheimer's disease',Neuromolecular Med,16(1),150-60.

Baietti,M.F.,et al.(2012),'Syndecan-syntenin-ALIX regulates thebiogenesis of exosomes',Nat Cell Biol,14(7),677-85.

Balla,Tamas(2013),'Phosphoinositides:Tiny Lipids With Giant Impact onCell Regulation',Physiological Reviews,93(3),1019-137.

Bar-On,P.,et al.(2006a),'Effects of the cholesterol-lowering compoundmethyl-beta-cyclodextrin in models of alpha-synucleinopathy',J Neurochem,98(4),1032-45.

Bar-On,Pazit,et al.(2006b),'Effects of the cholesterol-loweringcompound methyl-β-cyclodextrin in models ofα-synucleinopathy',Journal ofNeurochemistry,98(4),1032-45.

Beebe-Dimmer,J.L.,et al.(2015),'Familial clustering of breast andprostate cancer and risk of postmenopausal breast cancer in the Women'sHealth Initiative Study',Cancer,121(8),1265-72.

Bektas,M.,et al.(2005),'A novel acylglycerol kinase that produceslysophosphatidic acid modulates cross talk with EGFR in prostate cancercells',J Cell Biol,169(5),801-11.

Ben-Chetrit,N.,et al.(2015),'Synaptojanin 2 is a druggable mediatorof metastasis and the gene is overexpressed and amplified in breast cancer',Sci Signal,8(360),ra7.

Ben Halima,S.,et al.(2016),'Specific Inhibition of beta-SecretaseProcessing of the Alzheimer Disease Amyloid Precursor Protein',Cell Rep,14(9),2127-41.

Bereczki,E.,et al.(2016),'Synaptic proteins predict cognitive declinein Alzheimer's disease and Lewy body dementia',Alzheimers Dement.

Betz,A.,et al.(1997),'Direct interaction of the rat unc-13 homologueMunc13-1 with the N terminus of syntaxin',J Biol Chem,272(4),2520-6.

Bielicki,J.K.(2016),'ABCA1 agonist peptides for the treatment ofdisease',Curr Opin Lipidol,27(1),40-6.

Boehm-Cagan,A.,et al.(2016),'Differential Effects of apoE4 andActivation of ABCA1 on Brain and Plasma Lipoproteins',PLoS One,11(11),e0166195.

Bogie,J.F.,et al.(2013),'Myelin alters the inflammatory phenotype ofmacrophages by activating PPARs',Acta Neuropathol Commun,1,43.

Bohdanowicz,M.and Grinstein,S.(2013),'Role of phospholipids inendocytosis,phagocytosis,and macropinocytosis',Physiol Rev,93(1),69-106.

Bosch,Ana,et al.(2015),'PI3K inhibition results in enhanced estrogenreceptor function and dependence in hormone receptor–positive breast cancer',Science Translational Medicine,7(283),283ra51-83ra51.

Bottcher,T.,et al.(2013),'Fabry disease-underestimated in thedifferential diagnosis of multiple sclerosis？',PLoS One,8(8),e71894.

Bradley,Ryan M.,et al.(2015),'Acylglycerophosphate acyltransferase 4(AGPAT4)is a mitochondrial lysophosphatidic acid acyltransferase thatregulates brain phosphatidylcholine,phosphatidylethanolamine,andphosphatidylinositol levels',Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular andCell Biology of Lipids,1851(12),1566-76.

Bras,J.,et al.(2014a),'Genetic analysis implicates APOE,SNCAandsuggests lysosomal dysfunction in the etiology of dementia with Lewy bodies',Hum Mol Genet,23(23),6139-46.

Bras,Jose,et al.(2014b),'Genetic analysis implicates APOE,SNCA andsuggests lysosomal dysfunction in the etiology of dementia with Lewy bodies',Human Molecular Genetics,23(23),6139-46.

Brewster,M.E.and Loftsson,T.(2007),'Cyclodextrins as pharmaccuticalsolubilizers',Advanced Drug Delivery Reviews,59(7),645-66.

Bultema,J.J.,et al.(2012),'BLOC-2,AP-3,and AP-1 proteins function inconcert with Rab38 and Rab32 proteins to mediate protein trafficking tolysosome-related organelles',J Biol Chem,287(23),19550-63.

Burghel,George J.,et al.(2013),'Identification of Candidate DriverGenes in Common Focal Chromosomal Aberrations of Microsatellite StableColorectal Cancer',Plos One,8(12),e83859.

Busa,W.B.(1988),'Roles for the phosphatidylinositol cycle in earlydevelopment',Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,320(1199),415-26.

Cai,R.,et al.(2015),'Deterministic identification of specificindividuals from GWAS results',Bioinformatics,31(11),1701-7.

Cai,W.,et al.(2013),'Adenylyl cyclase 6 activation negativelyregulates TLR4 signaling through lipid raft-mediated endocytosis',J Immunol,191(12),6093-100.

Camilleri,P.,Haskins,N.J.,and Howlett,D.R.(1994),'beta-Cyclodextrininteracts with the Alzheimer amyloid beta-A4 peptide',FEBS Lett,341(2-3),256-8.

Cammarata,G.,et al.(2015),'High variability of Fabry diseasemanifestations in an extended Italian family',Biomed Res Int,2015,504784.

Campbell,I.M.,et al.(2012),'Novel 9q34.11 gene deletions encompassingcombinations of four Mendelian disease genes:STXBP1,SPTAN1,ENG,and TOR1A',Genet Med,14(10),868-76.

Castro,E.and Eeles,R.(2012),'The role of BRCA1 and BRCA2 in prostatecancer',Asian J Androl,14(3),409-14.

Cataldo,A.M.,et al.(2000),'Endocytic pathway abnormalities precedeamyloid beta deposition in sporadic Alzheimer's disease and Down syndrome:differential effects of APOE genotype and presenilin mutations',Am J Pathol,157(1),277-86.

Cataldo,Didier,et al.(2015),'Use Of Cyclodextrin For Treatment AndPrevention Of Bronchial Inflammatory Diseases',US 9034846 B2(US:UNIV LIEGE).

Cha,S.H.,et al.(2015),'Loss of parkin promotes lipid rafts-dependentendocytosis through accumulating caveolin-1:implications for Parkinson'sdisease',Mol Neurodegener,10,63.

Chen,Chun-Lin,et al.(2009),'Inhibitors of clathrin-dependentendocytosis enhance TGFβ signaling and responses',Journal of Cell Science,122(11),1863-71.

Chen,X.,et al.(2014),'Altered Cholesterol Intracellular Traffickingand the Development of Pathological Hallmarks of Sporadic AD',J ParkinsonsDis Alzheimers Dis,1(1).

Chen,X.I.N.,et al.(2015),'Vav3 oncogene is upregulated and a poorprognostic factor in breast cancer patients',Oncology Letters,9(5),2143-48.

Cheng,Danni,et al.(2011),'Lipid Pathway Alterations in Parkinson'sDisease Primary Visual Cortex',Plos One,6(2),e17299.

Chew,C.L.,Chen,M.,and Pandolfi,P.P.(2016),'Endosome and INPP4B',Oncotarget,7(1),5-6.

Chin,H.,et al.(2006),'Protein kinase A-dependent phosphorylation ofB/K protein',Exp Mol Med,38(2),144-52.

Choubey,V.,et al.(2014),'BECN1 is involved in the initiation ofmitophagy:it facilitates PARK2 translocation to mitochondria',Autophagy,10(6),1105-19.

Cicek,M.S.,et al.(2012),'Colorectal cancer linkage on chromosomes4q21,8q13,12q24,and 15q22',Plos One,7(5),e38175.

Cirrito,J.R.,et al.(2008),'Endocytosis is required for synapticactivity-dependent release of amyloid-beta in vivo',Neuron,58(1),42-51.

Clear,Kasey J.and Smith,Bradley D.(2015),'Synthetic Receptors forpolar Lipids:Design Principles and Applications',in Bradley D.Smith(ed.),Monographs in Supramolecular Chemistry(14:Royal Society of Chemistry),404-36.

Cleveland,William S.and Devlin,Susan J.(1988),'Locally WeightedRegression:An Approach to Regression Analysis by Local Fitting',Journal ofthe American Statistical Association,83(403),596-610.

Coisne,C.,et al.(2016),'Cyclodextrins as Emerging Therapeutic Toolsin the Treatment of Cholesterol-Associated Vascular and NeurodegenerativeDiseases',Molecules,21(12).

Colacurcio,D.J.and Nixon,R.A.(2016),'Disorders of lysosomalacidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerativedisease',Ageing Res Rev.

Coleman,J.A.,Quazi,F.,and Molday,R.S.(2013),'Mammalian P4-ATPases andABC transporters and their role in phospholipid transport',Biochim BiophysActa,1831(3),555-74.

Committee for Human Medicinal Products(CHMP)(2014),'Background reviewfor cyclodextrins used as excipients',Eurpean Medicines Agency,EMA/CHMP/333892/2013.

Crews,L.,et al.(2009),'Role of synucleins in Alzheimer's disease',Neurotox Res,16(3),306-17.

Cronin,S.,et al.(2015),'Hearing Loss and Otopathology FollowingSystemic and Intracerebroventricular Delivery of 2-Hydroxypropyl-Beta-Cyclodextrin',J Assoc Res Otolaryngol,16(5),599-611.

Crumling,M.A.,et al.(2012),'Hearing loss and hair cell death in micegiven the cholesterol-chelating agent hydroxypropyl-beta-cyclodextrin',PlosOne,7(12),e53280.

Cuzner,M.L.and Davison,A.N.(1973),'Changes in cerebral lysosomalenzyme activity and lipids in multiple sclerosis',J Neurol Sci,19(1),29-36.

da Costa,A.,et al.(2012),'Identification of six potential markers forthe detection of circulating canine mammary tumour cells in the peripheralblood identified by microarray analysis',J Comp Pathol,146(2-3),143-51.

Daleke,D.L.(2007),'Phospholipid flippases',J Biol Chem,282(2),821-5.

Danthi,P.and Chow,M.(2004),'Cholesterol removal by methyl-beta-cyclodextrin inhibits poliovirus entry',J Virol,78(1),33-41.

Davidson,C.D.,et al.(2016),'Efficacy and ototoxicity of differentcyclodextrins in Niemann-Pick C disease',Ann Clin Transl Neurol,3(5),366-80.

Davis,Mark E.and Brewster,Marcus E.(2004),'Cyclodextrin-basedpharmaceutics:past,present and future',Nat Rev Drug Discov,3(12),1023-35.

Day,P.,et al.(2011),'Syntaxins 3 and 4 mediate vesicular traffickingof alpha5beta1 and alpha3beta1 integrins and cancer cell migration',Int JOncol,39(4),863-71.

Deli,Mária A.(2009),'Potential use of tight junction modulators toreversibly open membranous barriers and improve drug delivery',Biochimica etBiophysica Acta(BBA)-Biomembranes,1788(4),892-910.

Di Fiore,Pier Paolo and von Zastrow,Mark(2014),'Endocytosis,Signaling,and Beyond',Cold Spring Harbor Perspectives in Biology,6(8).

Diao,J.,et al.(2013),'Native alpha-synuclein induces clustering ofsynaptic-vesicle mimics via binding to phospholipids and synaptobrevin-2/VAMP2',Elife,2,e00592.

Disse,M.,et al.(2016),'AReview of the Association Between ParkinsonDisease and Malignant Melanoma',Dermatol Surg,42(2),141-6.

Dong,Xiaoliu,et al.(2016),'The relevance of ABCA1 R219K polymorphismsand serum ABCA1 protein concentration to Parkinson’s disease pathogenesis andclassification:a case–control study',Genes&Genomics,38(3),243-50.

Dong,Y.,et al.(2015),'Synaptojanin cooperates in vivo with endophilinthrough an unexpected mechanism',Elife,4.

Dos Santos,A.G.,et al.(2017),'Changes in membrane biophysicalproperties induced by the Budesonide/Hydroxypropyl-beta-cyclodextrincomplex',Biochim Biophys Acta,1859(10),1930-40.

Duchene,D.and Wouessidjewe,D.(1990),'Pharmaceutical uses ofcyclodextrins and derivatives',Drug Development and Industrial Pharmacy,16(17),2487-99.

Erneux,C.,et al.(2016),'New Functions of the Inositol Polyphosphate5-Phosphatases in Cancer',Curr Pharm Des,22(16),2309-14.

Falasca,Marco(ed.),(2012),Phosphoinositides and Disease,ed.PeterK.Vogt(Current topics in microbiology and Immunology,Dordrecht:Springer).

Farge,E.,et al.(1999),'Enhancement of endocytosis due toaminophospholipid transport across the plasma membrane of living cells',Am JPhysiol,276(3 Pt 1),C725-33.

Fauvelle,F.,et al.(1997),'Mechanism of alpha-cyclodextrin-inducedhemolysis.1.The two-step extraction of phosphatidylinositol from themembrane',J Pharm Sci,86(8),935-43.

Feldman,A.L.,et al.(2014),'Familial coaggregation of Alzheimer'sdisease and Parkinson's disease:systematic review and meta-analysis',Neuroepidemiology,42(2),69-80.

Feng,D.D.,Cai,W.,and Chen,X.(2015),'The associations betweenParkinson's disease and cancer:the plot thickens',Transl Neurodegener,4,20.

Fernandez-Nogueira,P.,et al.(2016),'Differential expression ofneurogenes among breast cancer subtypes identifies high risk patients',Oncotarget,7(5),5313-26.

Filigheddu,N.,et al.(2007),'Diacylglycerol kinase is required forHGF-induced invasiveness and anchorage-independent growth of MDA-MB-231breast cancer cells',Anticancer Res,27(3B),1489-92.

Finn,R.S.,Aleshin,A.,and Slamon,D.J.(2016),'Targeting the cyclin-dependent kinases(CDK)4/6 in estrogen receptor-positive breast cancers',Breast Cancer Res,18(1),17.

Frank,D.W.,Gray,J.E.,and Weaver,R.N.(1976),'Cyclodextrin nephrosis inthe rat',Am J Pathol,83(2),367-82.

Frere,S.and Slutsky,I.(2016),'Targeting PTEN interactions forAlzheimer's disease',Nat Neurosci,19(3),416-8.

Fukuda,M.(2016),'Multiple Roles of VARP in Endosomal Trafficking:Rabs,Retromer Components and R-SNARE VAMP7 Meet on VARP',Traffic,17(7),709-19.

Fukuda,Mitsunori(2013),'The role of synaptotagmin and synaptotagmin-like protein(Slp)in regulated exocytosis',Madame Curie Regulated Database[Internet].

Fulop,T.,et al.(2012),'Aging,immunosenescence and membrane rafts:thelipid connection',Longev Healthspan,1,6.

Garcia-Closas,M.,et al.(2013),'Genome-wide association studiesidentify four ER negative-specific breast cancer risk loci',Nat Genet,45(4),392-8,98e1-2.

Gatto,F.,et al.(2015),'Flux balance analysis predicts essential genesin clear cell renal cell carcinoma metabolism',Sci Rep,5,10738.

Gautam,S.,et al.(2014),'beta-cyclodextrin and curcumin,a potentcocktail for disaggregating and/or inhibiting amyloids:a case study withalpha-synuclein',Biochemistry,53(25),4081-3.

Gautam,V.,et al.(2015),'Synaptotagmins interact with APP and promoteAbeta generation',Mol Neurodegener,10,31.

Gehan,E.A.(1965),'Ageneralised Wilcoxon test for comparingarbitrarily singly censored samples',Biometrika,52,203-23.

George,M.F.,et al.(2016),'Multiple sclerosis risk loci and diseaseseverity in 7,125 individuals from 10 studies',Neurol Genet,2(4),e87.

Germain,D.P.(2010),'Fabry disease',Orphanet J Rare Dis,5,30.

Gimpl,G.and Gehrig-Burger,K.(2011),'Probes for studying cholesterolbinding and cell biology',Steroids,76(3),216-31.

Goetz,J.G.,et al.(2011),'Biomechanical remodeling of themicroenvironment by stromal caveolin-1 favors tumor invasion and metastasis',Cell,146(1),148-63.

Gonzalez,A.,et al.(2014),'Lysosomal integral membrane protein-2:a newplayer in lysosome-related pathology',Mol Genet Metab,111(2),84-91.

Gotoh,K.,et al.(2014),'The antitumor effects of methyl-beta-cyclodextrin against primary effusion lymphoma via the depletion ofcholesterol from lipid rafts',Biochem Biophys Res Commun,455(3-4),285-9.

Gould,S.and Scott,R.C.(2005),'2-Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin(HP-beta-CD):a toxicology review',Food Chem Toxicol,43(10),1451-9.

Grosse,P.Y.,Bressolle,F.,and Pinguet,F.(1998),'Antiproliferativeeffect of methyl-beta-cyclodextrin in vitro and in human tumour xenograftedathymic nude mice',Br J Cancer,78(9),1165-9.

Guerra,Fabiana Sélos,et al.(2016),'Membrane cholesterol depletionreduces breast tumor cell migration by a mechanism that involves non-canonical Wnt signaling and IL-10 secretion',Translational MedicineCommunications,1(1),3.

Guerreiro,R.,et al.(2016),'Genome-wide analysis of geneticcorrelation in dementia with Lewy bodies,Parkinson's and Alzheimer'sdiseases',Neurobiol Aging,38,214 e7-10.

Gunasekara,L.,et al.(2017),'Pulmonary surfactant dysfunction inpediatric cystic fibrosis:Mechanisms and reversal with a lipid-sequesteringdrug',J Cyst Fibros.

Gupta,A.and Iadecola,C.(2015),'Impaired Abeta clearance:a potentiallink between atherosclerosis and Alzheimer's disease',Front Aging Neurosci,7,115.

Gurney,M.E.,D'Amato,E.C.,and Burgin,A.B.(2015),'Phosphodiesterase-4(PDE4)molecular pharmacology and Alzheimer's disease',Neurotherapeutics,12(1),49-56.

Haddad,S.A.,et al.(2016),'An exome-wide analysis of low frequency andrare variants in relation to risk of breast cancer in African American Women:the AMBER Consortium',Carcinogenesis.

Hall,E.H.,et al.(2009),'Tensin1 requires protein phosphatase-1alphain addition to RhoGAP DLC-1 to control cell polarization,migration,andinvasion',J Biol Chem,284(50),34713-22.

Hamon,Yannick,et al.(2006),'Cooperation between Engulfment Receptors:The Case of ABCA1 and MEGF10',Plos One,1(1),e120.

Hanson,H.A.,et al.(2016),'Is Cancer Protective for SubsequentAlzheimer's Disease Risk？Evidence From the Utah Population Database',JGerontol B Psychol Sci Soc Sci.

Hashimoto,S.,et al.(2016),'Lysophosphatidic acid activates Arf6 topromote the mesenchymal malignancy of renal cancer',Nat Commun,7,10656.

Hesketh,G.G.,et al.(2014),'VARP is recruited on to endosomes bydirect interaction with retromer,where together they function in export tothe cell surface',Dev Cell,29(5),591-606.

Hipler,U.C.,et al.(2007),'Influence of cyclodextrins on theproliferation of HaCaT keratinocytes in vitro',J Biomed Mater Res A,83(1),70-9.

Hoeffding,Wassily(1948),'Aclass of statistics with asymptoticallynormal distribution',Annals of Mathematical Statistics,19,293-325.

Hopkins,M.M.,et al.(2016),'Eicosopentaneoic Acid and Other Free FattyAcid Receptor Agonists Inhibit Lysophosphatidic Acid-and Epidermal GrowthFactor-Induced Proliferation of Human Breast Cancer Cells',J Clin Med,5(2).

Hoshino,Ayuko,et al.(2015),'Tumour exosome integrins determineorganotropic metastasis',Nature,527(7578),329-35.

Hsu,W.C.,et al.(2008),'Promoter polymorphisms modulating HSPA5expression may increase susceptibility to Taiwanese Alzheimer's disease',JNeural Transm(Vienna),115(11),1537-43.

Huang,Z.and London,E.(2013),'Effect of cyclodextrin and membranelipid structure upon cyclodextrin-lipid interaction',Langmuir,29(47),14631-8.

Hultberg,B.and Olsson,J.E.(1978),'Diagnostic value of determinationsof lysosomal hydrolases in CSF of patients with neurological diseases',ActaNeurol Scand,57(3),201-15.

---(1979),'Lysosomal hydrolases in CSF of patients with multiplesclerosis',Acta Neurol Scand,59(1),23-30.

Hunter,David J.,et al.(2007),'Agenome-wide association studyidentifies alleles in FGFR2 associated with risk of sporadic postmenopausalbreast cancer',Nature Genetics,39(7),870-74.

Hurley,J.H.and Odorizzi,G.(2012),'Get on the exosome bus with ALIX',Nat Cell Biol,14(7),654-5.

Iacopetta,Domenico,Rechoum,Yassine,and Fuqua,Suzanne A.W.(2012),'TheRole of Androgen Receptor in Breast Cancer',Drug discovery today.Diseasemechanisms,9(1-2),e19-e27.

Inabe,K.,et al.(2002),'Vav3 modulates B cell receptor responses byregulating phosphoinositide 3-kinase activation',J Exp Med,195(2),189-200.

Irie,T.and Uekama,K.(1997),'Pharmaceutical applications ofcyclodextrins.III.Toxicological issues and safety evaluation',J Pharm Sci,86(2),147-62.

Irie,T.,et al.(1992),'Hydroxypropylcyclodextrins in parenteraluse.II:Effects on transport and disposition of lipids in rabbit and humans',JPharm Sci,81(6),524-8.

Irie,T.,et al.(1982),'Cyclodextrin-induced hemolysis and shapechanges of human erythrocytes in vitro',J Pharmacobiodyn,5(9),741-4.

Jameson,L.P.,Smith,N.W.,and Dzyuba,S.V.(2012),'Dye-binding assays forevaluation of the effects of small molecule inhibitors on amyloid(abeta)self-assembly',ACS ChemNeurosci,3(11),807-19.

Jiang,H.L.,et al.(2015),'Loss of RAB1B promotes triple-negativebreast cancer metastasis by activating TGF-beta/SMAD signaling',Oncotarget,6(18),16352-65.

Jounai,N.,et al.(2011),'NLRP4 negatively regulates autophagicprocesses through an association with beclin1',J Immunol,186(3),1646-55.

Jung,S.,et al.(2013),'Oncogenic function of p34SEI-1 viaNEDD41mediated PTEN ubiquitination/degradation and activation of the PI3K/AKTpathway',Int J Oncol,43(5),1587-95.

Kagedal,K.,et al.(2010),'Increased expression of the lysosomalcholesterol transporter NPC1 in Alzheimer's disease',Biochim Biophys Acta,1801(8),831-8.

Kamar,R.I.,Organ-Darling,L.E.,and Raphael,R.M.(2012),'MembraneCholesterol Strongly Influences Confined Diffusion of Prestin',BiophysicalJournal,103(8),1627-36.

Kameyama,K.,et al.(2017),'Induction of mitophagy-mediated antitumoractivity with folate-appended methyl-beta-cyclodextrin',Int J Nanomedicine,12,3433-46.

Kanai,A.,et al.(1989),'The effect on the cornea of alpha cyclodextrinvehicle for cyclosporin eye drops',Transplant Proc,21(1 Pt 3),3150-2.

Kantner,I.and Erben,R.G.(2012),'Long-term parenteral administrationof 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin causes bone loss',Toxicol Pathol,40(5),742-50.

Kawate,T.,et al.(2015),'High levels of DJ-1 protein and isoelectricpoint 6.3 isoform in sera of breast cancer patients',Cancer Sci,106(7),938-43.

Kawauchi,T.(2012),'Cell adhesion and its endocytic regulation in cellmigration during neural development and cancer metastasis',Int J Mol Sci,13(4),4564-90.

Keogh,M.J.,et al.(2015),'A novel de novo STXBP1 mutation isassociated with mitochondrial complex I deficiency and late-onset juvenile-onset parkinsonism',Neurogenetics,16(1),65-7.

Kerr,W.G.(2011),'Inhibitor and activator:dual functions for SHIP inimmunity and cancer',Ann N Y Acad Sci,1217,1-17.

Khalil,B.,et al.(2015),'PINK1-induced mitophagy promotesneuroprotection in Huntington's disease',Cell Death Dis,6,e1617.

Kim,H.J.,et al.(2015),'Metastasis-Free Interval Is Closely Related toTumor Characteristics and Has Prognostic Value in Breast Cancer Patients withDistant Relapse',J Breast Cancer,18(4),371-7.

Kim,S.,et al.(2016),'Evidence that the rab5 effector APPL1 mediatesAPP-betaCTF-induced dysfunction of endosomes in Down syndrome and Alzheimer'sdisease',Mol Psychiatry,21(5),707-16.

Kim,T.W.,et al.(2012a),'Phosphoinositide modulation for the treatmentof neurodegenerative diseases',(Columbia University),US8288378.

Kim,Tae-Wan,et al.(2012b),'Phosphoinositide Modulation For TheTreatment Of Neurodegenerative Diseases',U.S.Patent 8,288,378(US:KIM,TAE-WAN

DI PAOLO,GILBERT

KANG MIN,SUK

BERMAN,DIEGO

MCINTIRE LAURA BETH,JOHNSONUNIV COLUMBIA,).

Kitada,T.,et al.(1998),'Mutations in the parkin gene cause autosomalrecessive juvenile parkinsonism',Nature,392(6676),605-8.

Koldamova,R.,Fitz,N.F.,and Lefterov,I.(2014),'ATP-binding cassettetransporter A1:from metabolism to neurodegeneration',Neurobiol Dis,72 Pt A,13-21.

Kondo,T.,Irie,T.,and Uekama,K.(1996),'Combination effects of alpha-cyclodextrin and xanthan gum on rectal absorption and metabolism of morphinefrom hollow-type suppositories in rabbits',Biol Pharm Bull,19(2),280-6.

Koran,M.E.,et al.(2014),'Genetic interactions within inositol-relatedpathways are associated with longitudinal changes in ventricle size',JAlzheimers Dis,38(1),145-54.

Koumangoye,Rainelli B.,et al.(2011),'Detachment of Breast Tumor CellsInduces Rapid Secretion of Exosomes Which Subsequently Mediate CellularAdhesion and Spreading',Plos One,6(9),e24234.

Krug,S.M.,et al.(2013),'Sodium caprate as an enhancer ofmacromolecule permeation across tricellular tight junctions of intestinalcells',Biomaterials,34(1),275-82.

Kuzuya,A.,et al.(2016),'Identification of the novel activity-driveninteraction between synaptotagmin 1 and presenilin 1 links calcium,synapse,and amyloid beta',BMC Biol,14,25.

Law,C.,et al.(2016),'Normal Molecular Specification andNeurodegenerative Disease-Like Death of Spinal Neurons Lacking the SNARE-Associated Synaptic Protein Munc18-1',J Neurosci,36(2),561-76.

Lee,B.H.,et al.(2013),'Dysregulation of cholesterol homeostasis inhuman prostate cancer through loss of ABCA1',Cancer Res,73(3),1211-8.

Leonova,E.I.and Galzitskaya,O.V.(2015),'Role of Syndecans in LipidMetabolism and Human Diseases',Adv Exp Med Biol,855,241-58.

Leroy-Lechat,F.,et al.(1994),'Evaluation of the cytotoxicity ofcyclodextrins and hydroxypropylated derivatives',International Journal ofPharmaceutics,101(1-2),97-103.

Levano,K.,et al.(2009),'A genetic strategy involving aglycosyltransferase promoter and a lipid translocating enzyme to eliminatecancer cells',Glycoconj J,26(6),739-48.

Levano,K.,et al.(2012),'Atp8a1 deficiency is associated withphosphatidylserine externalization in hippocampus and delayed hippocampus-dependent learning',J Neurochem,120(2),302-13.

Li,H.,Cuzner,M.L.,and Newcombe,J.(1996),'Microglia-derivedmacrophages in early multiple sclerosis plaques',Neuropathol Appl Neurobiol,22(3),207-15.

Li,H.,et al.(2008),'Candidate single-nucleotide polymorphisms from agenomewide association study of Alzheimer disease',Arch Neurol,65(1),45-53.

Li,Y.C.,et al.(2006),'Elevated levels of cholesterol-rich lipid raftsin cancer cells are correlated with apoptosis sensitivity induced bycholesterol-depleting agents',Am J Pathol,168(4),1107-18；quiz 404-5.

Liao,C.J.,et al.(2015),'Anovel small-form NEDD4 regulates cellinvasiveness and apoptosis to promote tumor metastasis',Oncotarget,6(11),9341-54.

Lill,C.M.,et al.(2012),'Comprehensive research synopsis andsystematic meta-analyses in Parkinson's disease genetics:The PDGenedatabase',PLoS Genet,8(3),e1002548.

Lim,S.,et al.(2014),'Amyloid-beta precursor protein promotes cellproliferation and motility of advanced breast cancer',BMC Cancer,14,928.

Lin,De-Chen,et al.(2013),'Genomic and functional characterizations ofphosphodiesterase subtype 4D in human cancers',Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America,110(15),6109-14.

Lindmark,T.,Kimura,Y.,and Artursson,P.(1998),'Absorption enhancementthrough intracellular regulation of tight junction permeability by mediumchain fatty acids in Caco-2 cells',J Pharmacol Exp Ther,284(1),362-9.

Liu,B.,et al.(2009),'Reversal of defective lysosomal transport in NPCdisease ameliorates liver dysfunction and neurodegeneration in the npc1-/-mouse',Proc Natl Acad Sci U S A,106(7),2377-82.

Liu,Xin-Ming,et al.(2008),'Osteotropicβ-cyclodextrin for local boneregeneration',Biomaterials,29(11),1686-92.

Lizarbe,M.A.,et al.(2013),'Annexin-phospholipidinteractions.Functional implications',Int J Mol Sci,14(2),2652-83.

Llanos,P.,et al.(2015),'The cholesterol-lowering agent methyl-beta-cyclodextrin promotes glucose uptake via GLUT4 in adult muscle fibers andreduces insulin resistance in obese mice',Am J Physiol Endocrinol Metab,308(4),E294-305.

Loane,D.J.,et al.(2011),'Modulation of ABCA1 by an LXR agonistreduces beta-amyloid levels and improves outcome after traumatic braininjury',J Neurotrauma,28(2),225-36.

Loftsson,T.and Brewster,M.E.(1996),'Pharmaceutical applications ofcyclodextrins.1.Drug solubilization and stabilization',J Pharm Sci,85(10),1017-25.

---(2010),'Pharmaceutical applications of cyclodextrins:basic scienceand product development',J Pharm Pharmacol,62(11),1607-21.

Loftsson,T.,et al.(2016),'Pharmacokinetics of cyclodextrins and drugsafter oral and parenteral administration of drug/cyclodextrin complexes',JPharm Pharmacol,68(5),544-55.

Lopez Gonzalez,I.,et al.(2016),'Genetic and Transcriptomic Profilesof Inflammation in Neurodegenerative Diseases:Alzheimer,Parkinson,Creutzfeldt-Jakob and Tauopathies',Int J Mol Sci,17(2),206.

Lowry,M.C.,Gallagher,W.M.,and O'Driscoll,L.(2015),'The Role ofExosomes in Breast Cancer',Clin Chem,61(12),1457-65.

Luo,C.,et al.(2017),'The role of microglia in multiple sclerosis',Neuropsychiatr Dis Treat,13,1661-67.

Ma,K.,et al.(2008),'PI(3,4,5)P3 and PI(3,4)P2 levels correlate withPKB/akt phosphorylation at Thr308 and Ser473,respectively；PI(3,4)P2 levelsdetermine PKB activity',Cell Signal,20(4),684-94.

Maarup,T.J.,et al.(2015),'Intrathecal 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin in a single patient with Niemann-Pick C1',Mol Genet Metab,116(1-2),75-9.

Majerus,Philip W.and York,John D.(2009),'Phosphoinositidephosphatases and disease',Journal of Lipid Research,50(Suppl),S249-S54.

Malhotra,Shikha,et al.(2009),'Vav and Rac Activation in B CellAntigen Receptor Endocytosis Involves Vav Recruitment to the Adapter ProteinLAB',The Journal of Biological Chemistry,284(52),36202-12.

Malkki,Hemi(2016),'Alzheimer disease:Cancer immunotherapy drugreduces symptoms of Alzheimer disease in mice',Nat Rev Neurol,12(3),126-26.

Mann,H.B.and Whitney,D.R.(1947),'On a test of whether one of tworandom variables is stochastically larger than the other',Annals ofMathematical Statistics,18(1),50-60.

Martin-Maestro,P.,et al.(2016),'PARK2 enhancement is able tocompensate mitophagy alterations found in sporadic Alzheimer's disease',HumMol Genet,25(4),792-806.

Martin,T.F.(2015),'PI(4,5)P(2)-binding effector proteins for vesicleexocytosis',Biochim Biophys Acta,1851(6),785-93.

Matigian,Nicholas,et al.(2010),'Disease-specific,neurosphere-derivedcells as models for brain disorders',Disease Models&Mechanisms,3(11-12),785-98.

Matsuo,M.,et al.(2013),'Effects of cyclodextrin in two patients withNiemann-Pick Type C disease',Mol Genet Metab,108(1),76-81.

Maxwell,M.J.,et al.(2012),'Attenuation of phosphoinositide 3-kinasedelta signaling restrains autoimmune disease',J Autoimmun,38(4),381-91.

Mayer,I.A.and Arteaga,C.L.(2016),'The PI3K/AKT Pathway as a Targetfor Cancer Treatment',Annu Rev Med,67,11-28.

McCleverty,Clare J.,Lin,Diane C.,and Liddington,Robert C.(2007),'Structure of the PTB domain of tensin1 and a model for its recruitment tofibrillar adhesions',Protein Science:A Publication of the Protein Society,16(6),1223-29.

McKeown,S.R.and Allen,I.V.(1977),'Lysosomal involvement in thepathogenesis of multiple sclerosis[proceedings]',Biochem Soc Trans,5(5),1416-8.

---(1979),'The fragility of cerebral lysosomes in multiplesclerosis',Neuropathol Appl Neurobiol,5(5),405-15.

McKew,John,et al.(2014),'Cyclodextrin For The Treatment Of LysosomalStorage Diseases',(WO:US HEALTH).

Mellman,Ira and Yarden,Yosef(2013),'Endocytosis and Cancer',ColdSpring Harbor Perspectives in Biology,5(12).

Michailidou,K.,et al.(2013),'Large-scale genotyping identifies 41 newloci associated with breast cancer risk',Nat Genet,45(4),353-61,61e1-2.

Miller,J.A.,et al.(2013),'Genes and pathways underlying regional andcell type changes in Alzheimer's disease',Genome Med,5(5),48.

Minn,A.J.,et al.(2005),'Genes that mediate breast cancer metastasisto lung',Nature,436(7050),518-24.

Mitra,S.,Cheng,K.W.,and Mills,G.B.(2012),'Rab25 in cancer:a briefupdate',Biochem Soc Trans,40(6),1404-8.

Miyajima,Koichiro,Tomita,Keiko,and Nakagaki,Masayuki(1985),'Complexformation between di-and monophosphatidylcholines and cyclodextrins inwater',Chem Pharm Bull(Tokyo),33(6),2587-90.

Mohammad,N.,et al.(2014),'Cholesterol depletion by methyl-beta-cyclodextrin augments tamoxifen induced cell death by enhancing its uptake inmelanoma',Mol Cancer,13,204.

Monnaert,V.,et al.(2004),'Behavior ofα-,β-,andγ-Cyclodextrins andTheir Derivatives on an in Vitro Model of Blood-Brain Barrier',Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics,310(2),745-51.

Moon,Hyun-Seuk,et al.(2008),'Physico-chemical modifications ofconjugated linoleic acid for ruminal protection and oxidative stability',Nutrition&Metabolism,5(1),16.

Moran,L.B.,et al.(2006),'Whole genome expression profiling of themedial and lateral substantia nigra in Parkinson's disease',Neurogenetics,7(1),1-11.

Morris,Richard G.M.(1981),'Spatial localization does not require thepresence of local cues',Learning and Motivation,12(2),239-60.

Mosesson,Yaron,Mills,Gordon B.,and Yarden,Yosef(2008),'Derailedendocytosis:an emerging feature of cancer',Nat Rev Cancer,8(11),835-50.

Moskvina,V.,et al.(2013),'Analysis of genome-wide association studiesof alzheimer disease and of parkinson disease to determine if these 2diseases share a common genetic risk',JAMA Neurology,70(10),1268-76.

Motoyama,K.,et al.(2015),'Evaluation of antitumor effects of folate-conjugated methyl-beta-cyclodextrin in melanoma',Biol Pharm Bull,38(3),374-9.

Nalls,M.A.,et al.(2014),'Large-scale meta-analysis of genome-wideassociation data identifies six new risk loci for Parkinson's disease',NatGenet,46(9),989-93.

NIH(2015),'Study of 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin(VTS-270)to TreatNiemann-Pick Type C1(NPC1)Disease',ClinicalTrials.gov,(2016-03-06),NCT02534844.

Nishimura,Y.,et al.(2003),'Overexpression of ROCK in human breastcancer cells:evidence that ROCK activity mediates intracellular membranetraffic of lysosomes',Pathol Oncol Res,9(2),83-95.

Nishimura,Y.,et al.(2006),'Arole of LIM kinase 1/cofilin pathway inregulating endocytic trafficking of EGF receptor in human breast cancercells',Histochem Cell Biol,126(5),627-38.

Nordestgaard,L.T.,et al.(2015),'Loss-of-function mutation in ABCA1and risk of Alzheimer's disease and cerebrovascular disease',Alzheimers&Dementia,11(12),1430-38.

O'Neill,C.(2013),'PI3-kinase/Akt/mTOR signaling:impaired on/offswitches in aging,cognitive decline and Alzheimer's disease',Exp Gerontol,48(7),647-53.

O'Reilly,E.A.,et al.(2015),'The fate of chemoresistance in triplenegative breast cancer(TNBC)',BBA Clin,3,257-75.

Ohtani,Yoshiro,et al.(1989),'Differential effects ofα-,β-andγ-cyclodextrins on human erythrocytes',European Journal of Biochemistry,186(1-2),17-22.

Ono,N.,et al.(2001),'A moderate interaction of maltosyl-alpha-cyclodextrin with Caco-2 cells in comparison with the parent cyclodextrin',Biol Pharm Bull,24(4),395-402.

Ooms,Lisa M,et al.(2015),'The Inositol Polyphosphate 5-PhosphatasePIPP Regulates AKT1-Dependent Breast Cancer Growth and Metastasis',Cancercell,28(2),155-69.

Pahnke,J.,Langer,O.,and Krohn,M.(2014),'Alzheimer's and ABCtransporters--new opportunities for diagnostics and treatment',Neurobiol Dis,72 Pt A,54-60.

Palaniyandi,Kanagaraj,et al.(2012),'Human Breast Cancer Stem CellsHave Significantly Higher Rate of Clathrin-Independent and Caveolin-Independent Endocytosis than the Differentiated Breast Cancer Cells',Journalof cancer science&therapy,4(7),214-22.

Pandey,P.,et al.(2016),'Amyloid precursor protein and amyloidprecursor-like protein 2 in cancer',Oncotarget,10430-44.

Park,C.W.,et al.(2002),'Inclusion complex of conjugated linoleic acid(CLA)with cyclodextrins',J Agric Food Chem,50(10),2977-83.

Parnell,E.,Palmer,T.M.,and Yarwood,S.J.(2015),'The future of EPAC-targeted therapies:agonism versus antagonism',Trends in PharmacologicalSciences,36(4),203-14.

Pearson,Thomas A.and Manolio,Teri A.(2008),'How to interpret agenome-wide association study',JAMA,299(11),1335-44.

Peinado,H.,Lavotshkin,S.,and Lyden,D.(2011),'The secreted factorsresponsible for pre-metastatic niche formation:old sayings and new thoughts',Semin Cancer Biol,21(2),139-46.

Perrett,R.M.,Alexopoulou,Z.,and Tofaris,G.K.(2015),'The endosomalpathway in Parkinson's disease',Mol Cell Neurosci,66(Pt A),21-8.

Persaud,A.,et al.(2011),'Nedd4-1 binds and ubiquitylates activatedFGFR1 to control its endocytosis and function',EMBO J,30(16),3259-73.

Pfeffer,Suzanne R.(1999),'Motivating endosome motility',Nat CellBiol,1(6),E145-E47.

Picollo,A.,Malvezzi,M.,and Accardi,A.(2015),'TMEM16 proteins:unknownstructure and confusing functions',J Mol Biol,427(1),94-105.

Pinho,Raquel,et al.(2016),'Gene Expression Differences in PeripheralBlood of Parkinson’s Disease Patients with Distinct Progression Profiles',PLOS ONE,11(6),e0157852.

Pitha,J and Szente,L(1982),'Cyclodextrins and Congeners in ParenteralApplications',Proceedings of the First International Symposium onCyclodextrins(Springer Netherlands),457-66.

Posor,Y.,Eichhorn-Grunig,M.,and Haucke,V.(2015),'Phosphoinositides inendocytosis',Biochim Biophys Acta,1851(6),794-804.

Pourmand,G.,et al.(2007),'Role of PTEN gene in progression ofprostate cancer',Urol J,4(2),95-100.

Prakash,A.S.and Abbott,P.J.(2001),'Safety evaluation of certain foodadditives and contaminants:alpha-cyclodextrin',WHO/JECFA Food AdditiveSeries,48,1030.

Prinz,M.and Priller,J.(2014),'Microglia and brain macrophages in themolecular age:from origin to neuropsychiatric disease',Nat Rev Neurosci,15(5),300-12.

Puthiyedth,N.,et al.(2016),'Identification of DifferentiallyExpressed Genes through Integrated Study of Alzheimer's Disease AffectedBrain Regions',Plos One,11(4),e0152342.

Raghu,H.,et al.(2010),'Localization of uPAR and MMP-9 in lipid raftsis critical for migration,invasion and angiogenesis in human breast cancercells',BMC Cancer,10,647.

Rainero,E.,et al.(2015),'Ligand-Occupied Integrin InternalizationLinks Nutrient Signaling to Invasive Migration',Cell Rep,10,398-413.

Rajendran,Lawrence,Knolker,Hans-Joachim,and Simons,Kai(2010),'Subcellular targeting strategies for drug design and delivery',Nat Rev DrugDiscov,9(1),29-42.

Rastogi,S.C.and Clausen,J.(1980),'Loss of lysosomal neutralproteinase from leucocytes induced by the action of multiple sclerosis-specific brain antigens',Clin Exp Immunol,42(1),50-6.

Reitz,C.(2012),'The role of intracellular trafficking and the VPS10dreceptors in Alzheimer's disease',Future Neurol,7(4),423-31.

Renukuntla,Jwala,et al.(2013),'Approaches for Enhancing OralBioavailability of Peptides and Proteins',International journal ofpharmaceutics,447(0),75-93.

Resnik,N.,et al.(2015),'Highly Selective Anti-Cancer Activity ofCholesterol-Interacting Agents Methyl-beta-Cyclodextrin and Ostreolysin A/Pleurotolysin B Protein Complex on Urothelial Cancer Cells',Plos One,10(9),e0137878.

Riekkinen,P.J.,Rinne,U.K.,and Arstila,A.U.(1972),'Neurochemical andmorphological studies on demyelination in multiple sclerosis with specialreference to etiological aspects',Z Neurol,203(2),91-104.

Risbridger,Gail P.,et al.(2010),'Breast and prostate cancer:moresimilar than different',Nat Rev Cancer,10(3),205-12.

Rivera,J.,Megias,D.,and Bravo,J.(2010),'Sorting nexin 6 interactswith breast cancer metastasis suppressor-1 and promotes transcriptionalrepression',J Cell Biochem,111(6),1464-72.

Rivero-Rios,P.,et al.(2015),'Alterations in late endocytictrafficking related to the pathobiology of LRRK2-linked Parkinson's disease',Biochem Soc Trans,43(3),390-5.

Rivers,J.R.,Maggo,S.D.,and Ashton,J.C.(2012),'Neuroprotective effectof hydroxypropyl-beta-cyclodextrin in hypoxia-ischemia',Neuroreport,23(3),134-8.

Rocks,N.,et al.(2012),'Curcumin-cyclodextrin complexes potentiategemcitabine effects in an orthotopic mouse model of lung cancer',Br J Cancer,107(7),1083-92.

Rodal,Siv Kjersti,et al.(1999),'Extraction of Cholesterol withMethyl-β-Cyclodextrin Perturbs Formation of Clathrin-coated EndocyticVesicles',Molecular Biology of the Cell,10(4),961-74.

Rodrigues,E.M.,et al.(2016),'Abeta-Induced Synaptic AlterationsRequire the E3 Ubiquitin Ligase Nedd4-1',J Neurosci,36(5),1590-5.

Rohatgi,R.A.and Shaw,L.M.(2016),'An autophagy-independent functionfor Beclin 1 in cancer',Mol Cell Oncol,3(1).

Roka,E.,et al.(2015),'Evaluation of the Cytotoxicity of alpha-Cyclodextrin Derivatives on the Caco-2 Cell Line and Human Erythrocytes',Molecules,20(11),20269-85.

Rossi,M.R.,et al.(2005),'Identification of inactivating mutations inthe JAK1,SYNJ2,and CLPTM1 genes in prostate cancer cells using inhibition ofnonsense-mediated decay and microarray analysis',Cancer Genet Cytogenet,161(2),97-103.

Rouzier,Roman,et al.(2005),'Microtubule-associated protein tau:Amarker of paclitaxel sensitivity in breast cancer',Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,102(23),8315-20.

Runowicz,C.D.,et al.(2016),'American Cancer Society/American Societyof Clinical Oncology Breast Cancer Survivorship Care Guideline',J Clin Oncol,34(6),611-35.

Russell,C.L.,et al.(2012),'Amyloid-beta acts as a regulator ofneurotransmitter release disrupting the interaction between synaptophysin andVAMP2',Plos One,7(8),e43201.

Sahay,D.,et al.(2015),'The LPA1/ZEB1/miR-21-activation pathwayregulates metastasis in basal breast cancer',Oncotarget,6(24),20604-20.

Sakane,F.and Kanoh,H.(1997),'Molecules in focus:diacylglycerolkinase',Int J Biochem Cell Biol,29(10),1139-43.

Salminen,A.,et al.(2013),'Impaired autophagy and APP processing inAlzheimer's disease:The potential role of Beclin 1 interactome',ProgNeurobiol,106-107,33-54.

Salter,M.W.and Stevens,B.(2017),'Microglia emerge as central playersin brain disease',Nat Med,23(9),1018-27.

Samie,M.A.and Xu,H.(2014),'Lysosomal exocytosis and lipid storagedisorders',J Lipid Res,55(6),995-1009.

Saunders,D.A.,et al.(1997),'Measurement of total phospholipids inurine of patients treated with gentamicin',Br J Clin Pharmacol,43(4),435-40.

Schimanski,S.,et al.(2010),'Expression of the lipid transportersABCA3 and ABCA1 is diminished in human breast cancer tissue',Horm Metab Res,42(2),102-9.

Schmid,Sandra L.and Mettlen,Marcel(2013),'Cell biology:Lipid switchesand traffic control',Nature,499(7457),161-62.

Schreij,A.M.,Fon,E.A.,and McPherson,P.S.(2015),'Endocytic membranetrafficking and neurodegenerative disease',Cell Mol Life Sci.

Schwyzer,R.U.and Henzi,H.(1983),'Multiple sclerosis:plaques caused by2-step demyelination？',Med Hypotheses,12(2),129-42.

Seaman,MNj and Freeman,C.L.(2014),'Analysis of the Retromer complex-WASH complex interaction illuminates new avenues to explore in Parkinsondisease',Commun Integr Biol,7,e29483.

Sekine,Y.,et al.(2010),'High-density lipoprotein inducesproliferation and migration of human prostate androgen-independent cancercells by an ABCA1-dependent mechanism',Mol Cancer Res,8(9),1284-94.

Sengelaub,Caitlin A.,et al.(2015),'PTPRN2 and PLCβ1 promotemetastatic breast cancer cell migration through PI(4,5)P2-dependent actinremodeling',The EMBO Journal.

Shaikh,I.,et al.(2012),'Permeability Enhancement Techniques forPoorly Permeable Drugs:A Review',J Appl Pharmacol Sci,2(7),34-39.

Shen,Q.,et al.(2013),'Phagocytic receptor signaling regulatesclathrin and epsin-mediated cytoskeletal remodeling during apoptotic cellengulfment in C.elegans',Development,140(15),3230-43.

Sherva,R.,et al.(2011),'Identification of novel candidate genes forAlzheimer's disease by autozygosity mapping using genome wide SNP data',JAlzheimers Dis,23(2),349-59.

Sherva,R.,et al.(2014),'Genome-wide association study of the rate ofcognitive decline in Alzheimer's disease',Alzheimers Dement,10(1),45-52.

Shimizu,E.,et al.(2008),'IL-4-induced selective clearance ofoligomeric beta-amyloid peptide(1-42)by rat primary type 2 microglia',JImmunol,181(9),6503-13.

Shityakov,S.,et al.(2016),'Evaluation of the potential toxicity ofunmodified and modified cyclodextrins on murine blood-brain barrierendothelial cells',J Toxicol Sci,41(2),175-84.

Shulga,Y.V.,et al.(2010),'Molecular species of phosphatidylinositol-cycle intermediates in the endoplasmic reticulum and plasma membrane',Biochemistry,49(2),312-7.

Singh,T.D.,et al.(2010),'MEGF10 functions as a receptor for theuptake of amyloid-beta',FEBS Lett,584(18),3936-42.

Tobias,et al.(2006),'The Consensus Coding Sequences of HumanBreast and Colorectal Cancers',Science,314(5797),268-74.

Small,Scott A.and Petsko,Gregory A.(2015),'Retromer in Alzheimerdisease,Parkinson disease and other neurological disorders',Nat Rev Neurosci,16(3),126-32.

Soderberg,M.,et al.(1992),'Lipid composition in different regions ofthe brain in Alzheimer's disease/senile dementia of Alzheimer's type',JNeurochem,59(5),1646-53.

Sole-Domenech,S.,et al.(2016),'The endocytic pathway in microgliaduring health,aging and Alzheimer's disease',Ageing Res Rev,32,89-103.

Solecki,D.J.(2012),'Sticky situations:recent advances in control ofcell adhesion during neuronal migration',Curr Opin Neurobiol,22(5),791-8.

Song,W.,et al.(2014),'2-Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin promotestranscription factor EB-mediated activation of autophagy:implications fortherapy',J Biol Chem,289(14),10211-22.

Stella,V.J.and He,Q.(2008),'Cyclodextrins',Toxicol Pathol,36(1),30-42.

Storch,C.H.,et al.(2007),'Localization of the human breast cancerresistance protein(BCRP/ABCG2)in lipid rafts/caveolae and modulation of itsactivity by cholesterol in vitro',J Pharmacol Exp Ther,323(1),257-64.

Swaminathan,G.,Zhu,W.,and Plowey,E.D.(2016),'BECN1/Beclin 1 sortscell-surface APP/amyloid beta precursor protein for lysosomal degradation',Autophagy,12(12),2404-19.

Symeonides,S.N.,Anderton,S.M.,and Serrels,A.(2017),'FAK-inhibitionopens the door to checkpoint immunotherapy in Pancreatic Cancer',J ImmunotherCancer,5,17.

Szejtli,J.,et al.(1981),'Influencing of resorption and side-effectsof salicylic acid by complexing with beta-cyclodextrin',Pharmazie,36(4),283-6.

Takahashi,M.,Iseki,E.,and Kosaka,K.(2000),'Cdk5 and munc-18/p67 co-localization in early stage neurofibrillary tangles-bearing neurons inAlzheimer type dementia brains',J Neurol Sci,172(1),63-9.

Takahashi,S.,et al.(2016),'Susceptibility of outer hair cells tocholesterol chelator 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrine is prestin-dependent',Sci Rep,6,21973.

Tan,M.G.,et al.(2014),'Decreased rabphilin 3Aimmunoreactivity inAlzheimer's disease is associated with Abeta burden',Neurochem Int,64,29-36.

Telarico,T.and Perl,A.(2012),'The role of endocytic recycling inautoimmunity',Methods Mol Biol,900,91-107.

Tiribuzi,R.,et al.(2011),'Lysosomal beta-galactosidase and beta-hexosaminidase activities correlate with clinical stages of dementiaassociated with Alzheimer's disease and type 2 diabetes mellitus',JAlzheimers Dis,24(4),785-97.

Tomas,Alejandra,Futter,Clare E.,and Eden,Emily R.(2014),'EGF receptortrafficking:consequences for signaling and cancer',Trends in Cell Biology,24(1),26-34.

Tomlinson,P.R.,et al.(2015),'Identification of distinct circulatingexosomes in Parkinson's disease',Ann Clin Transl Neurol,2(4),353-61.

Trasino,S.E.,Kim,Y.S.,and Wang,T.T.(2009),'Ligand,receptor,and celltype-dependent regulation of ABCA1 and ABCG1 mRNAin prostate cancerepithelial cells',Mol Cancer Ther,8(7),1934-45.

Tsigelny,I.F.,et al.(2008),'Mechanisms of hybrid oligomer formationin the pathogenesis of combined Alzheimer's and Parkinson's diseases',PlosOne,3(9),e3135.

Tukey,J.W.(1980),'We Need Both Exploratory and Confirmatory',AmericanStatistician,34(1),23-25.

Tukey,John W.(1977),Exploratory data analysis(Reading,Mass.:Addison-Wesley).

Tulpule,K.and Dringen,R.(2013),'Formaldehyde in brain:an overlookedplayer in neurodegeneration？',Journal of Neurochemistry,127(1),7-21.

Valencia,A.,et al.(2013),'Striatal synaptosomes from Hdh140Q/140Qknock-in mice have altered protein levels,novel sites of methionineoxidation,and excess glutamate release after stimulation',J Huntingtons Dis,2(4),459-75.

Valenza,M.,et al.(2015),'Disruption of astrocyte-neuron cholesterolcross talk affects neuronal function in Huntington's disease',Cell DeathDiffer,22(4),690-702.

van der Mark,Vincent A.,Oude Elferink,Ronald P.J.,and Paulusma,CoenC.(2013),'P4 ATPases:Flippases in Health and Disease',International Journalof Molecular Sciences,14(4),7897-922.

van Dijk,K.D.,et al.(2013),'Changes in endolysosomal enzymeactivities in cerebrospinal fluid of patients with Parkinson's disease',MovDisord,28(6),747-54.

Van Dooren,T.,et al.(2014),'Derailed intraneuronal signalling drivespathogenesis in sporadic and familial Alzheimer's disease',Biomed Res Int,2014,167024.

Van Ommen,B.,De Bie,A.T.,and Bar,A.(2004),'Disposition of 14C-alpha-cyclodextrin in germ-free and conventional rats',Regul Toxicol Pharmacol,39Suppl 1,57-66.

van Weering,J.R.,Verkade,P.,and Cullen,P.J.(2012),'SNX-BAR-mediatedendosome tubulation is co-ordinated with endosome maturation',Traffic,13(1),94-107.

Vance,Jean E.(2012),'Dysregulation of cholesterol balance in thebrain:contribution to neurodegenerative diseases',Disease Models andMechanisms,5(6),746-55.

Vance,Jean E.and Karten,Barbara(2014),'Niemann-Pick C disease andmobilization of lysosomal cholesterol by cyclodextrin',Journal of LipidResearch,55(8),1609-21.

Vecsernyes,M.,et al.(2014),'Cyclodextrins,blood-brain barrier,andtreatment of neurological diseases',Arch Med Res,45(8),711-29.

Viaud,Julien,et al.(2016),'Phosphoinositides:Important lipids in thecoordination of cell dynamics',Biochimie,125,250-58.

Vilarino-Guell,C.,et al.(2014),'DNAJC13 mutations in Parkinsondisease',Hum Mol Genet,23(7),1794-801.

Vite,C.H.,et al.(2015),'Intracisternal cyclodextrin preventscerebellar dysfunction and Purkinje cell death in feline Niemann-Pick type C1disease',Sci Transl Med,7(276),276ra26.

Wadman,M.(2016),'Battle over rare disease drug ensnares NIH',Science,354(6308),18-19.

Wagner,E.M.,et al.(2008),'Dietary alpha-cyclodextrin lowers low-density lipoprotein cholesterol and alters plasma fatty acid profile in low-density lipoprotein receptor knockout mice on a high-fat diet',Metabolism,57(8),1046-51.

Walenbergh,S.M.,et al.(2015),'Weekly Treatment of 2-Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin Improves Intracellular Cholesterol Levels in LDL ReceptorKnockout Mice',Int J Mol Sci,16(9),21056-69.

Walter,J.,et al.(2001),'Phosphorylation regulates intracellulartrafficking of beta-secretase',J Biol Chem,276(18),14634-41.

Wang,H.,et al.(2009),'Parkin regulates paclitaxel sensitivity inbreast cancer via a microtubule-dependent mechanism',J Pathol,218(1),76-85.

Wang,J.D.,et al.(2015a),'Apivotal role of FOS-mediated BECN1/Beclin 1upregulation in dopamine D2 and D3 receptor agonist-induced autophagyactivation',Autophagy,11(11),2057-73.

Wang,K.S.,et al.(2015b),'Polymorphisms within ASTN2 gene areassociated with age at onset of Alzheimer's disease',J Neural Transm(Vienna),122(5),701-8.

Wang,Xin,et al.(2014),'Dysregulation of protein trafficking inneurodegeneration',Molecular Neurodegeneration,9(1),1-9.

Ward,S.,et al.(2010),'2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin raiseshearing threshold in normal cats and in cats with Niemann-Pick type Cdisease',Pediatr Res,68(1),52-6.

Waschbusch,D.,et al.(2014),'LRRK2 transport is regulated by its novelinteracting partner Rab32',Plos One,9(10),e111632.

Waugh,M.G.(2015),'PIPs in neurological diseases',Biochim BiophysActa,1851(8),1066-82.

Weber,G.F.(2015),'Molecular Analysis of a Recurrent SarcomaIdentifies a Mutation in FAF1',Sarcoma,2015,839182.

Wei,B.,et al.(2015),'Annexin A4 and cancer',Clin Chim Acta,447,72-8.

Weng,L.,et al.(2013),'Genome-wide discovery of genetic variantsaffecting tamoxifen sensitivity and their clinical and functionalvalidation',Annals of Oncology.

Wilcoxon,Frank(1954),'Individual comparisons by ranking methods',Biometrics,1,80-83.

Wilkinson,Brandy L.,et al.(2012),'Ibuprofen attenuates oxidativedamage through NOX2 inhibition in Alzheimer’s Disease',Neurobiology of Aging,33(1),197.e21-97.e32.

Willshaw,A.,et al.(2004),'Identification of a novel protein complexcontaining annexin A4,rabphilin and synaptotagmin',FEBS Lett,559(1-3),13-21.

Wilson,Perrin M.,et al.(2010),'Astn2,ANovel Member of the AstrotactinGene Family,Regulates the Trafficking of ASTN1 during Glial-Guided NeuronalMigration',The Journal of Neuroscience,30(25),8529-40.

Winslow,A.R.,et al.(2010),'alpha-Synuclein impairs macroautophagy:implications for Parkinson's disease',J Cell Biol,190(6),1023-37.

Wittkowski,Knut M.(1988),'Friedman-type statistics and consistentmultiple comparisons for unbalanced designs',Journal of the AmericanStatistical Association,83,1163-70,87:258.

---(2008),'Statistical methods for hierarchical multivariate ordinaldata which are used for data base driven decision support',U.S.Patent 7,664,616(U.S.A.:The Rockefeller University).

---(2014),'Treatment and prevention of autism and autism spectrumdisorders',US 2016/0206581 A1(U.S.:Wittkowski,Knut M.).

Wittkowski,Knut M.,et al.(2013),'From single-SNP to wide-locus:genome-wide association studies identifying functionally related genes andintragenic regions in small sample studies',Pharmacogenomics,14(4),391-401.

Wittkowski,Knut M.,et al.(submitted),'Complex Polymorphisms inEndocytosis Genes Suggest alpha-Cyclodextrin against Metastases in BreastCancer',Appendix,10(2).

Wittkowski,Knut M.,et al.(2014),'Anovel computational biostatisticsapproach implies impaired dephosphorylation of growth factor receptors asassociated with severity of autism',Transl Psychiatry,4,e354.

Woolley,J.F.,Dzneladze,I.,and Salmena,L.(2015),'Phosphoinositidesignaling in cancer:INPP4B Akt(s)out',Trends Mol Med,21(9),530-2.

Yamaguchi,H.,et al.(2009),'Lipid rafts and caveolin-1 are requiredfor invadopodia formation and extracellular matrix degradation by humanbreast cancer cells',Cancer Res,69(22),8594-602.

Yamaguchi,R.,Perkins,G.,and Hirota,K.(2015),'Targeting cholesterolwith beta-cyclodextrin sensitizes cancer cells for apoptosis',FEBS Lett,589(24 Pt B),4097-105.

Yamashita,T.,et al.(2015),'Outer Hair Cell Lateral Wall StructureConstrains the Mobility of Plasma Membrane Proteins',PLoS Genet,11(9),e1005500.

Yang,L.,et al.(2008),'Attenuation of MPTP neurotoxicity by rolipram,aspecific inhibitor of phosphodiesterase IV',Exp Neurol,211(1),311-4.

Yang,Y.,et al.(2013),'Elevated expression of syntenin in breastcancer is correlated with lymph node metastasis and poor patient survival',Breast Cancer Res,15(3),R50.

Yao,H.,et al.(2016),'The role of annexin A4 in cancer',Front Biosci(Landmark Ed),21,949-57.

Yao,J.,et al.(2006),'An essential role for beta-actinmRNAlocalization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance',NatNeurosci,9(10),1265-73.

Yao,J.,et al.(2010),'MicroRNA-related cofilin abnormality inAlzheimer's disease',PLoS One,5(12),e15546.

Yao,Jiaqi,et al.(2012),'Neuroprotection by cyclodextrin in cell andmouse models of Alzheimer disease',The Journal of Experimental Medicine,209(13),2501-13.

Yokoo,M.,et al.(2015),'2-Hydroxypropyl-beta-Cyclodextrin Acts as aNovel Anticancer Agent',Plos One,10(11),e0141946.

Yoshitomi,H.,et al.(1987),'Effect of triglyceride on small intestinalabsorption of cefoxitin in rats',J Pharm Pharmacol,39(11),887-91.

Yu,Panpan,et al.(2015),'Cooperative interactions of LPPR familymembers in membrane localization and alteration of cellular morphology',Journal of Cell Science,128(17),3210-22.

Zhang,Hong-Yan,et al.(2013),'PTEN mutation,methylation and expressionin breast cancer patients',Oncology Letters,6(1),161-68.

Zhang,Q.,et al.(2006),'Metastatic potential of mouse Lewis lungcancer cells is regulated via ganglioside GM1 by modulating the matrixmetalloprotease-9 localization in lipid rafts',J Biol Chem,281(26),18145-55.

Zhang,Q.Y.,et al.(2015),'The Role of Retromer in Alzheimer'sDisease',Molecular Neurobiology.

Zhang,Yi,et al.(2014),'Endothelial PINK1 Mediates the ProtectiveEffects of NLRP3 Deficiency during Lethal Oxidant Injury',The Journal ofImmunology,192(11),5296-304.

Zhao,W.,et al.(2016),'Candidate Antimetastasis Drugs Suppress theMetastatic Capacity of Breast Cancer Cells by Reducing Membrane Fluidity',Cancer Res,76(7),2037-49.

Zhiyu,W.,et al.(2016),'The inflammasome:an emerging therapeuticoncotarget for cancer prevention',Oncotarget,7(31),50766.

Zhu,X.C.,et al.(2016),'Association of Parkinson's Disease GWAS-LinkedLoci with Alzheimer's Disease in Han Chinese',Molecular Neurobiology.

Zhu,Xianjun,et al.(2012),'Mutations in a P-Type ATPase Gene CauseAxonal Degeneration',PLOS Genetics,8(8),e1002853.

Zimmer,S.,et al.(2016),'Cyclodextrin promotes atherosclerosisregression via macrophage reprogramming',Sci Transl Med,8(333),333ra50.