阅读说明：本技术 复合材料及其制备方法和用途 (Composite material, preparation method and application thereof ) 是由 杨佼佼 李继遥 侯嫒琳 何利邦 梁坤能 于 2020-07-07 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种复合材料及其制备方法和用途,复合材料包括：内核,包含玉米蛋白和单宁酸的复合物；和外壳,包含分别接枝到玉米蛋白和单宁酸的复合物上的亲水聚氨基酸和疏水聚氨基酸,亲水聚氨基酸含有亲水链段,疏水聚氨基酸含有疏水链段。本发明能够与脱矿牙本质和脱矿牙釉质有很好的结合,并促进牙体硬组织再矿化。(The invention provides a composite material and a preparation method and application thereof, wherein the composite material comprises the following components in parts by weight: an inner core comprising a complex of zein and tannic acid; and a shell comprising a hydrophilic polyamino acid and a hydrophobic polyamino acid grafted to a complex of zein and tannic acid, respectively, the hydrophilic polyamino acid comprising a hydrophilic segment and the hydrophobic polyamino acid comprising a hydrophobic segment. The invention can be well combined with demineralized dentin and demineralized enamel and promote the remineralization of hard tissues of teeth.)

复合材料及其制备方法和用途

技术领域

本发明材料技术领域，更具体地，涉及一种用于修复牙体硬组织的复合材料、复合材料的制备方法和用途。

背景技术

口腔健康是衡量居民身心健康的重要标志之一，口腔组织中的牙体硬组织是人类身体最坚硬的部分，其特点表现为高度矿化、低有机基质含量和缺乏/极少含量的可分化活性细胞，因此成熟牙体硬组织受损之后难以自修复。然而，因机械磨损、细菌或酸性饮品等原因导致的牙体硬组织受损非常普遍。以儿童龋齿为例，2018年公布的第四次全国口腔流行病学调查显示：5岁儿童的乳牙龋患率和12岁儿童恒牙龋患率分别为70.9％和34.5％，相较十年前分别上升了5.8％和7.8％，然而5岁组和12岁组分别仅有4.1％和16.5％的龋齿得到了有效治疗。因此，探索方便高效的牙体硬组织修复材料，具有重要的社会意义和广泛的应用前景。

牙体硬组织修复材料的设计需要同时考虑口腔中的物理环境、化学环境和微生物环境。物理环境主要指牙体硬组织长时间受到咀嚼的摩擦和压迫、唾液的冲刷和浸泡以及时有发生的外力冲击等；化学环境主要指因进食、口腔疾病等因素导致的口腔环境pH变化、材料植入后的内电流影响等；微生物环境则主要指当环境中的某些因素(如抗生素的长期使用)干扰到机体和正常菌落之间的平衡时，会导致固有生态群落失调，进而为菌落提供危害机体的机会，同时口腔作为一种半开放环境，外来致病菌侵袭的风险也不容忽视。这些均对口腔生物材料提出了诸如高力学性、化学惰性、生物稳定性等多种特殊要求。与此同时，虽然不同类型的人工修复材料包括树脂、金属、陶瓷以及复合材料已经被广泛应用于临床，但这些材料易被口腔细菌侵蚀且难以匹配周围原生牙体硬组织的性能，使得现行的治疗手段在一定程度上存在患者适应性低、治疗长效性差和二次龋齿等问题。

发明内容

示例性实施例提供了一种能够与脱矿牙本质和脱矿牙釉质有很好的结合，并促进牙体硬组织再矿化的复合材料。

本发明的一方面提供了一种复合材料，复合材料包括：内核，包含玉米蛋白和单宁酸的复合物；和外壳，包含分别接枝到玉米蛋白和单宁酸的复合物上的亲水聚氨基酸和疏水聚氨基酸，亲水聚氨基酸含有亲水链段，疏水聚氨基酸含有疏水链段。

可选地，亲水链段和疏水链段可以含有羧基和/或磷酸根。

可选地，亲水链段可以为聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚丙烯酸，疏水链段可以为聚丙氨酸、聚乳酸。

可选地，玉米蛋白和单宁酸的复合物可以为纳米粒子。

可选地，玉米蛋白和单宁酸的复合物内可以装载有药物，亲水聚氨基酸的亲水链段上可以引入有功能基团，功能基团可以为半乳糖或葡萄糖。

本发明的另一方面提供了一种如上所述的复合材料用作牙体硬组织修复材料的用途。

本发明的又一方面提供了一种复合材料的制备方法，制备方法包括：获取聚氨基酸溶液，聚氨基酸溶液包含亲水聚氨基酸和疏水聚氨基酸，亲水聚氨基酸含有亲水链段，疏水聚氨基酸含有疏水链段；获取玉米蛋白和单宁酸的复合物；将亲水聚氨基酸和疏水聚氨基酸接枝到玉米蛋白和单宁酸的复合物，形成复合材料。

可选地，获取玉米蛋白和单宁酸的复合物的步骤可以包括：将玉米蛋白溶解于第一混合溶剂中，得到第一溶液，第一混合溶剂包括水和液态醇；向第一溶液中加入单宁酸，调节pH至3～10，搅拌，得到第二溶液；将第二溶液快速加入搅拌的水中，搅拌，得到ZP溶液。

可选地，获取聚氨基酸溶液的步骤可以包括：将聚天冬氨酸和聚丙氨酸溶解于第二混合溶剂中，充分搅拌，得到聚氨基酸溶液，第二混合溶剂包括水和液态醇。

可选地，接枝步骤可以包括：将所述ZP溶液加入聚氨基酸溶液，充分搅拌后冻干，获得复合材料。

可选地，方法还可以包括：将药物装载于玉米蛋白和单宁酸的复合物内；向复合材料的聚氨基酸的亲水链段引入不同的功能基团，功能基团可以为半乳糖或葡萄糖。

本发明的再一方面提供了一种如上所述的复合材料用于制造修复牙齿的牙科修复物的用途，其包括：将复合材料置于口腔中；复合材料粘附在牙体硬组织上，并诱导唾液中的钙磷离子沉积形成牙科修复物。

与现有技术相比，本发明制备的复合材料可以对牙体硬组织静电吸附-疏水性聚集-自适应粘附，实现对牙体硬组织的强界面相互作用、抗菌和高效诱导受损牙体硬组织再生。

附图说明

附图示出了发明构思的示例性实施例，并与说明一起用于解释发明构思的原理，附图被包括以提供对发明构思的进一步的理解，并且附图并入该说明书中并组成该说明书的一部分。

图1是轻型链球菌吸附于牙体硬组织表面并诱导牙结石形成的示意图。

图2是图1中的轻型链球菌的示意图。

图3是示出根据发明的示例性实施例的复合材料的示意图。

附图标记：

1-内核，2-亲水长菌毛，3-疏水短菌毛，4-毒素，100-玉米蛋白和单宁酸的复合物，200-亲水聚氨基酸，300-疏水聚氨基酸。

具体实施方式

理想的牙体硬组织修复材料面临着一个关键科学问题：如何在口腔的复杂环境尤其是细菌环境中，实现材料与原有牙体硬组织的有效界面相互作用，最终重建并长效保持牙体硬组织结构。

牙体硬组织的形成是一个生物矿化过程，受到生物体内有机成分的调控。这些有机成分主要包括疏水性大分子和酸性大分子两部分。其中，疏水性大分子如胶原蛋白分子通过自组装等方式形成疏水基质，从而作为矿化的基本结构框架，而固载于疏水基质上的酸性大分子则吸引溶液中的矿物离子向有机基质聚集，并最终依靠有机基质的结构、电荷和立体化学匹配等方式诱导矿物晶体成核及生长。例如，牙本质基质磷蛋白1通过蛋白质酸性残基吸引钙离子，β折叠构型诱导羟基磷灰石定向生长；牙釉原蛋白组装而成微米级带状体可以通过空间限制控制羟基磷灰石晶体的成核和生长。生物矿化形成的生物矿物在正常环境中始终处于溶解和再结晶的动态平衡，即脱矿与再矿化的动态平衡。这种由再矿化作用形成的新组织的成分、结构和性能与原生矿物组织完全相同。因此，促进牙体硬组织再矿化成为了一条修复受损牙体硬组织的可行途径。

传统的促牙体硬组织再矿化手段是向受损牙体硬组织的表面加钙、磷和氟源，随后高浓度的钙、磷和氟会形成氟磷灰石沉积到硬组织表面以修复受损部位。然而，该方法获得新生牙体硬组织与原生牙体硬组织的界面不能完全匹配，晶体结构也有差异，在后续的口腔细菌环境中不能保持长效性。

根据本发明，拟设计了一种新的材料，以仿生手段同时提供强界面结合力，实现持久的抗菌能力，达到快速促进牙体硬组织受损部位再矿化效果。

牙结石是矿化的牙菌斑生物膜，其特点是形成快、粘得牢、保持时间长，主要成分为羟基磷灰石。对牙结石形成过程的研究发现：与牙体硬组织受损之后不能自我修复不同，牙结石在12至15小时内即可生成；牙结石与牙体硬组织之间具有很高的粘附力，甚至不能被冲洗或牙刷去除；如果不利用特殊手段如洁牙处理，牙结石能够长时间存留在牙体硬组织表面。尽管牙结石的形成机制尚不明确，但细菌已经被公认在其中扮演了重要角色。有研究表面，细菌(包括轻型链球菌、变异链球菌、血链球菌、唾液链球菌等)首先通过电荷、极性和立体效应等作用粘附在牙体表面自然生成的唾液获得性膜，或直接粘附在牙体表面上，形成牙菌斑；随后，牙菌斑引导羟基磷灰石快速形成和生长形成矿化生物膜即牙结石；在这个过程中，细菌释放出毒素进一步破坏牙体结构。

对牙结石相关细菌的研究中发现，细菌与牙面的结合是形成牙结石的关键，而轻型链球菌(Streptococcus mitis)与牙体硬组织之间有着很高的界面结合力。如图2中所示，剖析轻型链球菌的结构，其尺寸为600到800纳米，由一个球型或椭球型内核1和长短不一的菌毛组成。亲水长菌毛2一般长于150纳米，富含有鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰半乳糖等功能基团；疏水短菌毛3的长度一般在50～80纳米，富含大量疏水性的连接素蛋白；而内核1由细胞壁、细胞膜等为支撑结构。探究轻型链球菌对牙体硬组织的吸附，尽管该过程尚未被完全认识，但可以被简化为三步。研究认为：初期，唾液中的钙(Ca²⁺)通过钙桥作用连接了长菌毛上的糖功能基团和唾液获得性膜上的羧基(-COO-)或磺酸基(-SO₃ ^2-)，或是长菌毛的糖功能基团直接与牙体硬组织的钙结合，从而吸引细菌靠近牙体硬组织，随后，短菌毛利用其疏水性与牙体硬组织强结合，排除牙体与细菌间的水分，图1(a)和(b)示出了菌毛结合牙体；最后，细菌依靠自身的柔软度，自适应地粘附在牙体硬组织上，图1(c)示出了菌毛粘附牙体。之后，轻型链球菌与其它相关细菌一起形成牙菌斑，而牙菌斑利用自身化学基团和结构特性实现生物矿化，诱导唾液中的钙磷离子沉积形成牙结石，图1(d)示出了牙菌斑生物矿化形成牙结石。在此过程中细菌持续释放毒素，最终形成坚硬的细菌-羟基磷灰石复合物(如图1中所示)。

为解决现有修复材料在复杂口腔环境中与原生牙体硬组织的强界面结合力难以保持、促牙体硬组织再矿化能力不佳以及长效稳定性差等问题，申请人细致分析轻型链球菌强吸附于牙体硬组织表面的分子机制，以轻型链球菌为蓝本，设计与之结构相似的材料。

在分子设计中，细菌结构被简化成①由亲水性长菌毛舒展形成的细菌表层，②由疏水性短菌毛聚集形成细菌中间层，以及③由细胞壁、细胞膜支撑形成的细菌内核。

最终，基于具有良好生物相容性的玉米蛋白和单宁酸的复合物与聚氨基酸，合成制备一系列能与牙体硬组织表面特异性吸附的“人工细菌”，其以不同尺寸的玉米蛋白和单宁酸的复合物为核，以不同链长和不同链数目的聚天冬氨酸、聚丙氨酸为壳，并最终应用于牙体硬组织的原位修复。

图3是示出根据发明的示例性实施例的合成具有类似轻型链球菌功能基团和结构的复合材料的示意图。参照图3，根据本发明示例性实施例的复合材料，包括：内核，包含玉米蛋白和单宁酸的复合物100；外壳，包含分别接枝到玉米蛋白和单宁酸的复合物1的上的亲水聚氨基酸200和疏水聚氨基酸300，疏水聚氨基酸含有疏水链段，亲水聚氨基酸含有亲水链段。

其中，聚氨基酸(Poly(α-amino acid),PαAA)是一类由α-氨基酸直接聚合而成的有序链状多肽。除了具有多肽的优点(多肽是由氨基酸以酰胺键组成的短链，具有与天然蛋白质相同的骨架结构和侧链基团。此外，多肽具备广泛的来源性、良好生物相容性和生物降解性，因此多肽是一种优良的天然蛋白模拟物)之外，聚氨基酸合成简单，结构可控，成本低廉，具有广阔的应用前景。选择不同亲/疏水性的氨基酸单体可以调节聚氨基酸的亲疏水性；选择不同侧链化学结构的氨基酸单体或者利用化学方法修饰聚氨基酸侧链可以获得不同侧链基团的聚氨基酸。同时，聚氨基酸的链长也可以通过投料比、温度、溶剂等方法调节。因此，特定的聚氨基酸结构(如聚天冬氨酸和聚丙氨酸)可以作为天然有机基质的模拟物吸引矿物离子富集，实现仿生矿化。由此可知，聚氨基酸可以作为细菌菌毛的模拟物。

玉米蛋白和单宁酸的复合物为玉米蛋白/单宁酸纳米粒子，可以引导仿生矿化或作为药物的载体，作为仿生矿化的成核位点和模板，同时作为药物释放的源头。因此，玉米蛋白和单宁酸的复合物是一种合适的细菌内核的模拟物。

基于轻型链球菌的结构和功能特性，申请人首次提出一种新的牙体硬组织修复材料的设计思路：通过材料模拟轻型链球菌的“内核-疏水短菌毛-亲水长菌毛”结构，重现牙结石生成过程，从而实现快速高效的牙体硬组织修复。

根据本发明示例性实施例，聚氨基酸包括亲水聚氨基酸和疏水聚氨基酸。亲水聚氨基酸含有亲水链段，疏水聚氨基酸含有疏水链段。亲水链段含有羧基和/或磷酸根。羧基和磷酸根是为了引导钙磷离子沉积再矿化，同时也和也面的钙形成静电相互作用从而加强吸附。亲水链段可以为聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚丙烯酸。疏水链段含有含有羧基或/和磷酸根，疏水链段可以为聚丙氨酸、聚乳酸。

作为一种可选的实施方式，为适应口腔的细菌环境，借鉴细菌释放毒素和玉米蛋白/单宁酸纳米粒子可作为药物载体的思路，玉米蛋白/单宁酸纳米粒子内可以装载有药物(例如，三氯生抗菌药物等)，实现药物的长效释放，从而不断优化材料对牙体硬组织的原位吸附/修复/抗菌效果。

作为一种可选的实施方式，针对不同的应用要求，亲水聚氨基酸的亲水链段上引入有各种功能基团，例如，半乳糖、葡萄糖等。

根据本发明的另一方面，提供了一种上述复合材料的制备方法，包括：

(1)获取玉米蛋白和单宁酸的复合物。

将玉米蛋白溶解于第一混合溶剂中，搅拌10min～10h，以使玉米蛋白充分溶解于第一混合溶剂，然后在0～25℃放置6h～20h，得到第一溶液。其中，在0～25℃放置一段时间是为了保存且使得复合物的结构充分舒展，优选地，在2～10℃放置10～15h，进一步优选地，在3～6℃放置11～13h。第一混合溶剂包括体积比为10：90～90：10的水和乙醇。但本发明不限于此，第一混合溶剂也可以是水以及诸如甲醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇等的液态醇的混合溶剂。水和乙醇的配比在上述范围内可以使得水和乙醇充分溶解。优选地，第二混合溶剂包括体积比为30：10～70：50的水和乙醇。进一步优选地，第二混合溶剂包括体积比为70：10～70：40的水和乙醇。

向第一溶液中加入单宁酸，调节pH值至3～10，20～70℃搅拌5min～5h，得到第二溶液。将pH值调节至上述范围内可以有利于溶解单宁酸并且且后续实现材料制备，优选地，调节pH值至5～8，进一步优选地，调节pH值至6～7。在20～70℃搅拌5min～5h搅拌是为了实现第一溶液和单宁酸充分溶解且均匀。优选地，在40～55℃搅拌30min～2h。

然后，将第二溶液快速加入搅拌的水中，搅拌20s～2h，得到ZP(Zein particles，玉米蛋白纳米粒子)溶液。其中，搅拌的水的搅拌速度(转速)可以为100～5000rpm，搅拌时间控制为20s～2h，可以获得均匀的纳米粒子。优选地，搅拌的水的搅拌速度可以为500～3000rpm，搅拌时间控制为5min～1h。进一步优选地，搅拌的水的搅拌速度可以为800～1500rpm，搅拌时间控制为10min～30min。

(2)获取聚氨基酸溶液，聚氨基酸溶液包含亲水聚氨基酸和疏水聚氨基酸，亲水聚氨基酸含有亲水链段，疏水聚氨基酸含有疏水链段。具体可以包括：

将聚天冬氨酸和聚丙氨酸溶解于第二混合溶剂中，充分搅拌，得到聚氨基酸溶液。其中，第二混合溶剂包括10：90～90：10的水和乙醇。但本发明不限于此，类似于第一混合溶剂，第二混合溶剂也可以是水与诸如甲醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇等液态醇的混合溶剂。水和液态醇的配比在上述范围内可以使得水和液态醇充分溶解。优选地，第二混合溶剂包括体积比为30：10～70：50的水和乙醇。进一步优选地，第二混合溶剂包括体积比为70：10～70：40的水和乙醇。

(3)将亲水聚氨基酸和疏水聚氨基酸接枝到玉米蛋白和单宁酸的复合物，形成具有核壳结构的复合材料。具体地：

将ZP溶液加入聚氨基酸溶液，充分搅拌后冻干，获得细菌结构模拟物，即，聚天冬氨酸长链和聚丙氨酸短链接枝玉米蛋白/单宁酸纳米粒子的复合材料。

作为一种可选的实施方式，还可以将抗菌药物装载于玉米蛋白/单宁酸纳米粒子内，以实现药物的长效释放，从而不断优化材料对牙体硬组织的原位吸附/修复/抗菌效果。优选地，在将亲水聚氨基酸和疏水聚氨基酸接枝到玉米蛋白/单宁酸纳米粒子之后，再将抗菌药物装载于玉米蛋白/单宁酸纳米粒子内。如果在接枝步骤之前先载药，再和复合材料连接，那么在连接过程中，会有药物渗漏。

向“人工细菌”中装载药物(以三氯生为例)的步骤如下：将准确称量的三氯生溶解于水中，再将溶液滴加到分散有“人工细菌”的水中震荡24h，离心取下层固体真空干燥可得载药的“人工细菌”，取上层液体用紫外测定三氯生浓度，可以计算被装载药物的量，进而计算载药量。载药量计算方法为：

作为一种可选的实施方式，为进一步模拟细菌亲水长菌毛对牙体硬组织的高吸附能力，可以向获得的材料聚氨基酸亲水链段引入不同的细菌功能基团，如半乳糖、葡萄糖等。以半乳糖为例，冰盐浴下，1当量的羧基(来自于步骤(3)中获得的复合材料)首先分散于THF中，随后依次加入1.2倍当量的EDCl、HOBt和一定当量的氨基(半乳糖)，常温过夜反应后，经水洗、离心、烘干得到产物。

在一个优选的示例性实施例中，本发明的复合材料的制备方法包括以下步骤：

1)制备细菌核结构的玉米蛋白/单宁酸纳米粒子。

(1)玉米蛋白溶解于体积比为70：30的乙醇/水混合溶剂中，搅拌2h后，在4℃条件下过夜；(2)向上述溶液中加入一定量的单宁酸，调节pH至7，55℃搅拌1h；(3)将步骤(2)得到的溶液快速加入搅拌(搅拌速度为1000rpm)的水中，搅拌20min，获得ZP溶液。

2)制备细菌结构模拟物—聚天冬氨酸长链、聚丙氨酸短链接枝玉米蛋白/单宁酸的复合材料。

(1)将聚天冬氨酸和聚丙氨酸溶解于体积比为70:30的乙醇/水混合溶剂中，充分搅拌聚氨基酸溶液，得到；(2)向步骤1)的步骤(3)获得的ZP溶液中加入上述聚氨基酸溶液，充分搅拌后冻干，获得细菌结构模拟物。

根据本发明的又一方面，上述复合材料用于制造修复牙齿的牙科修复物的用途，其包括：将复合材料置于口腔中；复合材料粘附在牙体硬组织上，并诱导唾液中的钙磷离子沉积形成牙科修复物。根据本发明的复合材料，可以与脱矿牙本质和脱矿牙釉质有很好的结合，并能利用其仿生矿化能力促进牙体硬组织再矿化。

根据本发明，受牙结石发生过程中菌斑生物膜的功能启发，通过分析与牙面具有强结合力的口腔细菌的结构特点，设计“人工细菌”——玉米蛋白/单宁酸纳米粒子接枝短链聚丙氨酸/聚天冬氨酸的复合材料，模拟细菌的纳米内核/疏水短菌毛/亲水长菌毛的结构，实现水下对牙面/唾液获得性膜的强吸附、生物矿化。该复合材料可以对牙体硬组织静电吸附-疏水性聚集-自适应粘附，实现对牙体硬组织的强界面相互作用、抗菌和高效诱导受损牙体硬组织再生。与此同时，变有害物质释放为药物释放，达到抗菌进而实现牙体新生组织的长效稳定。

虽然已经在这里描述了特定示例性实施例和实施方式，但是其它的实施例和修改将通过该描述而明显。因此，发明构思不限于这样的示例性实施例，而是限于所提出的权利要求以及各种明显修改和等同设置的更宽范围。