阅读说明：本技术 一种醇胺脂肪酸离子液体及其制备方法和应用 (Alcohol amine fatty acid ionic liquid and preparation method and application thereof ) 是由 张嘉恒 刘凌雯 费玉清 李志超 黎穗芝 陈正件 张基亮 余明远 于 2020-05-13 设计创作，主要内容包括：本发明属于天然产物提取技术领域,公开了一种醇胺脂肪酸离子液体,其结构通式如式(Ⅰ)：<Image he="303" wi="689" file="DDA0002489629290000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>其中X<Sup>n-</Sup>为脂肪酸脱去质子以后形成的阴离子,n＝1-3；R<Sub>1</Sub>、R<Sub>2</Sub>、R<Sub>3</Sub>独立选自氢原子、烷基或ω-羟基烷基,且R<Sub>1</Sub>、R<Sub>2</Sub>、R<Sub>3</Sub>中至少有一个为ω-羟基烷基；烷基选自甲基、乙基、丙基或丁基中的任意一种；ω-羟基烷基选自羟甲基、羟乙基或羟丙基中的任意一种。将该醇胺脂肪酸离子液体用于萃取细菌溶胞物,特别是乳酸菌溶胞物,不仅萃取效率高,而且无毒性。(The invention belongs to the technical field of natural product extraction, and discloses an alcohol amine fatty acid ionic liquid, which has a structural general formula as shown in formula (I): wherein X n‑ Is an anion formed after deprotonation of a fatty acid, n-1-3; r 1 、R 2 、R 3 Independently selected from hydrogen atom, alkyl or omega-hydroxyalkyl, and R 1 、R 2 、R 3 At least one of which is omega-hydroxyalkyl; the alkyl is selected from any one of methyl, ethyl, propyl or butyl; the omega-hydroxyalkyl is selected from any one of hydroxymethyl, hydroxyethyl or hydroxypropyl. The alcohol amine fatty acid ionic liquid is used for extracting bacteria lysate, particularly lactobacillus lysate, and has high extraction efficiency and no toxicity.)

一种醇胺脂肪酸离子液体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于天然产物提取技术领域，特别涉及一种醇胺脂肪酸离子液体及其制备方法和应用。

背景技术

乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称，在自然界分布极为广泛，具有丰厚的物种多样性。乳酸菌溶胞物包含菌体细胞裂解物、细胞质成分、细胞壁成分以及多种细胞器片段，这些乳酸菌溶胞物含有的多种活性成分有肽聚糖、磷壁酸、蛋白质、磷脂、甾醇、各种酶类、核苷酸、胞外多糖、维他命、矿物质、有机物(醇，酚，不饱和脂肪酸)、氨基酸和多肽等，为肌肤提供丰富营养的同时可以捕捉自由基，抑制脂质的过氧化，达到良好的抗衰老效果，亦能增进上皮细胞新陈代谢的速度，促使肌肤更新，抑制黑色素酶的活性，可以作为天然美白剂。

然而，现有技术中，细菌裂解物(即细菌溶胞物)主要通过水和磷酸盐缓冲液(PBS)进行萃取，但是有效成分收率较低，其他有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇等毒性较大且后续分离过程容易造成试剂残留。因此，开发新型的绿色、高效溶胞物有效成分萃取物质非常重要。

因此，希望提供一种新的萃取细菌裂解物的溶剂，萃取的有效成分收率高，且无毒性，是十分有必要的。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种醇胺脂肪酸离子液体，所述醇胺脂肪酸离子液体制备过程简单，特别是制备所需温度低，时间短，用所述醇胺脂肪酸离子液体萃取细菌裂解物(即细菌溶胞物)，特别是萃取乳酸菌的溶胞物，不仅萃取效率高，而且无毒性。

一种醇胺脂肪酸离子液体，其结构通式如式(Ⅰ)：

其中X^n-为脂肪酸脱去质子以后形成的阴离子，n＝1-3；R₁、R₂、R₃独立选自氢原子、烷基或ω-羟基烷基，且R₁、R₂、R₃中至少有一个为ω-羟基烷基；所述烷基选自甲基、乙基、丙基或丁基中的任意一种；所述ω-羟基烷基选自羟甲基、羟乙基或羟丙基中的任意一种。

优选的，所述脂肪酸的碳数为3-10之间的任意正整数；进一步优选的，所述脂肪酸的碳数为3-8之间的任意正整数。

优选的，所述脂肪酸选自丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、辛二酸、庚二酸、柠檬酸、马来酸或富马酸中的至少一种。

一种醇胺脂肪酸离子液体的制备方法，包括以下步骤：

将醇胺与溶剂搅拌混合，然后加入脂肪酸，在25-60℃下搅拌反应，去除溶剂，制得所述醇胺脂肪酸离子液体。

优选的，所述醇胺选自三乙醇胺、二乙醇胺或乙醇胺中的至少一种；进一步优选的，所述醇胺为三乙醇胺。

优选的，所述溶剂选自水、乙醇、甲醇、丙酮或异丙醇中的至少一种。

优选的，所述醇胺与溶剂的体积比为1:(1-8)；进一步优选的，所述醇胺与溶剂的体积比为1:(1-5)；更进一步优选的，所述醇胺与溶剂的体积比为1:(1-3)。

优选的，所述醇胺与脂肪酸的摩尔比为1:(0.3-1.2)；进一步优选的，所述醇胺与脂肪酸的摩尔比为1:(0.5-1)。

优选的，所述脂肪酸先与溶剂混合配成脂肪酸溶液，然后滴加到醇胺与溶剂搅拌混合所形成的混合物中。

优选的，所述搅拌反应的温度为25-60℃；进一步优选的，所述搅拌反应的温度为25-40℃。

优选的，所述搅拌反应的时间为1-5小时；进一步优选的，所述搅拌的时间为2-4小时。

优选的，所述去除溶剂是在负压下去除溶剂；所述负压是指比大气压小0.04-0.09Mpa；进一步优选的，所述负压是指比大气压小0.07-0.08Mpa。

所述醇胺脂肪酸离子液体在萃取细菌溶胞物中的应用。

优选的，所述细菌溶胞物为乳酸菌溶胞物。

一种乳酸菌溶胞物的萃取方法，包括以下步骤：

取乳酸菌种子液接种至乳酸菌培养基中培养，然后离心，取菌体，用所述醇胺脂肪酸离子液体悬浮菌体、超声破碎、离心过滤，取滤液，制得乳酸菌溶胞物。

优选的，所述乳酸菌包括乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属、双歧杆菌属或汁球菌属中的至少一种。

优选的，所述乳酸菌种子液为从冷冻(-80至0℃)条件下取出的乳酸菌复苏的第2至第3代的乳酸菌种子液。

优选的，所述乳酸菌种子液与乳酸菌培养基的体积比为(1-10):100。

优选的，所述培养的温度为25-40℃。

优选的，所述培养的时间超过24小时，例如培养24-72小时。

优选的，所述离心的转速3000-10000转/分钟。

优选的，所述离心的时间为10-30分钟。

优选的，用所述醇胺脂肪酸离子液体悬浮菌体的温度为4-40℃，悬浮的时间为5-50分钟。

优选的，所述菌体与所述醇胺脂肪酸离子液体的质量比为(0.05-0.5)：1；进一步优选的，所述菌体与所述醇胺脂肪酸离子液体的质量比为(0.1-0.3)：1。

优选的，所述醇胺脂肪酸离子液体悬浮菌体的过程中，先用水与所述醇胺脂肪酸离子液体混合，然后悬浮菌体，具有更好的传质传热效果；进一步优选的，水占所述醇胺脂肪酸离子液体和水的混合物的重量百分率为10-40％。

优选的，所述超声破碎的温度为4-40℃。

优选的，所述超声破碎的超声功率为100-600w。

优选的，所述超声破碎的时间为20-60分钟。

进一步优选的，所述超声破碎过程中每超声破碎8-12秒，然后停止超声破碎8-12秒，再接着超声破碎8-12秒，总共耗时20-60分钟。

三乙醇胺、二乙醇胺、乙醇胺具弱碱性，在护肤品中常用作pH调节剂或保湿作用的中和剂、非离子表面活性剂、乳化剂或润滑剂等。除了三乙醇胺之外，还有脂肪酸、乳酸、氢氧化钾、氢氧化钠等也会用来调整护肤品pH值。与其他胺类化合物相似，由于三乙醇胺的氮原子上存在孤对电子，呈碱性，能够与无机酸或有机酸反应生成离子液体(盐)，更加接近皮肤的弱酸性环境，从而达到更加安全增稠和滋润保湿的作用。作为一种新型的绿色溶剂，醇胺脂肪酸离子液体的前驱体原料(例如醇胺、脂肪酸)容易获得，合成成本远低于其他生物碱有机酸配对合成的离子液体，易于工业化生产，在天然产物萃取中有很重要的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

(1)所述醇胺脂肪酸离子液体制备过程简单，特别是制备所需温度低，时间短，低温制备醇胺脂肪酸离子液体可以很好的保持醇胺脂肪酸离子液体的活性，有助于提高萃取细菌溶胞物的效率。

(2)现有技术中使用水或PBS缓冲液萃取细菌溶胞物的收率低，传统有毒溶剂提取细菌溶胞物时存在残留、污染大的问题。但本发明制得的醇胺脂肪酸离子液体萃取细菌溶胞物，特别是萃取乳酸菌溶胞物，不仅萃取效率高，而且无毒性。

(3)本发明中利用所述醇胺脂肪酸离子液体和超声破碎可协同提升萃取细菌溶胞物的效率，使得萃取得到的细菌溶胞物的活性成分含量高。

附图说明

图1为实施例6制得的植物乳杆菌溶胞物的HPLC图谱；

图2为对比例1制得的植物乳杆菌溶胞物的HPLC图谱；

图3为对比例2制得的植物乳杆菌溶胞物的HPLC图谱。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实施例1：三乙醇胺脂肪酸离子液体的制备

一种三乙醇胺脂肪酸离子液体的制备方法，包括以下步骤：

将0.1mol三乙醇胺与水搅拌混合(水的体积是三乙醇胺的体积的2倍)，获得三乙醇胺溶液，然后加入0.1mol柠檬酸与水搅拌混合(水的体积是三乙醇胺的体积的1倍)，获得柠檬酸溶液，再将柠檬酸溶液滴加到三乙醇胺溶液中，在25℃下搅拌反应2小时，在负压0.08Mpa去除水，制得无色透明的三乙醇胺脂肪酸离子液体，该三乙醇胺脂肪酸离子液体的结构式如式(Ⅱ)：

实施例2：三乙醇胺脂肪酸离子液体的制备

与实施例1相比，实施例2中用0.05mol的丁二酸替代实施例1中的0.1mol柠檬酸，其他制备方法与实施例1相同。实施例2制得的三乙醇胺脂肪酸离子液体的结构式如式(Ⅲ)：

实施例3：三乙醇胺脂肪酸离子液体的制备

与实施例1相比，实施例3中用0.08mol的丙酸替代实施例1中的0.1mol柠檬酸，在40℃下搅拌反应3小时，其他制备方法与实施例1相同。实施例3制得的三乙醇胺脂肪酸离子液体的结构式如式(Ⅳ)：

实施例4：三乙醇胺脂肪酸离子液体的制备

与实施例1相比，实施例4中用0.09mol的己二酸替代实施例1中的0.1mol柠檬酸，在30℃下搅拌反应2.5小时，其他制备方法与实施例1相同。实施例4制得的三乙醇胺脂肪酸离子液体的结构式如式(Ⅴ)：

实施例5：三乙醇胺脂肪酸离子液体的制备

与实施例1相比，实施例5中用乙醇替代实施例1中的水，其他制备过程与实施例1相同。

实施例6：植物乳杆菌溶胞物的萃取

一种植物乳杆菌溶胞物的萃取方法，包括以下步骤：

取植物乳杆菌复苏至第3代，在37℃下的乳酸菌培养基中培养至对数期后，获得乳酸菌种子液，将乳酸菌种子液按照乳酸菌培养基体积的3％进行接种，在37℃下培养72小时，然后在5000转/分钟的转速下离心10分钟，取植物乳杆菌菌体；将实施例1制得的醇胺脂肪酸离子液体与水进行混合(水占醇胺脂肪酸离子液体和水的混合物的重量百分率为30％)，获得实施例1制得的醇胺脂肪酸离子液体的稀释液，取100g实施例1制得的醇胺脂肪酸离子液体的稀释液与20g的植物乳杆菌菌体混合悬浮，在冰浴4℃的环境下超声破碎30分钟，超声破碎的超声功率为200w(超声破碎过程中每超声破碎10秒，然后停止超声破碎10秒，再接着超声破碎10秒，时间总计为30分钟)，离心过滤，取滤液，制得植物乳杆菌溶胞物。

实施例7：植物乳杆菌溶胞物的萃取

与实施例6相比，实施例7中用实施例2制得的醇胺脂肪酸离子液体，其他制备方法与实施例6相同。

对比例1：植物乳杆菌溶胞物的萃取

与实施例6相比，对比例1中用水替代实施例6中的实施例1制得的醇胺脂肪酸离子液体，其他制备方法与实施例6相同。

对比例2：植物乳杆菌溶胞物的萃取

与实施例6相比，对比例2中用PBS缓冲液(pH＝6.8)替代实施例6中的实施例1制得的醇胺脂肪酸离子液体，其他制备方法与实施例6相同。

产品效果测试

1.不同含水量(wt％，即重量百分率)的实施例1制得的三乙醇胺离子液体的25℃下粘度值如表1所示。

表1：

从表1可以看出，实施例1制得的三乙醇胺离子液体粘度相对大(含水量为0的时候粘度达29771mPa.s)，具有强的分子间相互作用力，包括范德华力，氢键，离子间的库伦相互作用力等，极性较大，所以在萃取大极性的活性分子方面更具优势，但含水量低的时候粘度太大不利于传质；含水量太多的时候，离子作用力被稀释(含水量为50％的时候粘度降至19mPa.s)，故约30％含水量是较好的。

2.细胞毒性试验

将生长在对数期的人用生化表皮细胞用胰酶消化处理后，加入新鲜细胞培养液，配制成1x10⁵个/mL的浓度，接种100μL于96孔板中，置于二氧化碳培养箱(5％体积浓度的CO₂，37℃)培养24小时，待细胞贴壁后，弃去原培养液，分别加入100μL含不同浓度样品(不同浓度样品分别指10μg/mL的维生素C、280μg/mL的熊果苷、质量分数为千分之一的实施例6制得的植物乳杆菌溶胞物、等量水)的细胞培养液，继续于二氧化碳培养箱培养48小时，再加入10μL质量浓度为5g/L的MTT溶液(即3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐溶液)，孵育4小时后，弃去孔内液体，加150μL DMSO(二甲基亚砜)于摇床上低速上震荡5分钟；在酶标仪490nm波长下，测定吸光值，计算得到细胞的存活率，结果如表2所示。

表2：细胞存活率

从表2可以看出，本发明实施例6制得的植物乳杆菌溶胞物不仅不会抑制细胞的生长，还有促进细胞生长和存活的效果，可见实施例6制得的植物乳杆菌溶胞物是安全可靠的。

3.抗氧化效果

按常规DPPH自由基(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)清除率的测试方法，分别测试2mL的实施例6、对比例1和对比例2制得的植物乳杆菌溶胞物以及5μg/mL的维生素C的DPPH自由基清除率(DPPH自由基清除率越高表面抗氧化效果越好)，结果表3所示。

表3：抗氧化功效

从表3可以看出，本发明实施例6制得的植物乳杆菌溶胞物对DPPH自由基清除率明显高于对比例1-2制得的植物乳杆菌溶胞物对DPPH自由基清除率，说明用本发明实施例1制得的醇胺脂肪酸离子液体提取(或萃取)植物乳杆菌溶胞物活性成分的效率明显高于用水或PBS缓冲液提取植物乳杆菌溶胞物活性成分的效率(即在相同条件下，用本发明所述醇胺脂肪酸离子液体能提取或萃取更多的植物乳杆菌溶胞物活性成分)。

4.美白效果

取实施例6制得的植物乳杆菌溶胞物用水稀释至其质量浓度为1.5％、1.5‰、0.15‰，取对比例1和对比例2制得的植物乳杆菌溶胞物，再取42μg/mL的熊果苷、20μg/mL的熊果苷作为样品，采用常规方法测试这些样品对酪氨酸酶的抑制率，酪氨酸酶的抑制率越高，表明美白效果越好，结果如表4所示。

表4：美白功效

从表4可以看出，本发明实施例6制得的植物乳杆菌溶胞物对酪氨酸酶的抑制率明显高于对比例1-2制得的植物乳杆菌溶胞物对酪氨酸酶的抑制率。说明用本发明实施例1制得的醇胺脂肪酸离子液体提取(或萃取)植物乳杆菌溶胞物活性成分的效率明显高于用水或PBS缓冲液提取植物乳杆菌溶胞物活性成分的效率(即在相同条件下，用本发明所述醇胺脂肪酸离子液体能提取或萃取更多的植物乳杆菌溶胞物活性成分)。

5.萃取效果

取实施例6，对比例1-2制得的植物乳杆菌溶胞物，经微滤膜过滤处理以后，在LC-2040C型高效液相色谱(HPLC)上，采用C18色谱柱，在流速为1mL/分钟、CH₃OH/H₂O(体积比为65:35)为流动相中进行分离，于254nm下检测，结果如图1-3所示。

图1为实施例6制得的植物乳杆菌溶胞物的HPLC图谱；图2为对比例1制得的植物乳杆菌溶胞物的HPLC图谱；图3为对比例2制得的植物乳杆菌溶胞物的HPLC图谱(纵坐标Intensity表示强度，单位：mAU；横坐标Time表示时间，单位：分钟)。从图1-3中可以看出，实施例6制得的植物乳杆菌溶胞物经高效液相色谱分离，先出现强的峰，对比例1和对比例2制得的植物乳杆菌溶胞物经高效液相色谱分离，相对较晚出现较弱的峰。由此可见，实施例1制得的三乙醇胺脂肪酸离子液体相对于水和PBS缓冲液来说，在萃取植物乳杆菌溶胞物大极性的活性分子方面更具优势(C18色谱柱的特点是极性大的成分先出峰)。