阅读说明：本技术 从动物软骨中提取非变性ii型胶原蛋白的制备方法 (Preparation method for extracting non-denatured type II collagen from animal cartilage ) 是由 赵成军 李佳 于 2020-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种从动物软骨中提取非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)的制备方法,此工艺可以生产出对人体极为有用的生物营养素。该工艺包括以下步骤：浸泡—清洗—超声清洗—破碎—盐溶液浸泡—过滤—乙醇浸泡—过滤—真空干燥—涡旋粉碎—包装。利用本发明生产工艺提取的非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)的分子结构完整,能很好的保留营养成分的生物活性,脂肪含量低,胶原蛋白含量高,大分子粘多糖含量达20％以上,并含有钙、镁、磷等矿物质营养元素,所得产品无令人不悦的气味,利于消化、吸收和利用,具有良好的市场前景。(The present invention discloses a preparation method for extracting non-denatured type II collagen (composite bone collagen) from animal cartilage, and said process can produce biological nutrient which is very useful for human body. The process comprises the following steps: soaking, cleaning, ultrasonic cleaning, crushing, soaking in a salt solution, filtering, soaking in ethanol, filtering, vacuum drying, vortex crushing and packaging. The non-denatured type II collagen (composite ossein) extracted by the production process has complete molecular structure, can well retain the biological activity of nutrient components, has low fat content and high collagen content, has the macromolecular mucopolysaccharide content of more than 20 percent, contains mineral nutrient elements such as calcium, magnesium, phosphorus and the like, does not have unpleasant smell, is beneficial to digestion, absorption and utilization, and has good market prospect.)

从动物软骨中提取非变性II型胶原蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及一种从动物软骨组织中提取营养物质的制备方法，尤其是从哺乳动物、海洋和淡水鱼类软骨、禽类动物软骨中提取非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)的制备方法。

背景技术

胶原蛋白是皮肤、骨骼和关节等组织的重要组成部分，是多细胞动物的细胞外基质的主要成分。目前从哺乳动物中已经发现27种不同类型的胶原蛋白，其中三条相同的α链组成的非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)主要存在于软骨组织中和眼玻璃体中，因此非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)被视为软骨的一种结构功能性成分。

目前市面上销售的胶原蛋白多为经过过度水解后的胶原蛋白，其主要成分是氨基酸和多肽，分子量分布在200-20000道尔顿的范围内。这些多肽具有一定的保持皮肤水分、增加免疫力的功能，但是并不能预防和治疗骨质疏松、退行性关节炎、骨性关节炎、风湿性关节炎和类风湿性关节炎。

发明内容

本发明旨在提供一种从动物软骨中提取非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)的制备方法，利用本发明生产工艺生产的II型胶原蛋白(复合骨胶原)的结构完整，为非变性蛋白质，具有良好的市场前景。

非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)从动物软骨中提取，除了含有多肽成分，还含市售胶原蛋白粉不具有的大分子粘多糖成分，从而使该产品具有不同于一般胶原蛋白的特点与优越性。

本发明的制备方法如下：从动物软骨中提取非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)的制备方法，其特征是它依次包括以下步骤：

1)浸泡：将动物软骨放入水中浸泡1～4小时；

2)清洗：将步骤1)所得软骨入罐，加水搅拌清洗，除去血水和杂质；

3)超声清洗：将步骤2)所得干净软骨入超声清洗池，按重量比1：1.5的比例加入纯化水进行超声清洗，清洗时间为0.5～1小时，收集洁净软骨；

4)破碎：将步骤3)所得洁净软骨经-20℃～-1℃冷冻后用破碎机切成长度小于1cm的软骨粒；

5)盐溶液浸泡：将步骤4)所得软骨粒与盐溶液按1∶0.1～9的比例(w/w)浸泡处理，浸泡时间为0.5～4小时；

6)过滤：将步骤5)所得溶液进行过滤，除去液体，保留过滤所得固形物；

7)乙醇浸泡：将步骤6)所得固形物中加入乙醇，固形物与乙醇按1∶0.1～30的比例(w/w)投料进行搅拌和浸泡处理，浸泡时间为0.5～4小时，重复2～3次；

8)过滤：待步骤7)完成后，除去乙醇，保留过滤所得固形物；

9)真空干燥：将步骤8)所得固形物入低温真空干燥器，干燥至产品中水分含量小于10％(重量比)；

10)涡流粉碎：将步骤9)所得干燥固形物投入到涡流粉碎机中进行粉碎，得到目数大于50目的产品；

11)包装：将步骤10)所得产品过筛、密封包装。

所述的动物软骨以新鲜软骨为佳。

本发明还提供通过本发明的提取方法获得的非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)。

利用本发明的上述制备方法，取用原料的软骨为哺乳动物、海洋和淡水鱼类软骨、禽类(例如鸡)软骨，盐溶液处理步骤、低温破碎和真空干燥步骤需要确定盐溶液的浓度不超过35wt％(优选1wt％～25wt％)、粉碎和干燥的温度不超过50℃，以保证II型胶原蛋白(复合骨胶原)结构不被破坏，得到非变性II型胶原蛋白产品，其粘多糖含量大于30wt％(例如，30wt％-45wt％，诸如31wt％，32wt％，33wt％，34wt％，35wt％，40wt％或45wt％)。

附图说明

图1为本发明的从动物软骨中提取非变性II型胶原蛋白的制备方法的流程图；

图2为通过本发明的方法提取的非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)的粘多糖含量检测结果；

图3为通过本发明的方法提取的非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)和水解II型胶原蛋白的图谱；和

图4为通过本发明的方法提取的非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)的凝胶电泳。

具体实施方式

以下结合实施例，详细说明本发明从鸡胸软骨中提取非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)的制备方法。

实施例1

从鸡胸软骨中提取非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)的制备方法，包括以下步骤：

1)浸泡：将经检验检疫合格的鸡胸软骨(购自福建圣农集团有限公司科宝肉鸡品种)放入水中浸泡；

2)清洗：将步骤1)所得软骨入罐，加水搅拌清洗，除去血水和杂质；

3)超声清洗：将步骤2)所得干净软骨入超声清洗机(型号：RDS-226，购自郑州亨亚机械设备有限公司)，加入纯化水按1：1.5的比例进行超声清洗(40KHz频率超声清洗处理)，清洗时间为0.5小时，收集洁净软骨；

4)破碎：将步骤3)所得洁净软骨经-20℃～-1℃冷冻后用破碎机(型号：DW-430，购自滨州盛嘉食品机械有限公司)切成长度小于1cm的软骨粒；

5)盐溶液浸泡：将步骤4)所得软骨粒与10％的氯化钾溶液按1∶1的比例(w/w)浸泡处理，浸泡时间为2小时；

6)过滤：将步骤5)所得溶液进行过滤，除去液体，保留过滤所得滤渣；

7)乙醇浸泡：将步骤6)所得滤渣中加入乙醇(质量浓度≥96％)，滤渣与乙醇按1∶2的比例(w/w)投料进行搅拌和浸泡处理。浸泡时间为2小时，重复2次；

8)过滤：待步骤7)完成后，除去乙醇，保留过滤所得固形物；

9)真空干燥：将步骤8)所得固形物入低温真空干燥器(型号：FZG系列，购自杭州钱江干燥设备有限公司)，干燥至产品中水分含量小于10％(重量比)；

10)涡流粉碎：将步骤9)所得干燥固形物投入到低温涡流粉碎设备(型号：WLF-320，购自：天津市渤海鑫茂制药设备有限公司)中进行粉碎，得到80目的产品；

11)包装：将步骤10)所得产品过筛、密封包装，每个包装10Kg。

所得产品为鸡胸软骨提取制备的非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)。胶原蛋白有不同的类型，目前为止已经发现了几十种。其中Ⅰ、Ⅲ型主要存在于皮肤血管等***中；Ⅱ型主要由软骨细胞产生，多存在于骨骼、关节、肌腱等组织。Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的主要成分为蛋白质，含量≥90％，而Ⅱ型胶原蛋白主要成为蛋白质和粘多糖，其中粘多糖是其特有的成分，粘多糖的含量≥20％。

以上制备的非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)的粘多糖含量在广州市谱尼测试技术有限公司的检测，结果如图2所示，粘多糖含量大于30wt％。

在本发明的方法中，II型胶原蛋白的提取原料来源于动物软骨组织，同时制备方法避开了使蛋白质变性的化学方法如：强酸、强碱、重金属盐、尿素、丙酮等和使蛋白质变性的物理方法如：加热(高温)、紫外线及X射线照射等。制备方法中的冷冻破碎、真空干燥、低盐浓度浸泡工艺等保证了II型胶原蛋白分子的结构不被破坏。通过色谱分析、凝胶电泳分析法对利用本发明的上述制备方法制得的非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)进行蛋白质的分析也再次验证了其为非变性II型胶原蛋白。

以下还通过色谱分析方法对以上得到的非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)进行了分析。

非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)进行色谱分析方法：利用以上实施例1获得的产品，通过前处理，制备20μg/mL的非变性Ⅱ型胶原蛋白溶液，液池厚度1cm，扫描波长范围190～250nm，扫描速度100nm/min，进行分析。非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)溶液在波长221nm左右处出现正吸收峰，在波长198nm左右处出现负吸收峰是非变性II型胶原分子构象中无规则卷曲结构的典型特征。非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)和水解II型胶原蛋白的图谱如图3所示。

以下还通过凝胶电泳对以上得到的非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)进行了分析。

非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)进行凝胶电泳的分析方法：利用实施例1获得的产品，制备20μg/mL的非变性Ⅱ型胶原蛋白溶液，同时制备20μg/mL的水解Ⅱ型胶原蛋白溶液(购自公安县丽晶生化有限责任公司)，进行5500r/min离心处理10min，取上清液，采用凝胶电泳分析。非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)和水解II型胶原蛋白的电泳条带如图4所示：其中，9号条带为Marker，选择已知分子量为250KDa、150KDa、100KDa、75KDa的蛋白质进行电泳分析。1、2、5、6号条带：非变性II型胶原蛋白的电泳条带，其中1与2，5与6为平行处理，1、2的上样量为2μl，5、6的上样量为5μl。3、4、7、8号条带：水解II型胶原蛋白的电泳条带，其中其3与4，7与8为平行处理，3、4的上样量为2μl，7、8的上样量为5μl。非变性II型胶原蛋白的电泳条带显示其存在很多分子量大于250KDa的蛋白质，且整体分子量较大，是未被破坏的蛋白质结构，所以为非变性结构。但是水解II型胶原蛋白的电泳条带显示其不存在分子量大于25KDa的蛋白质，说明其分子量小于25KDa，已经跑出电泳条带，分子量较小，无明显的空间结构，是已经破坏和水解了的寡肽或者氨基酸结构，为变性蛋白质。

比较例

按照与实施例1相同的方法步骤提取非变性II型胶原蛋白(复合骨胶原)，差别仅在于以下表1中的制备工艺稍有不同。结果总结在表1中。

表1不同制备工艺所得物的电泳条带

以上所述仅为本发明的一个实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。