阅读说明：本技术 对数期特异性启动子及其应用 (Logarithmic phase specific promoter and application thereof ) 是由 陈玲 周豪宏 刘修才 于 2019-03-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供了对数期特异性启动子(序列如SEQ ID NO:1-10所示)及其应用。本发明提供的对数期特异性诱导的启动子主要集中在菌体生长的对数期启动重组表达,这对于发酵生产赖氨酸脱羧酶具有很重要的意义,本发明保护的对数期启动子可以在菌株的生长度过停滞期后开始诱导赖氨酸脱羧酶基因的表达,因此避免了菌体在停滞期就开始表达基因给菌体适应发酵环境带来的压力,可以在同样的发酵时间内表达更多的赖氨酸脱羧酶。本发明为利用微生物表达赖氨酸脱羧酶并利用赖氨酸脱羧酶作为体外酶催化L-赖氨酸生产1,5-戊二胺提供有力的技术支持。(The invention provides a logarithmic phase specific promoter (shown as SEQ ID NO: 1-10) and application thereof. The log-phase specific induction promoter provided by the invention mainly focuses on the log-phase starting recombinant expression of thallus growth, which has important significance for producing lysine decarboxylase by fermentation. The invention provides powerful technical support for producing 1, 5-pentanediamine by using the lysine decarboxylase expressed by microorganisms and using the lysine decarboxylase as in vitro enzyme to catalyze L-lysine.)

对数期特异性启动子及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种对数期特异性启动子及其应用。

背景技术

赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase,简称LDC,分类号为EC 4.1.1.18)广泛存在于微生物、动物和高等植物中，其可以将L-赖氨酸脱去一个羧基生成1,5-戊二胺(尸胺)和CO₂。1,5-戊二胺的用途相当广泛，例如可以和二元酸进行聚合反应合成新型聚酰胺，在工业生产中具有很高的应用价值。目前，微生物法戊二胺生产主要采用微生物发酵生产和微生物体外酶催化生产戊二胺。

利用微生物体外酶催化生产1,5-戊二胺时，使用较多的是根据乳糖操纵子来构建赖氨酸脱羧酶基因表达盒，利用lacI功能缺失的乳糖操纵子，lac启动子可以组成型表达，不依赖于诱导剂的添加与否，实现异源基因伴随着菌体生长的大量表达。

除了依赖于乳糖操纵子的lac启动子之外，还希望获得一些新的于菌体生长对数期就开始诱导下游基因转录的启动子，并且这些启动子的诱导不需要添加诱导剂。

发明内容

本发明的目的是提供对数期特异性启动子及其应用。

本发明的另一目的是提供一种全细胞催化生产1,5-戊二胺的方法。

为了实现本发明目的，本发明人提供的对数期诱导的启动子能够在对数期利用微生物大量表达异源蛋白，为利用微生物表达对菌体生长产生毒性的蛋白提供技术支持。进一步地，为了实现全细胞催化生产1,5-戊二胺，将编码赖氨酸脱羧酶的基因构建至对数期特异性启动子之后，并转化至细菌菌株中，得到的重组菌株可以用于全细胞催化生产1,5-戊二胺。

第一方面，本发明提供的对数期特异性启动子，所述启动子的大小为37-42bp，至少包括-10区、RNA聚合酶б^s特异性识别位点和-35区；

其中，将所述启动子序列的3’末端碱基对应于下游基因转录起始位点的位置记为-1位，所述-10区位于-12～-7位，碱基组成为5’-TATACT-3’；

所述启动子序列的-13位碱基为C；

所述RNA聚合酶б^s特异性识别位点位于-18～-14位，碱基组成为5’-TTGTT-3’；

所述-35区的碱基组成为5’-T(C或T)(C或T)(C或T)G(C或T或A)(T或C)-3’，但5’-TCCCGCC-3’除外，且所述-35区和-10区之间间隔的碱基数为15-20bp。

进一步地，所述对数期特异性启动子的序列为：

i)SEQ ID NO:1-10任一所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:1-10任一所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且以对数期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1-10任一所示序列杂交且以对数期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且以对数期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列。

第二方面，本发明提供含有所述对数期启动子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。

第三方面，本发明提供所述对数期启动子的以下任一应用：

1)作为原核生物的对数期特异性启动子的应用；

2)在构建重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌中的应用。

所述原核生物为细菌，例如埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、哈夫尼菌属(Hafnia)中的细菌；优选地，所述细菌选自大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(H.alvei)、谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)，或经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌。

进一步地，本发明提供所述对数期启动子作为大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(H.alvei)或谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)在发酵生产赖氨酸脱羧酶中调控赖氨酸脱羧酶基因表达的对数期特异性启动子的用途。

第四方面，本发明提供一种重组DNA，由所述启动子与下游目的基因可操作连接而成。

本发明中，所述目的基因选自编码蛋白质的核酸、编码核酶的核酸、编码反义RNA的核酸；优选地，所述蛋白质为酶、激素、抗体或生长因子；更优选地，所述酶选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶。进一步地，所述裂合酶为脱羧酶；所述脱羧酶为氨基酸脱羧酶，如赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。又进一步地，所述赖氨酸脱羧酶来源于大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或奥克西托克雷白杆菌(Klebsiella oxytoca)。更进一步地，所述赖氨酸脱羧酶由cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段所编码。更进一步优选由cadA基因编码的赖氨酸脱羧酶。

第五方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含所述的重组DNA。

在一些实施例中，所述表达载体携带含有赖氨酸脱羧酶基因的表达盒，且所述表达盒由所述对数期特异性启动子驱动赖氨酸脱羧酶基因的表达。

在一些实施例中，所述表达载体还含有能够在宿主细胞中自主复制的骨架质粒；优选地，所述骨架质粒选自pUC18、pUC19、pBR322、pACYC、pET、pSC101和它们的衍生质粒。

第六方面，本发明提供一种转化体，所述转化体为携带所述表达载体的宿主菌。

所述宿主菌选自埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、哈夫尼菌属(Hafnia)中的菌种；优选地，所述宿主菌选自大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(H.alvei)、谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)，或经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌；更优选地，所述宿主菌为大肠杆菌(E.coli)或蜂房哈夫尼菌(H.alvei)。

第七方面，本发明提供所述转化体在发酵生产氨基酸、多肽或蛋白质中的应用。

第八方面，本发明提供一种产赖氨酸脱羧酶的工程菌，所述工程菌的出发菌株为大肠杆菌(E.coli)或蜂房哈夫尼菌(H.alvei)，并携带含有赖氨酸脱羧酶基因表达盒的质粒，所述赖氨酸脱羧酶基因表达盒由所述对数期特异性启动子驱动赖氨酸脱羧酶基因的表达。

优选地，所述赖氨酸脱羧酶基因是来自大肠杆菌内源的cadA基因(SEQ ID NO:11)，其编码大肠杆菌诱导型赖氨酸脱羧酶CadA(SEQ ID NO:12)。

优选地，所述对数期特异性启动子为SEQ ID NO:1、2、3、4、6任一所示的启动子。

进一步地，本发明提供的产赖氨酸脱羧酶的工程菌，所述工程菌含有所述对数期特异性启动子，或者携带含有赖氨酸脱羧酶基因表达盒的质粒，所述赖氨酸脱羧酶基因表达盒由所述对数期特异性启动子驱动赖氨酸脱羧酶基因的表达。

第九方面，本发明提供一种发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法，包括在发酵培养基中对所述产赖氨酸脱羧酶的工程菌进行培养。

第十方面，本发明提供一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，包括利用上述第九方面得到的工程菌发酵生产赖氨酸脱羧酶，再利用获得的赖氨酸脱羧酶催化L-赖氨酸转化生成1,5-戊二胺。

优选地，所述工程菌经发酵获得酶发酵液，将酶发酵液与L-赖氨酸、L-赖氨酸盐溶液或L-赖氨酸发酵液混合，催化L-赖氨酸转化生成1,5-戊二胺。

优选地，所述L-赖氨酸发酵液选自L-赖氨酸发酵原液，L-赖氨酸发酵原液的浓缩液或稀释液，L-赖氨酸发酵原液去除菌体后的除菌L-赖氨酸发酵液和除菌L-赖氨酸发酵液的浓缩液或稀释液。所述L-赖氨酸发酵液可通过现有技术制备，例如在发酵培养基中培养产L-赖氨酸的工程菌获得L-赖氨酸发酵液，可参见CN104762336A，或者所述L-赖氨酸发酵液通过市售获得。

优选地，所述方法还包括向所述L-赖氨酸发酵液中添加辅酶，所述辅酶选自吡哆醛、磷酸吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺中的一种或多种，更优选5′－磷酸吡哆醛。

优选地，催化L-赖氨酸转化生成1,5-戊二胺时，反应体系的温度为25℃-55℃，更优选28℃-40℃。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供的对数期特异性诱导的启动子主要集中在菌体生长的对数期启动重组表达，这对于发酵生产赖氨酸脱羧酶具有很重要的意义，与组成型Plac启动子相比较，本发明保护的对数期启动子可以在菌株的生长度过停滞期后开始诱导赖氨酸脱羧酶基因的表达，避免了菌体在停滞期就开始表达基因给菌体适应发酵环境带来的压力，可以在同样的发酵时间内表达更多的赖氨酸脱羧酶。本发明为利用微生物表达赖氨酸脱羧酶并利用赖氨酸脱羧酶催化L-赖氨酸生产1,5-戊二胺提供有力的技术支持。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中述及的PCR扩增、质粒提取、酶切、酶切产物连接、转化的具体步骤、条件参数等均按所购相关酶和试剂的说明书建议的条件进行。其中PCR扩增所用的DNA聚合酶、酶切所用的限制性内切酶、酶切产物连接所用的连接酶、大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞均购自宝生物工程(大连)有限公司。质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒均购自康宁生命科学(吴江)有限公司，商标Axygen，引物均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，商标INVITROGEN。

以下实施例中述及的蜂房哈夫尼菌Am607(Hafnia alvei Am607)现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO:M2018737，保藏日期2018年11月1日。

以下实施例反应体系的L-赖氨酸-1,5-戊二胺转化率即1,5-戊二胺与初始L-赖氨酸的摩尔比的百分数，其中L-赖氨酸和1,5-戊二胺的检测使用核磁共振(BRUKERULTRASHIEDTM400PLUS,Beckman NMR)检测。

以下实施例中述及的质粒转化方法如下：将连接产物加入至100μl的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴20min后在42℃中热激90s。冰上孵育5min后加入1ml的LB。涂布至相对应的抗性平板上。

以下实施例中所用的引物如下：

实施例1 对数期表达的启动子序列

本发明设计并合成了10条启动子序列，所述启动子的长度为37-42bp，分别如下所示(5’-3’，启动子序列中3’端最后一个碱基对应下游基因转录起始位点的位置为-1位)，其中双下划线标注的为-10区(-12～-7)，-10区碱基组成为5’-TATACT-3’；延伸的-10区为(-13位)保守碱基C；-18～-14位碱基组成为5’-TTGTT-3’，该区域为RNA聚合酶б^s的特异性识别所必须；单下划线标注为可能的-35区，为本发明发现的保守区域所在，调控启动子的启动时间，其碱基序列可以是5’-T(C/T)(C/T)(C/T)G(C/T/A)(T/C)-3’，但其序列不可以是5’-TCCCGCC-3’，所述启动子-35区和-10区之间的间隔区碱基数可以为15-20bp。

1.CAGTCTTGTCAAATTTGTAAAATTGTTCGTATTG(SEQ ID NO:1)；

2.CCATTCCTGACAAATTTTTAATATTGTTCGTATTG(SEQ ID NO:2)；

3.AATCTCGCCAAATTTCAATTTGTTCGTATTG(SEQ ID NO:3)；

4.TAAGTCTTGCCAAATCCTTATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:4)；

5.TCCTGACAAATTTACAATATTGTTCGTATTG(SEQ ID NO:5)；

6.TCCTGCCAAATCCGTAAATTTTGTTCGTATTG(SEQ ID NO:6)；

7.CACTTTCGTCAAATTTGTAATTATTGTTCGTATTG(SEQ ID NO:7)；

8.TCTTGTTAAATTTGTAATTATTGTTCGTATTG(SEQ ID NO:8)；

9.TTTTGCTAAATTTGTAAATTATTGTTCGTATTG(SEQ ID NO:9)；

10.CGGAGTCTTGACAATTGTAAATTATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:10)。

实施例2 构建含有不同启动子的红色荧光蛋白表达质粒

mCherry红色荧光蛋白的编码基因均为利用基因组装的方法合成。红色荧光蛋白mCherry的氨基酸序列为SEQ ID NO:14，经过密码子优化后得到其核苷酸序列SEQ ID NO：15。密码子优化及其DNA组装的操作参考Hoover DM&Lubkowski J,Nucleic AcidsResearch 30:10,2002。

利用引物mCherry-F(SEQ ID NO：16)和mCherry-R(SEQ ID NO：17)对密码子优化后的mCherry基因进行PCR扩增，并在其基因起始密码子上游引入核糖结合位点(RBS，SEQID NO：18)；切胶回收目的大小的DNA片段后，进行加A反应，然后与pMD18-T(购自宝生物工程大连有限公司)载体进行连接，连接产物转化至E.coli BL21感受态细胞中，在含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素抗性的平板中进行筛选，37℃培养过夜(16h，下同)，分别多挑取几个克隆摇菌后送样测序，选取测序序列正确且mCherry基因反向连入乳糖启动子plac后的克隆抽提质粒，得到含有mCherry基因的质粒T-mCherry。在测序过程中发现，mCherry基因测序验证正确且正向***至plac后的克隆，在平板上可以表现为红色。由此，所克隆的mCherry基因可以在大肠杆菌中顺利表达且翻译产物均为有功能的蛋白。而mCherry基因反向***至plac后的克隆，虽然测序验证正确，克隆也没有红色出现，说明质粒T-mCherry可以用于后续验证启动子的启动时间。

以质粒T-mCherry为模板，首先利用引物T-mC-F1(SEQ ID NO:19)和引物T-mC-R1(SEQ ID NO:20)进行质粒扩增，利用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化后，用限制性内切酶DpnI将模板消化掉后，转化至E.coli BL21细胞中，在含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的抗性平板上进行筛选，37℃培养过夜。随机挑取三个单克隆进行测序鉴定。选择测序正确的克隆抽提质粒，以该质粒为模板，利用引物T-mC-F2(SEQ ID NO:21)和引物T-mC-R2(SEQ ID NO:22)对质粒进行PCR扩增，利用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化后，利用限制性内切酶DpnI将质粒模板消化掉后，转化至大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中，在含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的抗性平板上进行筛选，37℃培养过夜。随机挑取三个单克隆进行测序鉴定。选择测序正确的克隆抽提质粒，得到在mCherry基因之前***了RBS序列及多克隆位点的质粒T-Psyn-mCherry。

使用本领域常用基因序列合成方法分别合成含有实施例1所列的10条启动子的双链DNA序列，并在序列5’和3’端分别连接有KpnI和ClaI的酶切位点，利用KpnI和ClaI双酶切后，分别连接至KpnI和ClaI双酶切的质粒T-Psyn-mCherry中。得到含有不同启动子的质粒。分别将这10个质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中，得到分别含有这10个质粒的菌株，并分别命名为BL21-1～BL21-10。

实施例3 利用红色荧光蛋白验证启动子的启动时间

分别从10个质粒转化的平板上长出的克隆中各挑取4个于96孔深孔板中的600μl含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、250rpm的摇床中培养过夜后，分别吸取20μl菌液转接至新鲜的600μl含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、250rpm的摇床中培养2hrs，再转接8μl菌液转接至酶标板中新鲜的200μl含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的LB液体培养基中(设置四个重复)，置于酶标仪中。设置确定不含有红色荧光蛋白的菌株的菌液为阴性对照，阴性对照菌体正常生长，但无荧光检测到。设置温度为37℃，设置工作流程：首先摇菌15s，测定菌体的OD_600nm的值，然后测定菌体在575nm的激发光、610nm的发射光条件下的荧光值，最后摇菌600s，该流程循环，每隔15min测定一次，全长时间为24hrs。测定结束后，分别绘制菌体的生长曲线和单位OD的荧光曲线(菌体某个时间点的荧光值于该时间点测定的OD的比值)曲线。根据两条曲线的对应关系获得该菌体荧光显著增强的时间点为菌体生长的哪个阶段。当菌体生长的对数期后荧光值就开始显著提高的克隆中所含有的启动子即确定为对数期特异性诱导的启动子。

从表1可以看出，含有本发明启动子的重组菌株，培养时间为360～480min时，菌体OD增长迅速，从约0.2增加至约0.4，伴随着菌体的荧光值/OD也出现了显著增加，可以从约80单位增加至约120单位；随着菌体的培养时间继续延长，菌体的OD和荧光值/OD都无显著增加，说明这些启动子都是在菌体生长的对数期开始启动下游基因转录的。

表1 利用酶标仪检测的各菌株不同培养时间的OD值和荧光值/OD

实施例4 对数期启动子用于表达赖氨酸脱羧酶进行体外酶催化生产1,5-戊二胺

1、构建含有对数期启动子的诱导表达赖氨酸脱羧酶的质粒及重组菌株

以大肠杆菌MG1655 K12的基因组为模板，利用引物cadA-F(SEQ ID NO:23)和cadA-R(SEQ ID NO:24)进行第一轮扩增，对目的片段切胶回收后，作为模板，再利用引物cadA-F2(SEQ ID NO:25)和cadA-R(SEQ ID NO:24)进行第二轮扩增，切胶回收后得到5’端带有HindIII酶切位点以及核糖体结合位点的cadA基因(SEQ ID NO:13)；抽提实施例2中得到的含有10种启动子的质粒，利用HindIII和XbaI双酶切，与同样双酶切的cadA基因(SEQID NO:13)进行连接，得到T-1-cadA，T-2-cadA，T-3-cadA，T-4-cadA，T-5-cadA，T-6-cadA，T-7-cadA，T-8-cadA，T-9-cadA，T-10-cadA这10个cadA表达质粒，将这10个质粒分别转化至蜂房哈夫尼菌株Am607中，得到10个重组菌株，HA-1-cadA，HA-2-cadA，HA-3-cadA，HA-4-cadA，HA-5-cadA，HA-5-cadA，HA-6-cadA，HA-7-cadA，HA-8-cadA，HA-9-cadA，HA-10-cadA。

已知在没有LacI阻遏蛋白表达的情况下，plac启动子可以为组成型启动子，其下游基因是随着菌体生长而启动表达的，为了比较plac和本发明对数期诱导的启动子在表达异源蛋白方面的优劣。同时，以pUC18质粒为模板，利用引物plac-F(SEQ ID NO：26)和plac-R(SEQ ID NO：27)扩增得到plac组成型启动子(SEQ ID NO:28)，KpnI、ClaI双酶切后，与同样双酶切的质粒T-1-cadA连接，得到质粒T-plac-cadA。同样将其转化至蜂房哈夫尼菌株Am607中，得到HA-plac-cadA重组菌株。

2、发酵培养重组菌株

上述重组菌株分别挑取三个单克隆至5mL的LB液体培养基中，所述LB液体培养基含有胰蛋白胨(tryptone)1％(w/v)、酵母提取物(yeast extract)0.5％(w/v)、NaCl 1％(w/v)、氨苄青霉素100μg/mL，于37℃培养24h，获得酶发酵液，分别测定各菌株酶发酵液的OD_560nm。

3、催化L-赖氨酸转化生成1,5-戊二胺

取上述步骤获得的每个重组菌株的酶发酵液500μl，加入500μl L-赖氨酸盐酸盐水溶液(L-赖氨酸浓度为400g/L)，终浓度为0.05mM的5′-磷酸吡哆醛，pH自然，反应温度37℃，转速250rpm，反应2h，反应结束后对反应液进行离心(12000rpm，3min)，取500μl的反应液进行检测并计算各反应体系的L-赖氨酸-1,5-戊二胺转化率(表2)。

表2 检测各反应体系中剩余的L-赖氨酸和转化生成的1,5-戊二胺的水平

从表2可以看出，通过比较本发明中的10个对数期启动子与组成型的plac启动子诱导表达赖氨酸脱羧酶，结果表明本发明筛选到的对数期启动子1-10均能够催化L-赖氨酸转化为1,5-戊二胺，而且对数期启动子1、2、3、4、6诱导表达赖氨酸脱羧酶获得的转化率比组成型的plac启动子更有优势，转化率分别为78％、75％、71％、68％和62％。

实施例5 对数期启动子用于表达赖氨酸脱羧酶进行体外酶催化生产1,5-戊二胺

构建含有对数期启动子的诱导表达赖氨酸脱羧酶的质粒及重组菌株的方法、发酵培养重组菌株的方法与实施例4相同，区别在于，催化L-赖氨酸转化生成1,5-戊二胺：将获得的重组菌株HA-1-cadA，HA-2-cadA，HA-3-cadA，HA-4-cadA，HA-6-cadA和HA-plac-cadA的酶发酵液与L-赖氨酸发酵液混合，转化生成1,5-戊二胺，具体包括如下步骤：

取600μl赖氨酸发酵原液(购自凯赛(金乡)生物材料有限公司)，赖氨酸含量为11％。向此赖氨酸发酵原液中分别加入上述酶发酵液100μl和终浓度为0.05mM的5`-磷酸吡哆醛，pH自然，反应温度38℃，转速250rpm，反应2h，反应结束后对反应液进行离心(12000rpm，3min)，取500μl的反应液进行检测并计算各反应体系的L-赖氨酸-1,5-戊二胺转化率(表3)。

表3 检测各反应体系中剩余的L-赖氨酸和转化生成的1,5-戊二胺的水平

从表3可以看出，本发明筛选的对数期启动子1、2、3、4、6诱导表达的赖氨酸脱羧酶在对赖氨酸发酵原液进行催化转化时，同样获得了较高的L-赖氨酸-1,5-戊二胺转化率，本发明筛选的对数期启动子促进简化了L-赖氨酸催化转化1,5-戊二胺的工艺。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方式对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 CIBT美国公司

<120> 对数期特异性启动子及其应用

<130> KHP181115191.8

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagtcttgtc aaatttgtaa aattgttcta tactgtattg 40

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccattcctga caaattttta atattgttct atactgtatt g 41

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatctcgcca aatttcaatt tgttctatac tgtattg 37

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taagtcttgc caaatcctta ttgttctata ctgtattg 38

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcctgacaaa tttacaatat tgttctatac tgtattg 37

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcctgccaaa tccgtaaatt ttgttctata ctgtattg 38

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cactttcgtc aaatttgtaa ttattgttct atactgtatt g 41

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcttgttaaa tttgtaatta ttgttctata ctgtattg 38

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttttgctaaa tttgtaaatt attgttctat actgtattg 39

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cggagtcttg acaattgtaa attattgttc tatactgtat tg 42

<210> 11

<211> 2148

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 11

atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60

gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120

gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180

aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240

gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300

agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360

actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420

cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480

agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540

tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600

gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660

tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt 720

gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780

tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840

cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900

gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960

acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020

ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080

gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140

aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200

ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca 1260

ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320

cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat 1380

acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440

aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500

gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560

catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620

atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc 1680

gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740

tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800

aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860

tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920

gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980

ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040

gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100

gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148

<210> 12

<211> 715

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 12

Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu

1 5 10 15

Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln

20 25 30

Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn

35 40 45

Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu

50 55 60

Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr

65 70 75 80

Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp

100 105 110

Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile

115 120 125

Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys

130 135 140

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys

145 150 155 160

Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met

165 170 175

Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe

195 200 205

Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

210 215 220

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile

225 230 235 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

245 250 255

Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

260 265 270

Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg

275 280 285

Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys

305 310 315 320

Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly

340 345 350

Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

355 360 365

Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val

370 375 380

Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser

385 390 395 400

Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met

405 410 415

Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala

420 425 430

Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly

435 440 445

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys

450 455 460

Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp

465 470 475 480

Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

485 490 495

Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser

500 505 510

Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe

545 550 555 560

Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

565 570 575

Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn

580 585 590

Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg

595 600 605

Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe

610 615 620

Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met

625 630 635 640

Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

660 665 670

Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

675 680 685

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr

690 695 700

Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys

705 710 715

<210> 13

<211> 1642

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aagcgaacga acaacaagaa ggaaaacaag aacgagcaaa gaacacaggg ggaaaagaag 60

aacccaccgg aaccacgcgc gcgaacgcga acccagagac ccgaacgacc ggacgacaaa 120

aacgacgaaa acaagcgcgc ggcggcgaga cgggaaaaaa accgagcggc gaagaaaagc 180

aaaagaacga gaaccgccgg acgcgcgcaa acgaccaccc gagaagccga agaccgcgac 240

agaagccgaa agcgcggggc gcgaagaagc aaaagacaag cagaccacga cgaaaacaac 300

acacgccccg cgacaaagca cgaaaagcgg aaggaaaaac cgacccggca cagggcggac 360

gcaccagaaa agcccggagg agccgcagac ggccgaaacc agaaacgaac cacagacgaa 420

cgggccgcgg acacagggcc acacaaagaa gcagaacaga acgccgcgca acgcagaccg 480

cagcacaggg accaacggac ccacgcgaac aaaagggaga ccgcccagca ggcagcacca 540

cgagaccgaa cgccacaaac gcgacccacc gagagagagc gagacgccaa caccgcccga 600

cccgaacgca cggacgggga cccacagagg aaccagcacg caccagcaag cgcggaaaga 660

aacaccaaac gcaaccggcc ggacagcgaa accaaccacc agaggcgcga caacaccgac 720

cacaagaaaa cacggaggaa accaccacga cccgcggggg ccacaccaac ccaccgaacg 780

aaggaaagcg gagagcgggg ccggagaagg gaaaggaacg aaacccagcc accacaaacg 840

cggcggcgcc caggcccaga ccacgaaagg gacgaaacga agaaaccaac gaagccacag 900

agcacaccac caccccgcac acggacgggc gccacgaaac cgcgcggcga gagaaaggca 960

agcaggaagc gcgacaacgg cagaacggcg acaaaccgaa agagacaaac gcgagaacgg 1020

aacgaggcgg cgagaggcag ccggacaacg aacgacgaag cggccgcgcg cgacagcacc 1080

ggcacggcca aaaacacgaa acgagcacag acgacccgac aaagcacccg cgacccgggg 1140

aggaaaaaga cggcaccaga gcgacggacc ggccagcacg ggcgaaaacc cgacgaacag 1200

gcacgggaga aaaccggccg aaaccgcgcc gcagcacgga cgaaagacca aagcacgagc 1260

cgcgcggccg acgacaaacg gcgcgaccga accgcgggaa aaacagcgcc gccgacggaa 1320

gaccgaacag aaaacagcga caggaacggc cagaaaccac aaacgagcac cacaacgccg 1380

gacgagacgc gcagaaggcg ccgacgagga agacccgagc gcaccagaaa gagcgcacgg 1440

agaccgaaga agacccgacg aaaggaggcg aaacgccaaa gaccccgacc cgccgggagc 1500

ccggaagccg gggaaagaca ccgaagaaag ccgccggcgg agccgcagag cgggaaacgg 1560

cgccacaccg ggcgaaaccg aacacgggca accgcaggcg aggccgcaac cgaaggagaa 1620

agaagaaagc aaaaaaaaca ga 1642

<210> 14

<211> 236

<212> PRT

<213> 蘑菇珊瑚(mushroom coral)

<400> 14

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe

1 5 10 15

Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe

20 25 30

Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr

35 40 45

Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp

50 55 60

Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His

65 70 75 80

Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe

85 90 95

Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val

100 105 110

Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys

115 120 125

Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys

130 135 140

Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly

145 150 155 160

Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly

165 170 175

His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val

180 185 190

Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser

195 200 205

His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly

210 215 220

Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 15

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggtgtcta aaggcgagga agataatatg gcgattatca aagaatttat gcgttttaaa 60

gtgcatatgg aaggcagcgt gaatgggcat gagtttgaaa ttgaaggcga aggagaaggc 120

cgtccgtatg aaggcaccca gaccgctaaa ctgaaagtga ccaaaggcgg accactgccg 180

tttgcgtggg acattctgag cccgcagttt atgtatggca gcaaagcgta tgtgaaacat 240

ccggcggata ttccggatta tctgaaactg agctttccgg agggcttcaa atgggaacgt 300

gtgatgaatt ttgaagatgg cggcgtggtg accgtgaccc aggatagcag cctgcaagac 360

ggcgaattca tttacaaggt gaagctgcgt ggcaccaact ttcccagcga tggcccggtg 420

atgcagaaaa agaccatggg ctgggaggcg agcagcgaac gtatgtaccc ggaggatggc 480

gcgctgaagg gcgaaattaa gcagcgtctg aagttaaaag atggtgggca ctatgatgcg 540

gaagtgaaaa ccacctataa agcgaaaaaa ccggtgcagt taccaggcgc ttataatgtg 600

aacattaagc tggatattac cagccataat gaagattata ccattgtgga acagtatgag 660

cgtgcggagg gacggcatag cacgggcgga atggatgaac tgtataaata a 711

<210> 16

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gctctagagt ttttttggga attcacacac aggaggagct gatggtgtct aaaggcgag 59

<210> 17

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gctctagatt atttatacag ttcatccatt ccgcccg 37

<210> 18

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gtttttttgg gaattcacac acaggaggag ctgatggtgt ctaaaggcga ggaagataat 60

atggcgatta tcaaagaatt tatgcgtttt aaagtgcata tggaaggcag cgtgaatggg 120

catgagtttg aaattgaagg cgaaggagaa ggccgtccgt atgaaggcac ccagaccgct 180

aaactgaaag tgaccaaagg cggaccactg ccgtttgcgt gggacattct gagcccgcag 240

tttatgtatg gcagcaaagc gtatgtgaaa catccggcgg atattccgga ttatctgaaa 300

ctgagctttc cggagggctt caaatgggaa cgtgtgatga attttgaaga tggcggcgtg 360

gtgaccgtga cccaggatag cagcctgcaa gacggcgaat tcatttacaa ggtgaagctg 420

cgtggcacca actttcccag cgatggcccg gtgatgcaga aaaagaccat gggctgggag 480

gcgagcagcg aacgtatgta cccggaggat ggcgcgctga agggcgaaat taagcagcgt 540

ctgaagttaa aagatggtgg gcactatgat gcggaagtga aaaccaccta taaagcgaaa 600

aaaccggtgc agttaccagg cgcttataat gtgaacatta agctggatat taccagccat 660

aatgaagatt ataccattgt ggaacagtat gagcgtgcgg agggacggca tagcacgggc 720

ggaatggatg aactgtataa ataa 744

<210> 19

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gatatcgaat tcttaacttt aagaaggaat atacatatgg tgtctaaagg cgaggaa 57

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aaagttaaga attcgatatc ggcactggcc gtcgttttac 40

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gaattcgagc tcggtaccat cgataagctt gatatcgaat tc 42

<210> 22

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gatggtaccg agctcgaatt cggcactggc cgtcgtttta c 41

<210> 23

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gaattcttaa ctttaagaag gaatatacat atgaacgtta ttgcaatatt g 51

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gcctctagac cacttccctt gtacgagc 28

<210> 25

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gccaagcttg atatcgaatt cttaacttta agaag 35

<210> 26

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ggggtaccga gtgagctgat accgctcgcc g 31

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ggatcgatag ctgtttcctg tgtgaaattg 30

<210> 28

<211> 286

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 60

gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa 120

tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat 180

gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg 240

ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagct 286