一种新终止子及其应用
阅读说明：本技术 一种新终止子及其应用 (Novel terminator and application thereof ) 是由 周哲敏 崔文璟 周丽 刘中美 令狐梅 于 2018-12-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种新终止子及其应用,属于基因工程技术领域。本发明首先对单终止子的活性进行表征,通过不同活性的终止子进行组合串联的方式,得到了一系列可提高目的蛋白产量的新型终止子,以绿色荧光蛋白基因作为终止子上游基因,以红色荧光蛋白基因作为终止子下游基因,表征终止子对上下游基因的调控水平。结果表明,这些新型终止子对于提高上游基因表达量和抑制下游基因表达量都有良好的效果。这对在枯草芽孢杆菌中生产目的蛋白具有重要的应用价值。(The invention discloses a novel terminator and application thereof, belonging to the technical field of genetic engineering. The invention firstly characterizes the activity of a single terminator, obtains a series of novel terminators capable of improving the yield of target protein by combining and connecting terminators with different activities in series, takes a green fluorescent protein gene as an upstream gene of the terminator, takes a red fluorescent protein gene as a downstream gene of the terminator and characterizes the regulation level of the terminator on the upstream and downstream genes. The results show that these novel terminators are excellent in both the effect of increasing the expression level of the upstream gene and the effect of suppressing the expression level of the downstream gene. The method has important application value in producing target protein in bacillus subtilis.)
本发明是申请号为CN201811547733.1、申请日为2018年12月18日、发明名称为一种新终止子及其应用的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种新终止子及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
转录终止子位于基因或操纵子的下游，负责RNA聚合酶的解离和释放出转录的RNA从而起到终止转录的一段RNA序列。在原核生物中，转录终止子有两种类型，一种是蛋白因子依赖型，需要Rho、NusA和tau这些因子的帮助才能发挥作用；另一种是不依赖任何蛋白因子而是依赖其自身的反向回文序列形成的发夹结构发挥作用。转录终止子由于其特殊的二级结构及位于目的基因下游的特征，在维持mRNA稳定性和提高mRNA的半衰期方面起到重要作用：终止转录过程，释放RNA聚合酶，提高RNA聚合酶的利用效率；作为间隔序列，在相邻表达单元之间担任着绝缘元件的角色。
之前，对于终止子的研究主要集中在预测和鉴定方面，而终止子在调节基因表达或者遗传线路中的作用，近几年才受到关注。终止子不仅可以阻止转录通读，而且对提高上游mRNA的稳定性都有重要贡献。然而，迄今为止，大多数终止子调控元件研究主要集中在大肠杆菌中，只有一小部分文献提及在其他微生物中的应用，如酿酒酵母等。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，提供一种能够调控枯草芽孢杆菌中基因表达、稳定、高活性的终止子，对于制备目的蛋白，尤其是食品领域中用到的蛋白，具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种调控基因表达的元件，是将TB1、TB2、TB3、TB4、TB5、TB6、TB7、TB8、TB9、TB10、ST1、ST2、ST3、ST1.5a、ST1.5b或TB6S2中的两个或三个进行串联，所述TB1、TB2、TB3、TB4、TB5、TB6、TB7、TB8、TB9、TB10、ST1、ST2、ST3、ST1.5a、ST1.5b、TB6S2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.16所示。
在本发明的一种实施方式中，是将TB5、TB2、TB6S2、ST1.5b或TB10中的两个或三个进行串联。
在本发明的一种实施方式中，其特征在于，含SEQ ID NO.18-SEQ ID NO.29所示的序列。
本发明的第二个目的是提供一种含有上述元件的载体。
本发明的第三个目的是提供表达上述载体的基因工程菌。
本发明的第四个目的是提供一种调控枯草芽孢杆菌中目的蛋白表达的方法，将权利要求1-3任一所述的元件与目的蛋白基因共表达。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括Bacillus subtilis 168、Bacillus subtilis WB400、Bacillus subtilis WB600或Bacillus subtilis WB800。
在本发明的一种实施方式中，所述目的蛋白包括酶。
本发明的第五个目的是提供上述的调控元件或基因工程菌在制备目的蛋白中的应用。
本发明的第六个目的是提供上述的调控元件或基因工程菌在食品、制药或化工领域的应用。
本发明首先对单终止子的活性进行表征，发现添加TB5终止子比不添加终止子时，上游GFP表达量提高了1.68倍，下游mcherry表达量降低了27.4倍。通过将TB5终止子与其他终止子进行组合串联的方式，得到了一系列可提高目的蛋白产量的新型终止子，以绿色荧光蛋白基因作为终止子上游基因，以红色荧光蛋白基因作为终止子下游基因，表征终止子对上下游基因的调控水平。结果表明，这些新型终止子对于抑制下游基因表达量都有很好的效果，如添加TB2-TB5-TB5终止子时，比对照的下游mcherry表达量下降了337.58倍。这对在枯草芽孢杆菌中生产目的蛋白具有重要的应用价值。
附图说明
图1：测试质粒PBP43-GFP-mcherry的PCR验证，其中，M：DNA分子量标准；1：原始质粒大小；2：BamH I单酶切后片段大小；3：SacⅡ单酶切后片段大小。
图2：单终止子终止效率的表征，其中TB1，TB2，TB3，TB4，TB5，TB6，TB7，TB8，TB9，TB10，ST1，ST2，ST3，ST1.5a，ST1.5b分别表示在质粒PBP43-GFP-mcherry的GFP与mcherry之间***终止子TB1，TB2，TB3，TB4，TB5，TB6，TB7，TB8，TB9，TB10，ST1，ST2，ST3，ST1.5a，ST1.5b后，测定的各终止子的终止效率。
图3：单终止子上游GFP荧光强度的表征，其中GM表示参照质粒，TB1，TB2，TB3，TB4，TB5，TB6，TB7，TB8，TB9，TB10，ST1，ST2，ST3，ST1.5a，ST1.5b分别表示在质粒PBP43-GFP-mcherry的GFP与mcherry之间***终止子TB1，TB2，TB3，TB4，TB5，TB6，TB7，TB8，TB9，TB10，ST1，ST2，ST3，ST1.5a，ST1.5b后，测定的各终止子的上游GFP荧光强度。
图4：单终止子下游mcherry荧光强度的表征，其中GM表示参照质粒，TB1，TB2，TB3，TB4，TB5，TB6，TB7，TB8，TB9，TB10，ST1，ST2，ST3，ST1.5a，ST1.5b分别表示在质粒PBP43-GFP-mcherry的GFP与mcherry之间***终止子TB1，TB2，TB3，TB4，TB5，TB6，TB7，TB8，TB9，TB10，ST1，ST2，ST3，ST1.5a，ST1.5b后，测定的各终止子的下游mcherry荧光强度。
图5：串联终止子终止效率的表征，其中TB6S2-TB10，TB5-TB10，TB6S2-TB10和TB2-TB5表示双串联终止子的终止效率；其中TB6S2-ST1.5b-TB10，TB6S2-TB5-TB10，TB5-ST1.5b-TB10，TB5-TB5-TB10，TB6S2-ST1.5b-TB5，TB6S2-TB5-TB5，TB2-ST1.5b-TB5，TB2-TB5-TB5表示三串联终止子的终止效率。
图6：串联终止子上游GFP荧光强度的表征，其中TB6S2-TB10，TB5-TB10，TB6S2-TB10和TB2-TB5表示双串联终止子上游GFP的荧光强度；其中TB6S2-ST1.5b-TB10，TB6S2-TB5-TB10，TB5-ST1.5b-TB10，TB5-TB5-TB10，TB6S2-ST1.5b-TB5，TB6S2-TB5-TB5，TB2-ST1.5b-TB5，TB2-TB5-TB5表示三串联终止子上游GFP的荧光强度。
图7：串联终止子下游mcherry荧光强度的表征，其中TB6S2-TB10，TB5-TB10，TB6S2-TB10和TB2-TB5表示双串联终止子下游mcherry荧光强度；其中TB6S2-ST1.5b-TB10，TB6S2-TB5-TB10，TB5-ST1.5b-TB10，TB5-TB5-TB10，TB6S2-ST1.5b-TB5，TB6S2-TB5-TB5，TB2-ST1.5b-TB5，TB2-TB5-TB5表示三串联终止子下游mcherry荧光强度。
图8：终止子TB5与rrnBT1终止效率的表征，其中G-M-TB5作为G-rrnBT1-M-TB5，和G-TB5-M-TB5的对照；G-M-rrnBT1作为G-rrnBT1-M-rrnBT1和G-TB5-M-rrnBT1的对照；G-M-TB5和G-M-rrnBT1表示在GFP和mcherry之间不加终止子时的终止效率；G-rrnBT1-M-TB5和G-rrnBT1-M-rrnBT1表示终止子rrnBT1的终止效率；G-TB5-M-TB5和G-TB5-M-rrnBT1表示终止子TB5的终止效率。
图9：终止子TB5与rrnBT1上游GFP荧光强度的表征，G-M-TB5和G-M-rrnBT1表示在不加终止子时上游GFP的荧光强度；G-rrnBT1-M-TB5和G-rrnBT1-M-rrnBT1表示终止子rrnBT1上游GFP的荧光强度；G-TB5-M-TB5和G-TB5-M-rrnBT1表示终止子TB5上游GFP的荧光强度。
图10：终止子TB5与rrnBT1下游mcherry荧光强度的表征；G-M-TB5和G-M-rrnBT1表示在不加终止子时下游mcherry的荧光强度；G-rrnBT1-M-TB5和G-rrnBT1-M-rrnBT1表示终止子rrnBT1下游mcherry的荧光强度；G-TB5-M-TB5和G-TB5-M-rrnBT1表示终止子TB5下游mcherry的荧光强度。
具体实施方式
(一)培养基
LB培养基(g·L-1)：胰蛋白胨(Tryptone)10；酵母提取物(Yeast extract)5；氯化钠(NaCl)10。
(二)枯草芽孢杆菌168转化方法
挑单菌落枯草芽孢杆菌168接种至2mL的SPI培养基中，37℃摇床培养12-14h；从培养物中取100μL，接种至5mL SPI培养基中，37℃摇床培养4-5h后开始测OD600。当OD600约为1.0时，移取200μL菌液转接至2mL的SPI培养基中，于37℃、100r·min-1摇床孵育1.5h；向管中加入20μL 100×EGTA(乙二醇双(α-氨基乙基醚)四乙酸)溶液，于37℃、100r·min-1摇床中培养10min后分装500μL每l.5mL离心管；向管中加入经过测序验证正确的适量质粒，吹吸混匀放置于37℃、100r·min-1的摇床中培养2h；培养结束，吸取菌液约200μL均匀涂相应的选择性平板，37℃过夜培养12-14h。
(三)绿色荧光蛋白GFP荧光检测
将检测样品12000g离心5min，收集菌体，PBS缓冲液洗3次，用PBS稀释到一定浓度的菌体悬液，取200μL至96孔酶标板，放入Synergy TM H4荧光酶标仪检测荧光。程序设置为：600nm检测菌体浓度；激发光495nm，发射光525nm，增益60，检测荧光强度。
(四)红色荧光蛋白mcherry荧光检测
红色荧光蛋白mcherry荧光检测样品12 000g离心5min，收集菌体，PBS缓冲液洗3次，用PBS稀释到一定浓度的菌体悬液，取200μL至96孔酶标板，放入Synergy TM H4荧光酶标仪检测荧光。程序设置为：600nm检测菌体浓度；激发光587nm，发射光610nm，增益80，检测荧光强度。
(五)终止效率的测定方法
在这里我们用终止效率(TE)量化未通过终止子元件的转录延伸复合物的比例。破坏所有到达的转录复合物的终止子元件的TE值为1。GFP和mcherry的间隔序列的TE为0。因为表达的荧光报告基因的蛋白水平并不能直接用于测量TE值。我们用下游mcherry(FIDW)与上游GFP(FIUP)的荧光比值来估计终止子通读率(TR)。即TR＝FIDW/FIUP。使用标准化测试序列(即GFP和mcherry的间隔序列)建立了参考通读值(TRREF)，然后将所有TR测量值标准化：TRNORM＝TR/TRREF，并通过以下方式估算终止效率，TE＝1-TRNORM。
(六)参照质粒PBP43-GFP-mcherry的构建方法
由公司合成带间隔序列TCCGCGGGATTACGGATCCT的mcherry-rrnBT1序列(如SEQ IDNO.30所示)，以PBSG03(构建方法见Guan C,Cui W,Cheng J,et al.Construction anddevelopment of an auto-regulatory gene expression system in Bacillus subtilis[J].Microbial Cell Factories,2015,14(1):150)为模板，设计带有同源序列的引物，将mcherry-rrnBT1序列组装到GFP基因的下游，测序得到正确序列的质粒，之后再以这个质粒为模板，设计引物将srfA启动子替换为P43启动子，测序得到正确序列的参照质粒PBP43-GFP-mcherry。
实施例1：单终止子质粒构建和荧光蛋白重组表达
(1)设计带酶切位点的引物序列，由公司合成。
(2)将合成的引物序列(见表1)经温度梯度退火连接成双链，之后将退火后的DNA双链序列与参照质粒PBP43-GFP-mcherry经BamH I和SacⅡ酶切得到的片段用T4连接酶连接，构建携带终止子(见表2)的测试质粒PBP43-GFP-Term-mcherry，并进行DNA测序，DNA测序结果表明终止子成功连接到测试质粒PBP43-GFP-mcherry的GFP和mcherry之间的酶切位点，质粒酶切电泳验证如图1，证明成功构建了新的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体。
(3)将得到的测序验证正确的重组质粒转入枯草芽孢杆菌168中，在37℃，静置培养12-14h后，挑取单菌落于5mL LB种子培养基中，37℃进行培养；按终OD600为0.02转接至含50mL LB培养基的250mL三角瓶中，200rpm，温度37℃，培养24h。
测定筛选到的终止子的终止效率(图2和表3)和荧光强度(图3、图4；表4、表5)，说明不同终止子GFP和mcherry表达量存在差异，表明不同的终止子具有不同的特征。其中终止子TB4,TB5,TB6,TB7,TB9,ST1的终止效率较高，相应地，这些终止子上游GFP的表达量提高，而下游mcherry表达受到抑制。其中，添加TB5终止子比不添加终止子时，上游GFP表达量提高了1.68倍，下游mcherry表达量降低了27.4倍。
表1引物表
表2单终止子序列
表3单终止子终止效率
表4单终止子上游GFP荧光强度
终止子名称
上游GFP荧光强度(Fl<sub>GFP</sub>/OD<sub>600</sub>)
对照(GM)
4930
ST1
13369
ST1.5a
11112
ST1.5b
6752
ST2
6687
ST3
11647
TB1
5088
TB2
8906
TB3
4670
TB4
10897
TB5
13203
TB6
11933
TB7
13689
TB8
10645
TB9
12658
TB10
6914
TB6S2
5659
表5单终止子下游mcherry荧光强度
实施例2：双串联和三串联终止子质粒构建和荧光蛋白重组表达
(1)由公司合成带有BamH I，SacⅡ，XhoI和SacI酶切位点的引物序列(见表1)。
(2)双串联终止子质粒的构建：将用于双串联的四条终止子序列经温度梯度退火连接成双链，之后将退火后的DNA双链与参照质粒PBP43-GFP-mcherry经BamH I和SacⅡ酶切得到的片段用T4连接酶连接，得到携带双串联串联终止子(表6)的测试质粒PBP43-GFP-Terms-mcherry，并进行DNA测序，DNA测序结果表明终止子片段成功连接到测试质粒PBP43-GFP-mcherry的GFP和mcherry之间的酶切位点，新的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体构建成功。
(3)在双串联终止子质粒的基础上构建三串联终止子：由公司合成带有XhoI和SacI酶切后序列的引物序列(表1)。将合成的终止子序列经温度梯度退火连接成双链，之后将退火后的DNA双链与双串联质粒PBP43-GFP-Terms-mcherry经XhoI和SacI酶切得到的片段用T4连接酶连接，构建携带终止子的测试质粒PBP43-GFP-Terms-mcherry，并进行DNA测序，DNA测序结果表明三串联终止子(表6)成功连接到测试质粒PBP43-GFP-mcherry的GFP和mcherry之间的酶切位点，新的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体构建成功。
(3)将得到的测序验证正确的重组质粒转入枯草芽孢杆菌168中，在37℃，静置培养12-14h后，挑取单菌落于5mL LB种子培养基中，37℃进行培养；按终OD600为0.02转接至含50mL LB培养基的250mL三角瓶中，200rpm，温度37℃，培养24小时。
测定筛选到的双串联和三串联终止子的终止效率(图5；表7)和荧光强度(图6、图7和表7、表8)，说明通过不同的串联方式，可以明显改变终止子的终止效率。例如，通过将弱终止子(TB10，TB6S2，TB2)与强终止子(TB5)的串联可以提高终止子的终止效率，获得具有不同终止效率的新型终止子，丰富终止库。
新型启动子对下游基因表达的抑制效果会更好，如添加TB2-TB5-TB5终止子时，比对照的下游mcherry表达量下降了337.58倍。通过这种三串联方式，可以达到完全抑制转录通读，使得下游mcherry几乎不表达，在基因表达中可以避免一些无意义的转录，从而最大限度的提高胞内资源的利用。
表6双串联、三串联终止子序列表
表7双串联和三串联终止子终止效率
终止子
终止效率
TB6S2-TB10
0.65
TB6S2-ST1.5b-TB10
0.67
TB6S2-TB5-TB10
0.90
TB5-TB10
0.95
TB5-ST1.5b-TB10
0.95
TB5-TB5-TB10
0.99
TB6S2-TB5
0.82
TB6S2-ST1.5b-TB5
0.82
TB6S2-TB5-TB5
0.97
TB2-TB5
0.98
TB2-ST1.5b-TB5
0.99
TB2-TB5-TB5
0.9
表8双串联和三串联终止子上游GFP荧光强度
表9双串联和三串联终止子下游mcherry荧光强度
终止子
下游mcherry荧光强度(Fl<sub>mcherry</sub>/OD<sub>600</sub>)
TB6S2-TB10
5696
TB6S2-ST1.5b-TB10
5534
TB6S2-TB5-TB10
1971
TB5-TB10
1578
TB5-ST1.5b-TB10
1416
TB5-TB5-TB10
196
TB6S2-TB5
3599
TB6S2-ST1.5b-TB5
3455
TB6S2-TB5-TB5
562
TB2-TB5
438
TB2-ST1.5b-TB5
112
TB2-TB5-TB5
45
实施例3：筛选到的终止子TB5与常用终止子rrnBT1的特征比较
(1)质粒PBP43-GFP-rrnBT1-mcherry的构建：以质粒PBP43-GFP-mcherry为模板，将公司合成的单链rrnBT1终止子序列经温度梯度退火连接成双链，之后将退火后的双链终止子序列与质粒PBP43-GFP-mcherry经BamH I和SacⅡ酶切得到的片段用T4连接酶切连接接，构建质粒PBP43-GFP-rrnBT1-mcherry；
(2)质粒PBP43-GFP-mcherry-TB5的构建：以参照质粒PBP43-GFP-mcherry为模板，把TB5终止子序列设计在引物上，通过全质粒PCR将mcherry下游的终止子rrnBT1替换为终止子TB5，构建质粒PBP43-GFP-mcherry-TB5；
(3)质粒PBP43-GFP-rrnBT1-mcherry-TB5的构建：以质粒PBP43-GFP-mcherry-TB5为模板，将公司合成的单链rrnBT1终止子序列经温度梯度退火连接成双链，之后将退火后的双链终止子序列与质粒PBP43-GFP-mcherry-TB5经BamH I和SacⅡ酶切得到的片段用T4连接酶连接，构建质粒PBP43-GFP-rrnBT1-mcherry-TB5；
(4)质粒PBP43-GFP-TB5-mcherry-TB5的构建：以质粒PBP43-GFP-mcherry-TB5为模板，将公司合成的单链TB5终止子序列经温度梯度退火连接成双链，之后将退火后的双链终止子序列与质粒PBP43-GFP-mcherry-TB5经BamH I和SacⅡ酶切得到的片段用T4连接酶连接，构建质粒PBP43-GFP-TB5-mcherry-TB5；
(5)将得到的测序验证正确的重组质粒转入枯草芽孢杆菌168中，在37℃，静置培养12-14h后，挑取单菌落于5mL LB种子培养基中，37℃进行培养；按终OD600为0.02转接至含50mL LB培养基的250mL三角瓶中，200rpm，温度37℃，培养24小时。测定终止子的终止效率(图8；表10)和荧光强度(图9、图10和表11和表12)，其中G-M-TB5为G-rrnB1-M-TB5和G-TB5-M-TB5的参照，其中G-M-rrnB1为G-rrnB1-M-rrnB1和G-TB5-M-rrnB1的参照，荧光检测结果表明筛选的终止子TB5的终止效率高于常用终止子rrnBT1，同时对下游mcherry表达的抑制效果更好。
表10终止子TB5与rrnBT1的终止效率比较
质粒
终止效率
PBP43-GFP-mcherry-TB5(G-M-TB5)
0
PBP43-GFP-rrnBT1-mcherry-TB5(G-rrnBT1-M-TB5)
0.83
PBP43-GFP-TB5-mcherry-TB5(G-TB5-M-TB5)
0.97
PBP43-GFP-mcherry-rrnBT1(G-M-rrnBT1)
0
PBP43-GFP-rrnBT1-mcherry-rrnBT1(G-rrnBT1-M-rrnBT1)
0.83
PBP43-GFP-TB5-mcherry-rrnBT1(G-TB5-M-rrnBT1)
0.97
表11终止子TB5与rrnBT1的上游GFP荧光强度比较
质粒
上游GFP荧光强度(Fl<sub>GFP</sub>/OD<sub>600</sub>)
PBP43-GFP-mcherry-TB5(G-M-TB5)
9485
PBP43-GFP-rrnBT1-mcherry-TB5(G-rrnBT1-M-TB5)
18433
PBP43-GFP-TB5-mcherry-TB5(G-TB5-M-TB5)
21708
PBP43-GFP-mcherry-rrnBT1(G-M-rrnBT1)
9841
PBP43-GFP-rrnBT1-mcherry-rrnBT1(G-rrnBT1-M-rrnBT1)
18975
PBP43-GFP-TB5-mcherry-rrnBT1(G-TB5-M-rrnBT1)
23465
表12终止子TB5与rrnBT1的下游mcherry荧光强度比较
质粒
下游mcherry荧光强度(Fl<sub>mcherry</sub>/OD<sub>600</sub>)
PBP43-GFP-mcherry-TB5(G-M-TB5)
11091
PBP43-GFP-rrnBT1-mcherry-TB5(G-rrnBT1-M-TB5)
3592
PBP43-GFP-TB5-mcherry-TB5(G-TB5-M-TB5)
639
PBP43-GFP-mcherry-rrnBT1(G-M-rrnBT1)
11275
PBP43-GFP-rrnBT1-mcherry-rrnBT1(G-rrnBT1-M-rrnBT1)
3629
PBP43-GFP-TB5-mcherry-rrnBT1(G-TB5-M-rrnBT1)
655
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种新终止子及其应用
<160> 81
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
caaacagcgg gaggatacag ccaattcttt tttttatgct ataa 44
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
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gaaaggactg catagccagt cttttctttt atttta 36
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成
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taatagaatg gtatttaaat gagaatgcta tcaatttttt gtagtcagc 49
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
agaaaccggt ctggctgcca gccggtttct ttttttattc 40
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
caggacaccg ttcaaattga acggtgtttt tctttgaaaa g 41
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
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acaaagctgc attcaatagt tgaatgcagc tttttcatta ttgga 45
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<213> 人工合成
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gtgaacattt gaaatccggc cctctctata gtatccttta cttcagatga aggatactag 60
agggggcttt ttttatgtca at 82
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<212> DNA
<213> 人工合成
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agcaaggact gctgaaaggg ctgacataag ccttttgccg gcggtccttt tttaattctg 60
at 62
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ctcaatccct tggcactaaa agtgtcaggg gattttttat gttaata 47
<210> 10
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
caaaagagga gttagtgcct ctgctcaggc actactcctc tttttgggat tttct 55
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
ccctcctgta ctaggagggt attttttt 28
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
gggagcctca aggctccctt tagttt 26
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
gatcacaaag agtaggtgta gcctactcgc 30
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
gggcgggtct tcccgcccta cttttt 26
<210> 15
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
tgccctgaat ggcttagttg ctgttcaggg cattttt 37
<210> 16
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
acaaactgcc cggtcctacg gtacgggttc tttttcatta ttgga 45
<210> 17
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg 60
gtgaacgctc tcctgagtag gacaaat 87
<210> 18
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
ccgcggacaa actgcccggt cctacggtac gggttctttt tcattattgg actcgaggag 60
tccgagctcc aaaagaggag ttagtgcctc tgctcaggca ctactcctct ttttgggatt 120
ttctggatcc 130
<210> 19
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
ccgcggcagg acaccgttca aattgaacgg tgtttttctt tgaaaagctc gaggagtccg 60
agctccaaaa gaggagttag tgcctctgct caggcactac tcctcttttt gggattttct 120
ggatcc 126
<210> 20
<211> 116
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
ccgcggacaa actgcccggt cctacggtac gggttctttt tcattattgg actcgaggag 60
tccgagctcc aggacaccgt tcaaattgaa cggtgttttt ctttgaaaag ggatcc 116
<210> 21
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
ccgcgggaaa ggactgcata gccagtcttt tcttttattt tactcgagga gtccgagctc 60
caggacaccg ttcaaattga acggtgtttt tctttgaaaa gggatcc 107
<210> 22
<211> 125
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
ccgcgggaaa ggactgcata gccagtcttt tcttttattt tactcgagga gtaggctaca 60
cctactcttt gtgagctcca ggacaccgtt caaattgaac ggtgtttttc tttgaaaagg 120
gatcc 125
<210> 23
<211> 142
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
ccgcgggaaa ggactgcata gccagtcttt tcttttattt tactcgagca ggacaccgtt 60
caaattgaac ggtgtttttc tttgaaaagg agctccagga caccgttcaa attgaacggt 120
gtttttcttt gaaaagggat cc 142
<210> 24
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
ccgcggcagg acaccgttca aattgaacgg tgtttttctt tgaaaagctc gaggagtagg 60
ctacacctac tctttgtgag ctccaaaaga ggagttagtg cctctgctca ggcactactc 120
ctctttttgg gattttctgg atcc 144
<210> 25
<211> 161
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 25
ccgcggcagg acaccgttca aattgaacgg tgtttttctt tgaaaagctc gagcaggaca 60
ccgttcaaat tgaacggtgt ttttctttga aaaggagctc caaaagagga gttagtgcct 120
ctgctcaggc actactcctc tttttgggat tttctggatc c 161
<210> 26
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 26
ccgcggacaa actgcccggt cctacggtac gggttctttt tcattattgg actcgaggag 60
taggctacac ctactctttg tgagctccaa aagaggagtt agtgcctctg ctcaggcact 120
actcctcttt ttgggatttt ctggatcc 148
<210> 27
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 27
ccgcggacaa actgcccggt cctacggtac gggttctttt tcattattgg actcgagcag 60
gacaccgttc aaattgaacg gtgtttttct ttgaaaagga gctccaaaag aggagttagt 120
gcctctgctc aggcactact cctctttttg ggattttctg gatcc 165
<210> 28
<211> 134
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 28
ccgcggacaa actgcccggt cctacggtac gggttctttt tcattattgg actcgaggag 60
taggctacac ctactctttg tgagctccag gacaccgttc aaattgaacg gtgtttttct 120
ttgaaaaggg atcc 134
<210> 29
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 29
ccgcggacaa actgcccggt cctacggtac gggttctttt tcattattgg actcgagcag 60
gacaccgttc aaattgaacg gtgtttttct ttgaaaagga gctccaggac accgttcaaa 120
ttgaacggtg tttttctttg aaaagggatc c 151
<210> 30
<211> 880
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 30
tccgcgggat tacggatcct aaacacaata gatagcagta gaaggaggta gagtatggtt 60
tctaaaggcg aagaagataa catggctatc atcaaagaat tcatgcgttt caaagttcat 120
atggaaggct ctgttaacgg ccatgaattc gaaatcgaag gcgaaggcga aggccgtcct 180
tacgaaggca cacaaacagc taaacttaaa gttacaaaag gcggccctct tcctttcgct 240
tgggatatcc tttctcctca attcatgtac ggctctaaag cttacgttaa acatcctgct 300
gatatccctg attaccttaa actttctttc cctgaaggct tcaaatggga acgtgttatg 360
aacttcgaag atggcggcgt tgttacagtt acacaagatt cttctcttca agatggcgaa 420
ttcatctaca aagttaaact tcgtggcaca aacttccctt ctgatggccc tgttatgcaa 480
aaaaaaacaa tgggctggga agcttcttct gaacgtatgt accctgaaga tggcgctctt 540
aaaggcgaaa tcaaacaacg tcttaaactt aaagatggcg gccattacga tgctgaagtt 600
aaaacaacat acaaagctaa aaaacctgtt caacttcctg gcgcttacaa cgttaacatc 660
aaacttgata tcacatctca taacgaagat tacacaatcg ttgaacaata cgaacgtgct 720
gaaggccgtc attctacagg cggcatggat gaactttaca aataagggcc catggtacgc 780
gtgctagagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat 840
ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat 880
<210> 31
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 31
caaacagcgg gaggatacag ccaattcttt tttttatgct ataa 44
<210> 32
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 32
gatcttatag cataaaaaaa agaattggct gtatcctccc gctgtttggc 50
<210> 33
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 33
gaaaggactg catagccagt cttttctttt atttta 36
<210> 34
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 34
gatctaaaat aaaagaaaag actggctatg cagtcctttc gc 42
<210> 35
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 35
taatagaatg gtatttaaat gagaatgcta tcaatttttt gtagtcagc 49
<210> 36
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 36
gatcgctgac tacaaaaaat tgatagcatt ctcatttaaa taccattcta ttagc 55
<210> 37
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 37
agaaaccggt ctggctgcca gccggtttct ttttttattc 40
<210> 38
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 38
gatcgaataa aaaaagaaac cggctggcag ccagaccggt ttctgc 46
<210> 39
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 39
caggacaccg ttcaaattga acggtgtttt tctttgaaaa g 41
<210> 40
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 40
gatccttttc aaagaaaaac accgttcaat ttgaacggtg tcctggc 47
<210> 41
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 41
acaaagctgc attcaatagt tgaatgcagc tttttcatta ttgga 45
<210> 42
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 42
gatctccaat aatgaaaaag ctgcattcaa ctattgaatg cagctttgtg c 51
<210> 43
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 43
gtgaacattt gaaatccggc cctctctata gtatccttta cttcagatga aggatactag 60
agggggcttt ttttatgtca at 82
<210> 44
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 44
gatcattgac ataaaaaaag ccccctctag tatccttcat ctgaagtaaa ggatactata 60
gagagggccg gatttcaaat gttcacgc 88
<210> 45
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 45
agcaaggact gctgaaaggg ctgacataag ccttttgccg gcggtccttt tttaattctg 60
at 62
<210> 46
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 46
gatcatcaga attaaaaaag gaccgccggc aaaaggctta tgtcagccct ttcagcagtc 60
cttgctgc 68
<210> 47
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 47
ctcaatccct tggcactaaa agtgtcaggg gattttttat gttaata 47
<210> 48
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 48
gatctattaa cataaaaaat cccctgacac ttttagtgcc aagggattga ggc 53
<210> 49
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 49
caaaagagga gttagtgcct ctgctcaggc actactcctc tttttgggat tttct 55
<210> 50
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 50
gatcagaaaa tcccaaaaag aggagtagtg cctgagcaga ggcactaact cctcttttgg 60
c 61
<210> 51
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 51
ccctcctgta ctaggagggt attttttt 28
<210> 52
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 52
gatcaaaaaa ataccctcct agtacaggag gggc 34
<210> 53
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 53
gggagcctca aggctccctt tagttt 26
<210> 54
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 54
gatcaaacta aagggagcct tgaggctccc gc 32
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 55
gagtaggcta cacctactct ttgt 24
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 56
gatcacaaag agtaggtgta gcctactcgc 30
<210> 57
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 57
gggcgggtct tcccgcccta cttttt 26
<210> 58
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 58
gatcaaaaag tagggcggga agacccgccc gc 32
<210> 59
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 59
tgccctgaat ggcttagttg ctgttcaggg cattttt 37
<210> 60
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 60
gatcaaaaat gccctgaaca gcaactaagc cattcagggc agc 43
<210> 61
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 61
ggcaggacac cgttcaaatt gaacggtgtt tttctttgaa aagctcgagg agtcc 55
<210> 62
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 62
ctcgagcttt tcaaagaaaa acaccgttca atttgaacgg tgtcctgccg c 51
<210> 63
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 63
ggacaaactg cccggtccta cggtacgggt tctttttcat tattggactc gaggagtcc 59
<210> 64
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 64
ctcgagtcca ataatgaaaa agaacccgta ccgtaggacc gggcagtttg tccgc 55
<210> 65
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 65
gggaaaggac tgcatagcca gtcttttctt ttattttact cgaggagtcc 50
<210> 66
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 66
ctcgagtaaa ataaaagaaa agactggcta tgcagtcctt tcccgc 46
<210> 67
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 67
tcgagcagga caccgttcaa attgaacggt gtttttcttt gaaaaggagc t 51
<210> 68
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 68
ccttttcaaa gaaaaacacc gttcaatttg aacggtgtcc tgc 43
<210> 69
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 69
gagctccaaa agaggagtta gtgcctctgc tcaggcacta ctcctctttt tgggattttc 60
tg 62
<210> 70
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 70
gatccagaaa atcccaaaaa gaggagtagt gcctgagcag aggcactaac tcctcttttg 60
gagctcggac tc 72
<210> 71
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 71
aattcgagta ggctacacct actctttgtg agct 34
<210> 72
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 72
cacaaagagt aggtgtagcc tactcg 26
<210> 73
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 73
aattccagga caccgttcaa attgaacggt gtttttcttt gaaaaggagc t 51
<210> 74
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 74
ccttttcaaa gaaaaacacc gttcaatttg aacggtgtcc tgg 43
<210> 75
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 75
caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg 60
gtgaacgctc tcctgagtag gacaaat 87
<210> 76
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 76
gatcatttgt cctactcagg agagcgttca ccgacaaaca acagataaaa cgaaaggccc 60
agtctttcga ctgagccttt cgttttattt ggc 93
<210> 77
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 77
caggacaccg ttcaaattga acggtgtttt tctttgaaaa gtctgtgcgg tatttcacac 60
<210> 78
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 78
ccgttcaatt tgaacggtgt cctgatgcct ctagcacgcg ta 42
<210> 79
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 79
acaaactgcc cggtcctacg gtacgggttc tttttcatta ttgga 45
<210> 80
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 80
gatctccaat aatgaaaaag aacccgtacc gtaggaccgg gcagtttgtg c 51
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 81
tccgcgggat tacggatcct 20
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