阅读说明：本技术 一种标记棉花细胞微丝骨架的转基因棉花标签株系的培育方法及其应用 (Cultivation method and application of transgenic cotton tag strain for marking cotton cell microfilament skeleton ) 是由 孔照胜 于艳军 吴慎杰 王光达 田娟 马银平 于 2019-02-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种标记棉花细胞微丝骨架的转基因棉花标签株系的培育方法及其应用。所述培育方法包括如下步骤：将融合蛋白的编码基因导入受体棉花中,得到所述转基因棉花；所述融合蛋白由拟南芥微丝结合蛋白Fimbrin-1的第二个微丝结合结构域ABD2与绿色荧光蛋白GFP融合而成。应用激光共聚焦成像系统能清晰地观察在棉花生长发育过程中活细胞中的微丝的动态变化,可用作为棉花生产和研究行业的标准株系。本发明获得的转基因棉花标签株系可用于棉花纤维生长机理、生长发育、细胞分裂、囊泡运输、细胞器运输等方面的研究,尤其对于棉花纤维发育过程中微丝的观察、分析和棉花纤维品质的提高都有重大的应用前景。(The invention discloses a cultivation method and application of a transgenic cotton tag strain for marking a cotton cell microfilament skeleton. The cultivation method comprises the following steps: introducing the encoding gene of the fusion protein into receptor cotton to obtain transgenic cotton; the fusion protein is formed by fusing a second microfilament binding structural domain ABD2 of an arabidopsis microfilament binding protein Fimbrin-1 and a green fluorescent protein GFP. The dynamic change of microfilaments in living cells in the growth and development process of cotton can be clearly observed by using a laser confocal imaging system, and the method can be used as a standard strain of cotton production and research industries. The transgenic cotton label strain obtained by the invention can be used for the research on the aspects of cotton fiber growth mechanism, growth and development, cell division, vesicle transportation, organelle transportation and the like, and particularly has great application prospect on the observation and analysis of microfilaments in the cotton fiber development process and the improvement of the quality of cotton fibers.)

一种标记棉花细胞微丝骨架的转基因棉花标签株系的培育方 法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种标记棉花细胞微丝骨架的转基因棉花标签株系的培育方法及其应用。

背景技术

棉花(Gossypium)是世界上重要的经济作物之一，也是仅次于粮食的第二大农作物。棉花主要由棉纤维组成，棉纤维的特性直接决定了棉花的品质。棉纤维的品质包括棉纤维长度、棉纤维细度、棉纤维强度等，这些都与棉花纤维细胞发育密切相关。

棉花纤维细胞是由胚珠外珠被表皮细胞特异分化发育而成的单细胞，是研究单细胞极性生长和纤维素合成的理想材料。在植物细胞中细胞骨架有两种：微管与微丝。研究表明，细胞骨架在纤维细胞伸长和纤维素合成中具有极其重要的作用。

微丝的主要成分是肌动蛋白，肌动蛋白以亚基的形式相互聚合形成螺旋结构，该结构处于不停变化状态。研究表明，微丝在细胞的***、分化及发育过程中起着调节作用，其相关基因的表达变化影响纤维细胞伸长。但前人的研究发现都是基于观察的化学方法固定的纤维细胞中的微丝，如果能够观察活体棉花纤维细胞中微丝在纤维发育过程中的动态变化，将极大地促进对棉花纤维细胞发育机制的深入了解，同时对棉花纤维品质的提高也具有重要意义。

发明内容

本发明利用绿色荧光蛋白GFP标记拟南芥微丝结合蛋白Fimbrin-1的第二个微丝结合结构域ABD2转化棉花，获得可观察棉花活体纤维细胞生长过程中微丝动态变化的转基因棉花。该转基因棉花植株所有叶表皮细胞、萼片细胞、花丝细胞、根细胞及棉花纤维细胞均有ABD2-GFP融合蛋白的表达，且应用激光共聚焦成像系统能清晰地观察在棉花生长发育过程中活细胞中微丝的动态变化。

本发明首先保护一种转基因棉花的培育方法。

本发明保护的转基因棉花的培育方法包括如下步骤：将融合蛋白的编码基因导入受体棉花中，得到所述转基因棉花；

所述融合蛋白由拟南芥微丝结合蛋白Fimbrin-1的第二个微丝结合结构域ABD2与荧光蛋白融合而成。

上述方法中，所述拟南芥微丝结合蛋白Fimbrin-1的第二个微丝结合结构域ABD2的氨基酸序列如序列2第1-339位所示。

上述方法中，所述荧光蛋白可为现有技术中的常见荧光蛋白，在本发明的一个具体实施例中，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白GFP，所述融合蛋白由拟南芥微丝结合蛋白Fimbrin-1的第二个微丝结合结构域ABD2与绿色荧光蛋白GFP融合而成。

进一步的，所述融合蛋白为如下a)或b)或c)或d)所示的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列2所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。

更进一步的，所述融合蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述融合蛋白的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述融合蛋白的蛋白质的DNA分子。

其中，所述DNA分子可以是cDNA分子、基因组DNA分子或重组DNA分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述融合蛋白的DNA分子进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码上述融合蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述融合蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述方法中，所述融合蛋白的编码基因通过重组载体导入受体棉花中。携带有所述编码基因的重组载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化受体植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

进一步的，所述重组载体为pCAMBIA1390-ABD2-GFP，该重组载体记载于文献“Orchestration of microtubules and the actin cytoskeleton in trichome cellshape determination by a plant-unique kinesin，2015，Elife”中。

上述方法中，所述受体棉花可为现有技术中常见的棉花品种。在本发明的一个具体实施例中，所述受体棉花为陆地棉R15。

本发明将上述重组载体pCAMBIA1390-ABD2-GFP转入农杆菌EHA105菌株中，利用农杆菌转化的方法得到了标记棉花微丝结合蛋白的转基因棉花。

本发明另一方面保护按照上述方法制备得到的转基因棉花或其繁殖后代的新用途。

本发明提供了转基因棉花或其繁殖后代在如下A1)-A5)中任一种中的应用：

A1)观察棉花细胞中的微丝的动态变化；

A2)观察在棉花生长发育过程中活细胞中的微丝的动态变化；

A3)研究棉花细胞的生长发育；

A4)研究棉花纤维的品质；

A5)研究棉花细胞的伸长方式和/或细胞***和/或囊泡运输和/或细胞器运输和/或细胞壁合成和/或生物与非生物胁迫反应。

上述应用中，所述棉花细胞可为棉花纤维细胞；进一步的，所述棉花纤维细胞可为棉花活体纤维细胞。

上述应用中，所述繁殖后代包括本发明获得的转基因棉花与其他棉花品种、株系、突变体等杂交产生的带有肌动蛋白微丝标签的棉花品种、株系和突变体。

本发明还保护如下1)-3)任一所述的生物材料：

1)上述融合蛋白；

2)上述融合蛋白的编码基因；

3)含有上述融合蛋白的编码基因的表达盒、重组载体或重组菌。

进一步的，所述3)中，所述重组载体可为pCAMBIA1390-ABD2-GFP；

所述重组菌可为含有所述pCAMBIA1390-ABD2-GFP的农杆菌EHA105。

上述生物材料在制备上述转基因棉花中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明将pCAMBIA1390-ABD2-GFP导入棉花中，得到高效、稳定表达荧光蛋白GFP标记肌动蛋白微丝结合蛋白的转基因棉花。应用激光共聚焦成像系统能清晰地观察在棉花生长发育过程中活细胞中微丝的动态变化，且所获得转基因棉花的生长发育、棉花纤维长度及棉花产量等均未受到影响，可作为棉花生产和研究行业的标准株系。本发明获得的转基因棉花可用于棉花纤维的细胞伸长方式、棉花纤维的生长机理、棉花细胞生长发育、细胞***、囊泡运输、细胞器运输、细胞壁合成以及生物和非生物胁迫反应等方面的研究，尤其对于棉花纤维发育过程中微丝的观察、分析和棉花纤维品质的提高都有重大的应用前景。

附图说明

图1为转基因棉花表型及不同器官中的肌动蛋白微丝。a、ABD2-GFP转基因棉花株系与野生型棉花植株表型对比，R-15为野生型陆地棉R15，L 8-83和L 9-16均为ABD2-GFP转基因棉花株系。b、ABD2-GFP转基因棉花与野生型棉花纤维长度的对比。c、ABD2-GFP转基因棉花根、叶、表皮毛、花丝、花冠、棉纤维中微丝的形态和分布。

图2为转基因棉花纤维细胞中微丝的排布。左1，ABD2-GFP转基因棉花纤维中微丝的排布，左2-4，ABD2-GFP转基因棉花棉纤维中微丝三维重构不同角度图。

图3为转基因棉花纤维细胞肌动蛋白微丝动态。左1，ABD2-GFP转基因棉花纤维中微丝的形态结构，左2-5，ABD2-GFP转基因棉花纤维中微丝动态时间序列展开图。

图4为转基因棉花叶片中的肌动蛋白微丝的形态和分布。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件的修改或者替换，均属于本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

下述实施例中的陆地棉R15记载于文献“Significant Improvement of CottonVerticillium Wilt Resistance by Manipulating the Expression of GastrodiaAntifungal Proteins，2016，Molecular Plant”中，公众可从申请人处获得。该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的重组载体pCAMBIA1390-ABD2-GFP记载于文献“Orchestration ofmicrotubules and the actin cytoskeleton in trichome cell shape determinationby a plant-unique kinesin，2015，Elife”中，公众可从申请人处获得。该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、转基因棉花植株的获得与鉴定

一、转基因棉花植株的获得

1、重组载体的构建

本发明的重组载体为pCAMBIA1390-ABD2-GFP，该重组载体pCAMBIA1390-ABD2-GFP表达融合蛋白ABD2-GFP。融合蛋白ABD2-GFP的氨基酸序列为序列2，融合蛋白ABD2-GFP的编码基因序列为序列1。

序列1所示的DNA分子依次由ABD2蛋白编码基因和GFP蛋白编码基因组成。其中序列1第1-1017位为ABD2蛋白编码基因，第1018-1737位为GFP蛋白编码基因。

序列2所示的氨基酸序列依次由ABD2蛋白的氨基酸序列和GFP蛋白的氨基酸序列组成。其中序列2第1-339位为ABD2蛋白的氨基酸序列，第340-578位为GFP蛋白的氨基酸序列。

2、重组菌的构建

将重组载体pCAMBIA1390-ABD2-GFP导入EHA105农杆菌(北京博迈德基因技术有限公司)中，得到重组菌pCAMBIA1390-ABD2-GFP/EHA105。

3、转化

采用农杆菌介导的方法将步骤2制备的重组菌pCAMBIA1390-ABD2-GFP/EHA105转化到陆地棉R15的下胚轴中，然后在含有卡那霉素的筛选培养基中培养诱导形成愈伤组织，选择转化的愈伤组织，愈伤组织在含有卡那霉素的筛选培养基中形成胚性愈伤组织，培养进而得到T0代转基因棉花植株，收获T1代转基因棉花植株种子。

二、转基因棉花植株的鉴定

1、真叶中GFP荧光信号检测

种植T1代转基因棉花植株种子，得到T1代转基因棉花幼苗，应用转盘式共聚焦显微镜观察T1代转基因棉花幼苗的第一片真叶，检测GFP荧光信号，结果如图4所示。

2、其它部位中GFP荧光信号检测

对于步骤1检测到GFP荧光信号的植株，应用转盘式共聚焦显微镜进一步检测表皮毛、萼片、花冠、根、花丝、纤维中GFP荧光信号，结果如图1c所示。

上述部位均检测到GFP荧光信号的转基因植株为阳性转基因棉花植株。共获得12个阳性转基因棉花植株。

3、阳性转基因棉花植株的其它表型检测

对T1代阳性转基因棉花植株的生长发育、棉花纤维长度和棉花产量进行了观察和检测。同时以野生型陆地棉R15为对照。

结果表明：所获阳性转基因棉花株系的生长发育、棉花纤维长度和棉花产量与野生型陆地棉R15相比没有显著性差异(图1a和1b)。说明外源DNA分子的导入并没有显著影响棉花植株的生长发育、棉花纤维长度和棉花产量。

实施例2、转基因棉花肌动蛋白微丝的观察

观察实施例1获得的阳性转基因棉花植株中的肌动蛋白微丝的结合蛋白。具体步骤如下：取开花后1-3天的T1代阳性转基因棉花植株的棉桃，剥去果皮，取一个胚珠，用手术刀片切取一层纤维细胞，置于载玻片上，加上盖玻片，用蜡封好，应用转盘式共聚焦显微镜观察纤维细胞中的GFP荧光信号，应用三维重构不同角度观察棉花纤维细胞中肌动蛋白微丝的分布。应用多层扫描和连续拍摄棉花纤维细胞，观察棉花纤维细胞生命活动过程中肌动蛋白微丝的分布和动态变化，应用光漂白荧光信号，观察荧光信号的恢复，得到棉花纤维顶端的生长与微丝的生长之间的联系。

结果表明：应用三维重构不同角度观察到了阳性转基因棉花植株的棉花纤维细胞中肌动蛋白微丝的分布(图2)；应用激光共聚焦成像系统能清晰地观察到阳性转基因棉花活体细胞中微丝的动态变化，棉纤维在生长过程中，微丝排布逐渐与生长方向平行，在棉纤维顶端，微丝是闭合的(图3)。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种标记棉花细胞微丝骨架的转基因棉花标签株系的培育方法及其应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1737

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atggagatcg ttgaaggatc ttcaactttg aatcttgcct ttgtggcaca aatcttccat 60

gaaaggaatg gtctaaacaa ggatggtaag tatgcatttg cggagatgat gaccgaagac 120

gtagagactt gtagagatga acgatgctac cggctatgga tcaacagcct cgggattgac 180

agttatgtca ataatgtatt tgaagatgtt agaaatggat ggattcttct tgaggttctt 240

gacaaggtct ctcccagttc agtcaactgg aagcatgctt ccaaaccacc gattaagatg 300

ccgtttagaa aagtagagaa ctgcaatcaa gtcataaaga tcgggaaaca gctaaaattc 360

tcacttgtaa atgtagctgg aaatgacata gttcaaggga ataagaagct cattcttggt 420

ctcttatggc agttgatgag attccatatg ctccaacttc tcaagagtct cagatctcgg 480

acactaggta aagagatgac tgatgcagat atcctcagct gggccaacag gaaagtaaga 540

acaatgggac gaaaattgca aatcgagagt ttcaaggaca agagtctatc gagtgggtta 600

ttcttcctca accttctatg ggcggttgaa ccaagagttg tgaactggaa tcttgtcacc 660

aagggtgaaa cagatgatga gaagaggttg aatgctacat acatagttag tgtcgcaaga 720

aagctcggtt gttcggtttt cttgttacct gaagatatcg tggaggtgaa tcagaagatg 780

atcctaattt taacggcaag tataatgtac tggagtcttc agagacattc acgggagagt 840

tcagattcgt cgtcaactca gagcaccaca acgacgtgca ccagcacagc ctcgtcccct 900

gccccatctg tcacagaaga ggaggaagtc tcctcattga gcggtgaagt cacgagcttg 960

gccgttggtg atgcggtttc tgaaatcacc acggtctcag aggaagcatc catcgaaatg 1020

gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 1080

gacgtgaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 1140

aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 1200

gtgaccacct tcacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 1260

cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 1320

aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 1380

aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 1440

ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 1500

atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 1560

cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 1620

ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 1680

ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact cacggcatgg acgagctgta caagtaa 1737

<210>2

<211>578

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Glu Ile Val Glu Gly Ser Ser Thr Leu Asn Leu Ala Phe Val Ala

1 5 10 15

Gln Ile Phe His Glu Arg Asn Gly Leu Asn Lys Asp Gly Lys Tyr Ala

20 25 30

Phe Ala Glu Met Met Thr Glu Asp Val Glu Thr Cys Arg Asp Glu Arg

35 40 45

Cys Tyr Arg Leu Trp Ile Asn Ser Leu Gly Ile Asp Ser Tyr Val Asn

50 55 60

Asn Val Phe Glu Asp Val Arg Asn Gly Trp Ile Leu Leu Glu Val Leu

65 70 75 80

Asp Lys Val Ser Pro Ser Ser Val Asn Trp Lys His Ala Ser Lys Pro

85 90 95

Pro Ile Lys Met Pro Phe Arg Lys Val Glu Asn Cys Asn Gln Val Ile

100 105 110

Lys Ile Gly Lys Gln Leu Lys Phe Ser Leu Val Asn Val Ala Gly Asn

115 120 125

Asp Ile Val Gln Gly Asn Lys Lys Leu Ile Leu Gly Leu Leu Trp Gln

130 135 140

Leu Met Arg Phe His Met Leu Gln Leu Leu Lys Ser Leu Arg Ser Arg

145 150 155 160

Thr Leu Gly Lys Glu Met Thr Asp Ala Asp Ile Leu Ser Trp Ala Asn

165 170 175

Arg Lys Val Arg Thr Met Gly Arg Lys Leu Gln Ile Glu Ser Phe Lys

180 185 190

Asp Lys Ser Leu Ser Ser Gly Leu Phe Phe Leu Asn Leu Leu Trp Ala

195 200 205

Val Glu Pro Arg Val Val Asn Trp Asn Leu Val Thr Lys Gly Glu Thr

210 215 220

Asp Asp Glu Lys Arg Leu Asn Ala Thr Tyr Ile Val Ser Val Ala Arg

225 230 235 240

Lys Leu Gly Cys Ser Val Phe Leu Leu Pro Glu Asp Ile Val Glu Val

245 250 255

Asn Gln Lys Met Ile Leu Ile Leu Thr Ala Ser Ile Met Tyr Trp Ser

260 265 270

Leu Gln Arg His Ser Arg Glu Ser Ser Asp Ser Ser Ser Thr Gln Ser

275 280 285

Thr Thr Thr Thr Cys Thr Ser Thr Ala Ser Ser Pro Ala Pro Ser Val

290 295 300

Thr Glu Glu Glu Glu Val Ser Ser Leu Ser Gly Glu Val Thr Ser Leu

305 310 315 320

Ala Val Gly Asp Ala Val Ser Glu Ile Thr Thr Val Ser Glu Glu Ala

325 330 335

Ser Ile Glu Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val

340 345 350

Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser

355 360 365

Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu

370 375 380

Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu

385 390 395 400

Val Thr Thr Phe Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp

405 410 415

His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr

420 425 430

Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr

435 440 445

Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu

450 455 460

Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys

465 470 475 480

Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys

485 490 495

Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu

500 505 510

Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile

515 520 525

Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln

530 535 540

Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu

545 550 555 560

Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu

565 570 575

Tyr Lys