阅读说明：本技术 一种示踪棉花细胞中微管正极端的转基因棉花标签株系的培育方法及其应用 (Cultivation method and application of transgenic cotton tag strain tracing positive end of microtubule in cotton cell ) 是由 孔照胜 于艳军 冯志迪 王光达 田娟 马银平 于 2019-02-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种示踪棉花细胞中微管正极端的转基因棉花标签株系的培育方法及其应用。所述方法包括如下步骤：将融合蛋白的编码基因导入受体棉花中,得到所述转基因棉花；所述融合蛋白由微管正极端结合蛋白EB1b与荧光蛋白mCherry融合而成。应用激光共聚焦成像系统能清晰地观察到转基因棉花活体细胞中的微管蛋白在棉花生命活动过程中的动态变化,且所获得转基因棉花并不影响棉花的生长发育、棉花纤维长度及棉花产量,可作为棉花生产和研究行业的标准株系。本发明获得的转基因棉花可用于棉花生长发育、细胞分裂、细胞器运输等方面的研究,特别是可用于棉花纤维发育过程中微管动态分析,在棉花纤维品质改良的机制研究方面有重要应用价值。(The invention discloses a cultivation method and application of a transgenic cotton tag strain for tracing the positive end of a microtubule in a cotton cell. The method comprises the following steps: introducing the encoding gene of the fusion protein into receptor cotton to obtain transgenic cotton; the fusion protein is formed by fusing a microtubule positive terminal binding protein EB1b and a fluorescent protein mCherry. The laser confocal imaging system can clearly observe the dynamic change of tubulin in the living cells of the transgenic cotton in the life activity process of the cotton, and the obtained transgenic cotton does not influence the growth and development of the cotton, the length of cotton fibers and the yield of the cotton and can be used as a standard strain in the cotton production and research industry. The transgenic cotton obtained by the invention can be used for research on cotton growth and development, cell division, organelle transportation and the like, particularly can be used for microtubule dynamic analysis in the cotton fiber development process, and has important application value in the mechanism research aspect of cotton fiber quality improvement.)

一种示踪棉花细胞中微管正极端的转基因棉花标签株系的培 育方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种示踪棉花细胞中微管正极端的转基因棉花标签株系的培育方法及其应用。

背景技术

棉花(Gossypium)是世界上重要的经济作物之一，也是全球纺织工业最主要的天然纤维来源。棉花的主要产品是棉纤维，棉纤维的特性直接决定了棉花的品质。棉纤维的品质包括棉纤维长度、棉纤维细度、棉纤维强度等，这些都与棉花纤维细胞发育密切相关。

棉花纤维细胞是由胚珠外珠被表皮细胞特异分化发育而成的单细胞，是研究单细胞极性生长和纤维素合成的理想材料。在植物细胞中细胞骨架有两种：微管与微丝。研究表明，微管骨架与植物细胞生长方向的决定以及纤维素合成密切相关，因此研究棉花纤维细胞中微管的结构及动态特性对于解析棉花纤维细胞生长机制以及棉花纤维遗传改良具有重要意义。

微管的主要成分是微管蛋白，微管蛋白主要包括α-微管蛋白、β-微管蛋白和微管结合蛋白。在植物细胞中，微管处于不断的变化中。微管蛋白两端的亚基不断的聚合和解聚，聚合速度大于解聚速度的一端为微管的正极端。

发明内容

本发明利用荧光蛋白标记棉花细胞中正在生长的微管的正极端，获得可观察活体棉花纤维细胞生长过程中微管动态的转基因棉花。该转基因棉花所有叶表皮细胞、棉花纤维细胞等组织均有mCherry-EB1b融合蛋白的表达，且应用激光共聚焦成像系统能清晰地观察到在棉花生长发育过程中活细胞中微管的动态变化。

本发明首先保护一种转基因棉花微管标签株系的培育方法。

本发明保护的转基因棉花微管标签株系的培育方法包括如下步骤：将融合蛋白的编码基因导入受体棉花中，得到所述转基因棉花；

所述融合蛋白由微管正极端结合蛋白EB1b与荧光蛋白融合而成。

上述方法中，所述微管正极端结合蛋白EB1b(氨基酸序列如序列2第241-529位所示)可以结合正在生长的微管的正极端，通过将其与荧光蛋白在棉花细胞中融合表达，即可观察棉花细胞中的微管的动态变化。

上述方法中，所述荧光蛋白可为现有技术中的常见荧光蛋白，在本发明的一个具体实施例中，所述荧光蛋白为红色荧光蛋白mCherry，所述融合蛋白由微管正极端结合蛋白EB1b与红色荧光蛋白mCherry融合而成。

进一步的，所述融合蛋白为如下a)或b)或c)或d)所示的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列2所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。

更进一步的，所述融合蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1第1370-4533位所示的DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述融合蛋白的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述融合蛋白的蛋白质的DNA分子。

其中，所述DNA分子可以是cDNA分子、基因组DNA分子或重组DNA分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述融合蛋白的DNA分子进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码上述融合蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述融合蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或 85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比 (％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述方法中，所述融合蛋白的编码基因通过重组载体导入受体棉花中。携带有所述编码基因的重组载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化受体植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

进一步的，所述重组载体为将含有融合蛋白的编码基因的DNA片段***表达载体中得到的载体。

更进一步的，所述含有融合蛋白的编码基因的DNA片段依次包括用于启动所述融合蛋白的编码基因表达的启动子、荧光蛋白mCherry编码基因和微管正极端蛋白EB1b 编码基因。

在本发明的一个具体实施例中，所述重组载体具体为pGWB1-P_EB1b:mCherry-EB1b，其为用序列1所示的DNA分子替换pGWB1表达载体的attB1和attB2位点之间的DNA 片段后得到的载体。

上述方法中，所述受体棉花可为现有技术中常见的棉花品种，在本发明的一个具体实施例中，所述受体棉花为新彩棉7号。

本发明另一方面保护按照上述方法制备得到的转基因棉花或其繁殖后代的新用途。

本发明提供了转基因棉花或其繁殖后代在如下A1)-A5)中任一种中的应用：

A1)观察棉花细胞中的微管的动态变化；

A2)观察在棉花生长发育过程中活细胞中的微管的动态变化；

A3)研究棉花细胞的生长发育；

A4)研究棉花纤维的品质；

A5)研究棉花细胞的伸长方式和/或细胞***和/或囊泡运输和/或细胞器运输和/或细胞壁合成和/或生物与非生物胁迫反应。

上述应用中，所述棉花细胞可为棉花纤维细胞；进一步的，所述棉花纤维细胞可为棉花活体纤维细胞。

上述应用中，所述繁殖后代包括本发明获得的转基因棉花与其他棉花品种、株系、突变体等杂交产生的带有微管正极端标签的棉花品种、株系和突变体。

本发明还保护如下1)-5)任一所述的生物材料：

1)上述融合蛋白；

2)上述融合蛋白的编码基因；

3)含有上述融合蛋白的编码基因的表达盒、重组载体或重组菌；

4)序列1所示的DNA分子；

5)含有序列1所示的DNA分子的重组载体或重组菌。

进一步的，所述4)中，所述重组载体为将序列1所示的DNA分子***表达载体中得到的载体；

所述重组菌为含有所述重组载体的重组菌。

更进一步的，所述重组载体可为pGWB1-P_EB1b:mCherry-EB1b；

所述重组菌为含有所述pGWB1-P_EB1b:mCherry-EB1b的农杆菌GV3101。

上述生物材料在制备上述转基因棉花中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的有益效果：本发明基于微管正极端结合蛋白EB1b可以结合正在生长的微管的正极端，利用荧光蛋白标记棉花细胞中正在生长的微管的正极端，通过特异示踪正在生长的微管正极端来标记棉花细胞微管，培育转基因棉花株系，并且应用于研究棉花纤维细胞中微管的结构及动态特性，不仅可以标记微管，而且可以揭示微管的动态。对于解析棉花纤维细胞生长机制以及棉花纤维遗传改良具有重要意义。

本发明将重组载体pGWB1-P_EB1b:mCherry-EB1b导入棉花中，得到高效、稳定表达荧光蛋白mCherry标记微管蛋白正极端的转基因棉花。应用激光共聚焦成像系统能清晰地观察在棉花生长发育过程中活细胞中微管的动态变化，且所获得转基因棉花并不影响棉花的生长发育、棉花纤维长度及棉花产量，可作为棉花生产和研究行业的标准株系。本发明获得的转基因棉花可用于棉花纤维的细胞伸长方式、棉花纤维的生长机理、棉花细胞生长发育、细胞***、囊泡运输、细胞器运输、细胞壁合成以及生物和非生物胁迫反应等方面的研究，尤其在棉花纤维发育过程中微管的活体观察、动态分析和棉花纤维品质的遗传改良方面都有重大的应用前景。

附图说明

图1为转基因棉花表型及叶片和纤维中的微管蛋白。C7是野生型新彩棉7号；L1-1-2为mCherry-EB1b转基因棉花株系。1a、mCherry-EB1b转基因棉花株系与野生型棉花植株表型对比。1b、棉花纤维中mCherry-EB1b标记的微管。1c、棉花纤维中 mCherry-EB1b的微管三维重构图。1d、叶片中的微管正极端。1e、叶片中的微管。

图2为转基因棉花纤维中微管正极端的分布和微管蛋白的排布。2a、开花当天棉纤维细胞中微管的排布。2b、开花2天棉纤维细胞中微管的排布。2c、开花当天棉纤维细胞中微管的Kymograph图。2d、开花两天棉纤维细胞中微管的Kymograph图。2e、棉纤维发育过程中微管排布模型。

图3为重组质粒pGWB1-P_EB1b:mCherry-EB1b的图谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件的修改或者替换，均属于本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的新彩棉7号记载于文献“绿色棉新彩棉7号体细胞胚胎发生及其植株再生，2013年，棉花学报”中，公众可从申请人处获得。该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的pGWB1表达载体记载于文献“Development of Series ofGateway Binary Vectors,pGWBs,for Realizing Efficient Construction of FusionGenes for Plant Transformation，2007年，JOURNAL OF BIOSCIENCE ANDBIOENGINEERING”中，公众可从申请人处获得。该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、转基因棉花植株的获得与鉴定

一、转基因棉花植株的获得

1、重组质粒的构建

pGWB1-P_EB1b:mCherry-EB1b的具体构建方法如下：用序列1所示的DNA分子替换pGWB1 表达载体的attB1和attB2位点之间的DNA片段，得到重组质粒 pGWB1-P_EB1b:mCherry-EB1b。重组质粒pGWB1-P_EB1b:mCherry-EB1b的图谱如图3所示。

序列1所示的DNA分子依次由启动子、荧光蛋白mCherry编码基因和微管正极端蛋白EB1b编码基因连接而成。其中序列1第1-1369位为启动子序列，第1370-2077 位为荧光蛋白mCherry编码基因序列，第2078-2089位为编码GAGA接头的序列，第 2090-4533位为微管正极端蛋白EB1b编码基因序列。

重组质粒pGWB1-P_EB1b:mCherry-EB1b表达融合蛋白mCherry-EB1b，融合蛋白mCherry-EB1b是荧光蛋白mCherry与微管正极端蛋白EB1b融合形成的蛋白质，其氨基酸序列如序列2所示。序列2第1-236位为荧光蛋白mCherry的氨基酸序列，第 241-529位为微管正极端蛋白EB1b的氨基酸序列。

2、重组菌的构建

将步骤1制备的重组质粒pGWB1-P_EB1b:mCherry-EB1b导入农杆菌GV3101(北京博迈德基因技术有限公司)中，得到重组菌pGWB1-P_EB1b:mCherry-EB1b/GV3101。

3、转化

采用农杆菌介导的方法将步骤2制备的重组菌pGWB1-P_EB1b:mCherry-EB1b/GV3101转化到新彩棉7号的下胚轴中，然后在含有潮霉素的筛选培养基中培养诱导形成愈伤组织，选择转化的愈伤组织，愈伤组织在含有潮霉素的筛选培养基中形成胚性愈伤组织，培养进而得到T0代转基因棉花植株，收获T1代转基因棉花植株种子。

二、转基因棉花植株的鉴定

1、真叶中mCherry-EB1b荧光信号检测

种植T1代转基因棉花植株种子，得到T1代转基因棉花幼苗，应用转盘式共聚焦显微镜观察T1代转基因棉花幼苗的第一片真叶，检测mCherry-EB1b荧光信号(图1d)。

2、其它部位中mCherry-EB1b荧光信号检测

对于步骤1检测到荧光信号的植株，应用转盘式共聚焦显微镜进一步检测棉花纤维中mCherry-EB1b荧光信号(图1b、1c)。共获得7个阳性转基因棉花株系。

3、阳性转基因植株的其它表型检测

对T1代阳性转基因棉花植株的生长发育情况进行观察。同时以野生型新彩棉7 号为对照。

结果表明：所获阳性转基因株系表型与野生型新彩棉7号相比没有显著性差异，说明外源DNA分子的导入并没有显著影响棉花植株的生长发育。

实施例2、转基因棉花微管骨架的观察

观察实施例1获得的阳性转基因植株中的微管正极端蛋白。具体步骤如下：取开花后1-3天的T1代阳性转基因植株的棉桃，剥去果皮，取一个胚珠，用手术刀片切取一层纤维细胞，置于载玻片上，加上盖玻片，用蜡封好，应用转盘式共聚焦显微镜观察纤维细胞中的mCherry-EB1b信号，应用三维重构不同角度观察棉花纤维细胞中EB1b标记的微管的分布，应用连续拍摄棉花纤维细胞中的EB1b来揭示微管的动态组织。

结果表明：应用激光共聚焦成像系统能清晰地观察在棉花生长发育过程中活细胞中微管的动态变化，在棉花叶片气孔中，微管呈放射状排列(图1e)；在棉纤维细胞突起期(开花当天)，微管在棉花纤维细胞内散乱排列(图2a，c)，随着棉纤维的伸长(开花两天)，微管在纤维中排布逐渐与纤维伸长方向垂直(图2b，d)，从而得到棉纤维发育过程中微管排布模型(图2e)。

本发明制备的阳性转基因植株可作为转基因棉花标签株系，用于观察在棉花生长发育过程中活体棉花纤维细胞中微管的动态变化，为进一步分析棉花纤维生长发育与微管动态的联系奠定基础。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种示踪棉花细胞中微管正极端的转基因棉花标签株系的培育方法及其应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>4533

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

ggtaagagtc tagactagct atgatcaatt tagtatcgta tattgctttc ttcctcgacc 60

aatgatgaga gaattcagaa acgaggtttt gatagcgtag ctcaccgctc agtcgctcac 120

gggctcggag tagatatatt ttctttcaat attcgtcgac ttactcgact ataaacaagc 180

agtatgaaga agagttgaca ctaaagaaat ggtaaagcca aaaatcttat agctgtaaag 240

agaataagaa tgagtaggtg tactagccat atattcgttt tcttaccacg ttaccaaaag 300

cattgtgtgt ttgaaccgga gctaattaat ttgattctat tcacatattg tatttacata 360

catcatgtga agtctgtcat ggaaataaat gtctcttttc atcgtcacga aaatatgttt 420

aatttgatgt tgtcattctt aaatgatttt ctactttatt gttaacaaaa gaaattgatt 480

tcctacctta cacatatctt gttggtaaaa tagacaacta attttaatac cctcatctca 540

ataaatgcta tttacactaa ataaagtctg atatgagaaa tgttacagaa tgcaataaac 600

agaaagaaat aaaaaaaaat tgcaacaaaa aatcattctc aattggggaa gaaaataaag 660

tcgaaatgat aagtttcata agaaatgtat attttaccat gtttactaaa aggcaagacc 720

cacgtgggaa ggcgttacat attacacagt ccaaatcagc atcgttatta ttgtgaactc 780

tcacattagc tgttaccgaa actaaccaac aacaagtttt tgcctctttg aggacattta 840

aatatagaga aattgtttct ttctttgatt ttttaaaaaa taaaagaaaa atcaaaactt 900

agtctattaa gcatcggtca ttatcacaaa tgtaatccta agcatccgta tctaataagt 960

taagagtaat ttatccacac atagagtttt ttttttaaaa ataattattt attttcttta 1020

agtgtaacga ctaataaaat aagttataat taaattaaga atcaaattct ctctatcttt 1080

tgcacttttt cttctttgtc tatctctctc tctctctatc tctaaccttt gcttctccgt 1140

ccttttctct gcttcagttt tctcttccta acaagcaaaa cccgaaacag atcgaaccat 1200

ttttttcctt tagaaattaa acaacaaaaa tcattttttt gtttgttttc ggtttcacct 1260

aaccaaattg attctcttac ctttttatat cacattgcat ctgggtttcc attagaaaca 1320

acaacaaacg aaaaaagagg cttctttcgt ttcagagagg ggttcaaaaa tggtgagcaa 1380

gggcgaggag gataacatgg ccatcatcaa ggagttcatg cgcttcaagg tgcacatgga 1440

gggctccgtg aacggccacg agttcgagat cgagggcgag ggcgagggcc gcccctacga 1500

gggcacccag accgccaagc tgaaggtgac caagggtggc cccctgccct tcgcctggga 1560

catcctgtcc cctcagttca tgtacggctc caaggcctac gtgaagcacc ccgccgacat 1620

ccccgactac ttgaagctgt ccttccccga gggcttcaag tgggagcgcg tgatgaactt 1680

cgaggacggc ggcgtggtga ccgtgaccca ggactcctcc ctgcaggacg gcgagttcat 1740

ctacaaggtg aagctgcgcg gcaccaactt cccctccgac ggccccgtaa tgcagaagaa 1800

gaccatgggc tgggaggcct cctccgagcg gatgtacccc gaggacggcg ccctgaaggg 1860

cgagatcaag cagaggctga agctgaagga cggcggccac tacgacgctg aggtcaagac 1920

cacctacaag gccaagaagc ccgtgcagct gcccggcgcc tacaacgtca acatcaagtt 1980

ggacatcacc tcccacaacg aggactacac catcgtggaa cagtacgaac gcgccgaggg 2040

ccgccactcc accggcggca tggacgagct gtacaaggga gcaggagcaa tggcgacgaa 2100

cattgggatg atggatagtg cttactttgt tggaaggaat gagattctga gttggatcaa 2160

tgaccgcctt catctcaatc tctctcgtat cgaagaggta cttttataaa aaaattgctg 2220

gattttgtaa tctgcatgtt tgtttccatg gatagatttc tccattgtgt gcattgtcat 2280

ggaattgatt tataaaggac gtgcctttcg ctttaaaagg gttttgtttt gataatgtcg 2340

gtggcttaag aggattgatt ttgaggaatg tgttgttgat ctggtgcaat tttgtttggt 2400

aatttggggg gaattgggtt tctggaattt gatttcttgt catgatccaa cagatttgtc 2460

ggtgtggtcc tctcactcga tttcttgaaa tgatattgct gatctataca acaagtgttt 2520

tggggggaac tggtttatct ttggttctgt ctgatagtta aggtgttttt gtgtgtgtta 2580

agatgcaact tcattgattc tctgatggtt cttgctctgt gtgtgtgtat ttgatgattc 2640

aatgcttagc tagcttttgg aagcaaactc atgttagttg ttgaaatgtg ttattgttct 2700

ggacctccca agttaaaaag attcattttt tcttagttgt ttgattttcg actgatacac 2760

ttgcaagtaa gcattgaaac tgttgtaatt cgtcttgctt gtgagattgt ttatctaagt 2820

ggcttatggt tgggttttgc taggctgcat caggtgctgt gcaatgtcaa atgttggaca 2880

tgacttttcc aggagttgtg ccaatgcaca aggtgatttt attattcaca ttttatcggc 2940

atctcttgtt tgcttttttc acagagcaat ctaaatctcc cactttttag gttaactttg 3000

aagcaaagaa cgagtacgaa atgatacaaa actacaaggt catgcaagaa gtcttcacca 3060

aattgaaaat tacaaaggta cttctttctc ttagatatca ttacattttg cttgggataa 3120

agtttctgtg tgctaatgct ttcaaatatg tatattactc acaatgctgt tgtcttagcc 3180

attggaagtc aacaggcttg tcaaaggccg accactagac aatttggagt ttcttcaatg 3240

gttgaaacgt ttttgcgatt caataaatgg cggcattatg aacgagtatg gacttttata 3300

cctattctct caacttttaa tccaagaaca agtaaaagtc ttcttaccat caatccaatg 3360

gtttcatcat tgtaggaatt ataatccagt agaacgaaga tcaagaggtg ggagagagaa 3420

aagcgtaaag ggatctagta agatctcaaa gtcattgcaa acaaacaata tgcatcatcc 3480

tcctgtggct acttccaaca aaccagctgg tatgcctttg aatttgcttc tcttatccta 3540

ttgcttgcct atccaaattt tctcaaggtc attgaaaatt ataactccta ggtcccaagc 3600

aagcaaaatc acatggaatt ggaggtggga gcaactcatc agccgaagtg caagctctgt 3660

caaaggaggt aatcaaacat ctaatcatcc ctcttaacca ttcggtttca ttcttttctt 3720

cttgttaatg aagatagact tataatgaaa ttttcttttc acaataccag gtagaagatc 3780

tcaaggtctc ggttgatctc ttggaaaaag aaagagattt ttacttctct aagctccggg 3840

atatagagat actatgtcag actcctgaac tcgatgatct tccggtaaat gtcatcattt 3900

ttgttgttga tatgctgtct ttgtttttct tagtttgaac tcaaaccata tatgattttg 3960

ttgaaaccac aatgtgtgca gatagtggta gcggttaaga agatattata cgcaaccgat 4020

gcaaatgaat ctgtgctaga agaagctcaa gagtgcctaa accagtctct agggcttgag 4080

ggttatgaag aagaaggaaa agaggaggaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagca 4140

gcagctgctg cagagaccca aacttaaagt tgtgacaaat aaaagtagag ggcaacaatg 4200

atccattgcc ttgtcttaga agatagaatc acttggagag gatgtttgca caatattcaa 4260

tttaccctaa ccggtttttt ggttttacag tgaactgaac cgaatttatt ccttcctaaa 4320

cttgaaagat tatctgatgg attttcattg tatcacaaaa atgattttat taaatgttcc 4380

ccaataagta aaattaaaaa ttacaaaata aatagtacca ttgtattatt aaagggtaat 4440

gtataatcct accctcagac ctggccatac gatatacttt ataattaagg acttgttgaa 4500

ttttcacttt aaagaaatac aaagtaatgg tat 4533

<210>2

<211>529

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe

1 5 10 15

Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe

20 25 30

Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr

35 40 45

Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp

50 55 60

Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His

65 70 75 80

Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe

85 90 95

Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val

100 105 110

Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys

115 120 125

Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys

130 135 140

Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly

145 150 155 160

Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly

165 170 175

His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val

180 185 190

Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser

195 200 205

His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly

210 215 220

Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Met Ala Thr Asn

225 230 235 240

Ile Gly Met Met Asp Ser Ala Tyr Phe Val Gly Arg Asn Glu Ile Leu

245 250 255

Ser Trp Ile Asn Asp Arg Leu His Leu Asn Leu Ser Arg Ile Glu Glu

260 265 270

Ala Ala Ser Gly Ala Val Gln Cys Gln Met Leu Asp Met Thr Phe Pro

275 280 285

Gly Val Val Pro Met His Lys Val Asn Phe Glu Ala Lys Asn Glu Tyr

290 295 300

Glu Met Ile Gln Asn Tyr Lys Val Met Gln Glu Val Phe Thr Lys Leu

305 310 315 320

Lys Ile Thr Lys Pro Leu Glu Val Asn Arg Leu Val Lys Gly Arg Pro

325 330 335

Leu Asp Asn Leu Glu Phe Leu Gln Trp Leu Lys Arg Phe Cys Asp Ser

340 345 350

Ile Asn Gly Gly Ile Met Asn Glu Asn Tyr Asn Pro Val Glu Arg Arg

355 360 365

Ser Arg Gly Gly Arg Glu Lys Ser Val Lys Gly Ser Ser Lys Ile Ser

370 375 380

Lys Ser Leu Gln Thr Asn Asn Met His His Pro Pro Val Ala Thr Ser

385 390 395 400

Asn Lys Pro Ala Gly Pro Lys Gln Ala Lys Ser His Gly Ile Gly Gly

405 410 415

Gly Ser Asn Ser Ser Ala Glu Val Gln Ala Leu Ser Lys Glu Val Glu

420 425 430

Asp Leu Lys Val Ser Val Asp Leu Leu Glu Lys Glu Arg Asp Phe Tyr

435 440 445

Phe Ser Lys Leu Arg Asp Ile Glu Ile Leu Cys Gln Thr Pro Glu Leu

450 455 460

Asp Asp Leu Pro Ile Val Val Ala Val Lys Lys Ile Leu Tyr Ala Thr

465 470 475 480

Asp Ala Asn Glu Ser Val Leu Glu Glu Ala Gln Glu Cys Leu Asn Gln

485 490 495

Ser Leu Gly Leu Glu Gly Tyr Glu Glu Glu Gly Lys Glu Glu Glu Glu

500 505 510

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ala Ala Ala Glu Thr Gln

515 520 525

Thr