阅读说明：本技术 拟南芥ant基因在提高鸡冠花耐旱性和种子产量中的应用 (Application of arabidopsis ANT gene in improvement of cockscomb drought tolerance and seed yield ) 是由 孟来生 曹小迎 宛雯 于 2019-03-05 设计创作，主要内容包括：拟南芥ANT基因在提高鸡冠花耐旱性和种子产量中的应用,所述拟南芥ANT基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明将拟南芥ANT基因应用于培育耐逆性鸡冠花良种及种子产量高的品种,通过在转基因鸡冠花中表达上述拟南芥ANT基因提高了鸡冠花的耐干旱性和种子的长度、宽度及重量,在鸡冠花育种技术领域具有较好的应用前景。(The application of the arabidopsis ANT gene in improving the drought tolerance and the seed yield of cockscomb is disclosed, and the nucleotide sequence of the arabidopsis ANT gene is shown as SEQ ID No. 1. According to the invention, the arabidopsis ANT gene is applied to cultivation of stress-tolerant cockscomb fine breeds and breeds with high seed yield, and the drought tolerance of cockscomb and the length, width and weight of seeds are improved by expressing the arabidopsis ANT gene in transgenic cockscomb, so that the arabidopsis ANT gene has a good application prospect in the technical field of cockscomb breeding.)

拟南芥ANT基因在提高鸡冠花耐旱性和种子产量中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程领域，具体地涉及拟南芥ANT基因在提高鸡冠花耐旱性和种子产量中的应用。

背景技术

鸡冠花是世界上最常见的观赏植物之一。花的颜色有金色、红色、橙色、黄色和粉色。鸡冠花种子是一种潜在的食品，其蛋白质含量超过73％。鸡冠花不但是夏秋季节一种妍丽可爱的常见花卉，还可制成良药和佳肴，且有良好的强身健体功效。鸡冠花以花和种子入药。种子有消炎、收敛、明目、降压、强壮等作用，可治肠风便血，赤白痢疾，崩带，淋浊，眼疾等。鸡冠花栽培过程中受到干旱胁迫时，会造成光和效率降低等不利于鸡冠花正常生长的一系列生理变化，表现出抑制生长和促进衰老等症状。提高鸡冠花的种子大小及耐旱性对于增强鸡冠花的耐逆性及增加种子产量具有重要意义。

发明内容

作为本发明的一个方面，提供了拟南芥ANT基因在提高鸡冠花耐旱性中的应用。

本发明还提供了上述拟南芥ANT基因在增加鸡冠花种子产量中的应用。

本发明还提供了上述拟南芥ANT基因在制备转基因鸡冠花中的应用。

本发明还提供了上述拟南芥ANT基因在鸡冠花种质资源改良中的应用。

本发明还提供了一种提高鸡冠花品质的方法，其在转基因鸡冠花中表达上述的拟南芥ANT基因。

本发明的有益效果：本发明通过在转基因鸡冠花中表达拟南芥ANT基因可大大提高鸡冠花的耐旱性和种子产量，可用于培育耐逆性鸡冠花良种及种子产量高的品种，在培育鸡冠花良种方面具有较好的应用前景。

附图说明

图1为pCB308R的T-DNA区的组成及35S及ANT的***位置；

图2为正常条件和干旱胁迫下野生型与转基因鸡冠花的植株形态比较图；

图3为正常条件和干旱胁迫下野生型与转基因鸡冠花的种子性状比较图。

具体实施方式

：

本发明提供的项目实施方案用于说明本发明，但是不局限于本发明的范围。如果没有特别指出，本发明实施中的技术手段为本研究领域的常用技术，所用原料为市场所购。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例

1.拟南芥ANT基因序列的获得以及植物表达载体的构建

登录拟南芥信息资源数据库网站：

https://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject？type＝sequence&id＝116967，找到

ANT(AT4G37750.1)基因的序列(SEQ ID No.1)。根据ANT基因的CDS设计PCR扩增引物：

ANTF:5'-atgaagtctttttgtgataat-3'(SEQ ID No.2)

ANTR:5'-tcaagaatcagcccaagcagcg-3'；(SEQ ID No.3)

以野生型拟南芥Col-0为材料，取短日照生长3周的拟南芥叶片，用天根公司生产的植物总RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录得cDNA。反应步骤如下：液氮情况下将拟南芥叶片研磨粉碎，待液氮完全挥发后，将样品分装至离心管，参照试剂盒说明书提取总RNA。总RNA经电泳及测OD证实质量没问题，然后进行总RNA的反转录，步骤如下：在离心管中依次加入2μL拟南芥总RNA、10μL不含核酸酶的ddH₂O、4μL 5*反应缓冲液、1μLOligo(dT)₁₈引物、2μLdNTP、1μL RNase抑制剂及1μL反转录酶，混合均匀后42℃反应1小时；70℃处理5min终止反应，即为反转录的cDNA。将cDNA稀释后依次加入PCR缓冲液、dNTP、引物、DNA聚合酶和不含核酸酶的ddH₂O后用PCR仪进行扩增反应。程序如下：热启动98℃10s，60℃5s，72℃2min，30个循环后，72℃延伸5min，最后10℃结束反应。

PCR反应结束后进行电泳，切去大小合适的条带进行胶回收，然后进行克隆测序。测序结果正确的序列通过无缝拼接的方法在5‘端加上CaMV35S强启动子。然后通过Gateway的方法进行植物表达载体构建。根据Gateway克隆技术的要求，此过程中包含两轮PCR，第一轮PCR的引物用加部分adaptor attB接头的引物，而第二轮的模板用第一轮的PCR产物，并且引物采用完整的adaptor attB引物。将CaMV 35S强启动子和ANT基因的编码区序列连接到pDONR克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。如图1所示，通过LR反应将ANT基因及强启动子构建到植物表达载体pCB308R上(Lei Z Y，Ping Z，Cao M J，etal.High-throughput Binary Vectors for Plant Gene Function Analysis[J].Journalof Integrative Plant Biology，2010，49(4):556-567.)，获得载体35S-ANT::pCB308R。

2.鸡冠花分生芽的诱导

从市场上买来鸡冠花的种子,用0.1％(v/v)HgCl₂表面消毒20min，然后用无菌水冲洗3-5次，培养在MS(Murashige and Skoog)培养基+1.5m g/L 6-BA培养基上。15-20天后，将长到1cm左右的无菌苗取出，用剪刀剪去两片子叶，下胚轴，胚根和子叶柄。留下芽分生组织作为外植体。以上培养条件是23℃，16小时光照。

3.农杆菌介导转化鸡冠花分生芽

将35S-ANT::pCB308R质粒转化农杆菌LBA4404，挑取单菌落，接种于40ml YEB+Km25mg/l+Rif 50mg/l液体培养基中27℃于摇床上200rpm培养48h。在超净工作台上将上述培养液倒入无菌离心管内，4000rpm/min离心20min。取出离心管，弃去上清液，用MS+2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA液体培养液洗一次，然后再4000rpm/min离心20min，弃去上清液，调OD600＝1.0-1.5之间。

将鸡冠花分生芽切段，浸入农杆菌菌液10-15min。取出后放入MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/LNAA的培养基中，在黑暗条件下共培养，共培养两天后，转入与原先培养基添加有相同激素的培养基中进行光照培养。此时的培养基中还添加有cefotaxime 500mg/l和kanamycin60mg/l，前者为脱菌，后者是为筛选转基因植株。20-30天后，将长得健壮的植株转入到生根培养基，即1/2MS。20天后生根。

4.转基因植株的验证

初筛获得的鸡冠花植株再用ANT正向引物5-actggctctcaccaccacca-3(SEQ IDNO.4)和反向引物5-ccgccattgtcgtcgtctca-3(SEQ ID No.5)进行PCR验证。同时用RT-PCR、GUS染色及western bolting检测转基因植株中ANT蛋白的表达情况，结果表明ANT基因已经转入鸡冠花并能正常表达蛋白。

5.干旱胁迫实验

在干旱胁迫前，20日龄的野生型对照和转基因植株没有明显的区别，然而，经过14天的控水和5天的再浇水后，与野生型对照相比，转基因植株大部分表现出鲜活的特性，如绿叶和直立茎，存活率和幼苗鲜重均高于野生型对照(图2)。叶片中的花青素积累是植物应激敏感性的另一个指标。再浇水5天后野生型幼苗花青素含量约为转基因幼苗的3倍，说明转ANT基因幼苗对干旱胁迫的抗性更强。转基因鸡冠花收种子后发现，与野生型对照的种子相比，转拟南芥ANT基因的鸡冠花种子的长度、宽度及重量无论在正常条件下还是在干旱胁迫下都显著增加(图3)。

序列表

<110> 江苏师范大学

<120> 拟南芥ANT基因在提高鸡冠花耐旱性和种子产量中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1668

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

atgaagtctt tttgtgataa tgatgataat aatcatagca acacgactaa tttgttaggg 60

ttctcattgt cttcaaatat gatgaaaatg ggaggtagag gaggtagaga agctatttac 120

tcatcttcaa cttcttcagc tgcaacttct tcttcttctg ttccacctca acttgttgtt 180

ggtgacaaca ctagcaactt tggtgtttgc tatggatcta acccaaatgg aggaatctat 240

tctcacatgt ctgtgatgcc actcagatct gatggttctc tttgcttaat ggaagctctc 300

aacagatctt ctcactcgaa tcaccatcaa gattcatctc caaaggtgga ggatttcttt 360

gggacccatc acaacaacac aagtcacaaa gaagccatgg atcttagctt agatagttta 420

ttctacaaca ccactcatga gcccaacacg actacaaact ttcaagagtt ctttagcttc 480

cctcaaacca gaaaccatga ggaagaaact agaaattacg ggaatgaccc tagtttgaca 540

catggagggt cttttaatgt aggggtatat ggggaatttc aacagtcact gagcttatcc 600

atgagccctg ggtcacaatc tagctgcatc actggctctc accaccacca acaaaaccaa 660

aaccaaaacc accaaagcca aaaccaccag cagatctctg aagctcttgt ggagacaagc 720

gttgggtttg agacgacgac aatggcggct gcgaagaaga agaggggaca agaggatgtt 780

gtagttgttg gtcagaaaca gattgttcat agaaaatcta tcgatacttt tggacaacga 840

acttctcaat accgaggcgt tacaagacat agatggactg gtagatatga agctcatcta 900

tgggacaata gtttcaagaa ggaaggtcac agtagaaaag gaagacaagt ttatctggga 960

ggttatgata tggaggagaa agctgctcga gcatatgatc ttgctgcact caagtactgg 1020

ggtccctcta ctcacaccaa tttctctgcg gagaattatc agaaagagat tgaagacatg 1080

aagaacatga ctagacaaga atatgttgca catttgagaa ggaagagcag tggtttctct 1140

aggggtgctt ccatctatag aggagtcaca agacatcacc agcatggaag gtggcaagca 1200

cggattggta gagtcgctgg aaacaaagat ctctaccttg gaacttttgg aacccaagaa 1260

gaagctgcag aagcttacga tgtagcagca attaagttcc gtggcacaaa tgctgtgact 1320

aactttgata tcacgaggta cgatgttgat cgtatcatgt ctagtaacac actcttgtct 1380

ggagagttag cgcgaaggaa caacaacagc attgtcgtca ggaatactga agaccaaacc 1440

gctctaaatg ctgttgtgga aggtggttcc aacaaagaag tcagtactcc cgagagactc 1500

ttgagttttc cggcgatttt cgcgttgcct caagttaatc aaaagatgtt cggatcaaat 1560

atgggcggaa atatgagtcc ttggacatca aaccctaatg ctgagcttaa gaccgtcgct 1620

cttactttgc ctcagatgcc ggttttcgct gcttgggctg attcttga 1668

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaagtctt tttgtgataa t 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcaagaatca gcccaagcag cg 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

actggctctc accaccacca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgccattgt cgtcgtctca 20