尼克酰胺在提高小麦基因编辑效率中的应用
阅读说明：本技术 尼克酰胺在提高小麦基因编辑效率中的应用 (Application of nicotinamide in improving wheat gene editing efficiency ) 是由 王轲 代文双 叶兴国 邹枨 刘会云 杜丽璞 于 2020-06-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了尼克酰胺在提高小麦基因编辑效率中的应用。尼克酰胺提高小麦基因编辑效率是通过尼克酰胺处理小麦幼胚或成熟胚实现的,小麦为含有Cas9蛋白和针对靶基因的sgRNA且靶基因未发生或者部分发生编辑的小麦。实验证明,2.5mM尼克酰胺处理14天获得的外源基因GUS和内源基因TaWaxy编辑效率最高,与对照组(未经尼克酰胺处理)相比编辑效率分别提高了36.0％和22.5％。本发明可以提高小麦基因编辑效率,具有重要的应用价值。(The invention discloses application of nicotinamide to improvement of wheat gene editing efficiency. The nicotinamide-enhanced wheat gene editing efficiency is realized by treating wheat immature embryos or mature embryos with nicotinamide, wherein the wheat contains Cas9 protein and sgRNA aiming at a target gene, and the target gene is not edited or is partially edited. Experiments prove that the editing efficiency of the exogenous gene GUS and the endogenous gene TaWaxy obtained by treating for 14 days with 2.5mM nicotinamide is the highest, and the editing efficiency is respectively improved by 36.0 percent and 22.5 percent compared with that of a control group (without the nicotinamide treatment). The invention can improve the wheat gene editing efficiency and has important application value.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及尼克酰胺在提高小麦基因编辑效率中的应用。
背景技术
CRISPR/Cas9系统编辑效率在不同物种间差异很大，如二倍体植物水稻CRISPR/Cas9技术产生突变的效率可达到80％以上。多倍体植物尤其是小麦、马铃薯等，构建有效的基因编辑系统仍然是当前研究的难点。小麦是由A、B和D三个基因组组成的六倍体，基因组约17Gb，约为水稻的40倍，且重复序列高达85％至90％。利用CRISPR/Cas9技术同时编辑小麦基因组中的多个拷贝依然非常困难，这是限制小麦基因编辑应用的主要原因。虽然在小麦中基因编辑效率最高可达80％，但三个同源基因同时编辑的效率最高也仅有30％左右。因此，提高小麦尤其是三个基因组的编辑效率的研究工作任重道远。
组蛋白乙酰化在核小体重塑中起主要作用，它是研究最早、特征最多的翻译后修饰。组蛋白乙酰化修饰可以改变染色质结构，调控基因转录、DNA复制和修复。尼克酰胺(Nicotinamide)是常见的用来研究组蛋白乙酰化修饰水平的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors，HDACi)。尼克酰胺是维生素B3的衍生物，属于SIR2类的去组蛋白去乙酰化酶抑制剂，当过量加入会显著抑制哺乳动物和酵母中的去组蛋白去乙酰化酶。目前小麦中还没有尼克酰胺应用的报道。
发明内容
本发明的目的是提高小麦基因编辑效率。
本发明首先保护尼克酰胺在提高小麦基因编辑效率中的应用。
上述应用中，所述尼克酰胺提高小麦基因编辑效率是通过尼克酰胺处理小麦外植体实现的。
上述应用中，所述尼克酰胺处理小麦外植体可为将小麦外植体在含2.0-5.0mM(如2.0-2.5mM、2.5-5.0mM、2.0mM、2.5mM或5.0mM)尼克酰胺的培养基上培养7天以上(如7-14天、7天、14天)。
所述培养基具体可为1/2MS培养基。1/2MS培养基可为将2.215g MS粉末、20g蔗糖和0.5g MES溶于适量蒸馏水，然后用蒸馏水定容至1L；加入3g植物凝胶，调节pH值至5.8；121℃灭菌15min获得。
所述培养可为23-27℃(如23-25℃、25-27℃、23℃、25℃或27℃)光暗交替培养。所述光暗交替培养的周期具体可为16h光照，8h黑暗；光照培养时光强度具体可为300μmol/m2/s。
上述任一所述的应用中，所述小麦可含有Cas9蛋白和针对靶基因的sgRNA。
上述任一所述的应用中，所述小麦可为含有Cas9蛋白和针对靶基因的sgRNA且靶基因未发生编辑或者部分发生编辑的小麦。
上述任一所述的应用中，所述外植体可为幼胚或成熟胚。
本发明还保护一种提高小麦基因编辑效率的方法，可包括如下步骤：用尼克酰胺处理含有Cas9蛋白和针对靶基因的sgRNA的小麦的外植体。
上述方法中，所述用尼克酰胺处理含有Cas9蛋白和针对靶基因的sgRNA的小麦的外植体可为将含有Cas9蛋白和针对靶基因的sgRNA的小麦的外植体在含2.0-5.0mM(如2.0-2.5mM、2.5-5.0mM、2.0mM、2.5mM或5.0mM)尼克酰胺的培养基上培养7天以上(如7-14天、7天、14天)。
所述培养基具体可为1/2MS培养基。1/2MS培养基可为将2.215g MS粉末、20g蔗糖和0.5g MES溶于适量蒸馏水，然后用蒸馏水定容至1L；加入3g植物凝胶，调节pH值至5.8；121℃灭菌15min获得。
所述培养可为23-27℃(如23-25℃、25-27℃、23℃、25℃或27℃)光暗交替培养。所述光暗交替培养的周期具体可为16h光照，8h黑暗；光照培养时光强度具体可为300μmol/m2/s。
上述任一所述的方法中，所述含有Cas9蛋白和针对靶基因的sgRNA的小麦可为含有Cas9蛋白和针对靶基因的sgRNA且靶基因未发生编辑或者部分发生编辑的小麦。
上述任一所述的方法中，所述外植体可为幼胚或成熟胚。
上述任一所述基因可为小麦外源基因或内源基因。
上述任一所述Cas9蛋白具体可为SpCas9蛋白。
上述任一所述含有Cas9蛋白和针对靶基因的sgRNA具体可为含有基因编辑载体。
上述任一所述小麦可为含有基因编辑载体但靶基因未编辑的转基因植株。
上述任一所述靶基因具体可为GUS基因(外源基因)或TaWaxy基因(内源基因)。
上述任一所述基因编辑载体具体可为载体pMWB110-SpCas9-TaU3-Gus(含有Ubi和TaU3启动子分别启动SpCas9和针对外源基因GUS的sgRNA的载体)或载体pMWB110-SpCas9-TaU3-WAXY(含有Ubi和TaU3启动子分别启动SpCas9和针对内源基因TaWaxy的sgRNA的载体)。
上述任一所述小麦具体可为实施例提及的未发生GUS基因编辑的转基因植株、TaWaxy基因未发生编辑的转基因植株或TaWaxy基因单基因组编辑的转基因植株。
本发明利用尼克酰胺处理含有基因编辑载体但靶基因未编辑或者部分编辑的转基因小麦的幼胚或成熟胚，获得靶基因编辑的突变体植株，以此提高小麦基因编辑效率。其中，2.5mM尼克酰胺处理14天获得的外源基因GUS和内源基因TaWaxy编辑效率最高，与对照组(未经尼克酰胺处理)相比编辑效率分别提高了36.0％和22.5％。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例1步骤二中5的部分编辑植株突变类型的检测结果。其中，A为未经尼克酰胺处理的检测结果，M为DNA marker，泳道1-7为2-CK-G，泳道8为没有酶切的PCR扩增产物(对照1)，泳道9为对照2，泳道10-15为7-CK-G，泳道16-20为14-CK-G；B为经尼克酰胺处理的检测结果，M为DNA marker，泳道1-4为7-2.5-G，泳道5-7为7-5-G，泳道8为没有酶切的PCR扩增产物(对照1)，泳道9为酶切的PCR扩增产物(对照2)，泳道10-12为7-5-G，泳道13-16为14-2.5-G，泳道17-20为14-5-G。
图2为实施例2步骤二中5的尼克酰胺处理TaWaxy基因未发生编辑的转基因植株的幼胚后突变类型的部分检测结果。其中，M为DNA marker，泳道1-5为14-CK-W1，泳道6-8为14-2.5-W1，泳道9-10为14-5-W1，泳道11为酶切的PCR扩增产物(对照3)，泳道12为未酶切的PCR扩增产物(对照4)。
图3为实施例2步骤二中5的尼克酰胺处理TaWaxy基因单基因组编辑的转基因植株的幼胚后突变类型的部分检测结果。其中，M为2kb DNA marker，泳道1-2为仅7D发生编辑在转基因植株，泳道3-4为仅4A发生编辑在转基因植株，泳道5-6为仅7A发生编辑在转基因植株，泳道7为酶切的PCR产物(对照3)，泳道8为没有酶切的PCR扩增产物(对照4)。
图4为实施例3步骤二中5的尼克酰胺处理未编辑植株的成熟胚后突变类型的部分检测结果。其中，M为2kb DNA marker，泳道1-5为14-2.5-W3，泳道6-10为14-5-W3，泳道11-15为14-CK-W3，泳道16为酶切的PCR产物(对照3)，泳道17为未酶切的PCR产物(对照4)
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
1/2MS培养基：将2.215g MS粉末、20g蔗糖和0.5g MES溶于适量蒸馏水，然后用蒸馏水定容至1L；加入3g植物凝胶，调节pH值至5.8；121℃灭菌15min。
2×Taq PCR StarMix为诺唯赞生物科技股份有限公司的产品，产品目录号为P213-03。植物基因组DNA提取试剂盒为康为世纪生物科技有限公司的产品，产品目录号为CW0531M。
实施例1、尼克酰胺可以提高小麦外源GUS基因的编辑效率
一、未发生GUS基因编辑的转基因植株的获得
1、将含有Ubi和TaU3启动子分别启动SpCas9和针对外源基因GUS的sgRNA的载体pMWB110-SpCas9-TaU3-Gus导入转基因植株H29，得到T0代转基因植株(记载于如下文献中：Liu HY，Wang K，Jia ZM，Gong Q，Lin ZS，Du LP，Pei XW，Ye XG.Editing TaMTLgeneinduces haploid plants efficiently by optimized Agrobacterium-mediated CRISPRsystem in wheat.Journal of Experimental Botany，2020，71:1337–1349)。
针对外源基因GUS的靶点为CCGTTTACGTACGTCGAGGACAT(下划线为PAM区)。
2、完成步骤1后，分别取饱满、大小一致的未发生GUS基因编辑的T0转基因植株的种子，浸泡于含15ml 0.7％双氧水的培养皿中，23℃培养箱培养过夜；再经4℃春化室春化约1个月，转入温室土培，得到T1代转基因植株
3、检测T1代转基因植株的GUS基因编辑情况。根据检测结果，从中挑选含有载体pMWB110-SpCas9-TaU3-Gus但未发生GUS基因编辑的T1代转基因植株(以下简称未发生GUS基因编辑的转基因植株)。
未发生GUS基因编辑的转基因植株即基因编辑载体(载体pMWB110-SpCas9-TaU3-Gus)存在但GUS基因未编辑的转基因植株。
二、尼克酰胺对小麦外源基因GUS编辑效率的影响
1、待未发生GUS基因编辑的转基因植株开花授粉后14天左右，分别选取未成熟的小麦籽粒(T2代)，先用70％乙醇水溶液洗涤1min，再用15％次氯酸钠溶液震荡洗涤10min，最后用灭菌水洗涤3次，得到无菌小麦籽粒。
2、分别取无菌小麦籽粒，在超净工作台中高倍镜下分离小麦幼胚，然后将小麦幼胚芽尖朝上置于培养基(1/2MS培养基、含2.5mM尼克酰胺的1/2MS培养基或含5mM尼克酰胺的1/2MS培养基)中，25℃、光暗交替培养2天、7天或14天，得到小麦幼苗。
光暗交替培养的周期为16h光照，8h黑暗；光强为300μmol/m2/s。
3、分别取小麦幼苗的叶片，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，得到小麦叶片的基因组DNA。
采用NANO DROP 2000c(Thermo)检测小麦叶片的基因组DNA的质量。结果表明，小麦叶片的基因组DNA的浓度为200-400μg/μl，OD260/280值为1.8-2.0。
4、阳性植株的检测
(1)制备反应体系。反应体系为15μl，包括7.5μl2×Taq PCR StarMix、小麦叶片的基因组DNA(含100ng DNA)、引物BarF、引物BarR和水。该反应体系中，引物BarF和引物BarR的浓度均为10μM。
引物BarF的核苷酸序列为：5’-ACCATCGTCAACCACTACATCG-3’。
引物BarR的核苷酸序列为：5’-GCTGCCAGAAACCACGTCATG-3’。
(2)取步骤(1)制备的反应体系，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果某小麦的PCR扩增产物中含有约406bp的DNA片段，则该小麦为阳性植株(含有编辑载体)；如果某小麦的PCR扩增产物中不含有约406bp的DNA片段，则该小麦为阴性植株(不含编辑载体)。
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，26个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。
检测结果见表1中第3列。
表1
样本
检测植株(株)
阳性植株(株)
编辑植株(株)
编辑效率(％)
2-CK-G
17
13
0
0
2-2.5-G
28
21
0
0
2-5-G
27
22
0
0
7-CK-G
25
15
0
0
7-2.5-G
20
18
3He
16.7
7-5-G
26
19
4He
21.1
14-CK-G
26
17
0
0
14-2.5-G
36
25
8He+1Bi
36.0
14-5-G
35
23
4He
17.4
注：2-CK-G表示0mM尼克酰胺处理2天，2-2.5-G表示2.5mM尼克酰胺处理2天，2-5-G表示5mM尼克酰胺处理2天，7-CK-G表示0mM尼克酰胺处理7天，7-2.5-G表示2.5mM尼克酰胺处理7天，7-5-G表示5mM尼克酰胺处理7天，14-CK-G表示0mM尼克酰胺处理14天，14-2.5-G表示2.5mM尼克酰胺处理14天，14-5-G表示5mM尼克酰胺处理14天；Bi表示双等位突变类型，He表示杂合突变类型。
5、编辑植株突变类型的检测
(1)制备反应体系。反应体系为15μl，包括7.5μl2×Taq PCR StarMix、步骤4检测的阳性植株叶片的基因组DNA(含100ng DNA)、引物GUSF、引物GUSR和水。该反应体系中，引物GUSF和引物GUSR的浓度均为10μM。
引物GUSF的核苷酸序列为：5’-CAAGGAAATCCGCAACCATATC-3’。
引物GUSR的核苷酸序列为：5’-TCAAACGTCCGAATCTTCTCCC-3’。
(2)取步骤(1)制备的反应体系，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，40个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。
(3)取步骤(2)得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶Eco105I进行酶切，得到酶切产物；将酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果电泳结果显示3条带，则该阳性植物为编辑植株且编辑类型为杂合突变类型；如果电泳结果显示1条带，则该阳性植物为编辑植株且编辑类型为双等位突变类型；如果电泳结果显示2条带，则该阳性植物为未编辑植物。
酶切体系为20μl，包括10μl PCR扩增产物、0.3μl限制性内切酶Eco105I、2μl 10×FD Green Buffer和7.7μl ddH2O。
限制性内切酶Eco105I为赛默飞世尔科技(中国)有限公司的产品，产品目录号为FD0404；10×FD Green Buffer为限制性内切酶Eco105I中的组件。
反应程序为：37℃2h。
按照上述步骤(1)-(2)，将阳性植株叶片的基因组DNA替换为未发生GUS基因编辑的转基因植株叶片的基因组DNA，其它步骤均不变，得到的PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，作为对照1。
按照上述步骤(1)-(3)，将阳性植株叶片的基因组DNA替换为未发生GUS基因编辑的转基因植株叶片的基因组DNA，其它步骤均不变，得到的酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，作为对照2。
部分样本的2％琼脂糖凝胶电泳结果见图1。
检测结果见表1中第4列。
6、根据步骤5的结果，统计编辑效率。
编辑效率＝编辑植株的株数/阳性植株的株数×100％
统计结果见表1中第5列。
结果表明，尼克酰胺处理2天时，2-CK-G、2-2.5-G和2-5-G均未检测到编辑植株；尼克酰胺处理7天时，7-CK-G未检测到编辑植株，而7-2.5-G和7-5-G分别获得3株和4株编辑植株，编辑效率分别为16.7％和21.1％；尼克酰胺处理14天时，14-CK-G未检测到编辑植株，而14-2.5-G和14-5-G分别检测到9株和4株编辑植株，编辑效率分别为36.0％和17.4％。2.5mM尼克酰胺处理14天获得的外源基因GUS编辑效率最高，与对照组(未经尼克酰胺处理)相比编辑效率提高了36.0％。
上述结果表明，采用尼克酰胺处理基因编辑载体(载体pMWB110-SpCas9-TaU3-Gus)存在但GUS基因未编辑的转基因植株的幼胚，可以提高小麦外源GUS基因的编辑效率。
实施例2、尼克酰胺处理幼胚可以提高小麦内源基因TaWaxy的编辑效率
一、TaWaxy基因未发生或者部分发生编辑的转基因植株的获得
1、将含有Ubi和TaU3启动子分别启动SpCas9和针对内源基因TaWaxy的sgRNA的载体pMWB110-SpCas9-TaU3-WAXY导入Fielder，得到T0代转基因植株(记载于如下文献中：LiuHY，Wang K，Jia ZM，Gong Q，Lin ZS，Du LP，Pei XW，Ye XG.Editing TaMTLgene induceshaploid plants efficiently by optimized Agrobacterium-mediated CRISPR systemin wheat.Journal of Experimental Botany，2020，71:1337–1349)。
针对内源基因TaWaxy的靶点为AAGACCAAGGAGAAGATCTA(下划线为PAM区)。
2、完成步骤1后，检测T0代转基因植株的TaWaxy基因编辑情况。根据检测结果，从中挑选含有载体pMWB110-SpCas9-TaU3-WAXY且TaWaxy基因未发生编辑的T0代转基因植株(以下简称TaWaxy基因未发生编辑的转基因植株)和含有载体pMWB110-SpCas9-TaU3-WAXY且仅有一个基因组(4A或7A或7D)发生编辑的T0代转基因植株(以下简称TaWaxy基因单基因组编辑的转基因植株)。
TaWaxy基因未发生编辑的转基因植株即基因编辑载体(载体pMWB110-SpCas9-TaU3-WAXY)存在但TaWaxy基因未编辑的转基因植株；TaWaxy基因单基因组编辑的转基因植株即基因编辑载体(载体pMWB110-SpCas9-TaU3-WAXY)存在且仅有一个基因组(4A或7A或7D)的TaWaxy基因发生编辑的转基因植株。
二、尼克酰胺处理幼胚对小麦内源基因TaWaxy编辑效率的影响
1、待TaWaxy基因未发生编辑的转基因植株或者TaWaxy基因单基因组编辑的转基因植株开花授粉后14天左右，分别选取未成熟的小麦籽粒(T1代)，先用70％乙醇水溶液洗涤1min，再用15％次氯酸钠溶液震荡洗涤10min，最后用灭菌水洗涤3次，得到无菌小麦籽粒。
2、分别取无菌小麦籽粒，在超净工作台中高倍镜下分离小麦幼胚，然后将小麦幼胚芽尖朝上置于培养基(1/2MS培养基、含2.5mM尼克酰胺的1/2MS培养基或含5mM尼克酰胺的1/2MS培养基)中，25℃、光暗交替培养14天，得到小麦幼苗。
光暗交替培养的周期为16h光照，8h黑暗；光强为300μmol/m2/s。
3、分别取小麦幼苗的叶片，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，得到小麦叶片的基因组DNA。
采用NANO DROP 2000c(Thermo)检测小麦叶片的基因组DNA的质量。结果表明，小麦叶片的基因组DNA的浓度为200-400μg/μl，OD260/280值为1.8-2.0。
4、阳性植株的检测
(1)制备反应体系。反应体系为15μl，包括7.5μl2×Taq PCR StarMix、小麦叶片的基因组DNA(含100ng DNA)、引物BarF、引物BarR和水。该反应体系中，引物BarF和引物BarR的浓度均为10μM。
引物BarF的核苷酸序列为：5’-ACCATCGTCAACCACTACATCG-3’。
引物BarR的核苷酸序列为：5’-GCTGCCAGAAACCACGTCATG-3’。
(2)取步骤(1)制备的反应体系，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果某小麦的PCR扩增产物中含有约406bp的DNA片段，则该小麦为阳性植株(含有编辑载体)；如果某小麦的PCR扩增产物中不含有约406bp的DNA片段，则该小麦为阴性植株(不含有编辑载体)。
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，26个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。
TaWaxy基因未发生编辑的转基因植株的检测结果见表2中第3列。
TaWaxy基因单基因组编辑的转基因植株的检测结果见表3中第3列。
表2
注：14-CK-W1表示0mM尼克酰胺处理幼胚14天，14-2.5-W1表示2.5mM尼克酰胺处理幼胚14天，14-5-W1尼克酰胺处理幼胚14天；He表示杂合突变类型。
表3
注：14-CK-W2表示0mM尼克酰胺处理幼胚14天，14-2.5-W2表示2.5mM尼克酰胺处理幼胚14天，14-5-W2尼克酰胺处理幼胚14天；He表示杂合突变类型；Bi表示双等位突变类型。
5、编辑植株突变类型的检测
(1)由于小麦是六倍体植物，它由A、B和D基因组组成，因此一般内源基因在小麦中至少含有3个拷贝分别位于3个基因组上。在检测突变时需要对这3个基因组分别检测。TaWaxy基因在小麦中有3个拷贝分别位于4A、7A和7D染色体上，因此制备反应体系1、反应体系2和反应体系3分别用来检测4A、7A和7D染色体上TaWaxy基因的突变情况。
反应体系1为15μl，包括7.5μl2×Taq PCR StarMix、步骤4检测的阳性植株叶片的基因组DNA(含100ng DNA)、引物4AWaxy-F、引物4AWaxy-R和水。该反应体系中，引物4AWaxy-F和引物4AWaxy-R的浓度均为10μM。
反应体系2为15μl，包括7.5μl2×Taq PCR StarMix、步骤4检测的阳性植株叶片的基因组DNA(含100ng DNA)、引物7AWaxy-F、引物7AWaxy-R和水。该反应体系中，引物7AWaxy-F和引物7AWaxy-R的浓度均为10μM。
反应体系3为15μl，包括7.5μl2×Taq PCR StarMix、步骤4检测的阳性植株叶片的基因组DNA(含100ng DNA)、引物7DWaxy-F、引物7Dwaxy-R和水。该反应体系中，引物7DWaxy-F和引物7Dwaxy-R的浓度均为10μM。
引物4AWaxy-F、引物4AWaxy-R、引物7AWaxy-F、引物7AWaxy-R、引物7DWaxy-F、引物7Dwaxy-R的核苷酸序列及组成的引物对扩增的PCR扩增产物的长度见表4。
表4
(2)分别将步骤(1)制备的反应体系1、反应体系2或反应体系3进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，40个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。
(3)取步骤(2)得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶BglII(赛默飞世尔科技(中国)有限公司的产品，产品目录号为FD0083)进行酶切，得到酶切产物；将酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果电泳结果显示3条带，则该阳性植物为编辑植株且编辑类型为杂合突变类型；如果电泳结果显示1条带，则该阳性植物为编辑植株且编辑类型为双等位突变类型；如果电泳结果显示2条带，则该阳性植物为未编辑植物。
按照上述步骤(1)-(2)，将阳性植株叶片的基因组DNA替换为Fielder叶片的基因组DNA，其它步骤均不变，得到的PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，作为对照4。
按照上述步骤(1)-(3)，将阳性植株叶片的基因组DNA替换为Fielder叶片的基因组DNA，其它步骤均不变，得到的酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，作为对照3。
TaWaxy基因未发生编辑的转基因植株的部分样本的2％琼脂糖凝胶电泳结果见图2。
TaWaxy基因单基因组编辑的转基因植株的部分样本的2％琼脂糖凝胶电泳结果见图3。
TaWaxy基因未发生编辑的转基因植株的检测结果见表2中第4列、第6列和第7列。
TaWaxy基因单基因组编辑的转基因植株的检测结果见表3中第4-7列、第9列和第10列。
6、根据步骤5的结果，统计编辑效率。
编辑效率＝编辑植株的株数/阳性植株的株数×100％
TaWaxy基因未发生编辑的转基因植株的统计结果见表2中第5-7列；TaWaxy基因单基因组编辑的转基因植株统计结果见表2中第8-10列。
TaWaxy基因未发生编辑的转基因植株的检测结果表明，14-CK-W1未检测到编辑植株，而14-2.5-W1和14-5-W1分别检测到7株和5株编辑植株，编辑效率分别为13.2％和10.4％。2.5mM尼克酰胺处理14天获得的小麦内源基因TaWaxy编辑效率最高，与对照组(未经尼克酰胺处理)相比编辑效率提高了13.2％。
TaWaxy基因单基因组编辑的转基因植株的检测结果表明，对照组14-CK-W2，新增1株在T0代7A染色体编辑的前提下其T1代4A染色体编辑的植株，新增编辑效率为8.3％；14-2.5-W2中检测到新增编辑的植株数4株，效率为30.8％比对照组提高了22.5％，尤其是成功拿到发1株三个基因组同时突变的转基因植株效率为7.7％；14-5-W2中检测到新增编辑植株2株，效率为25％比对照组提高了16.7％。
上述结果表明，采用尼克酰胺处理TaWaxy基因未发生编辑的转基因植株或TaWaxy基因单基因组编辑的转基因植株的幼胚，可以提高小麦内源基因TaWaxy的编辑效率。
实施例3、尼克酰胺处理成熟胚可以提高小麦内源基因TaWaxy的编辑效率
一、TaWaxy基因未发生编辑的转基因植株的获得
将实施例2中含有载体pMWB110-SpCas9-TaU3-WAXY且TaWaxy基因未发生编辑的T1代转基因植株移栽至花盆并种植于温室中，生长环境设置为日照16小时，24℃；黑暗8小时，18℃。培养条件为光强300μmol/m2/s，湿度为45％。每周浇水一次。待植株自然成熟，收取种子(T2代)并放置一个月左右(打破休眠)。
二、尼克酰胺处理成熟胚对小麦内源基因TaWaxy编辑效率的影响
1、实验第1天，将T2代种子灭菌，然后用无菌水浸泡过夜；实验第2天，再次种子灭菌，得到无菌小麦成熟种子。
种子灭菌步骤为：先用70％乙醇水溶液洗涤1min，再用15％次氯酸钠溶液震荡洗涤10min，最后用灭菌水洗涤3次，然后用无菌水浸泡过夜。
2、分别取无菌小麦成熟种子，在超净工作台中高倍镜下分离小麦成熟胚，然后将小麦成熟胚芽尖朝上置于培养基(1/2MS培养基、含2.5mM尼克酰胺的1/2MS培养基或含5mM尼克酰胺的1/2MS培养基)中，25℃、光暗交替培养14天，得到小麦幼苗。
光暗交替培养的周期为16h光照，8h黑暗；光强为300μmol/m2/s。
3、分别取小麦幼苗的叶片，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，得到小麦叶片的基因组DNA。
采用NANO DROP 2000c(Thermo)检测小麦叶片的基因组DNA的质量。结果表明，小麦叶片的基因组DNA的浓度为200-400μg/μl，OD260/280值为1.8-2.0。
4、阳性植株的检测
(1)制备反应体系。反应体系为15μl，包括7.5μl2×Taq PCR StarMix、小麦叶片的基因组DNA(含100ng DNA)、引物BarF、引物BarR和水。该反应体系中，引物BarF和引物BarR的浓度均为10μM。
引物BarF的核苷酸序列为：5’-ACCATCGTCAACCACTACATCG-3’。
引物BarR的核苷酸序列为：5’-GCTGCCAGAAACCACGTCATG-3’。
(2)取步骤(1)制备的反应体系，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果某小麦的PCR扩增产物中含有约406bp的DNA片段，则该小麦为阳性植株(含有编辑载体)；如果某小麦的PCR扩增产物中不含有约406bp的DNA片段，则该小麦为阴性植株(不含有编辑载体)。
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，26个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。
检测结果见表5中第3列。
表5
注：14-CK-W3表示0mM尼克酰胺处理幼胚14天，14-2.5-W3表示2.5mM尼克酰胺处理幼胚14天，14-5-W3尼克酰胺处理幼胚14天；He表示杂合突变类型。
5、编辑植株突变类型的检测
(1)由于小麦是六倍体植物，它由A、B和D基因组组成，因此一般内源基因在小麦中至少含有3个拷贝分别位于3个基因组上。在检测突变时需要对这3个基因组分别检测。TaWaxy基因在小麦中有3个拷贝分别位于4A、7A和7D染色体上，因此制备反应体系1、反应体系2和反应体系3分别用来检测4A、7A和7D染色体上TaWaxy基因的突变情况。
反应体系1为15μl，包括7.5μl2×Taq PCR StarMix、步骤4检测的阳性植株叶片的基因组DNA(含100ng DNA)、引物4AWaxy-F、引物4AWaxy-R和水。该反应体系中，引物4AWaxy-F和引物4AWaxy-R的浓度均为10μM。
反应体系2为15μl，包括7.5μl2×Taq PCR StarMix、步骤4检测的阳性植株叶片的基因组DNA(含100ng DNA)、引物7AWaxy-F、引物7AWaxy-R和水。该反应体系中，引物7AWaxy-F和引物7AWaxy-R的浓度均为10μM。
反应体系3为15μl，包括7.5μl2×Taq PCR StarMix、步骤4检测的阳性植株叶片的基因组DNA(含100ng DNA)、引物7DWaxy-F、引物7Dwaxy-R和水。该反应体系中，引物7DWaxy-F和引物7Dwaxy-R的浓度均为10μM。
引物4AWaxy-F、引物4AWaxy-R、引物7AWaxy-F、引物7AWaxy-R、引物7DWaxy-F、引物7Dwaxy-R的核苷酸序列及组成的引物对扩增的PCR扩增产物的长度见表4。
(2)分别将步骤(1)制备的反应体系1、反应体系2或反应体系3进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，40个循环；72℃终延伸5min；4℃保存。
(3)取步骤(2)得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶BglII(赛默飞世尔科技(中国)有限公司的产品，产品目录号为FD0083)进行酶切，得到酶切产物；将酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果电泳结果显示3条带，则该阳性植物为编辑植株且编辑类型为杂合突变类型；如果电泳结果显示1条带，则该阳性植物为编辑植株且编辑类型为双等位突变类型；如果电泳结果显示2条带，则该阳性植物为未编辑植物。
部分样本的2％琼脂糖凝胶电泳结果见图4。
检测结果见表5中第4-7列、第9列和第10列。
6、根据步骤5的结果，统计编辑效率。
编辑效率＝编辑植株的株数/阳性植株的株数×100％
统计结果见表5中第8-10列；
结果显示，对照组14-CK-W3未检测到编辑植株；14-2.5-W3中检测到新增编辑植株2株，编辑效率为13.3％；14-5-W3中检测到新增编辑植株1株，编辑效率为12.5％。
上述结果表明，采用尼克酰胺处理含有载体pMWB110-SpCas9-TaU3-WAXY且TaWaxy基因未发生编辑的T2代种子的成熟胚，也可以提高小麦内源基因TaWaxy的编辑效率。