阅读说明：本技术 水稻组蛋白去甲基化酶jmj708在水稻育种中的应用 (Application of rice histone demethylase JMJ708 in rice breeding ) 是由 魏金环 陈忠科 安镇兴 于 2020-07-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了水稻组蛋白去甲基化酶JMJ708在水稻育种中的应用,属于农作物育种技术领域。通过本发明对于水稻组蛋白去甲基化酶JMJ708对水稻抗倒伏的调控研究,有利于选育出抗倒伏品种,增加粮食生产的品系,对解决目前生产上低产,易倒伏的问题可以很好的解答,能够为农业生产,粮食安全,农民增收提供保障。(The invention discloses application of rice histone demethylase JMJ708 in rice breeding, and belongs to the technical field of crop breeding. The regulation and control research of the rice histone demethylase JMJ708 on the lodging resistance of the rice is beneficial to breeding lodging-resistant varieties and increasing the variety of grain production, can well solve the problems of low yield and easy lodging in the prior production, and can provide guarantee for agricultural production, grain safety and income increase of farmers.)

水稻组蛋白去甲基化酶JMJ708在水稻育种中的应用

技术领域

本发明属于农作物育种技术领域，具体涉及水稻组蛋白去甲基化酶JMJ708在水稻育种中的应用。

背景技术

近年来，水稻功能基因组研究的快速发展，为我国水稻遗传育种鉴定了大量的有重要利用价值的基因，水稻育种正迈向设计育种的新时代。水稻育种的创新发展为我国口粮安全提供了重要保障，提高单产仍是未来一段时期内我国水稻育种的主攻方向。因此仍要继续重视发掘、克隆和鉴定新的水稻重要农艺性状调控基因，为设计育种提供元件，服务于新时期水稻育种的精准化、数据化和智能化战略需求。

水稻组蛋白去甲基化酶家族有20个基因，分别是OsJMJ701、OsJMJ702、OsJMJ703、OsJMJ704、OsJMJ705、OsJMJ706、OsJMJ707、OsJMJ708、OsJMJ709、OsJMJ710、OsJMJ711、OsJMJ712、OsJMJ713、OsJMJ714、OsJMJ715、OsJMJ716、OsJMJ717、OsJMJ718、OsJMJ719、OsJMJ720。已知报道发现，水稻组蛋白去甲基化酶家族成员在水稻各器官的发育及开花中起着重要作用，其中，OsJMJ703可调控水稻的茎干伸长及反转座子的活性。

目前，还未有任何关于OsJMJ708调控水稻发育及增强水稻抗倒伏中的报道。

发明内容

本发明的目的是提供了水稻组蛋白去甲基化酶JMJ708（OsJMJ708）在水稻育种中的应用，为水稻育种提供了新的资源和研究方法。

本发明利用T-DNA***的方法构建了OsJMJ708敲除突变体，T-DNA***到OsJMJ708序列的第6个外显子上，将OsJMJ708在水稻中进行敲除；同时还利用RNA干扰技术对OsJMJ708的第3个外显子及第5个外显子之间250bp的功能区域进行了干扰。之后，对突变体的进行了相关研究。

有益效果：

本发明对水稻组蛋白去甲基化酶JMJ708在水稻发育及抗倒伏中的作用进行了详细研究。通过本发明的研究可知，水稻组蛋白去甲基化酶JMJ708是调控株高、分蘖数、茎叶碎性、种子脱落的重要因子。

通过本发明对于水稻组蛋白去甲基化酶JMJ708对水稻抗倒伏的调控研究，有利于选育出抗倒伏品种，增加粮食生产的品系，对解决目前生产上低产，易倒伏的问题可以很好的解答，能够为农业生产，粮食安全，农民增收提供保障。

附图说明

图1为OsJMJ708 T-DNA***突变体构建与表达模式结果。其中：A为T-DNA***OsJMJ708的位置及各引物位置：TR390R、TR390LS和NGUS1用来做基因型鉴定的引物，RTF和RTR用来做检测OsJMJ708基因表达量的引物；B为23株转基因植物的基因型鉴定；C为OsJMJ708在各基因型植株中的表达量；D为OsJMJ708在不同组织器官中的表达量。

图2为OsJMJ708敲除纯合突变植株的表型结果。其中：A为出芽5天后幼苗表型；B为短日照温室条件，抽穗时期表型；C为大田条件，成熟时期表型；D为不同节间及稻穗的长度；E为稻穗表型；F为叶片脆性表型；G为茎秆第二节间脆性表型。

图3为OsJMJ708突变体细胞壁各成分的含量结果。其中：A-C为茎秆的第2节间、叶鞘及叶片中纤维素的含量；D-E为茎秆的第2节间(D)和叶鞘(E)中纤维素染色；F-H为茎秆的第2节间、叶鞘及叶片中木质素的含量；I为气相色谱法分析细胞壁中各单糖含量。

图4为透射电子显微镜观察野生型及OsJMJ708突变体细胞壁的结果。其中：A为野生型细胞壁；B、C为野生型初生细胞壁（C为B的局部放大）；D为OsJMJ708突变体细胞壁；E、F为OsJMJ708突变体初生细胞壁（F为E的局部放大）；PCW为初生细胞壁；SCW为次生细胞壁。

图5为OsJMJ708-RNAi转基因植物的表型鉴定。其中：A为OsJMJ708在RNAi转基因植物和野生型中的表达量；B为OsJMJ708-RNAi转基因植物及野生型第2叶片的脆性表型。

具体实施方式

下面结合附图通过实施例来对本发明进行详细说明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1

本实施例采用T-DNA***和RNA干扰技术，将OsJMJ708在水稻中进行敲除，然后进行后续相关研究。

一、具体实验方法如下：

1. 水稻培育

在Oryza sativa cv. Dongjin中构建OsJMJ708（LOC_Os06g51490）的T-DNA***突变体种系3A-08440（1. Jinhuan Wei, Heebak Choi, Ping Jin, Yunfei Wu, Jinmi Yoon,Yang-Seok Lee, Taiyong Quan, Gynheung An; GL2-type homeobox gene Roc4 in ricepromotes flowering time preferentially under long days by repressing Ghd7,Plant Science, 2016, 252: 133–143. 2.Jinhuan Wei, Yunfei Wu, Lae-Hyeon Cho,Jinmi Yoon, Heebak Choi, Ping Jin, Jakyung Yi, Yang-Seok Lee, Hee JoongJeong, Jungil Yang, Gynheung An; Identification of root-preferentialtranscription factors in rice by analyzing GUS expression patterns of T-DNAtagging lines, Journal of Plant Biology, 2017, 60 (3): 268-277）。

植物种植在大田或温室里（14.5小时光照，28℃/9.5小时黑暗，22℃，湿度50%）。种子用含有3%蔗糖的MS培养基(Murashig and Skoog Medium)发芽，种子发芽7天后将幼苗移植到土壤中。

OsJMJ708（LOC_Os06g51490）cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

T-DNA***纯合子突变体植物用以下的引物进行基因型鉴定：

TR390R—CGCTTTCTGTAGGCTATGTT (SEQ ID NO.2)，

TR390LS—TCATCCCATTGATATTAGCC (SEQ ID NO.3)

5'-AACGCTGATCAATTCCACAG-3' (NGUS1) (SEQ ID NO.4)。

2. RNA提取和实时定量PCR分析

提取最上面第二片叶子的中间1.5到2厘米部分的RNA。

总RNA提取使用RNAiso Plus (TaKaRa, Shiga, Japan; http://www.takarabio.com)，保证RNA样品260/280的比大于1.8 (NanoDrop 2000; ThermoScientific, Wilmington, DE, USA)。

cDNA合成采用2μg 总RNA、Moloney murine leukemia virus 逆转录酶(Promega,Madison, WI, USA)、RNasin® Ribonuclease Inhibitor (Promega)、oligo (dT)18 引物和dNTP。

实时定量PCR检测目的基因表达采用 SYBR Green I Prime Q-Master mix(GENETBIO, Daejeon, Republic of Korea)和the Rotor-Gene Q (QIAGEN, Hilden,Germany)。所有实验至少取样自四棵不同植株，重复三次以上。基因表达变化根据∆∆Ct方法计算。

引物的特异性根据熔点曲线确定，OsUbi5作为内参。

OsUbi5引物序列如下：

F：5'-TGAAGACCCTGACTGGGAAG-3' (SEQ ID NO.5)

R：5'-CACGGTTCAACAACATCCAG -3'(SEQ ID NO.6)。

OsJMJ708的qRT-PCR引物如下：

RTF：GGTTCAGGGGGTAATTTGTA(SEQ ID NO.7)

RTR：ATGTGAGCCATTTCTTGGAC(SEQ ID NO.8)。

3. 载体构建和水稻转化

RNAi载体构建引物分别为RNAi-F：GCTGAGTCCATCGATTTTAC（位于第3个外显子）(SEQ IDNO.9)和RNAi-R：GGGGTACCCTTTGCAACCACATA（位于第5个外显子）(SEQ ID NO.10)，划线部分为KpnI酶切位，干扰序列长度为250bp。使用Pfu高保真酶进行PCR，产物使用乙醇纯化后，用KpnI消化，载体pGA3720使用SmaI消化，载体pGA3426使用KpnI消化，将三种产物连接后，进行大肠杆菌质粒转化。根据冻融方法将RNAi载体转染到农杆菌Agrobacteriumtumefaciens LBA4404中。转基因植物通过农杆菌转化方法培育。

4. 纤维素含量测定及染色

（1）纤维素染色

取抽穗期茎秆第二节间徒手切取横切面染色，滴1滴1 mol/L Tris-HCl ( pH=8)浸泡1min 吸干后，滴2μL荧光增白剂(Calcofluor，Sigma，Canada)染色3 min，置于紫外荧光显微镜下观察拍照。

（2）纤维素含量测定

纤维素含量测定参照文献（D.M. Updegraff. Semi-micro determination of cellμLose in biological material. Analytical Biochemistry 32(1969):424-428）。

将突变体与对照的茎秆第二节间、叶片、叶鞘取下，干燥，研磨成粉末。

称取2mg粉末，加入3mL乙酸-硝酸试剂（150mL 80%乙酸与15mL 纯硝酸混合），混匀，沸水煮30分钟。12000rpm离心5分钟，弃上清。加入10mL 蒸馏水重悬，12000rpm离心5分钟，弃上清。加入10mL 67% H₂SO₄ (v/v)，室温水解1小时后，取10μL稀释到1mL，加入10mL蒽酮，沸水煮10min。冷却后使用Origin酶标仪在625nm波长下进行比色测定。标准曲线由已知量的葡萄糖溶液的蒽酮显色数据制成。

5. 木质素含量测定

木质素含量测定参照巯基乙酸方法（Shiro S , Yoshie S , Naoki Y , et al.High-throughput determination of thioglycolic acid lignin from rice. PlantBiotechnology, 2009, 26(3):337-340.）。

将突变体与对照的茎秆第二节间、叶片、叶鞘取下，干燥，研磨成粉末。

称取20mg粉末，加入2mL水，室温离心10min。沉淀中加入1.8mL甲醇，60°C反应20min，室温离心10min。弃上清，重复2次。真空干燥并称重，加入1mL HCl和0.1mL巯基乙酸。封上盖子，80°C反应3h。室温离心10min，将沉淀用1mL蒸馏水溶解清洗。离心后的沉淀加入1mL 1N NaOH，80rpm摇动16h。离心后将上清移到新管子里加入0.2mL HCl在4°C中酸化4h。离心后的沉淀用1mL 1N NaOH稀释。以NaOH为空白对照，在280nm处测定光吸收值，以每毫克细胞壁吸光值表示木质素的相对含量。

6. 细胞壁单糖组分的测定

称取2mg细胞壁乙醇不溶物于干燥的螺口管中，加入20ug肌醇作为内标，加入200μL的丙酮，40°C烘干后加入250μL的2M三氟乙酸在121°C下处理90min，离心取上清置于新的玻璃螺口管中干燥。加入200μL 10mg/mL硼氢化钠震荡混匀后，还原90min，再用150μL冰醋酸中和。吹干后，依次用冰醋酸/甲醇（1：9，体积比）、甲醇清洗，吹干。再用乙酸酐和吡啶在121°C下乙酰化20min。吹干后加入1mL乙酸乙酯和4mL蒸馏水萃取，离心后吸取乙酸乙酯相于气相色谱进样瓶中，在Hewlett-Packard 6890气相色谱仪上，对不同单糖进行分离和量化测定。

7 细胞壁透射电镜观察

将种植13周后的突变体和对照水稻茎秆第二节间切成3mm的小段，投入含有2.5%戊二醛的PBS缓冲液中，抽真空，直至材料沉入溶液表面以下。4°C固定72h后，用1%锇酸PBS溶液再固定48h。用PBS缓冲液漂洗样品后，进行30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇梯度脱水各30min，再用100%乙醇和丙酮各处理2次，每次10min。脱水后的材料依次用London ResinWhite (Sigma)树脂与乙醇以1:3、1:1、3:1的比例混合进行置换和浸透，最后在纯树脂中浸透72h，在模块中包埋后于60°C聚合24h。样品修块后，制备超薄切片，观察前用醋酸铀和柠檬酸铅复染。样品在生物型透射电子显微镜(FEI公司, Tecnai G2 Spirit Biotwin)上观察。

二、实验结果

1. 为研究OsJMJ708在水稻中的功能，发明人利用T-DNA***的方法构建了OsJMJ708敲除突变体，T-DNA***到OsJMJ708序列的第6个外显子上（图1A所示）。

之后，将第1代杂合子的种子种植在大田里，在第2代的23棵植株中鉴定得到5棵OsJMJ708敲除纯合植株，6棵杂合植株，12棵野生型植株（图1B）。

利用qRT-PCR检测OsJMJ708在不同基因型植株中的表达，野生型和杂合子的植株中都有表达，而在纯合子的植株中检测不到OsJMJ708的表达量（图1C），说明本发明构建的T-DNA***突变体是有效敲除了OsJMJ708，可以用来做后续实验。另外，为更好的探求OsJMJ708的功能，对OsJMJ708在不同组织器官中的表达进行了检测，发现其在花、叶片、叶鞘及不同节间都有表达（图1D）。

2. 为明确OsJMJ708在水稻生长发育及成熟过程中的作用，发明人对突变体在水稻发育不同时期的表型进行了观察。

如图2所示，在水稻的整个发育过程中，与野生型植株相比，突变体植株都呈现植株矮小、分蘖数减少、茎叶易碎及种子易脱落的表型。水稻成熟时期，OsJMJ708突变体稻穗的长度是野生型的71%，茎秆长度是野生型的61%（图2C）。OsJMJ708突变体水稻种子数量和质量都低于野生型植株（图2D）。除此之外，还有叶片、叶鞘及茎秆都呈现易碎的表型（图2F和图2G）。本发明重点研究脆性表型，为水稻的抗倒伏育种提供理论基础。

3. 水稻细胞壁是由初生壁、次生壁和中胶层构成的一种细胞结构，细胞壁的主要成分包含纤维素、半纤维素及木质素。水稻脆性突变体一直以为被认为是由细胞壁的改变所致。

本发明首先对突变体的细胞壁成分进行了研究。在初测纤维素的含量时，发明人发现OsJMJ708突变体水稻第2节间茎秆、叶鞘及叶片中的纤维素含量分别比野生型降低了43.4%, 35.2% 和27.4%（图3A-C）。用荧光增白剂染色法检测茎秆的第2节间及叶片的纤维素含量，呈现一致的结果（图3D、E）。木质素含量在OsJMJ708突变体的茎秆的第2节间比野生型降低33.8%，而在叶鞘中只有稍微变化，叶片中没有显著差异（图F-H）。发明人还利用气相色谱法对细胞壁的单糖组成进行了分析，结果显示，在半纤维素的主要成分木聚糖（XYL）在OsJMJ708突变体中的含量是其在野生型中的1.6倍，而纤维素的主要成分葡萄糖（GLU）在OsJMJ708突变体中的含量只是其在野生型中的0.6倍（图3I）。

4. 为探索细胞壁成分改变的原因，发明人使用透射电子显微镜对野生型及OsJMJ708突变体的细胞壁进行了观察。与野生型相比，OsJMJ708突变体细胞壁中的次生细胞壁和初生细胞壁的厚度都发生了显著变化（图4A, 4D）。特别地，OsJMJ708突变体的初生细胞壁除了厚度发生改变，其形态和结构变得不规则（图4B，4C，4E，4F）。

5. 为验证OsJMJ708突变体的表型，我们利用RNA干扰技术对OsJMJ708的第3个外显子及第5个外显子之间250bp的功能区域进行了干扰。22棵OsJMJ708-RNAi转基因植物中，1-6中OsJMJ708的表达量最低（图5A）。与野生型相比，OsJMJ708-RNAi转基因植物的叶片呈明显的脆性。

本发明对水稻组蛋白去甲基化酶JMJ708在水稻发育及抗倒伏中的作用进行了详细研究，由以上研究结果可知，水稻组蛋白去甲基化酶JMJ708是调控株高、分蘖数、茎叶碎性、种子脱落的重要因子。本发明有利于选育出抗倒伏，增加粮食生产的品系，对解决目前生产上低产，易倒伏的问题可以很好的解答，能够为农业生产，粮食安全，农民增收提供保障。

序列表

<110> 南通大学

<120> 水稻组蛋白去甲基化酶JMJ708在水稻育种中的应用

<130> 2020717

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5268

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttagtattag gcgccagaag aaaaggctta ggaaaaccag caacacaatg ggacactgtg 60

gaggcagcac tagtgccaaa actgcagcat ctgctcccaa gcagaaaagg agaaaggttg 120

atgcaacggc tactgtggtc aatgaggcaa tggatcaggt ctgtgagcag tgtaatagtg 180

gcttgcatgg ggaagtcatg ctgctctgtg atcgctgtga taagggatgg catctatatt 240

gcttgtctcc accactcgag agtgtgcctc cgggaaactg gtattgctca gagtgcatga 300

actctgatag gaattgtttt ggatttgtcc acaggaggaa gacttgccaa gttgaaactt 360

tccggaaatt tgaggagagg gtgagaaaaa ggtggtttgg acacaagaat cccagtcgtg 420

ttcaggttga gaagcaattt tgggagattg tagagggaaa ggtaggagag cttgaggtta 480

tgtatgggag tgatttggac acttcaattt atggaagtgg gtttcctcgc ctttgtgatc 540

ccgtgccatc gtcggtggac ccagttatgt ggcacaagta ttgctcgagc ccatggaatc 600

tgaataattt cccaaaccta ccaggctcag ttcttcagac agtccgggat aacattgctg 660

gtgtaatggt cccttggctc tacataggga tgctgttttc atcattttgt tggcatgttg 720

aggatcattg cttttattcg attaattatt tacattgggg tgagccgaaa tgttggtatg 780

gggtacctgg agcagaagca aatgcttttg agaaggttat gcgcaatgct ttgcctgatc 840

tatttgatgc acagcctgac ctgctttttc accttgtcac gatgctgagt ccatcgattt 900

tacaagcaaa tggtgttcct gtttatagtg tgatacagga acctggtaac tttgtgatta 960

cttttcctag gtcattccat ggtggtttca attttggttt aaattgtgct gaggctgtaa 1020

attttgctcc tgccgattgg ttacctcatg gtggcattgg tgctgaacta tatcgcctgt 1080

accgtaaagc acctgttttg tcacatgagg agcttttgta tgtggttgca aagaacggcg 1140

tggacaatga atcacttccc tacttacaag gagaaataga gaggctattt gtgaaggaga 1200

aaaaatgtcg tgaggagcta tggattactg ggattgtcaa atccaatctg atgccaccga 1260

agaataatcc aaacttcatt ggaagtgaag aggaccctac atgcattatt tgtcgccagt 1320

atctgtatct ctctgctgtt tcttgtaact gtaggctgtc ttcgtatgtt tgccttgagc 1380

actggaagca cctttgtgaa tgcagtccag agaaacatcg cttactttac cgccataccc 1440

ttgcagagtt gggtgattta gtttgtgagg tctcaaaggc taatctacca agggagaatg 1500

ttaagcagaa ctccctttta catagtgatg tttttttgcc aacgagaaag gacaaagatc 1560

agtatatgtc atatacacaa cttgcagaag actggctttc aaaagctgac catattctcc 1620

atatgccatt tttagatact gcatatgcca ctgccttaga agatgctgaa cagtttcttt 1680

ggggtgatca taatatggat tctgtgcgga atatgtcagc aaaattaata gaaggtagga 1740

aatgggcttc cagtgttaga aaatgcctct ctcaaattga tggctttctt cattgtaaag 1800

agaattgttc cgagaaagta aattatgtgg aaatcaaaga attagctgct gtaagatgca 1860

aaccatgtta tgaaccaagt cttgcacaat tgcaggtata tgtggacaaa ggagaaataa 1920

tgattaatga gataaacaat gcattatcat ctcgctcaaa ggttgattac ttggaaacac 1980

tgtactctag ggctttagag ttcccggttg aactaacaga aacatcagca ctgtcttgtg 2040

agatttcttc cgcaaagtcc tggttgaaga aagcatgtga ttgccttgaa cagaataaac 2100

ggggcatcgt cgacatagat ttcctaaatg aactgaaatc tgagatggtg tgccttcgag 2160

tgttagttcc agaaattaat cttgtttctg agctgtggaa agaagctgaa gcatggagaa 2220

tacgttgtcg atcctacctc caagaccccc ccagccttaa ggagttggag agcttccttc 2280

ttgtggtgga tggtgccaac ttcagtattc cagagctgaa cattctgatg caacggtatt 2340

caggtgcttg ctcatgggtc aatcatgcta ataacatagt cggcaaactt cttgaaagga 2400

atgattatga caacattgtt gaggagttga ctggcattct gaaggatgga gaatcactag 2460

gagtaaaagt tgaggaattt tccgttgttg aggaagagct aaagaaatcc ttctgcagga 2520

agcaagcatc cgaggctctt gcaacacaaa catctatgga ggtggtcaaa gaagtgctga 2580

aagaagcttc catattaacc attgaagagg agcaaccatt tgttgatctg tcccataacc 2640

tcaaagctgc catcacttgg gaagagaagg ctagctttat tcttgagcac tcagctgctc 2700

tccctgagtt tgaaaaccat attctgtgct cagagaacat acatgttatc cttccatctg 2760

aactggatat gaaagcagag gttgctactg ctaagttgtg gatggacaaa tgtcaggcct 2820

atctgaggcc tagaagtgat aaacctgcat ctggaggttt tcttaatgtt gatgacctaa 2880

aggatttaat cggccagcct gcaagtatga aagtcattct tgacacttct gcaattaatt 2940

ctgttctcaa caatgtcata gaatgggagc ataattcact aagtctgata cacagttcaa 3000

gatccttact ggattcaaat gtaatcgact ctactattga tccacttaaa agaaaactag 3060

aggagctgca agataaaatt aatgcagaaa tagaaaaagg actatctctc ggttttgaat 3120

ttaaggttgt tcatgagctg aaggattctt ttttcacact tggatggata ttgaatgcat 3180

tgtctttctg cggtgtgact cctttgttgc aggatgctga aaaattaatt caacaagctg 3240

tcaaccttcc tgcctcattg tcggattgtt ccttagctga actattggtg aggggatcat 3300

cttggctaag aaaagcactt atgtttcttc ctggttcaga aatgtctgaa acatccagat 3360

tgttaaatgt tgaaaatatt ttagcggagt ataaggaaat tgctgttcct tatcctatga 3420

tgattgccaa acttgaggat gctatcaaca agcacaattc atgggcagaa caatgcaatg 3480

ccttcttcat gtttcctgat catcaatctt gggatggact attaagcttg agagacagtg 3540

gtcagtctgt ggcattcgat tgtactgaga tggataaggt ggttgctgag attaaaaaga 3600

tcgaggagtg gcttactcac tgccactgta ctctgtttcc tgatggcaat aacagtgatt 3660

ctttgctctc cgcgcttctg aagattagag gatcaatgga caatgcttgt atgttatatt 3720

ccgactgtaa ccagaaagga ttatgtgcca tctgctcttg tgatgtggga gatcatatta 3780

cccctagatg tatgatatgt caagcgaggt atcatagctc ctgtgtcgaa ccactgcctg 3840

cttctacaca agtgactcgt gaatggacct gtcctttttg ctttcattta gaaagtgggg 3900

acccattaca gaatagacta caggagaaga tatctaaagg gaatcgtcca gcacttcctg 3960

cattaatcgg gctccgctct tttgccaagg gtttctattc agggattgag gagttggatt 4020

tattagaaga aattgctgag aaagctcata aatttaagtc ctaccttatg caaatattgc 4080

atgatgcaga ctcttaccat ggagaagatc ttagtgtcat gcacagatct cttttgattg 4140

ctctaaaggc aacatcggct gctggcttat atgatcacca gatcagttgc agaattgagt 4200

caatgttgag cagatattcc tggaaaaaac gaatacatat tctcttgtgt ggtggaaaaa 4260

agataccgat ccaacaagta ctgatgcttg ataatgaggg ttcaagttta gagatatgtg 4320

gtgaagattt cttcaagttg gagattaata aaataaagga aactagtctg cagtggctgg 4380

ccaaagcaga aaagactaca cttgattctg gtaagctcgc ccttgacctt gtgtatggac 4440

ttattattga aggcgaaagt cttactgtgc atgttgagaa ggaactgaag ttactacgag 4500

accgcagtgt tctatattgc atttgccgta agccatatga taatagggcc atgatcgcat 4560

gtgatcaatg tgacgaatgg tatcattttg attgtatcaa attgcatgga ccccctccaa 4620

aaacattcta ttgccctgca tgccgtccta ataatggcgg agagtatata tcacttccat 4680

gcttagccca tgaggacgat agatcaacga ccgaagcagg acctcacacc cctccggcat 4740

cttgtgaagc agcaggaaga gtgggagcta tccagtgcaa cagtagtagc caatgggaga 4800

aaacacatgt aagggtcgat ttaataaaac ttctacgttg tcatagcgaa actgacagct 4860

cgtggagaga aagcaaaagg gttctccatc gaacagctag aagacgtagt aattttttag 4920

ggctgttatg atatttacat caatcttctc ttgtcagctt taggtatctc atttttaaca 4980

tgaaaattct tgaggcaatt cttttattat gatctggtgc tgtcaatgga tgtattgcgg 5040

tttgaacctt aagtacttta ctattaatca aatatttgta gcttgccaga gagatctctg 5100

ctctcttgta cttaggtcat ggcagtgctg cgctggattc aatatgagaa cattaagctt 5160

gtagcattcg actgcaacat gacaagtttt tatcatgtaa ttagtttcta ggtcggtata 5220

tacgcacccg tgtaaaacaa tagtccaaat ggtttctagt ctcggcac 5268

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgctttctgt aggctatgtt 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tcatcccatt gatattagcc 20

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aacgctgatc aattccacag 20

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tgaagaccct gactgggaag 20

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atgtgagcca tttcttggac 20

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gctgagtcca tcgattttac 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggggtaccct ttgcaaccac ata 23