阅读说明：本技术 一种石榴皮炮制方法、质量控制方法及应用 (Pomegranate peel processing method, quality control method and application ) 是由 王京龙 郑丹丹 安佰海 于 2020-06-02 设计创作，主要内容包括：本发明属于质量检测技术领域,公开了一种石榴皮炮制方法、质量控制方法及应用,样品预处理模块用于石榴皮进行预处理；炮制模块用于基于正交设计石榴皮的炮制；参数测定模块用于测定水分含量、总多酚含量、总三萜含量以及没食子酸和鞣花酸的含量；综合评价模块用于含量测定结果进行综合分析,确定石榴皮炮制影响参数以及最佳炮制参数；质量控制模块用于正交优化石榴皮炒炭工艺；气味分析模块用于利用主成分分析法、线性判别式分析法分析石榴皮炒炭前后气味变化。本发明能够更好地控制石榴皮饮片质量,使对于石榴皮炮制程度的主观性状标准数字化、可视化,为电子鼻技术在中药饮片标准化应用中提供参考。(The invention belongs to the technical field of quality detection, and discloses a pomegranate rind processing method, a quality control method and application, wherein a sample pretreatment module is used for pretreating pomegranate rind; the processing module is used for processing the pomegranate rind based on orthogonal design; the parameter determination module is used for determining the water content, the total polyphenol content, the total triterpene content and the contents of gallic acid and ellagic acid; the comprehensive evaluation module is used for comprehensively analyzing the content measurement result and determining the processing influence parameters and the optimal processing parameters of the pomegranate rind; the quality control module is used for orthogonally optimizing the pomegranate bark carbonizing process; the odor analysis module is used for analyzing the odor change before and after the pomegranate rind is charred by utilizing a principal component analysis method and a linear discriminant analysis method. The method can better control the quality of the pomegranate bark decoction pieces, enables the subjective character standard of the processing degree of the pomegranate bark to be digital and visible, and provides reference for the electronic nose technology in the standardized application of the traditional Chinese medicine decoction pieces.)

一种石榴皮炮制方法、质量控制方法及应用

技术领域

本发明属于测量技术领域，尤其涉及一种石榴皮炮制方法、质量控制方法及应用。

背景技术

目前，石榴皮为石榴科植物石榴(Punica granatum L.)的干燥果皮，在我国药用历史悠久，具有涩肠止泻、止血、驱虫等功效。在临床用药时，应用最普遍的石榴皮饮片包括生品和炭品2种。而当前石榴皮的质量控制指标，还仅限于没食子酸、鞣质和鞣花酸等少量成分，可以说还无法全面地控制石榴皮药材及其制剂的质量。石榴皮炭品作为石榴皮饮片的炮制品，其质量标准在2015版《中国药典》上仅是表面黑黄色，内部棕褐色的性状规定，标准过于简单，容易受到主观的影响使炮制程度受到影响。

目前，对石榴皮炭品炮制标准的判断主要是基于感官和含量测定，感官容易受到主观的影响，气味作为感官的一项重要指标，也难以形成标准。如药典中对“气清香”、“焦香气”等的描述，显得过于主观和模糊，而电子鼻可以较好地将中药炮制过程中的“气味”进行数字化表达。与液相、气相色谱相比，电子鼻技术的操作相对简单，仅需简单的样品前处理，保存了样品的整体性信息。

现有技术一运用电子鼻技术准确鉴别出了姜黄连、酒黄连等不同炮制品，经线性判别式分析，识别率高达96.4％。现有技术二采用电子鼻对2015版《中国药典》收录的8味酒制中药炮制前后的气味进行采集分析，将不同炮制品的气味差异数据化、可视化，所建立的判别模型识别率达到96.7％。现有技术三对同一批山楂样品进行不同时间的炒制，采用电子鼻获取其气味传感器响应值，发现山楂炮制过程中气味的变化与5-HMF含量的变化有关，并推断糖降解反应及美拉德反应可能是山楂炮制过程气味变化的作用机制之一，该研究从饮片炮制过程中引起气味变化的物质基础出发，从新的角度为解释炮制机理奠定了基础。由此可见，中药炮制过程的客观量化研究，不仅利于完善与质量相关的性状指标的检查与测定，而且有助于建立中药材的质量标准规范。

综上所述，现有石榴皮炮制质量控制存在的问题是：

(1)现有标准中，以鞣花酸和鞣质的含量对石榴皮炮制进行质量控制，作为品质评价标准的评价，不够全面。

(2)石榴皮炮制要求“炒炭存性”，炒制过程中产生“焦香气”、“糊味”，缺少系统控制方法。

解决上述技术问题的难度：之前石榴皮炮制质量控制，多以含量、肉眼观测、鼻闻为主，尤其是对于气味控制这块，缺乏客观化的指标，电子鼻的使用，使得石榴皮炮制的气味变化有了一定的客观指标。

解决上述技术问题的意义：通过石榴皮炮制全面质量控制，既体现了现有标准鞣花酸的含量，又增加了其他成分总多酚、总三萜、没食子酸的含量控制，而且通过电子鼻气味检测，从根本上解决了炮制品的气味缺少质控手段的问题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种石榴皮炮制方法、质量控制方法及应用。

本发明是这样实现的，一种石榴皮炮制方法，其特征在于，所述石榴皮炮制方法的不锈钢炒锅放于电磁炉上，开中档，加温，用红外测温仪，测量锅底温度，330℃时，放入石榴皮，快速翻炒，待表面黑色，有烟雾产生后，16min取出，晾晾，筛除碎屑。

本发明的另一目的在于提供一种所述石榴皮炮制方法的石榴皮炮制质量控制方法，所述石榴皮炮制质量控制方法包括：

步骤一，将石榴皮先用自来水反复冲洗，去掉粘附在石榴皮身上的杂质，再用蒸馏水冲洗3次，置于45℃烘箱中干燥，保存备用；

步骤二，对石榴皮炒炭过程中的温度、翻炒时间各选三个水平，按L₉(3⁴)正交表进行石榴皮炮制；

步骤三，测单炮制后的石榴皮的水分含量、总多酚含量、总三萜含量以及没食子酸和鞣花酸的含量；

步骤四，对水分含量、总多酚含量、总三萜含量以及没食子酸和鞣花酸的含量测定结果进行综合分析，确定石榴皮炮制影响参数以及最佳炮制参数；利用主成分分析法、线性判别式分析法分析石榴皮炒炭前后气味变化；

步骤五，基于最佳炮制参数以及相关气味分析结果正交优化石榴皮炒炭工艺，控制石榴皮炮制质量。

进一步，步骤三中，所述水分含量、总多酚含量、总三萜含量以及没食子酸和鞣花酸的含量测定方法具体包括：

(1)水分含量的测定：取经粉碎过筛后的石榴皮及不同程度石榴皮炮制品粉末大于0.5g，置于水分快速测定仪样品盘上均匀铺平，关闭样品室，按仪器操作程序测定样品中水分的含量；

(2)总多酚的含量测定：

(3)总三萜含量的测定方法：

(4)没食子酸和鞣花酸的含量测定：

进一步，所述总多酚的含量测定方法包括：

1)制备没食子酸标准曲线：称取没食子酸标准品25mg，用无水乙醇溶解并定容至25ml，得1mg/ml没食子酸标准品溶液；分别精密吸取没食子酸标准溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20ml于25ml容量瓶中，加入酒石酸亚铁溶液6ml，摇匀后静置10min；再用pH7.5磷酸盐缓冲液定容，摇匀，静置显色，30min后在540nm波长下用紫外可见分光光度计测定吸光度，重复3次，取平均值；

2)制备供试品：称取石榴皮生品及炮制品粉末1g，按1:20的料液比加入40％乙醇溶液20ml，在30℃，高功率下超声提取30min，超声结束后，以8000r/min离心分离10min收集上清液，用40％乙醇溶液定容至100ml，作为供试品溶液；量取供试品溶液0.5ml，

加入酒石酸亚铁溶液6ml，摇匀后静置10min；再用pH7.5磷酸盐缓冲液定容，摇匀，静置显色，30min后在540nm波长下用紫外可见分光光度计测定A值，重复3次，取平均值，计算各个样品中总多酚的含量。

进一步，所述总三萜含量的测定方法包括：

1)制备熊果酸标准曲线：称取熊果酸标准品5.00mg于25ml容量瓶中，以甲醇溶解并定容，得0.2mg/ml的熊果酸标准品溶液；分别精确量取熊果酸标准品溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40ml，置于25ml具塞刻度试管中，70℃水浴加热挥尽溶剂，加入0.6ml 0.5％香草醛-冰乙酸溶液和2ml高氯酸，60℃水浴20min后，冰浴冷却，加入冰乙酸至25ml，充分振摇，于550nm波长处测定吸光度，重复3次，取平均值；

2)供试品制备：称取石榴皮生品及炮制品粉末1g，按1:20的料液比加入体积分数70％的乙醇溶液20ml，在50℃下以高功率超声提取30min，提取反应结束后，以10000r/min离心分离10min收集上清液，水浴蒸干，干膏用甲醇溶解并定容至100ml，作为供试品溶液；量取供试品溶液1ml，置于25ml具塞刻度试管中，70℃水浴加热挥尽溶剂，加入0.6ml 0.5％香草醛-冰乙酸溶液和2ml高氯酸，60℃水浴20min后，冰浴冷却，加入冰乙酸至25ml，充分振摇，于550nm波长处测定吸光度，重复3次，取平均值；计算样品中三萜类化合物含量。

进一步，所述没食子酸和鞣花酸的含量测定方法包括：

1)配制对照品溶液：称取没食子酸2.00mg用超纯水定容至10ml容量瓶中，即得没食子酸对照品溶液浓度为0.2000mg/ml；精确称取鞣花酸2.62mg用二甲基亚砜定容至10ml容量瓶中，即得鞣花酸对照品溶液，浓度为0.2620mg/ml；分别精确吸取没食子酸对照品溶液和鞣花酸对照品溶液5ml，涡旋震荡混合均匀，即得混合对照品溶液，浓度为没食子酸0.1mg/ml，鞣花酸0.131mg/ml；

2)绘制标准曲线：取混合对照品溶液，分别进样20μl，15μl，10μl，5μl，2μl，在270nm和254nm波长条件下测定峰面积，并以峰面积为纵坐标，以含量单位μg为横坐标，绘制标准曲线；

3)制备供试液：精确称取石榴皮生品及炮制品0.25g，加入25ml蒸馏水，高功率超声提取30min，超声结束后，以10000r/min离心分离5min收集上清液，过0.45μm微孔滤膜，即得；

4)测定精密度：精密吸取没食子酸和鞣花酸混合对照品溶液适量，定量进样20μl，连续进样6次，离线工作站保存目标物峰面积，计算RSD值；

5)测定稳定性：取任意一样品粉末，制备样品溶液，分别在0、2、4、6、8、16h测定，离线工作站保存目标物峰面积，计算RSD值；

6)确定重复性：取样品粉末，平行制备供试品溶液6份，离线工作站保存目标物峰面积，计算RSD值；

7)测定含量：分别精密吸取供试品溶液，按流速为0.8mg/ml 0～12min；1mg/ml 12～25min；柱温为30℃；进样量为20μl；检测波长270nm 0～12min、254nm则12～25min；检测时间为25min；进行色谱测定，依法同时测定没食子酸和鞣花酸的含量。

再次，通过电子鼻检测石榴皮炒炭前后的气味变化。

1)样品的预处理

将石榴皮生品及炮制品粉碎过筛后，称取20g置于干燥锥形瓶中，密封静置，采用静置顶空抽样的方法进行样品气味信息采集，顶空生成时间为120min，即将样品装入锥形瓶后密封静置2h。

2)检测参数

将PEN3电子鼻与电脑连接后，运行其配置软件WinMuster。设定电子鼻的各检测参数如下：以洁净干燥空气为载气，预采样准备时间为8s，采样时间为160s，气体流量为0.4L/min，等待时间为10s，清洗时间为50s。

3)气味采集

用电子鼻对锥形瓶内的顶空气体进行检测，每个样品采集稳定后的数据，各样品重复测量3次。

4)数据分析

采用主成分分析(PCA)散点图和线性判别式分析(LDA)投影图，有效区分炮制品与生品，对炮制“炒炭存性”的火候，也能有效区分。

本发明的另一目的在于提供一种由所述石榴皮炮制方法制备的石榴皮。

本发明的另一目的在于提供一种由所述石榴皮制造的涩肠止泻药物。

本发明的另一目的在于提供一种由所述石榴皮制造的止血药物。

本发明的另一目的在于提供一种由所述石榴皮制造的驱虫药物。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明能够更好地控制石榴皮饮片质量，通过建立HPLC同时测定饮片中没食子酸和鞣花酸的含量，采用UV法测定总多酚、总三萜含量，以多指标评价不同炮制程度的石榴皮炭品优化石榴皮炮制工艺。以电子鼻技术检测石榴皮生品与炮制品气味变化，用主成分分析法、线性判别式分析法区分石榴皮生品与炭品，使对于石榴皮炮制程度的主观性状标准数字化、可视化，为电子鼻技术在中药饮片标准化应用中提供参考。

附图说明

图1是本发明实施例提供的石榴皮炮制质量控制方法流程图。

图2是本发明实施例提供的没食子酸标准曲线示意图。

图3是本发明实施例提供的熊果酸标准曲线示意图。

图4是本发明实施例提供的对照品溶液的HPLC图。

图5是本发明实施例提供的供试品溶液的HPLC图。

图6是本发明实施例提供的没食子酸HPLC标准曲线示意图。

图7是本发明实施例提供的鞣花酸HPLC标准曲线示意图。

图8是本发明实施例提供的不同炮制时间主成分析图。

图中：(a)270℃，8min、12min、16min；(b)300℃，8min、12min、16min；(c)330℃，8min、12min、16min。

图9是本发明实施例提供的不同炮制时间线性判别式分析图。

图中：(a)270℃，8min、12min、16min；(b)300℃，8min、12min、16min；(c)330℃，8min、12min、16min。

图10是本发明实施例提供的不同炮制温度主成分析图。

图中：(a)8min，270℃、300℃、330℃；(b)12min，270℃、300℃、330℃；(c)16min，270℃、300℃、330℃。

图11是本发明实施例提供的不同炮制温度线性判别式分析图；

图中：(a)8min，270℃、300℃、330℃；(b)12min，270℃、300℃、330℃；(c)16min，270℃、300℃、330℃。

图12是本发明实施例提供的生品与炮制品主成分分析图。

图13是本发明实施例提供的生品与炮制品线性判别式分析图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的技术方案与技术效果做详细说明。

本发明实施例提供的石榴皮炮制方法包括以下步骤：

将石榴皮先用自来水反复冲洗，去掉粘附在石榴皮身上的杂质，再用蒸馏水冲洗3次，置于45℃烘箱中干燥，保存备用；

用红外测温仪，测量锅底温度，330℃时，放入石榴皮，快速翻炒，待表面黑色，有烟雾产生后，16min取出，晾晾，筛除碎屑。

如图1所示，本发明实施例提供的石榴皮炮制质量控制方法包括以下步骤：

S101：将石榴皮先用自来水反复冲洗，去掉粘附在石榴皮身上的杂质，再用蒸馏水冲洗3次，置于45℃烘箱中干燥，保存备用。

S102：对石榴皮炒炭过程中的温度、翻炒时间各选三个水平，按L₉(3⁴)正交表进行石榴皮炮制。

S103：测单炮制后的石榴皮的水分含量、总多酚含量、总三萜含量以及没食子酸和鞣花酸的含量。

S104：对水分含量、总多酚含量、总三萜含量以及没食子酸和鞣花酸的含量测定结果进行综合分析，确定石榴皮炮制影响参数以及最佳炮制参数；利用主成分分析法、线性判别式分析法分析石榴皮炒炭前后气味变化。

S105：基于最佳炮制参数以及相关气味分析结果正交优化石榴皮炒炭工艺，控制石榴皮炮制质量。

本发明实施例提供的水分含量、总多酚含量、总三萜含量以及没食子酸和鞣花酸的含量测定方法具体包括：

(1)水分含量的测定：取经粉碎过筛后的石榴皮及不同程度石榴皮炮制品粉末大于0.5g，置于水分快速测定仪样品盘上均匀铺平，关闭样品室，按仪器操作程序测定样品中水分的含量。

(2)总多酚的含量测定：

(2.1)制备没食子酸标准曲线：准确称取没食子酸标准品25mg，用无水乙醇溶解并定容至25ml，得1mg/ml没食子酸标准品溶液；分别精密吸取没食子酸标准溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20ml于25ml容量瓶中，加入酒石酸亚铁溶液6ml，摇匀后静置10min；再用pH7.5磷酸盐缓冲液定容，摇匀，静置显色，30min后在540nm波长下用紫外可见分光光度计测定吸光度，重复3次，取平均值。

(2.2)制备供试品：准确称取石榴皮生品及炮制品粉末1g，按1:20的料液比加入40％乙醇溶液20ml，在30℃，高功率下超声提取30min，超声结束后，以8000r/min离心分离10min)收集上清液，用40％乙醇溶液定容至100ml，作为供试品溶液；量取供试品溶液0.5ml。

加入酒石酸亚铁溶液6ml，摇匀后静置10min；再用pH7.5磷酸盐缓冲液定容，摇匀，静置显色，30min后在540nm波长下用紫外可见分光光度计测定A值，重复3次，取平均值，计算各个样品中总多酚的含量。

(3)总三萜含量的测定方法：

(3.1)制备熊果酸标准曲线：准确称取熊果酸标准品5.00mg于25ml容量瓶中，以甲醇溶解并定容，即得0.2mg/ml的熊果酸标准品溶液；分别精确量取熊果酸标准品溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40ml，置于25ml具塞刻度试管中，70℃水浴加热挥尽溶剂，加入0.6ml 0.5％香草醛-冰乙酸溶液和2ml高氯酸，60℃水浴20min后，冰浴冷却，加入冰乙酸至25ml，充分振摇，于550nm波长处测定吸光度，重复3次，取平均值。

(3.2)供试品制备：准确称取石榴皮生品及炮制品粉末1g，按1:20的料液比加入体积分数70％的乙醇溶液20ml，在50℃下以高功率超声提取30min，提取反应结束后，以10000r/min离心分离10min收集上清液，水浴蒸干，干膏用甲醇溶解并定容至100ml，作为供试品溶液；量取供试品溶液1ml，置于25ml具塞刻度试管中，70℃水浴加热挥尽溶剂，加入0.6ml 0.5％香草醛-冰乙酸溶液和2ml高氯酸，60℃水浴20min后，冰浴冷却，加入冰乙酸至25ml，充分振摇，于550nm波长处测定吸光度，重复3次，取平均值；计算样品中三萜类化合物含量。

(4)没食子酸和鞣花酸的含量测定：

(4.1)配制对照品溶液：精确称取没食子酸2.00mg用超纯水定容至10ml容量瓶中，即得没食子酸对照品溶液浓度为0.2000mg/ml；精确称取鞣花酸2.62mg用二甲基亚砜定容至10ml容量瓶中，即得鞣花酸对照品溶液，浓度为0.2620mg/ml；分别精确吸取没食子酸对照品溶液和鞣花酸对照品溶液5ml，涡旋震荡混合均匀，即得混合对照品溶液，浓度为没食子酸0.1mg/ml，鞣花酸0.131mg/ml。

(4.2)绘制标准曲线：取混合对照品溶液，分别进样20μl，15μl，10μl，5μl，2μl，在270nm和254nm波长条件下测定峰面积，并以峰面积为纵坐标，以含量单位μg为横坐标，绘制标准曲线。

(4.3)制备供试液：精确称取石榴皮生品及炮制品0.25g，加入25ml蒸馏水，高功率超声提取30min，超声结束后，以10000r/min离心分离5min收集上清液，过0.45μm微孔滤膜，即得。

(4.4)测定精密度：精密吸取没食子酸和鞣花酸混合对照品溶液适量，定量进样20μl，连续进样6次，离线工作站保存目标物峰面积，计算RSD值。

(4.5)测定稳定性：取任意一样品粉末，制备样品溶液，分别在0、2、4、6、8、16h测定，离线工作站保存目标物峰面积，计算RSD值。

(4.6)确定重复性：取样品粉末，平行制备供试品溶液6份，离线工作站保存目标物峰面积，计算RSD值。

(4.7)测定含量：分别精密吸取供试品溶液，按流速为0.8mg/ml 0～12min；1mg/ml12～25min；柱温为30℃；进样量为20μl；检测波长270nm 0～12min、254nm则12～25min；检测时间为25min；进行色谱测定，依法同时测定没食子酸和鞣花酸的含量。

(5)电子鼻评价石榴皮炒炭前后的气味变化。

(5.1)样品的预处理

将石榴皮生品及炮制品粉碎过筛后，称取20g置于干燥锥形瓶中，密封静置，采用静置顶空抽样的方法进行样品气味信息采集，顶空生成时间为120min，即将样品装入锥形瓶后密封静置2h。

(5.2)检测参数

将PEN3电子鼻与电脑连接后，运行其配置软件WinMuster。设定电子鼻的各检测参数如下：以洁净干燥空气为载气，预采样准备时间为8s，采样时间为160s，气体流量为0.4L/min，等待时间为10s，清洗时间为50s。

(5.3)气味采集

用电子鼻对锥形瓶内的顶空气体进行检测，每个样品采集稳定后的数据，各样品重复测量3次。

(5.4)数据分析

采用主成分分析(PCA)散点图和线性判别式分析(LDA)投影图，有效区分炮制品与生品，对炮制“炒炭存性”的火候，也能有效区分。

本发明实施例提供的石榴皮炮制最佳工艺具体包括330℃炒制16min。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例1：

1.材料与仪器

1.1试验材料

石榴皮(品种：酸石榴，产于安徽亳州，经枣庄学院食品科学与制药工程学院张立华教授鉴定为正品酸石榴皮)。

1.2试验试剂

试验中所用试剂见表1。

表1试验试剂

1.3试验仪器

试验中所用仪器与设备见表2。

表2仪器与设备

2、实验方法

2.1石榴皮的预处理

将购买的石榴皮先用自来水反复冲洗，去掉粘附在石榴皮身上的杂质，再用蒸馏水冲洗3次，置于45℃烘箱中干燥，保存备用。

2.2石榴皮的炮制

取净石榴皮60g，对石榴皮炒炭过程中的温度、翻炒时间进行考察，各选三个水平，按L₉(3⁴)正交表进行实验设计，正交设计因素水平见表3，正交设计试验见表4。石榴皮经炮制后，用小型粉碎机将石榴皮与石榴皮炮制品粉碎成粉末，过45目筛，置于样品瓶中密封备用。

表3石榴皮炒炭正交设计因素水平表

2.3水分含量的测定

取“2.2”项下经粉碎过筛后的石榴皮及不同程度石榴皮炮制品粉末＞0.5g，置于水分快速测定仪样品盘上均匀铺平，关闭样品室，按仪器操作程序测定样品中水分的含量。

2.4总多酚的含量测定

2.4.1没食子酸标准曲线的制备

准确称取没食子酸标准品25mg，用无水乙醇溶解并定容至25ml，得1mg/ml没食子酸标准品溶液。分别精密吸取没食子酸标准溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20ml于25ml容量瓶中，加入酒石酸亚铁溶液6ml，摇匀后静置10min；再用pH7.5磷酸盐缓冲液定容，摇匀，静置显色，30min后在540nm波长下用紫外可见分光光度计测定吸光度，重复3次，取平均值。

2.4.2供试品的制备

准确称取石榴皮生品及炮制品粉末1g，按1:20的料液比加入40％乙醇溶液20ml，超声提取(30℃，30min，高功率)。超声结束后，离心分离(8000r/min，10min)收集上清液，用40％乙醇溶液定容至100ml，作为供试品溶液。量取供试品溶液0.5ml，按照“3.4.1”项下方法在540nm波长下测定A值，重复3次，取平均值，计算各个样品中总多酚的含量。

2.5总三萜含量的测定

2.5.1熊果酸标准曲线的制备

准确称取熊果酸标准品5.00mg于25ml容量瓶中，以甲醇溶解并定容，即得0.2mg/ml的熊果酸标准品溶液。分别精确量取熊果酸标准品溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40ml，置于25ml具塞刻度试管中，70℃水浴加热挥尽溶剂，加入0.6ml 0.5％香草醛-冰乙酸溶液和2ml高氯酸，60℃水浴20min后，冰浴冷却，加入冰乙酸至25ml，充分振摇，于550nm波长处测定吸光度，重复3次，取平均值。

2.5.2供试品制备

准确称取石榴皮生品及炮制品粉末1g，按1:20的料液比加入体积分数70％的乙醇溶液20ml，超声提取(50℃，30min，高功率)。提取反应结束后，离心分离(10000r/min，10min)收集上清液，水浴蒸干，干膏用甲醇溶解并定容至100ml，作为供试品溶液。量取供试品溶液1ml，按照“2.5.1”项下方法测定吸光值，计算样品中三萜类化合物含量。

2.6没食子酸和鞣花酸的含量测定

2.6.1对照品溶液的配制

精确称取没食子酸2.00mg用超纯水定容至10ml容量瓶中，即得没食子酸对照品溶液(0.2000mg/ml)。

精确称取鞣花酸2.62mg用二甲基亚砜(DMSO)定容至10ml容量瓶中，即得鞣花酸对照品溶液(0.2620mg/ml)。

分别精确吸取没食子酸对照品溶液和鞣花酸对照品溶液5ml，涡旋震荡混合均匀，即得混合对照品溶液(没食子酸0.1mg/ml，鞣花酸0.131mg/ml)。

2.6.2标准曲线的绘制

取混合对照品溶液，分别进样20μl，15μl，10μl，5μl，2μl，在270nm和254nm波长条件下测定峰面积，并以峰面积为纵坐标，以含量(μg)为横坐标，绘制标准曲线。

2.6.3供试液的制备

精确称取石榴皮生品及炮制品0.25g，加入25ml蒸馏水，高功率超声提取30min，超声结束后，离心分离(10000r/min，5min)收集上清液，过0.45μm微孔滤膜，即得。

2.6.4色谱条件

表5色谱条件

表6流动相系统

2.6.5精密度

精密吸取“2.6.1”项下的没食子酸和鞣花酸混合对照品溶液适量，定量进样20μl，连续进样6次，离线工作站保存目标物峰面积，计算RSD值。

2.6.6稳定性

取任意一样品粉末，照“2.6.3”项下方法制备样品溶液，分别在0、2、4、6、8、16h测定，离线工作站保存目标物峰面积，计算RSD值。

2.6.7重复性

取同“2.6.6”项一样的样品粉末，平行制备供试品溶液6份，离线工作站保存目标物峰面积，计算RSD值。

2.6.8含量测定

分别精密吸取供试品溶液，按“2.6.4”项下色谱条件，依法同时测定没食子酸和鞣花酸的含量。

2.7气味的测定

2.7.1样品的预处理

将石榴皮生品及炮制品粉碎过筛后，称取20g置于干燥锥形瓶中，密封静置，采用静置顶空抽样的方法进行样品气味信息采集，顶空生成时间为120min，即将样品装入锥形瓶后密封静置2h。

2.7.2检测参数

将PEN3电子鼻与电脑连接后，运行其配置软件WinMuster。设定电子鼻的各检测参数如下：以洁净干燥空气为载气，预采样准备时间为8s，采样时间为160s，气体流量为0.4L/min，等待时间为10s，清洗时间为50s。

2.7.3气味采集

用电子鼻对锥形瓶内的顶空气体进行检测，每个样品采集稳定后的数据，各样品重复测量3次。

2.7.4数据分析

2.7.4.1主成分分析

主成分分析能最大限度的保持对原有测定数据的信息，通过对电子鼻传感器测定出来的多指标信息进行数据变换和降维，对其进行分类，最后在PCA分析散点图上显示主要的两维散点图。

2.7.4.2线性判别式分析

线性判别式分析(LDA)由原始数据经线性组合构造判别函数，将多维空间分成一些子空间，能够最大限度地区分不同的样品，分类效果好且易实现。此分析更加注重样品在空间中的分布状态及彼此之间的距离，将样品信号数据通过运算法则投影到某一方向，使得组与组之间的投影尽可能分开。

3、结果与分析

3.1炮制样品性状

以表4中正交试验条件炮制石榴皮，样品性状如表7。

表7石榴皮炮制品性状

3.2水分含量测定结果

以“2.3”项下方法测定石榴皮及石榴皮炮制品的水分含量结果如表8，以“0”表示生品，“1～9”表示正交条件下各炮制品。

表8石榴皮及石榴皮炮制品含水量

3.3总多酚含量测定结果

3.3.1没食子酸标准曲线

按照“2.4.1”项下方法，测定吸光值，以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，将平行测定结果的平均值进行线性回归，得没食子酸浓度(x)与吸光值(y)之间的方程：y＝14.336x+0.0009，R²＝0.9994。表明没食子酸浓度在0.008～0.0112mg/ml范围内，与吸光值有良好线性关系。

3.3.2总多酚含量测定结果分析

在总多酚含量测定中，生品总多酚含量为20.31％，在经炮制后各炮制品总多酚含量明显降低，总多酚含量结果分析如表10所示，此外，炒制温度对石榴皮饮片的质量有显著性影响，炒制时间无显著性影响，方差分析如表11所示。

总多酚含量计算方法：

式(1)中，w为石榴皮及石榴皮炮制品总多酚含量(％)，c为测定总多酚的浓度(mg/ml)，V为供试液的体积(ml)，n为稀释倍数，M为取样的质量(g)，W为样品含水量(％)。

表10正交试验测定总多酚含量结果分析

表11总多酚含量方差分析表

3.4总三萜含量测定结果

3.4.1熊果酸标准曲线

按照2.5.2项下方法，测定吸光值，以熊果酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，将平行测定结果的平均值进行线性回归，得熊果酸浓度(x)与吸光值(y)之间的方程：y＝47.837x+0.0044，R²＝0.999。在熊果酸浓度0.0016～0.0112mg/ml范围内，熊果酸浓度与吸光值有良好线性关系。

3.4.2总三萜含量测定结果分析

在总三萜含量测定中，生品总三萜含量为2.94％，在经炮制后各炮制品三萜含量变化幅度不大，且炮制温度与炮制时间对石榴皮饮片的质量均无显著性影响总三萜含量结果分析如表12所示，方差分析如表13所示。

总三萜含量计算方法：

式(2)中，w为石榴皮及石榴皮炮制品总三萜含量(％)，c为测定总三萜的浓度(mg/ml)，V为供试液的体积(ml)，n为稀释倍数，M为取样的质量(g)，W为样品含水量(％)。

表12正交试验测定总三萜含量结果分析

表13总三萜含量方差分析表

3.5没食子酸和鞣花酸含量测定结果

3.5.1HPLC鉴定没食子酸和鞣花酸结果

没食子酸、鞣花酸与其他成分可达到基线分离，在本实验的色谱条件下没食子酸和鞣花酸分离效果良好。

3.5.2没食子酸含量测定结果

3.5.2.1没食子酸标准曲线

按照“2.6.4”项下方法测定峰面积，并按“2.6.2”中方法绘制标准曲线，以没食子酸浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，得线性回归方程：程y＝3635.6x-3.2146，R²＝0.9996。在没食子酸质量为0.2-2μg的范围内，没食子酸浓度和峰面积成线性关系。如图5所示。

3.5.2.2没食子酸含量测定结果分析

在没食子酸含量测定中，生品没食子酸0.1％，在经炮制后各炮制品没食子酸含量较生品有所增加，但是炮制温度与炮制时间对石榴皮炭品均无显著性影响各炮制条件下没食子酸含量结果分析如表14所示，方差分析如表15所示。

没食子酸含量计算方法：

式(3)中，w为石榴皮及石榴皮炮制品没食子酸含量(％)，m为测定没食子酸的质量(μg)，n为稀释倍数，M为取样的质量(g)，W为样品含水量(％)。

表14正交试验测定没食子酸含量结果分析

表15没食子酸含量方差分析表

3.5.3鞣花酸含量测定结果

3.5.3.1鞣花酸标准曲线

按照“2.6.4”项下方法测定峰面积，并按“2.6.2”中方法绘制标准曲线，以没食子酸浓度(X)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，得线性回归方程：y＝13811x-396.08，R²＝0.9992。在鞣花酸质量为0.262-2.62μg的范围内，鞣花酸浓度和峰面积成线性关系，如图6所示。

3.5.3.2鞣花酸测定结果分析

在鞣花酸的含量测定中，石榴皮生品鞣花酸的含量为1.08％，在经炮制后各炮制品鞣花酸含量增加，且炮制温度对石榴皮饮片的质量有显著性影响，鞣花酸结果分析如表16所示，方差分析如表17所示。

鞣花酸含量计算方法：

式(4)中，w为石榴皮及石榴皮炮制品鞣花酸含量(％)，m为测定总多酚的质量(μg)，n为稀释倍数，M为取样的质量(g)，W为样品含水量(％)。鞣花酸含量测定结果如表16所示，方差分析如图5-图11所示。

表16正交试验测定鞣花酸含量结果分析

表17鞣花酸含量方差分析表

3.5.4精密度实验结果

按照“2.4.3.3”项下方法进行实验，没食子酸和鞣花酸RSD值分别为1.48％和0.67％，表明仪器精密度良好。

3.5.5稳定性实验结果

按照“2.4.3.4”项下方法进行实验，没食子酸和鞣花酸RSD值分别为1.96％和1.27％，表明供试品溶液至少在16h内稳定。

3.5.6重复性实验结果

按照“2.4.3.5”中方法进行实验，没食子酸和鞣花酸RSD值分别为2.49％和2.31％，表明该试验方法的重复性良好。

3.6总多酚、总三萜、没食子酸和鞣花酸的含量测定汇总分析

在饮片规格相同的前提下，选择炮制时间(X₁)、炮制温度(X₂)为影响因素，总多酚含有量(Y₁)、总三萜含有量(Y₂)、没食子酸与鞣花酸总量(Y₃)作为评价指标，然后根据指标差异分别对其赋予不同权重系数，得到综合评分(Y)，计算公式为Y＝(y₁/y_1max)*40+(y₂/y_2max)*20+(y₃/y_3max)*20+(y₄/y_4max)*20，所得到石榴皮的炮制最优工艺为A₃B₃，即炮制温度330℃，炮制时间16min，以空白因素项为误差项，方差分析得温度对于石榴皮炭品的炮制具有显著性影响。综合评分直观分析表如表18所示，方差分析表如表19所示。

表18含量测定综合评分结果

表19方差分析表

3.7石榴皮生品与优化炭品各成分比较

优化得到石榴皮炒炭最佳工艺为A₃B₃，经实验验证，确定石榴皮经炒炭后，生品与炭品的总多酚、总三萜、没食子酸、鞣花酸总多酚含量如表20所示。较生品降低至89.46％，总三萜含量降低为97.62％，没食子酸和鞣花酸含量较生品依次上升至270％、105.55％。在石榴皮炒炭过程中，高温条件下，多酚分解产生没食子酸与鞣花酸，这一结论与周倩等对于石榴皮炒炭过程中没食子酸与鞣花酸含量变化规律的研究一致。

表20生品与炭品各成分含量比较

3.8石榴皮生品与炭品的气味分析结果

3.8.1炮制时间对气味的区分

按照“2.7.2”项下检测参数对石榴皮样品气味信息测定后，对炮制温度相同条件下不同炮制时间的样品数据进行主成分分析，线性判别式分析。主成分分析如图7所示，在炮制时间为8min、12min、16min时，分别在270℃、300℃、330℃条件下的PC1依次为：79.85％、98.11％、93.50％；线性判别式分析如图8所示，LD1依次为：94.75％、97.44％、98.67％。表明相同温度条件下，不同炮制时间炮制品的电子鼻数据之间无重叠，区分度较好。进一步分析可以看出，不同炮制时间的炮制品主要分布在三个区域，说明这三种炮制品的挥发性气味能比较清晰的区别。这说明电子鼻技术能很好地对不同炮制时间的石榴皮炮制品进行定性鉴别。

3.8.2炮制温度对气味的区分

按照“2.7.2”项下检测参数对石榴皮样品气味信息测定后，对相同时间条件下不同炮制温度的样品数据进行主成分分析，线性判别式分析。主成分分析如图9所示，控制炮制温度为270℃、300℃、330℃条件下，分别在8min，12min，16min炮制时间时PC1分别为90.27％、94.99％、95.12％，线性判别式分析如图10所示，LD1依次为97.26、88.67％、88.05％。表明相同炮制时间条件下，不同炮制温度炮制品的电子鼻数据之间无重叠，区分度较好。进一步分析可以看出，不同炮制时间的炮制品主要分布在三个区域，说明这三种炮制品的挥发性气味能比较清晰的区别。这说明电子鼻技术能很好地对不同炮制温度的石榴皮炮制品进行定性鉴别。

3.8.3生品与炮制品气味变化分析

按照“2.7.2”项下检测参数对石榴皮及石榴皮炮制品气味信息测定后，对石榴皮生品及优化石榴皮炭品进行主成分分析、线性判别式分析，PC1、LD1分别为88.46％、100％，分析结果如图11、图12所示，表明石榴皮生品与炭品之间无重叠，区分度较好。也说明电子鼻技术能很好地对石榴皮生品和炮制品进行定性鉴别。根据电子鼻检测器数据显示，引起石榴皮炒炭前后气味变化的检测器为W5S，根据附录3电子鼻传感器阵列及主要作用可得W5S对氮氧化物灵敏度很高，推测引起石榴皮生品与炭品气味变化的原因与石榴皮炒炭那过程中温度升高，生物碱成分在高温条件下会分解产生氮氧化物有关。

4、结果

在正交设计优化石榴皮炮制的最佳工艺中，石榴皮炭炮制工艺的最佳工艺条件为A₃B₃，即330℃炒制16min，此时根据总多酚、总三萜、没食子酸和鞣花酸的含量所加权得到的综合评价最高，根据加权各指标得率，影响因素主次为炮制温度＞炮制时间，炮制温度对石榴皮饮片的质量有显著性影响。另外，通过电子鼻技术可以明显区分石榴皮生品与炮制品，采用主成分分析法、线性判别式分析法能明确区分石榴皮生品与炭品。通过对电子鼻技术在中药炮制过程中的研究，使炮制性状客观化、数字化，为电子鼻技术在中药饮片标准化应用中提供参考。目前，对于中药质量的评价主要是主观与客观两种模式并存，而客观化评价借助其客观性的数据占据主导地位，而仅对于中药中一种或者几种有效成分作为品质评价标准的评价，不仅不够全面，而且耗时耗力。在中药的传统质量评价中，气味是十分重要的评价指标，每一味中药或强或淡，都有其独特的气味，而气味与化学成分的含量直接相关，能够反映药物的内在品质，所以气味完全可以作为中药材品质的外在评价标准，而电子鼻技术在中药质量评价上的应用这一创新，也将带来中药质量评价的技术性变革。

电子鼻PEN3标准传感器阵列及其主要应用

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。