阅读说明：本技术 复合外泌体Nidogen-1的组织工程支架及其制备方法 (Tissue engineering scaffold of composite exosome Nidougen-1 and preparation method thereof ) 是由 程朋真 刘斌 杨柳 曹天庆 宁芬茹 于 2020-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种复合外泌体Nidogen-1的组织工程支架及其制备方法,收集经过表达处理的骨髓间充质干细胞上清液,通过超速离心法分离外泌体Nidogen-1,调整其使用浓度为10-100μg/mL；将海藻酸钠、透明质酸、PEG-600溶于去离子水制成混合预聚物；添加外泌体Nidogen-1,从而制备获得复合外泌体Nidogen-1的组织工程支架。将该组织工程支架植入创伤部位或生物相容性组织工程材料中心,可促进缺损部位血管再生,改善材料中心代谢微环境,具有重要的临床应用价值。(The invention discloses a tissue engineering scaffold of a composite exosome Nidogen-1 and a preparation method thereof, wherein the tissue engineering scaffold is characterized in that bone marrow mesenchymal stem cell supernatant subjected to expression treatment is collected, the exosome Nidogen-1 is separated by an ultracentrifugation method, and the use concentration of the exosome Nidogen-1 is adjusted to be 10-100 mu g/mL; dissolving sodium alginate, hyaluronic acid and PEG-600 in deionized water to prepare a mixed prepolymer; adding an exosome Nidogen-1 to prepare the tissue engineering scaffold of the composite exosome Nidogen-1. The tissue engineering scaffold is implanted into a wound part or a biocompatible tissue engineering material center, can promote the regeneration of blood vessels of the defect part and improve the metabolism microenvironment of the material center, and has important clinical application value.)

复合外泌体Nidogen-1的组织工程支架及其制备方法

技术领域

本发明属于医学生物材料领域，具体涉及一种复合外泌体Nidogen-1的组织工程支架及其制备方法。

背景技术

由创伤、疾病导致的大范围组织器官缺损具有发生率高、致残率高的特点。再生医学和组织工程技术不断突破，为使用外源性材料移植修复缺损组织提供了有力支撑。然而，早期血管化仍是制约其修复效果的关键因素。组织工程支架产品一般在体外构建、在体内应用，研究证实组织液只能渗透到支架材料表面以下300μm，支架内部的细胞难以获得足够的氧气和营养供给，其增殖、分化及分泌功能受到影响，甚至引发支架中心细胞凋亡，导致支架内部重建受阻，成为制约组织工程移植物修复宿主器官缺损的瓶颈问题。为此，中国专利CN111065731A通过在体外形成血管类器官，然后再植入体内完成修复。但与组织工程移植物相比，存在修复过程复杂的问题。并且该专利使用外源干细胞进行血管重建，存在免疫排斥、感染风险和致瘤性问题。

干细胞来源的外泌体具有与干细胞相似的功能，如促进组织修复和再生等。相比单纯细胞治疗，外泌体更易穿透人体屏障到达受损部位，规避外源干细胞致瘤风险，且方便冻融保存，可以成为临床更理想的生物修复剂。但由于外泌体组成复杂，市场上很少见到与外泌体完美契合的相关组织工程复合材料，制约了外泌体作为新一代生物制品的使用效率和应用研发进程。

巢蛋白Nidogen-1是一种主要由***分泌的细胞外基质(ECM)蛋白，作为血管基底膜的主要成分之一，有文献报道在毛细血管形成过程中，Nidogen-1参与管状结构形成过程，可以稳定新生血管的结构并促进微血管成熟。然而，既往研究主要聚焦在Nidogen-1作为结构蛋白维持内环境稳态方向，且认为Nidogen-1存在于细胞外基质，而不是外泌体中。

综上所述，目前亟待解决的问题为：如何尽早在组织工程移植物内部建立血运，以促进细胞浸润、增殖和分化，从而发挥组织工程移植物的治疗优势、提高靶向修复效果。

发明内容

为了解决组织工程移植物内部缺血缺氧、代谢缓慢的问题，本发明基于首次证实结构蛋白Nidogen-1存在于外泌体中，且具有调节蛋白的功能，提供一种复合外泌体Nidogen-1的组织工程支架及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种复合组织工程支架，该复合组织工程支架包括可降解的生物相容性基质及载入在该基质中的成血管效应分子，所述成血管效应分子为外泌体Nidogen-1；或者，所述复合组织工程支架包括可降解的生物相容性基质及载入在该基质中的经过上述成血管效应分子处理的血管内皮细胞。

优选的，所述外泌体Nidogen-1分离自经过细胞过表达Nidogen-1处理的骨髓间充质干细胞的培养液。

优选的，所述外泌体Nidogen-1的使用浓度(以外泌体Nidogen-1所含总蛋白计)为10-100μg/mL，外泌体Nidogen-1与生物相容性基质的体积比为1:5-10。

优选的，所述生物相容性基质选自复合水凝胶或基质胶。

优选的，所述复合水凝胶包括海藻酸钠、透明质酸、聚乙二醇(例如，PEG600)以及水。

上述复合组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

1)获得成血管效应分子，所述成血管效应分子为外泌体Nidogen-1；

2)将外泌体Nidogen-1载入可降解的生物相容性基质，得到复合组织工程支架。

优选的，所述步骤1)具体包括以下步骤：在分离得到的骨髓间充质干细胞中过表达Nidogen-1，然后采用超速离心法分离所述骨髓间充质干细胞的培养液中的囊泡体，得到外泌体Nidogen-1。

优选的，所述步骤2)具体包括以下步骤：将使用浓度为10-100μg/mL的外泌体Nidogen-1与液态复合水凝胶或者基质胶混合，然后进行后处理(稳定结构、凝固等)。

优选的，所述液态复合水凝胶由95-100mL水与0.5-2g海藻酸钠、1-5g透明质酸及1.5-6mL PEG混合而成。

优选的，所述液态复合水凝胶由95-100mL水与1-2g海藻酸钠、1-2g透明质酸及3-6mL PEG混合而成。

优选的，所述后处理具体包括以下步骤：将外泌体Nidogen-1与液态复合水凝胶混合后采用氯化钙进行交联。

一种仿生骨组织支架，包括力学承重结构以及嵌入在力学承重结构内部的上述复合组织工程支架。

优选的，所述力学承重结构选自采用组织工程骨材料(例如，磷酸钙、羟基磷灰石、胶原)制成的中空多孔生物陶瓷。

上述外泌体Nidogen-1在制备用于皮肤等软组织缺损修复的药物或组织工程支架中的应用。

优选的，所述药物或组织工程支架通过注射或涂敷方式植入创伤部位。

上述外泌体Nidogen-1在制备用于骨组织缺损修复的药物或组织工程支架中的应用。

优选的，所述骨组织缺损选自临界骨缺损，缺损长度大于等于缺损骨周径的1.5倍。

本发明的有益效果体现在：

本发明的复合组织工程支架以外泌体Nidogen-1作为成血管效应分子，既可以单独用于治疗皮肤等软组织创伤，又可以组成仿生骨组织支架，通过改善代谢微环境加速骨缺损修复。本发明采用的外泌体Nidogen-1属于富集Nidogen-1的外泌体，相比传统的细胞组织工程产品，避免了外源性细胞带来的感染、致瘤风险和免疫反应，可以稳定的发挥治疗和调节作用。本发明的复合组织工程支架可显著促进生物材料于机体内外的有效应答，加速血管再生进程，从而构建高活性的组织工程仿生替代材料。

本发明依据外泌体成分Nidogen-1在促进内源性和外源性细胞迁移和成血管过程中的活性作用，将富集Nidogen-1的外泌体，即外泌体Nidogen-1载入生物相容性基质中，所形成的复合组织工程支架可植入创伤部位软组织或组织工程骨材料中心，促进缺损组织修复中的血管再生，及改善材料中心代谢微环境，从而提高了靶向修复效率且符合精准给药的发展趋势，具有重要的临床应用价值。

进一步的，本发明使用的组织工程骨材料均具有良好的生物相容性，安全无毒。

进一步的，本发明采用过表达处理生成骨髓间充质干细胞源性外泌体Nidogen-1，可以获得高丰度的效应分子成分Nidogen-1，该外泌体Nidogen-1中Nidogen-1的丰度为未过表达处理的骨髓间充质干细胞源性常规外泌体的1.5倍以上。

附图说明

图1为本发明实施例1中制备复合组织工程支架的流程图。

图2为本发明实施例1中富集Nidogen-1的外泌体的透射电镜鉴定图像(a)、外泌体中Nidogen-1蛋白印迹丰度(b)、外泌体表面标志物CD9的检测结果(c)和富集Nidogen-1的外泌体的NTA粒径分析(d)。

图3为未经过诱导的血管内皮细胞体外迁移实验结果(a)、常规外泌体诱导的血管内皮细胞体外迁移试验结果(b)、外泌体Nidogen-1诱导的血管内皮细胞迁移试验结果(c)及阻断外泌体诱导的血管内皮细胞迁移试验结果(d)。

图4为未经过诱导的血管内皮细胞体外成血管结果(a)、常规外泌体诱导的血管内皮细胞体外成血管结果(b)、外泌体Nidogen-1诱导的血管内皮细胞体外成血管结果(c)、阻断外泌体诱导的血管内皮细胞体外成血管结果(d)及各组体外血管形成实验的管状结构节点数统计结果(e)；其中：*P<0.05，**P<0.01，ns表示差异不显著。

图5为本发明实施例1中制备的水凝胶的外观，其中：(a)未交联液态复合水凝胶，(b)交联及发生固化的水凝胶支架。

图6为未经过诱导的血管内皮细胞体内(裸鼠皮下注射凝胶模型)成血管结果(a)、常规外泌体诱导的血管内皮细胞体内成血管结果(b)及外泌体Nidogen-1诱导的血管内皮细胞体内成血管结果(c)。

图7为本发明实施例1中制备组织工程骨复合支架所采用的陶瓷材料侧面外观(a)、组织工程骨复合支架侧面外观(b)及组织工程骨复合支架横截面外观(c)。

图8为未注射外泌体的组织工程骨复合支架材料中心HE染色切片(a)、注射常规外泌体的组织工程骨复合支架材料中心成血管的HE染色切片(b)及注射外泌体Nidogen-1的组织工程骨复合支架材料中心成血管的HE染色切片(c)；其中：黑线框内箭头所指为血管化区域。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

实施例1

1、外泌体收集

1.1收集骨髓间充质干细胞上清液或血清

对于骨髓间充质干细胞(BMSC)：选择10日龄大鼠幼鼠(2017年1月购买自第四军医大学动物实验中心)，脱颈处死后取出股骨、胫骨，剪去其干骺端，暴露骨髓腔，用培养液(a-MEM+10％胎牛血清+1％青霉素/链霉素双抗)冲洗骨髓，收集骨髓单核细胞，通过贴壁法分离纯化至P3代，流式细胞术检测其表面标志物表达情况，细胞(CD34-CD45-CD11b/c-CD90+)纯度大于93％即可用于下一步试验。将分离纯化后细胞接种于培养瓶内，待细胞融合至80％时更换无血清培养基，每隔48h收集一次细胞上清液，-80℃保存备用。

1.2富集外泌体中的Nidogen-1

6孔板内接种P3代骨髓间充质干细胞，调整细胞密度为3×10⁴个/mL，每孔接种2mL，当细胞融合较好后加入过表达Nidogen-1的慢病毒感染试剂(上海吉凯基因)，12小时后更换培养基(a-MEM+10％胎牛血清+1％青霉素/链霉素双抗)，镜下观察细胞状态，继续培养70小时后，传代至10cm²培养皿内，待细胞融合至80％，更换无血清培养基，每隔48小时收集一次细胞上清液，-80℃保存备用。

1.3外泌体分离和Nidogen-1丰度检测

超速离心法分离外泌体：将步骤1.1得到的细胞上清液，及步骤1.2得到的细胞上清液分别进行梯度离心。

其中，梯度离心的具体流程如下：取50mL细胞上清液，首先300g离心10分钟，弃沉淀；2000g离心10min，弃沉淀；10000g离心30min，弃沉淀；100000g离心70min，弃上清；用1mL的磷酸盐缓冲液(PBS，Hyclone)重悬沉淀，继续以100000g的转速离心70min，得到的沉淀即为外泌体，将其溶于少量PBS，即得外泌体溶液，-80℃保存。外泌体溶液通过0.22μm滤膜过滤除菌后，即可用于构建组织工程支架。

外泌体鉴定和Nidogen-1丰度检测：检测从步骤1.1和1.2的细胞上清液中分离的外泌体，如图2a所示，通过透射电镜观察，发现经超速离心分离获得了圆盘状囊泡体，直径100nm左右；如图2c所示，Western blot检测表明，囊泡体的表面均表达标志蛋白CD9；如图2d所示，囊泡体粒径分析(NTA)结果显示其主成分的直径约为120nm，与外泌体的直径范围(30-150nm)相符合，证实其为外泌体。同时，如图2b所示，Nidogen-1的蛋白印迹分析表明，外泌体中均含有Nidogen-1，且从步骤1.2(经过过表达处理)所得细胞上清液中分离的外泌体，与从步骤1.1(未经过过表达处理)所得细胞上清液中分离的外泌体相比，Nidogen-1丰度更高(约为1.5倍)。因此，定义步骤1.2收集的细胞上清液中的富集Nidogen-1的外泌体为外泌体Nidogen-1，定义步骤1.1收集的细胞上清液中的外泌体为常规外泌体。

将以上步骤中得到的外泌体溶液与BCA蛋白浓度测定工作液混合，37℃孵育20-30分钟，测定A562处吸光值，对照总蛋白标准曲线得到外泌体溶液的浓度。

1.4磁珠捕获Nidogen-1

通过抗Nidogen-1的免疫磁珠(厦门普睿迈格)将外泌体溶液中的Nidogen-1吸附，洗脱后可富集外泌体中的Nidogen-1。尽管利用磁珠吸附的方式分离外泌体中的Nidogen-1的效率有待提高，但事实上，过表达后所分离的外泌体中Nidogen-1的丰度已完全满足应用要求，可用于构建组织工程支架。

1.5外泌体Nidogen-1的生物学功能

建立大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)和血管内皮细胞的Transwell隔离共培养体系，通过该体系进行细胞互作研究，发现血管内皮细胞在与外泌体Nidogen-1共培养后成血管能力提升，后期通过反复试验确证BMSC衍生的外泌体Nidogen-1为关键效应分子。

1)外泌体Nidogen-1诱导处理：将体外培养的大鼠血管内皮细胞与5-50μg/mL的外泌体Nidogen-1共同孵育48小时。

处理结果表明，经外泌体Nidogen-1诱导处理的血管内皮细胞迁移能力显著提升(图3a、图3c)，小管形成能力增强(图4a、图4c)。同时，将外泌体Nidogen-1诱导处理的血管内皮细胞与基质胶融合后植入裸鼠背部皮下，植入2周后取材，发现外泌体Nidogen-1诱导组(图6c)相比无诱导处理组(图6a)，具有更显著的血管浸润状态，可见血管内皮细胞在基质胶内成血管能力大幅提升。

2)常规外泌体诱导处理对照实验：取从步骤1.1获得的骨髓间充质干细胞上清液中分离的常规外泌体，调整浓度为5-50μg/mL后与大鼠血管内皮细胞共同孵育48h。

处理结果表明，外泌体Nidogen-1相比常规外泌体，具有更显著的促进血管内皮细胞迁移(图3b、图3c)、体外成血管(图4b、图4c、图4e)和体内成血管(图6b、图6c)的能力。

另外，在上述外泌体Nidogen-1与血管内皮细胞的共孵育体系中添加Nidogen-1的中和抗体(Abcam)，可见血管内皮细胞迁移(图3d)和体外成血管(图4d、图4e)能力显著下调，说明外泌体促进内皮细胞成血管的关键效应分子为Nidogen-1。

根据以上实验结果，本发明首次证实了Nidogen-1以外泌体形式存在，并发现Nidogen-1可作为调节蛋白干预血管内皮细胞活性，促进其迁移和成血管。本发明通过在细胞内过表达Nidogen-1，显著提高外泌体中的效应分子Nidogen-1的含量，可以利用分离得到的外泌体Nidogen-1显著提升血管内皮细胞的体内外成血管能力。因此，外泌体Nidogen-1可以作为组织工程支架的构成要素。

2、复合外泌体Nidogen-1的组织工程支架的制备(实例1)

复合水凝胶主要包括海藻酸钠、透明质酸、PEG-600以及去离子水四种成分，并经过交联、固化而形成可以存储和释放外泌体的基质。

2.1液态复合水凝胶配制

称取2g海藻酸钠、1g透明质酸(1000-1500kDa)分别置于无菌离心管内，环氧乙烷杀菌和消毒，备用。将无菌离心管内的海藻酸钠、透明质酸加入盛有95mL无菌去离子水的烧杯中，置于水浴加热(37℃)的磁力搅拌器上，搅拌至完全溶解，得海藻酸钠-透明质酸预混液；另取5mL经0.22μm滤器过滤的无菌PEG-600，室温下与海藻酸钠-透明质酸预混液充分搅拌均匀，得到混合预聚物溶液，即液态复合水凝胶(图5a)。

2.2外泌体Nidogen-1的复合

用PBS调整外泌体的浓度为50μg/mL(即使用浓度)，然后进行以下后续操作：用移液器吸取100μL使用浓度为50μg/mL的外泌体，加入到1mL液态复合水凝胶中(即体积比为1:10)中，充分混匀，得到复合水凝胶组织工程支架(可塑形、质软)，然后再加入使用浓度为20mg/mL的氯化钙水溶液(3-5mL)浸没该支架，室温交联5-10分钟后取出，使复合水凝胶组织工程支架具备稳定的化学结构，保证体内外降解平衡，即获得复合外泌体Nidogen-1的组织工程支架，该支架在室温下放置中发生固化(海藻酸钠与氯化钙发生化学反应后，结构变稳定，强度和硬度也逐渐变大，参见图5b)，实际使用中可以考虑涂敷、注射等缺损修复操作的便利性，以及体内外温度对固化速度的影响，调整组分配制比例、交联时间等。

复合常规外泌体的组织工程支架的制备参照步骤2.2。

3、仿生骨支架的制备

骨的天然结构包括皮质骨和骨髓腔，皮质骨质地坚硬，主要成分为无机盐(羟基磷灰石)和有机物(I型胶原)等，无机盐的沉积赋予骨支撑能力，有机物则赋予骨弹性和韧性，具有缓冲外力的功能。骨髓腔位于骨内部，呈中空状，其中包含血管(血液)、干细胞、免疫细胞、脂肪等，当骨损伤时，骨髓腔中的细胞和因子激活，参与再生修复进程。

本发明的仿生骨支架，依据骨的天然结构，同样包含内外两层，外层为具有多孔表面的中空柱状生物陶瓷，用于模仿皮质骨，发挥力学承重作用。内层为填充于所述中空柱状生物陶瓷内的复合外泌体Nidogen-1的组织工程支架，模拟骨髓腔，在损伤部位释放外泌体Nidogen-1，促进仿生骨支架中心血管再生，在支架内部重建代谢循环。

其中，外层的生物陶瓷由磷酸钙、羟基磷灰石及胶原通过3D打印或烧结方式制备，三者优化混合质量比为磷酸钙:羟基磷灰石:胶原＝3:2:2，打印或烧结成品的孔径为150-450μm，中空部分直径根据宿主骨解剖结构确定(图7a)。制备完成后采用环氧乙烷灭菌处理，备用。

移植手术前1天，将外层的生物陶瓷置于50％血清培养基内过夜孵育，使血清预吸附在生物陶瓷表面，利于术后内源性细胞粘附和迁移，吸附12小时后取出生物陶瓷，用无菌滤纸吸干表面的培养基，将步骤2得到的复合外泌体Nidogen-1的组织工程支架注射入生物陶瓷中心，即为待移植的仿生骨支架(图7b、图7c)。

4、仿生骨支架的移植

注射后大概半小时，即可以进行仿生骨支架移植。

仿生骨支架植入大鼠体内2周后的HE染色切片证实：经常规外泌体诱导(注射复合常规外泌体的组织工程支架，参照步骤3)的生物陶瓷内部有较多新生血管(图8b)，经外泌体Nidogen-1诱导(注射复合外泌体Nidogen-1的组织工程支架)的仿生骨支架内部有大量新生血管，且有红细胞分布(图8c)，而未经过外泌体诱导(注射经过交联的液态复合水凝胶，参照步骤3)的仿生骨支架内部则主要被纤维组织填充(图8a)。

以上实验结果表明，本发明制备的仿生骨支架所用材料安全无毒，可在体内有序降解，支架中心凝胶释放外泌体Nidogen-1，作用于内源性细胞，促进支架中心早期血管化，从而改善支架中心缺血缺氧状态。

实施例2

按照以上实例1的制备步骤(图1)，本发明实际针对不同组织工程支架材料组分进行了多个实例的实验，各实例的制备步骤中组分的配比不同，具体参见表1。

对于表1中不同的实例，海藻酸钠是一种来源于藻类的有机化合物，价格低，且具有良好的生物相容性，易于交联，调整海藻酸钠的比例可以获得不同力学属性(强度、韧性)的支架材料，可根据修复靶器官的力学性能选择最佳比例。透明质酸是一种酸性粘多糖，具有良好的生物相容性，不同比例的透明质酸可用来制备不同器官的修复支架，如制备关节软骨修复支架，则需要提高透明质酸的比例(5％)，而制备骨缺损修复支架，则应降低透明质酸的比例(1％)。PEG-600，即分子量为600左右的聚乙二醇，常温下为液体，毒性低，生物相容好，PEG-600具有适宜的降解性能，可作为外泌体的良好载体，调整PEG-600比例，可制备不同缓释功能的支架材料。

例如，实施例1中的仿生骨支架还可以采用表1中实例6、实例9、实例10制备的复合外泌体Nidogen-1的组织工程支架。

表1.组织工程支架制备实例的工艺参数

编号	海藻酸钠(w/v)	透明质酸(w/v)	PEG-600(v/v)	外泌体Nidogen-1使用浓度
					实例1	2％	1％	5％	50μg/mL
实例2	0.5％	5％	1.5％	10μg/mL
					实例3	0.5％	5％	1.5％	50μg/mL
实例4	0.5％	5％	1.5％	100μg/mL
					实例5	1％	2％	3％	10μg/mL
实例6	1％	2％	3％	50μg/mL
					实例7	1％	2％	3％	100μg/mL
实例8	2％	1％	6％	10μg/mL
					实例9	2％	1％	6％	50μg/mL
实例10	2％	1％	6％	100μg/mL

实施例3

与实施例1不同的是，用外泌体Nidogen-1在体外预先处理血管内皮细胞，并通过将处理后的血管内皮细胞与液态复合水凝胶混合，从而构建用于制备仿生骨支架的组织工程支架。结果表明，经外泌体Nidogen-1处理后的血管内皮细胞同样可促进仿生骨支架中心血管化，但缺点是仿生骨支架植入后可能会导致免疫反应。

实施例4

与实施例1不同的是，选择基质胶作为装载外泌体Nidogen-1的简化方案，从而替换液态复合水凝胶。

在使用浓度为10-100μg/mL的外泌体Nidogen-1与载体基质胶融合构建组织工程支架中，外泌体Nidogen-1与基质胶的混合体积比为1:5-10。基质胶具有温敏效应，4℃低温下呈液态，37℃则自然凝固成胶，因此，支架构建过程在冰上操作，支架植入体内后温度上升，自然成胶。

以基质胶作为载体，还可以运送细胞(例如，实施例3)至损伤部位参与再生修复。

总之，本发明基于外泌体有效成分的精准分析和实验科学发现，提出了可以用于复合效应分子或经效应分子处理后的细胞的组织工程生物载体，有助于提升与外泌体相关的组织工程支架的靶向修复效率，具有重要的临床应用价值。