阅读说明：本技术 基于pisa方法制备的偶氮还原酶响应性的近红外聚合物荧光探针及其应用 (Azo reductase responsive near-infrared polymer fluorescent probe prepared based on PISA method and application thereof ) 是由 周年琛 王雨晴 李立山 王书媛 孙亚兰 张伟 张正彪 于 2020-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种基于PISA方法制备的偶氮还原酶响应性的近红外聚合物荧光探针及其应用,本发明提供了一种偶氮还原酶响应的分子PPEGMA-ADP-Azo-CDPA,其可作为PISA聚合法中的近红外大分子链转移剂,并进一步通过PISA方法,将甲基丙烯酸苄基酯在引发剂和红外大分子链转移剂的作用下,高效合成偶氮还原酶响应的近红外聚合物荧光探针,聚合物纳米粒子在偶氮还原酶作用下消除聚集猝灭作用荧光增强,利用上述性质该近红外聚合物纳米粒子实现荧光探针和药物载体功能。(The invention relates to an Azo reductase responsive near-infrared polymer fluorescent probe prepared based on a PISA method and application thereof, and provides an Azo reductase responsive molecule PPEGMA-ADP-Azo-CDPA which can be used as a near-infrared macromolecular chain transfer agent in a PISA polymerization method, and further, benzyl methacrylate is efficiently synthesized into the Azo reductase responsive near-infrared polymer fluorescent probe under the action of an initiator and the infrared macromolecular chain transfer agent by the PISA method, polymer nanoparticles eliminate aggregation quenching effect fluorescence enhancement under the action of the Azo reductase, and the near-infrared polymer nanoparticles realize the functions of the fluorescent probe and a drug carrier by utilizing the properties.)

基于PISA方法制备的偶氮还原酶响应性的近红外聚合物荧光 探针及其应用

技术领域

本发明涉及材料制备技术领域，尤其涉及一种基于PISA方法制备的偶氮还原酶响应性的近红外聚合物荧光探针及其应用。

背景技术

近些年来，由于聚合物纳米材料在药物载体、纳米药物、药物传送与生物成像等方面的应用引起了研究者们的广泛的关注。刺激响应纳米粒子可在光、pH、温度、酶、氧化还原等因素下发生可逆或不可逆的物理或者化学变化，刺激响应性纳米粒子可应用于药物传送、诊断成像、生物传感器和生物分离等。传统溶液自组装通常是两亲性嵌段聚合物溶解在选择的溶剂中并加入不良溶剂，然后透析冻结链段形成聚合物纳米粒子组装体，然而这种制备方法只能在低浓度下进行(<1％w/w)，并且步骤繁琐，限制了此方法的商业化应用。随着活性自由基聚合的发展，聚合诱导自组装(PISA)由于制备方法的简单、高效以及可高浓度下制备可控形貌的纳米粒子的优点成为此领域研究的热点。聚合诱导自组装的步骤通常如下：作为大分子RAFT试剂的可溶链段完全溶解在溶剂中，然后加入另一合适单体进行扩链，而在扩链过程中第二段聚合物可溶性逐渐变差，体系中为了保持相互作用力的平衡会驱动两亲性聚合物纳米组装体形成，且在聚合诱导自组装体系中控制疏水链段的长度、亲疏水链段的比例和聚合时间可得到不同形貌与粒径的聚合物纳米粒子。基于上述原因，利用聚合诱导自组装的手段制备刺激响应聚合物纳米粒子用于可控药物释放将具有极大的优势(参见：Zhang,W.J.,Hong,C.Y.,Pan,C.Y.,Biomacromolecules2017,18,1210-1217.)。

近些年，结肠部位的药物靶向传送策略的构建吸引了研究学者们的广泛关注。人体的结肠部位存在着大量的厌氧微生物(10¹⁰～10¹²细菌/g)，可产生如偶氮还原酶、硝基还原酶等酶，含偶氮键的负载药物聚合物纳米粒子可在结肠定位释放药物，在治疗结肠疾病同时减少副作用，这为药物靶向传送用于治疗结肠疾病的体系设计提供了启发。荧光探针因其高效、灵敏与可视化的优势而被广泛应用于生物成像、生物传感等领域。近红外荧光在生物成像时由于具有高透过率、低背景噪音与减少人体组织器官伤害等优势，成为荧光探针的研究热点。荧光探针在药物传送体系中具有可直观、高效灵敏地实现药物释放的监测的优点，成为研究药物分布、监视药物递送过程的可靠方式。近红外荧光分子Aza-BODIPY不仅具有高摩尔吸光系数、高荧光量子产率、高结构稳定性与低pH敏感性等优点，而且还是一种ACQ型染料分子，即其可在聚集状态下实现荧光的猝灭，而在溶解状态下实现荧光恢复，因此利用此策略可高效设计在模拟结肠环境下的偶氮还原酶响应的两亲性聚合物纳米粒子探针用于近红外荧光监测的药物释放。

目前报道的偶氮还原酶响应的近红外聚合物荧光探针用于结肠药物的靶向传送可控释放相对较少，而利用PISA策略制成近红外探针原位高浓度包载药物实现荧光监测的药物靶向传送与释放更是鲜有报道，因此研究PISA原位制备偶氮还原酶响应的近红外聚合物包药纳米粒子荧光探针对于进一步结肠的成像以及治疗具有重要的意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种基于PISA方法制备的偶氮还原酶响应性的近红外聚合物荧光探针及其应用，本发明提供了一种偶氮还原酶响应的近红外大分子链转移剂，并进一步通过PISA方法高效合成偶氮还原酶响应的近红外聚合物荧光探针，聚合物纳米粒子在偶氮还原酶作用下消除聚集猝灭作用荧光增强，利用上述性质该近红外聚合物纳米粒子实现荧光探针和药物载体功能。

本发明的第一个目的是提供一种具有偶氮还原酶响应性的分子PPEGMA-ADP-Azo-CDPA，其结构式如式(I)所示：

其中，11≤n≤25。

本发明的第二个目的是提供一种式(I)所示的偶氮还原酶响应性的分子的制备方法，包括以下步骤：

(1)将式(1)的化合物ADP与AzoBr在碱金属盐和碘化钾的作用下，在有机溶剂中于60～65℃下反应，反应完全后得到式(2)的化合物ADP-Azo；

(2)将式(2)的化合物ADP-Azo与溴丙炔在碱金属盐的作用下，在有机溶剂中于60～65℃下反应，反应完全后得到式(3)的化合物Al-ADP-Azo；

(3)将Al-ADP-Azo与RAFT试剂CDPA在DMAP和DCC作用下，在有机溶剂中于0～25℃下反应，反应完全后进行柱层析，分离出式(4)的化合物Al-ADP-Azo-CDPA；

(4)在惰性气氛保护下，将Al-ADP-Azo-CDPA和式(5)的化合物PPEGMA-N₃在溴化亚铜和PMDETA作用下，在有机溶剂中于60～65℃下反应，反应完全后得到式(Ⅰ)所示的偶氮还原酶响应性的分子；其中，式(1)-(5)和AzoBr的结构式依次如下：

进一步地，在步骤(1)中，ADP、AzoBr、碱金属盐和碘化钾的摩尔比为1:(1.1～1.5):2:0.1。

进一步地，在步骤(1)中，AzoBr的制备方法包括以下步骤：

制备对氨基苯甲醇的重氮盐：在-5～0℃下，在浓盐酸存在条件下，向对氨基苯甲醇中滴加亚硝酸盐的水溶液，反应完全后得到对氨基苯甲醇的重氮盐溶液；

制备Azo：在0～5℃下，向碱金属盐和苯酚的水溶液中滴加对氨基苯甲醇的重氮盐溶液，反应完全后得到Azo；

制备AzoBr：将Azo与1,6-二溴己烷在碱金属盐的作用下，在有机溶剂中于65℃反应，反应完全后柱层析得到AzoBr。

进一步地，在步骤(2)中，ADP-Azo、溴丙炔和碱金属盐的摩尔比为1:(1.1～1.5):2。

进一步地，在步骤(1)和步骤(2)中，碱金属盐选自碳酸钾。

优选地，在步骤(1)和步骤(2)中，有机溶剂为丙酮，在步骤(3)中，有机溶剂为二氯甲烷，在步骤(4)中，有机溶剂为无水甲苯。

进一步地，在步骤(3)中，Al-ADP-Azo、CDPA、DMAP和DCC的摩尔比为1:(1.1～1.3):0.5:(1.0～1.2)；在步骤(4)中，Al-ADP-Azo-CDPA、PPEGMA-N₃、溴化亚铜(CuBr)与PMDETA的摩尔比为(1.1～1.5):1:(1～2):(2～3)。

进一步地，在步骤(4)中，式(5)的化合物PPEGMA-N₃的制备方法包括以下步骤：

(S1)在无氧条件下，将PEAMA、EBIB、PMDETA与溴化亚铜在苯甲醚中于90℃下反应1.5小时，得到PPEGMA，其中PEGMA、EBIB、PMDETA与溴化亚铜的比例为(1.1～1.5):1:2:3；

(S2)在惰性气氛保护下，将PPEGMA与叠氮化钠，在有机溶剂中于80～85℃下反应，反应完全后得到式(5)的化合物PPEGMA-N₃。

优选地，PPEGMA的数均分子量(M_n,NMR)为6500-7500g/mol(通过核磁测试测得)；或数均分子量(M_n,SEC)为6300～7900g/mol(通过凝胶色谱仪(SEC)测得)。

优选地，以上式(I)所示的偶氮还原酶响应性的分子的制备路线如下：

本发明的第三个目的是公开式(I)所示的偶氮还原酶响应性的分子作为近红外大分子链转移剂的应用。

本发明的第四个目的是提供一种通过PISA(聚合诱导自组装)法原位制备偶氮还原酶响应性近红外聚合物的方法，包括以下步骤：

在惰性气氛保护下，以式(I)所示的的偶氮还原酶响应性的分子作为近红外大分子链转移剂，将甲基丙烯酸苄基酯(BzMA)在引发剂和近红外大分子链转移剂的作用下，在有机溶剂中于68～73℃下反应，反应完全后，得到式(II)所示的偶氮还原酶响应性近红外聚合物(PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA_x)，其中，式(II)如下：

其中，5≤n≤87，3≤x≤75。优选地，11≤n≤25，3≤x≤40。

进一步地，BzMA、PPEGMA-ADP-Azo-CDPA和引发剂的摩尔比为6:1:(0.2～0.4)。

进一步地，引发剂为AIBN(偶氮二异丁腈)。

本发明的第五个目的是提供一种采用上述制备方法所制备的式(II)所示的偶氮还原酶响应性近红外聚合物。

本发明所制备的式(II)所示的偶氮还原酶响应的近红外聚合物为两亲性嵌段聚合物，在制备过程是在疏水端的不良溶剂乙醇中进行，在聚合过程中聚合物溶解性变差，最终聚合物以不同形貌的组装体形式存在。

本发明上述聚合诱导自组装所得偶氮还原酶应性近红外聚合物组装体经透析制得相应的胶束PBS溶液，在Na₂S₂O₄作用下破坏组装体，并伴随着荧光逐渐增强的现象。

目前为止，通过PISA策略制备偶氮还原酶响应的近红外聚合物荧光探针鲜有报道。本发明公开了通过PISA策略制备偶氮还原酶响应的近红外聚合物荧光探针的方法。

本发明还要求保护式(II)所示的偶氮还原酶响应性近红外聚合物在制备偶氮还原酶响应的荧光探针中的应用。

本发明进一步还要求保护式(II)所示的偶氮还原酶响应性近红外聚合物在制备偶氮还原酶响应的药物载体或生物成像制剂中的应用。

进一步地，可利用近红外荧光监测药物载体的药物释放过程或生物成像制剂的靶向位点。

进一步地，采用原位载药方式制备偶氮还原酶响应近红外聚合物药物载体，包括以下步骤：

将本发明式(I)所示的PPEGMA-ADP-Azo-CDPA、引发剂、BzMA以及疏水性药物在有机溶剂中于70℃下反应24小时，通过聚合诱导自组装(PISA)法得到偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物载药胶束。

优选地，疏水性药物为阿霉素(DOX)，也可选用其他类型性能的疏水性药物，使其包载于偶氮还原酶响应性聚合物胶束的内部。

所制备的载药胶束只有在偶氮还原酶的存在下模拟结肠的环境可以实现药物的可控释放，并且伴随着近红外荧光的激活增强现象。在模拟人体结肠环境下，偶氮还原酶特异性还原聚合物中的偶氮键改变胶束的亲疏水比例破坏组装体释放药物，随着药物的释放，近红外荧光分子不再处于聚集猝灭的状态而随着亲水端更好地分散在PBS缓冲液中，荧光还原的进行不断地增强。由于偶氮还原酶主要存在人体的结肠中，所以本发明采用PISA策略制备的载药胶束在制备治疗结肠疾病的制剂领域、药物监控和生物成像制剂领域具有潜在的应用。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

(1)本发明合成一种偶氮还原酶响应分子PPEGMA-ADP-Azo-CDPA，该分子在亲水链端引入近红外荧光基团，可作为具有近红外特性的大分子链转移剂使用。(2)利用偶氮还原酶响应的近红外的大分子链转移剂PPEGMA-ADP-Azo-CDPA对BzMA进行扩链，利用PISA策略合成偶氮还原酶响应的近红外两亲性聚合物PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA_x，在聚合过程中疏水链段不断地增加，两亲性聚合物形成纳米组装体。(3)巧妙利用近红外荧光分子ACQ性能，在形成组装体过程中猝灭近红外荧光，利用Na₂S₂O₄或偶氮还原酶打开荧光，实现组装体的探针性能。(4)聚合物亲水端引入近红外荧光，同紫外可见光区域的荧光成像相比在进行生物成像时具有更高的信噪比和更小的人体伤害。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

图1是本发明中Azo在DMSO-d₆中的核磁氢谱¹H NMR图；

图2是本发明中AzoBr在DMSO-d₆的核磁氢谱¹H NMR图；

图3是本发明中Al-ADP-Azo在DMSO-d₆的核磁氢谱¹H NMR图；

图4是本发明中Al-ADP-Azo-CDPA在DMSO-d₆中的核磁氢谱¹H NMR图；

图5是本发明中PPEGMA-N₃在CDCl₃中的核磁氢谱¹H NMR图；

图6是本发明中PPEGMA-ADP-Azo-CDPA在DMSO-d₆中的核磁氢谱¹H NMR图；

图7是本发明中PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA₅在CDCl₃中的核磁氢谱¹H NMR图；

图8是本发明中Al-ADP-Azo-CDPA与聚合诱导自组装所得聚合物PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA_x的GPC流出曲线；

图9是本发明中PISA制备的PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA_x的TEM图谱；

图10是本发明中PISA原位制备的组装体PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA_x的PBS溶液(0.3mg/mL)Na₂S₂O₄还原前后的紫外可见图谱；

图11本发明中PISA原位制备的组装体PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA_x的PBS溶液(0.3mg/mL)Na₂S₂O₄还原前后的荧光光谱(激发波长650nm)；

图12是本发明中PISA原位制备的组装体PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA_x的PBS溶液(0.3mg/mL)Na₂S₂O₄还原后的透射电镜TEM图；

图13是本发明中PISA原位制备的组装体PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA_x的PBS溶液(0.1mg/mL)Na₂S₂O₄还原前后相应的动态粒径散射(DLS)图；

图14是本发明中PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA₅@DOX在CDCl₃中的核磁氢谱¹H NMR图；

图15是本发明中PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA₅@DOX的GPC流出曲线；

图16是包载DOX的胶束溶液PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA₅@DOX(0.3mg/mL)在酶解不同时间的紫外可见图谱；

图17是包载DOX的胶束溶液(0.3mg/mL)在偶氮还原酶作用下随时间变化的药物释放结果；

图18是包载DOX的胶束溶液(0.3mg/mL)PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA₅@DOX在偶氮还原酶作用下随时间变化的荧光谱图(激发波长650nm)；

图19是载药胶束PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA₅@DOXPBS溶液(0.3mg/mL)(a)酶解前(b)酶解24h后的透射电镜(TEM)图像；

图20是载药胶束PBS溶液(0.1mg/mL)酶解前与酶解24h后的动态粒径散射(DLS)图；

图21是偶氮还原酶响应的载药胶束的合成及药物释放的过程示意图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明公开了一种通过PISA原位制备偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物胶束的策略，其具体方法如下：

(1)对氨基苯甲醇与苯酚通过重氮偶合反应，制得分别带有官能团酚羟基和醇羟基偶氮苯Azo：

Azo通过亲核取代反应，合成AzoBr：

近红外荧光分子ADP与上述AzoBr反应通过亲核取代制得ADP-Azo：

ADP-Azo与溴丙炔通过酯化反应合成带有炔基和偶氮键的Al-ADP-Azo：

Al-ADP-Azo与小分子RAFT试剂CDPA通过酯化反应合成Al-ADP-Azo-CDPA。

(2)选择单体为PEGMA，在EBIB、CuBr、PMDETA作用下选择溶剂为苯甲醚通过ATRP聚合得到PPEGMA，将聚合物PPEGMA加入叠氮化钠合成端基为叠氮的PPEGMA-N₃：

端基为叠氮的PPEGMA-N₃与连接有近红外荧光分子的RAFT试剂Al-ADP-Azo-CDPA通过点击化学CuAAC反应合成大分子链转移剂PPEGMA-ADP-Azo-CDPA：

(3)以PPEGMA-ADP-Azo-CDPA为大分子链转移剂，选用BzMA为单体，乙醇为溶剂进行聚合诱导自组装，制得偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物胶束，相应的两亲性嵌段聚合物为PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA：

具体实施例中性能测试方法如下：

1、核磁氢谱(¹H NMR)是通过Bruker 300MHz核磁仪，四甲基硅烷(TMS)为内标，将测试样品以CDCl₃为溶剂溶解后进行测试；

2、聚合物数均分子量(M_n)、重均分子量(M_w)和分子量分布指数(M_w/M_n)使用装配有示差折光检测器和紫外检测器TOSOH HLC-8320凝胶色谱仪(SEC)上测定，采用两根TSKgelSuper Mutipore HZ-N(3μm beads size)柱子串联，分子量范围为500至190,000g/mol，选用色谱纯THF作为流动相，流速为0.35mL/min，40℃下进行测试，以聚甲基丙烯酸甲酯(窄分布)为标样对聚合物分子量进行校正；

3、荧光发射光谱采用Hitachi F-4600型荧光光度计测试得到；

4、紫外-可见吸收光谱在UV-2600紫外可见光谱仪(Shimadzu,Nakagyo-ku,Kyoto,Japan)25℃下进行测定；

5、透射电子显微镜(TEM)采用HITACHI HT7700TEM，工作加速电压为120kV；

6、动态光散射(DLS)用Malvern Zetasizer Nano-ZS90，测试角度90o，测试温度25℃。

实施例一

通过PISA制备偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物胶束，包括以下步骤：

1、合成Azo

将4.0g(32.4mmol)对氨基苯甲醇加入到100mL的烧杯中，加入6.8mL的浓盐酸，加入20mL的水放置在冰水浴中搅拌。将3.3g(34.0mmol)的亚硝酸钠溶于10mL的水中，将配置的亚硝酸钠的水溶液逐滴加入到烧杯中，滴加完毕后继续反应半小时，期间一直保持温度为-5～0℃，完全反应得到对氨基苯甲醇的重氮盐。将3.2g(34.0mmol)的苯酚和6.3g(45.4mmol)碳酸钾加入到250mL的烧杯中，加入100mL的冰水溶解后放置在冰水浴下然后向其中加入对氨基苯甲醇的重氮盐，保持在0～5℃下缓慢滴加，滴加完毕后继续反应。反应完全后抽滤，20mL冰水冲洗三次，收集滤饼烘干，得到橘黄色固体，产率为91％。附图1是Azo的¹H NMR图谱。

2、合成AzoBr

将2.0g(8.8mmol)Azo、2.1g(10.5mmol)的1,6-二溴己烷和4.8g(17.6mmol)的碳酸钾加入到250mL的圆底烧瓶中，向内加入100mL的丙酮，放置在65℃下回流反应12小时。反应结束后，加入乙酸乙酯萃取，水洗三次，取有机层加入无水硫酸钠干燥，旋蒸后放置到真空烘箱烘干，柱层析(淋洗剂：V_石油醚/V_乙酸乙酯＝4/1)得到黄色固体，产率为64.4％。

附图2是AzoBr的¹H NMR图谱。

3、合成ADP-Azo

将0.7g(1.3mmol)ADP、0.5g(1.3mmol)AzoBr和0.3g(2.6mmol)碳酸钾以及21.6mg(0.13mmol)的碘化钾加入至50mL圆底烧瓶中，加入20mL的丙酮，65℃下回流反应24小时。反应结束，冷却至室温，加入乙酸乙酯萃取，水洗三次，取有机层加入无水硫酸钠干燥，旋蒸，放置在真空烘箱干燥，得到粗产物ADP-Azo投入下一步反应。

4、合成Al-ADP-Azo

将0.6g(0.7mmol)ADP-Azo、99.6mg(0.8mmol)溴丙炔和98.4mg(0.72mmol)碳酸钾加入50mL的圆底烧瓶中，加入20mL丙酮，65℃下回流反应24小时，TLC监测反应，反应结束后冷却至室温，乙酸乙酯萃取，水洗三次，取有机层加入无水硫酸钠干燥，旋蒸，放入真空烘箱干燥，柱层析(淋洗剂：V_石油醚/V_乙酸乙酯＝2/1)得到墨绿色固体Al-ADP-Azo，产率为45.4％。附图3是Al-ADP-Azo的¹H NMR图谱。

5、合成Al-ADP-Azo-CDPA

在惰性气体氩气氛围下将0.5g(0.6mmol)Al-ADP-Azo、276.1mg(0.7mmol)CDPA，8.5mg(0.3mmol)DMAP置于50mL三颈烧瓶中加入10mL的二氯甲烷溶解。将10mL二氯甲烷溶解的141.3mg(0.7mmol)DCC加入恒压滴液漏斗，冰浴下缓慢将恒压滴液漏斗中的DCC滴加到三颈烧瓶中，待DCC滴加完毕冰浴下继续反应15分钟，撤去冰水浴25℃搅拌反应36小时。反应结束后，混合物过滤两次，旋蒸至干，20℃真空干燥。产物为墨绿色固体，产率为56.7％。附图4是Al-ADP-Azo-CDPA的¹H NMR图谱。

6、合成PPEGMA-N₃

称取1.2g(2.4mmol)的PEGMA，48.5mg(0.3mmol)的PMDETA，27.3mg(0.15mmol)的EBIB和20.1mg(0.15mmol)的CuBr置于5mL的安瓿瓶中，加入2.5mL的苯甲醚，通过冷冻-抽气-解冻-充气三次循环除去氧气，移至90℃反应2h。待反应完毕，破管，在正己烷中沉降，得到粘稠状聚合物PPEGMA。

称取1.0g(0.14mmol)的PPEGMA和0.14g(2.15mmol)的叠氮化钠，加入10mL的无水DMF，80℃下反应24小时。反应结束后，加入二氯甲烷和饱和食盐水萃取8次，收集溶解有叠氮化钠的水层集中处理，同时收集有机层加入无水硫酸钠干燥，抽滤，收集滤液旋蒸浓缩，在正己烷中沉降得到PPEGMA-N₃，产率为85.2％。附图5是PPEGMA-N₃的¹H NMR图谱。

7、亲水大分子链转移剂PPEGMA-ADP-Azo-CDPA的合成

将231.6mg(0.36mmol)Al-ADP-Azo-CDPA、PPEGMA-N₃(分子量为7000g/mol，2.1g,0.30mmol)、43.03mg(0.3mmol)溴化亚铜和104.0mg(0.6mmol)PMDETA加入到25mL的舒伦克管中，加入8mL的无水甲苯溶解，通过冷冻-抽气-解冻-充气三次循环除去氧气后放置在60℃的油浴锅内反应24小时，反应结束冷却至室温，放入透析袋内(MWCO3500)在无水乙醇中透析除去未反应的Al-ADP-Azo-CDPA以及小分子量的聚合物和副产物等，透析过后旋蒸，放置在25℃真空烘箱内烘干，得到PPEGMA-ADP-Azo-CDPA，产率为87.6％。附图6是PPEGMA-ADP-Azo-CDPA的¹H NMR图谱。

其中亲水链段的重复单元个数n可通过PPEGMA-ADP-Azo-CDPA的¹H NMR(图6)采用下列公式(1)计算得到：

m＝(I_4.01-4.16/2)/(I_7.84-7.96/8)公式(1)

I_4.01-4.16：谱图中4.01-4.16ppm处对应亲水链段PPEGMA中-OCH₂CH₂O-片段的质子峰(a)；

I_7.84-7.96：谱图中7.84-7.96ppm处对应近红外荧光团与偶氮苯的苯环上的质子峰(g，h)。

根据4.01-4.16ppm和7.84-7.96ppm处质子信号峰的积分面积比值通过公式(1)计算得到PPEGMA-ADP-Azo-CDPA的-OCH₂CH₂O-片段重复单元数为14。利用GPC对PPEGMA-ADP-Azo-CDPA的分子量与分子量分布进行表征，结果如图8中曲线macro-RAFT所示，其分子量(M_n)为10500g/mol，分子量分布指数(M_w/M_n)为1.12。

8、聚合诱导自组装

利用聚合诱导自组装的策略制备偶氮还原酶响应的近红外纳米粒子，以制备纳米探针PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA₅为例该聚合诱导自组装的典型步骤如下：将120.0mg(0.014mmol)PPEGMA-ADP-Azo-CDPA，0.8mg(0.003mmol)AIBN和28.0mg(0.084mmol)的BzMA加入安瓿瓶中，其摩尔比为[BzMA]₀/[PPEGMA-ADP-Azo-CDPA]₀/[AIBN]₀＝30/5/1。用1440.0mg无水乙醇溶解，固含量为10％，搅拌至完全溶解后，通过冷冻-抽气-解冻-充气三次循环除去体系中的氧气后封管，然后将安瓿瓶放置于70℃反应24小时后破管。取一部分胶束溶液在正己烷中沉降，此时有绿色粘稠状固体沉出，除去正己烷，真空干燥(30℃)，得墨绿色粘稠状固体，该固体中包括两亲性嵌段聚合物为PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA₅，采用核磁、GPC测试该产物，其产率约为91％，M_n＝12400g/mol，M_w/M_n＝1.15。

而取出部分聚合物组装体乙醇溶液放置在透析袋中(MWCO 8000)在PBS缓冲液中(pH为7.4)透析24h除去聚合过程中产生的死链和乙醇溶液，期间每隔4h换一次水，最终得到偶氮还原酶响应的近红外聚合物纳米粒子PBS溶液。

按照上述方法制备PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA_x，不同之处在于，改变PPEGMA-ADP-Azo-CDPA和BzMA的摩尔比。

附图7是PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA₅的¹H NMR谱图，附图8为本发明中PPEGMA-ADP-Azo-CDPA(曲线macro-RAFT)与PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA_x的GPC流出曲线。其中疏水链段的重复单元个数(x)可通过下列公式(2)计算得到：

x＝(I_4.80-4.97/2)/(I_7.84-7.96/8)公式(2)

I_4.80-4.97：谱图中4.80-4.97ppm处对应亲水链段PBzMA中-OCH₂片段的质子峰(d)；

I_7.84-7.96：谱图中7.84-7.96ppm处对应近红外荧光团与偶氮苯的苯环上的质子峰(g，h)。

如PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA₅为例，根据特征信号峰4.80-4.97和7.84-7.96的积分面积通过公式(2)计算得出BzMA重复单元的平均聚合度为5.1。PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA₅的GPC曲线如图8中相应曲线所示，分子量(M_n)为12400g/mol，分子量分布(M_w/M_n)为1.15。图8中，PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA₉的分子量(M_n)为14000g/mol，分子量分布(M_w/M_n)为1.19；PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA₁₈的分子量(M_n)为15800g/mol，分子量分布(M_w/M_n)为1.17；PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA₃₅的分子量(M_n)为17600g/mol，分子量分布(M_w/M_n)为1.20。

9、胶束溶液的制备及表征

取100μL聚合物组装体乙醇溶液放稀释至5mg/mL，将胶束溶液转移至透析袋(MWCO8000)中，超纯水透析24小时除去未参与聚合的大分子链转移剂和乙醇。透析结束后，用PBS溶液(pH＝7.4)将其定容至1mg/mL。

胶束溶液用PBS缓冲液稀释至0.2mg/mL，取15μL胶束溶液滴加在纯碳膜上，停留30秒后，用滤纸吸干。后在其上滴加15μL浓度为1wt％的磷钨酸溶液，停留20秒后，用滤纸吸干，干燥后通过透射电镜(TEM)进行测试。同时，通过动态光散射(DLS)对其尺寸进行表征，以佐证TEM测试的结果。附图9为本发明中组装体PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA_x的TEM谱图，图9(a)-(d)依次为PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA₅、PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA₈、PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA₁₈、PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA₃₅胶束溶液的TEM谱图。

实施例二

胶束溶液的还原相应与荧光的活化，步骤如下：

模拟结肠环境，选用连二亚硫酸钠Na₂S₂O₄作为还原剂模拟偶氮还原酶，对实施例一所得几种胶束的还原释放行为进行研究。首先，移取3.0mL浓度为0.3mg/mL的胶束溶液于比色皿中，通氩气除氧5分钟，加入5mg的Na₂S₂O₄，将其置于37℃水浴中密闭搅拌。期间一直通过荧光光谱监测近红外聚合物胶束探针的还原响应行为，激发波长在650nm。

同时，通过TEM、DLS、UV-vis对其还原前后的形貌、尺寸以及特征吸收峰变化进行表征。

通过观察UV-vis紫外可见光谱(图10)，在Na₂S₂O₄的作用下聚合度为5、9、18(图10a、b、c)的聚合物纳米探针在360nm处的偶氮的吸收峰消失，这证实了偶氮键的断裂。由于偶氮键断裂会导致聚合物链断裂，组装体无法维持原来稳定的状态，聚合物组装体被破坏。而疏溶剂链段为35个重复单元的囊泡形貌的纳米探针在Na₂S₂O₄的存在下则表现出了一定的稳定性(图10d)。由于ACQ作用的逐渐消除，荧光图谱显示(图11)聚合度为5、9、18(图11a、b、c)聚合物纳米粒子在700～750nm近红外区域范围内的荧光强度逐渐增加，形貌为囊泡的聚合物纳米探针的近红外区域也未出现荧光增强现象。在此还原反应中，聚合度为35、形貌为囊泡的组装体表现出了抗还原性(图11d)，原因可能因为偶氮部分作为疏水段紧密堆积在囊泡的膜中，而反应的活性位点被紧紧包埋难已还原偶氮键。

通过TEM和DLS对胶束还原前后的形貌和粒径变化进行了测试。图12和图13表明，由于偶氮键的断裂破坏了亲疏水间的作用，导致聚合度为5(图12a、13a)、聚合度为9(图12b、13b)、聚合度为18(图12c、13c)组装体由原来的规则组装形貌破坏为不规则组装体，与此同时DLS图谱证实组装体粒径变大，表明了组装体在还原作用下被破坏。而聚合度为35的聚合物囊泡(图12d、13d)的形貌和粒径未发生明显变化，则显示了一定的抗还原性和稳定性。

实施例三

通过PISA制备偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物载药胶束，包括以下步骤：

1、通过聚合诱导自组装进行阿霉素(DOX)的包载

将120.0mg(0.014mmol)PPEGMA-ADP-Azo-CDPA，0.8mg(0.002mmol)AIBN和20mgBzMA(0.06mmol)加入安瓿瓶中，其摩尔比为[BzMA]₀/[PPEGMA-ADP-Azo-CDPA]₀/[AIBN]₀＝30:5:1，与此同时向内加入1mg的阿霉素(DOX)。用1400mg无水乙醇溶解，固含量为10％。搅拌至完全溶解后，通过冷冻-抽气-解冻-充气三次循环除去体系中的氧气，于70℃反应24小时后破管。聚合结束后，取出一部分聚合物在正己烷中沉降，得到墨绿色聚合物，将其命名为PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA₅@DOX，对产物进行核磁测试(产率约为90％，M_n＝11500g/mol，M_w/M_n＝1.17)。附图14是PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA₅@DOX包药胶束的¹H NMR谱，图15为PPEGMA-ADP-Azo-PBzMA₅@DOX包药胶束的GPC流出曲线。取出另一部分聚合胶束溶液，加入到透析袋(MWCO 8000)在超纯水中进行透析48小时除去未包载的DOX，未参与聚合或者提前终止的大分子链转移剂以及乙醇，透析完毕后用PBS缓冲液将聚合物包药胶束定容为1mg/mL留待后续包封率、包载率以及还原相应行为的测试。

2、包载阿霉素(DOX)含量测试

取1mL的PISA制备的包药胶束溶液，将其经过冷冻干燥出去水溶液后加入3mLDMSO，使包药胶束完全溶解破坏胶束释放DOX。通过荧光光谱(Hitachi F-4600)测试DOX的含量：在480nm激发波长下，测定590nm处的DOX的荧光发射强度，测定不同浓度DOX/DMSO溶液的DOX的荧光强度得到DOX浓度与荧光的标准曲线，通过对比荧光标准曲线得到DOX的浓度，进而计算得到包药胶束包载DOX的包载量和包封率。

载药量(DLC)和包封率(DLE)根据以下的公式得到：

载药量(wt％)＝(装载药物的重量/聚合物纳米粒子的重量)×100％

包封率(wt％)＝(装载药物重量/药物总投入量)×100％

根据上述载药量(DLC)和包封率(DLE)的公式，聚合物胶束溶液浓度是1mg/mL，其理论载药量为0.47wt％，实际载药量为0.22～0.34wt％，包封率46.2～0.72％。

3、偶氮还原酶响应的包药胶束药物释放行为研究

取1mL包药胶束溶液(0.6mg/mL)通过冷冻-抽气-解冻-充气三次循环除去氧气，在惰性气体的保护下将除氧的胶束溶液转移至2.0mL反应管中，随后分别加入0.20mg偶氮还原酶(DT-diaphorase Human)和1.0mg辅酶(NADPH)，与此同时继续用鼓泡除氧后的PBS缓冲液定容，完全除氧密闭反应管，放置于37℃恒温振荡器中避光振荡1、3、6、9、12、18和24h后分别取管监测药物释放和荧光增强效果，通过荧光光谱分别在650nm和480nm激发波长下监测近红外荧光变化以及药物释放效果。通过紫外吸收光谱测试酶解前后360nm左右偶氮苯特征吸收的强度变化，以观测偶氮苯的断裂情况。同时通过TEM及DLS表征还原前后胶束形貌、尺寸以及粒径分布的变化。

如图16所示，随着偶氮还原酶的作用，偶氮键在不断地断裂为苯胺片段，表现在从此紫外-可见光谱可以看到偶氮键的吸收强度随着还原时间的增加不断地降低。随着偶氮还原酶的作用，从图17可以看出，DOX不断地被释放出来并且呈现不断增加的趋势，在还原24小时时释放量可以达到82％，与此同时对近红外荧进行了监测，图18可以清楚地看到随着还原时间的增加，近红外荧光逐渐的增强，证实了偶氮还原酶响应的近红外聚合物纳米粒子荧光探针实现了荧光监测的药物靶向释放效果。

通过TEM和DLS对包载DOX的胶束的形貌和粒径变化进行了测试。观察图19还原前(图19a)、后(图19b)的胶束形貌可以发现，在经过偶氮还原酶作用后，球形胶束大幅减少，同时有较大尺寸的不规则聚集体产生。这是由于偶氮键断裂，球形胶束被解离的缘故。载药胶束酶解前与酶解24小时后的动态粒径散射(DLS)图(图20)很好印证这一点。

以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。