阅读说明：本技术 使用切叶蜂属的蜂的莴苣属植物种子的生产方法 (Method for producing seed of Lactuca plant using wasp of genus Cerebrophora ) 是由 堀内慎吾 铃木隆夫 泉田敦 于 2018-12-05 设计创作，主要内容包括：本发明涉及莴苣属植物的种子的生产方法,所述方法包括：作为花粉传播手段,使用切叶蜂属的蜂,并且,除了花粉亲本莴苣属植物和种子亲本莴苣属植物之外,还使用下述植物种作为辅助蜜源植物,进行莴苣属植物的交配,所述植物种是切叶蜂属的蜂具有访花偏好性、并且该访花偏好性等于或低于莴苣属植物的植物种。根据本发明,能够使用切叶蜂属的蜂作为花粉传播手段,并且与以往相比高效且经济性地生产莴苣属植物的种子。(The present invention relates to a method for producing seeds of a plant of the genus lactuca, said method comprising: as a pollen transmission means, bees of the genus Apis are used, and mating of plants of the genus Lactuca is carried out using, as a co-nectar source plant, in addition to the pollen parent Lactuca plant and the seed parent Lactuca plant, a plant species in which bees of the genus Apis have a floral preference and which floral preference is equal to or lower than that of the Lactuca plant. According to the present invention, it is possible to produce seeds of a plant of the genus lactuca more efficiently and economically than before using bees of the genus aphelesia as a pollen propagation means.)

使用切叶蜂属的蜂的莴苣属植物种子的生产方法

对相关申请的引用

本申请基于作为在先日本专利申请的日本特愿2017-234674号(申请日：2017年12月6日)主张优先权权益，日本特愿2017-234674号的全部公开内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及使用切叶蜂属的蜂作为花粉传播手段的、高效的莴苣属植物的种子的生产方法。更详细而言，本发明涉及使用切叶蜂属的蜂作为花粉传播手段、并且除了花粉亲本莴苣属植物和种子亲本莴苣属植物之外还使用辅助蜜源植物的莴苣属植物的种子的生产方法。更详细而言，本发明涉及莴苣的杂交第一代种子(F1种子)的生产方法。

背景技术

植物品种中存在固定种和杂交第一代(以下有时简称为“F1”)品种，在主要作物中，F1品种是普遍的。

F1品种由于杂种优势(heterosis)而具有生长旺盛、生长快、产量能力提高等较大优点。此外，就F1品种而言，由于生长变得旺盛，故而也可期待提高对病害虫的耐性、耐寒·耐暑性等环境适应性。另外，由于F1品种的基因型为杂合性并且是相同的基因型，因此表型显示出极高的均一性，从而生产物的可销售性提高。此外，F1品种的双亲能够整合被显性基因支配的有用性状，因此能实现迅速的育种。由于具有如上所述的优势，使得F1品种在主要作物中占据了栽培品种的主流。

莴苣属植物、尤其是莴苣(Lactuca sativa)在世界各国进行生产，是市场规模非常大的蔬菜，强烈需求F1品种化。本申请的发明人曾经成功开发了莴苣F1品种开发所必需的细胞质雄性不育莴苣，表明了在莴苣中也能够制备F1种子(国际公开公报，WO2007/049730A(专利文献1))。

莴苣F1种子的采种可通过手动交配来实施，但由于莴苣仅在早晨的数小时开花，因此操作效率差，通过1朵花的交配得到的种子数量也少，为10粒左右。因此，利用手动交配的采种经济性低，期望开发作为替代的、经济性高且高效的采种方法。虽然希望开发如在其他作物中所实施的、利用传粉昆虫的经济性高的交配、采种方法，但通常作为传粉昆虫为人所知的西方蜜蜂(Apis mellifera)不对莴苣进行访花，因此必须利用西方蜜蜂以外的传粉昆虫。

因此，为了解决莴苣中如上所述的问题点，迄今为止已对各种传粉昆虫的利用进行了研究。

例如，日本专利第3635036号公报(专利文献2)中，公开了利用淡脉隧蜂(Lasioglossum villosulum)采集莴苣的F1种子的方法。然而，淡脉隧蜂的生息数量少，即使成功捕获，其增殖方法也尚未公开。另外，根据该专利文献中记载的数据，其采种效率也非常低，为每1株330粒(莴苣的千粒重为约1g，因此为约0.33g)，从经济的观点考虑，认为难以用于商业采种。另外，淡脉隧蜂在市场中也没有贩售，通常难以获得，因此认为难以用于需要大量传粉昆虫的商业采种。

另外，日本专利第4471983号公报(专利文献3)中，公开了利用丝光绿蝇(Luciliasericata)采集莴苣的F1种子的方法。然而，根据该专利文献中记载的、利用丝光绿蝇的传粉能力试验结果，结实数仅为来自2株合计245粒(约0.245g)，与专利文献2的情况同样地，从经济的观点考虑，认为难以用于商业采种。另外，由于蝇类没有归巢性，因此采种需要封闭式设施。商业采种中，期望能够在生产成本低的开放式场圃中生产种子。因此，该专利文献2的方法中，存在导致成本增大的可能性。

日本专利第5627894号公报(专利文献4)中，公开了利用丽蝇科双翅目的反吐丽蝇(Calliphora vomitaria)、红头丽蝇(Calliphora erythrocephala)、或凯撒绿蝇(Lucilia Caesar)来采集莴苣F1种子的方法。该专利文献的方法中，得到了每1株莴苣为1.67g～11.25g的F1种子。

然而，如该专利文献的0040段中所记载的，双翅目(Diptera)不是恒定地授粉至莴苣的花的昆虫，并且也并不知晓其以莴苣花蜜为食。专利文献中仅仅记载了向封闭环境中导入过剩数量的双翅目后，其作为莴苣的花粉授粉者行动。另外，根据该专利文献的审查过程的审查文件(由申请人提出的书面文件)，其说明了双翅目不是被莴苣的花特异性地吸引，而是通过使用大量双翅目，从而在概率上至少其中一部分降落至花冠并与花粉接触，由此实现传粉。因此，该方法中，与为采食而积极地对花进行访花的传粉昆虫相比，传粉效率差，因而必须导入过剩数量的双翅目。另外，与专利文献3的情况同样地，由于蝇类没有归巢性，因此采种需要封闭式设施。因此，存在导致种子的生产成本增大的可能性。

日本特表2009-539409号公报(专利文献5)(国际公开公报WO2007/146420A号小册子)中，公开了利用切叶蜂属的蜂、具体而言为苜蓿切叶蜂(Megachile rotundata)来采集莴苣的F1种子的方法。其中，公开了通过将苜蓿栽培于莴苣附近来引诱苜蓿切叶蜂、使其对莴苣进行访花的方法。另外，国际公开公报WO2009/086173A号(专利文献6)中，与专利文献5同样地，公开了利用切叶蜂属的蜂、具体而言为苜蓿切叶蜂来采集莴苣的F1种子的方法。

然而，专利文献5的实施例中仅仅公开了：针对24朵雄性不育性的花得到了平均为5.6粒的种子(专利文献5，0065段)；以及，对13只不同的雌性苜蓿切叶蜂每2分钟进行观察，发现其1分钟访问平均7.1朵花(专利文献5，0096段)。该专利文献5中，没有公开具体且定量的采种量、例如每1株的莴苣F1种子的产量、每单位场圃面积的莴苣F1种子的产量。这几点对于专利文献6而言也是同样的。

因此，阅读了专利文献5及专利文献6的本领域技术人员根据其中公开的方法难以想到能够在商业水平上采集莴苣的F1种子。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开公报WO2007/049730A号小册子

专利文献2：日本专利第3635036号公报

专利文献3：日本专利第4471983号公报

专利文献4：日本专利第5627894号公报

专利文献5：日本特表2009-539409号公报(国际公开公报WO2007/146420A号小册子)

专利文献6：国际公开公报WO2009/086173A号小册子

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于，提供使用切叶蜂属的蜂作为花粉传播手段、并且与以往相比高效且经济性地生产莴苣属植物的种子的方法。

用于解决课题的手段

苜蓿切叶蜂是在北美的苜蓿采种中应用最为广泛的传粉者(参考文献1(W.P.KEMP等，(2000))，p904)。另外，苜蓿切叶蜂也作为苜蓿以外的作物、具体而言为蓝莓、琉璃苣(Borage)、芥花(Canola)、胡萝卜、蔓越莓、小冠花(Crown vetch)、毛苕子(Hairy vetch)、薄荷、洋葱、岩黄芪(Sweet vetch)的传粉者而为人所知(参考文献2(Eric Mader等，(2010))，p10，表1.2)。此外，苜蓿切叶蜂具有作为传粉者而言优异的特征(一化性、连续同种访花性、授粉效率高、容易管理、适应人工环境的营巢性)(参考文献3(松香光男，“昆虫利用科学系列7”(1996))，p99)。

苜蓿切叶蜂等花蜂类需要为了后代而采集花粉、蜜，因此传粉效率在任何种类中均是较高的。另一方面，例如，为蝇类时，亲代蝇仅进行产卵，后代的幼虫自行从腐败物等中采食，因此亲代蝇仅采集蜜作为自身的活动能源和用于产生卵的营养源即可。

花蜂类中，由于亲代蜂需要采集并提供后代成为成虫为止的营养源，因此，每1只后代需要大量的蜜和花粉。尤其对于独栖性的花蜂而言，下一代的繁殖取决于亲代蜂的劳动量，需要在短时间内将其达成。因此，花蜂类中，1只个体的劳动量非常惊人，据称其表现出社会性蜜蜂的20～80倍的劳动量。

如上所述，苜蓿切叶蜂作为传粉者的能力非常高，被视为有希望在各种作物中代替蜜蜂作为传粉者。另外，苜蓿的采种主要在美国西部进行，苜蓿切叶蜂生产于加拿大，每年大量输入至美国。莴苣的主要采种地也是美国西部，因此，能够容易地获得大量苜蓿切叶蜂也是较大优点。

苜蓿切叶蜂被报道是对豆科植物具有强偏好性、同时对广范围的菊科植物进行访花的广食性物种(参考文献4(Dave Goulson,Annu.Rev.Ecol.Evol.Syst.34:1-26(2003))，p3)。

前述的专利文献5(日本特表2009-539409号公报)中记载的方法中，利用了苜蓿作为引诱植物。然而，就苜蓿切叶蜂的访花偏好性而言，苜蓿高于莴苣，因此，将莴苣与苜蓿混植的情况下，苜蓿切叶蜂的访花会集中于苜蓿。结果，莴苣中的受粉的效率未得到提高，采种不得不受到限制。

专利文献5(0048段)中，还记载了可以在莴苣开花后，切下苜蓿的花使得苜蓿切叶蜂集中于莴苣。

然而，此处，切下苜蓿的花可能会导致产生如下所述的重大问题。

即，莴苣的花具有在上午较早的时间段开花、于数小时后闭花的特殊开花习性，因此，在切下苜蓿的花的情况下，在莴苣的花闭合后，采种场圃会失去全部蜜源。另一方面，苜蓿切叶蜂在温度为约25℃以上时，将在一天内均持续采食活动。因此，其重复进行以寻找蜜源为目的的活跃飞行，大部分的个体会消耗体力，如果蜜源不充分，则会在当天之内导致饿死。因此，如前所述，由于切下苜蓿的花而使得莴苣闭花后在采种场圃中不再存在蜜源时，苜蓿切叶蜂将逐渐饿死。

另外，在每次放养苜蓿切叶蜂时，于采种场圃中切下场圃的全部苜蓿的花的操作是烦杂的，需要非常多的劳动成本。

如上所述，莴苣具有仅在早晨开花数小时的特殊开花习性，而另一方面，如专利文献2(0006段)中也记载的那样，多数传粉昆虫具有在昼间长时间范围内进行采食活动的类型的访花日周期性。

因此，使传粉昆虫对特定的植物仅仅集中于上午的短时间进行采食活动是困难的。

另外，前述的专利文献5中，记载了除了利用苜蓿作为引诱植物以外，还可以将包含引诱苜蓿切叶蜂的植物组合物的植物提取产物置于莴苣附近、或与莴苣接触而放置。然而，实际上并不知晓这样的对于苜蓿切叶蜂有效的引诱提取产物的报道，专利文献5中也没有具体地公开。因此，本领域技术人员难以容易地获得并使用这样的引诱提取产物。

基于如上所述的情况，本申请的发明人反复进行了深入研究。

本申请的发明人本次进行了如下研究：在生产莴苣属植物的种子时，在莴苣属植物的采种场圃中准备花粉亲本莴苣属植物和种子亲本莴苣属植物，使用切叶蜂属的蜂作为花粉传播手段进行莴苣属植物的交配。此时，为了防止蜂在莴苣属植物闭花时成为饥饿状态，一并准备了辅助蜜源植物，进行了以切叶蜂属的蜂作为花粉传播手段的莴苣属植物的交配。作为辅助蜜源植物，使用了切叶蜂属的蜂具有访花偏好性、并且该访花偏好性等于或低于莴苣属植物的植物种。结果，通过准备辅助蜜源植物，能够在实际上抑制切叶蜂成为饥饿状态，由此，能够高效地进行莴苣属植物的交配，成功地更高效地生产种子。

本发明中，以上述见解作为基础。

即，根据本发明，可提供以下的发明。

＜1＞莴苣属植物的种子的生产方法，所述方法包括：

作为花粉传播手段，使用切叶蜂属的蜂，并且，

除了花粉亲本莴苣属植物和种子亲本莴苣属植物之外，还使用下述植物种作为辅助蜜源植物，进行莴苣属植物的交配，所述植物种是切叶蜂属的蜂具有访花偏好性、并且该访花偏好性等于或低于莴苣属植物的植物种。

＜2＞如前述＜1＞所述的方法，其中，莴苣属植物的种子为莴苣属植物的杂交第一代种子(F1种子)。

＜3＞如前述＜1＞或＜2＞的方法，其中，莴苣属植物为莴苣(Lactuca sativa)。

＜4＞如前述＜1＞～＜3＞中任一项的方法，其中，切叶蜂属的蜂为苜蓿切叶蜂。

＜5＞如前述＜1＞～＜4＞中任一项的方法，其中，辅助蜜源植物具有在莴苣属植物闭花时也开花的开花习性。

＜6＞如前述＜1＞～＜5＞中任一项的方法，其中，作为辅助蜜源植物，使用选自由春黄菊(Anthemi)属植物、芫荽(Coriandrum)属植物、神香草(Hyssopus)属植物、美国薄荷(Monarda)属植物、荆芥(Nepeta)属植物、午时花(Pentapetes)属植物、鼠尾草(Salvia)属植物、飞蓬(Erigeron)属植物、茴香(Foeniculum)属植物、美兰菊(Melampodium)属植物、马齿苋(Portulaca)属植物、及蝴蝶草(Torenia)属植物组成的组中的1个属以上。

＜7＞如前述＜1＞～＜6＞中任一项的方法，其中，作为辅助蜜源植物，使用选自由春黄菊(Anthemis tinctoria)、芫荽(Coriandrum sativum)、牛膝草(Hyssopusofficinalis)、美国薄荷(Monarda didyma)、荆芥(Nepeta cataria)、午时花(Pentapetes phoenicea)、蓝色鼠尾草(Salvia azurea)、加勒比飞蓬菊(Erigeron karvinskianus)、茴香(Foeniculum vulgare)、美兰菊(Melampodium paludosum)、大花马齿苋(Portulaca grandiflora)、及夏堇(Torenia fournieri)组成的组中的1种以上。

＜8＞如前述＜1＞～＜7＞中任一项的方法，其中，作为辅助蜜源植物，使用选自由加勒比飞蓬菊、茴香、美兰菊、大花马齿苋、及夏堇组成的组中的1种以上。

＜9＞如前述＜1＞～＜8＞中任一项的方法，其中，作为辅助蜜源植物，使用选自由美兰菊及夏堇组成的组中的1种或2种。

＜10＞如前述＜1＞～＜9＞中任一项的方法，其中，作为辅助蜜源植物，使用美兰菊。

＜11＞如前述＜1＞～＜10＞中任一项的方法，其中，花粉亲本莴苣植物为雄性可育株系，并且，种子亲本莴苣植物为雄性不育株系。

＜12＞莴苣属植物的交配方法，其中，作为花粉传播手段，使用切叶蜂属的蜂，

所述方法的特征在于，作为辅助蜜源植物，使用切叶蜂属的蜂具有访花偏好性、并且该访花偏好性等于或低于莴苣属植物的植物种。

＜13＞如前述＜12＞的方法，其中，莴苣属植物的交配的目的在于得到莴苣属植物的杂交第一代(F1)的种子。

＜14＞如前述＜12＞或＜13＞的方法，其中，莴苣属植物为莴苣(Lactuca sativa)。

＜15＞如前述＜12＞～＜14＞中任一项的方法，其中，切叶蜂属的蜂为苜蓿切叶蜂。

＜16＞如前述＜12＞～＜15＞中任一项的方法，其中，辅助蜜源植物具有在莴苣属植物闭花时也开花的开花习性。

发明效果

根据本发明，通过在莴苣属植物的采种场圃培育辅助蜜源植物，使用切叶蜂属的蜂作为花粉传播手段，从而能够与以往相比高效地生产此前难以利用传粉昆虫高效地生产的莴苣属植物的种子。另外，利用本发明的方法，能够大幅度削减用于生产莴苣属植物的种子的操作、劳力，也能够实现生产成本的大幅度降低。

附图说明

[图1]图中的曲线图示出实施例3的不同植物种间的访花频率的调查的结果。

[图2]图中示出实施例4中的温室内的种子亲本、花粉亲本、及辅助蜜源植物(苜蓿或美兰菊)(图中为“蜜源植物”)的配置。

[图3]图中示出实施例5中的温室内的种子亲本、花粉亲本、及辅助蜜源植物(夏堇)(图中为“蜜源植物”)的配置。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细说明。

根据本发明的莴苣属植物的种子的生产方法如前所述，包括：作为花粉传播手段，使用切叶蜂属的蜂，并且，除了花粉亲本莴苣属植物和种子亲本莴苣属植物之外，还使用下述植物种作为辅助蜜源植物，进行莴苣属植物的交配，所述植物种是切叶蜂属的蜂具有访花偏好性、并且该访花偏好性等于或低于莴苣属植物的植物种。

本发明中，进行莴苣属植物的种子的生产。此处，种子的生产的含义如下：使成为花粉亲本的莴苣属植物、与成为种子亲本的莴苣属植物交配，即，使种子亲本接受花粉亲本的花粉，并采集栽培该种子亲本而得到的种子，由此生产种子。

此处，作为莴苣属植物，可举出例如莴苣(Lactuca sativa)、毒莴苣(Lactuca serriola)、L.aculeate、L.scarioloides、L.azerbaijanica、L.georgica、L.dregeana、阿尔泰莴苣(L.altaica)、柳叶莴苣(L.saligna)、刺毛莴苣(L.virosa)、蒙山莴苣(L.tatarica)、山莴苣(L.indica)、或L.debilis等。另外，莴苣属植物中也可包含莴苣(Lactuca sativa)与除其以外的前述莴苣属植物种的细胞融合所形成的杂种、种属间杂交所形成的杂种。优选的是，莴苣属植物为选自前述中列举的种的组中的一种以上，更优选为莴苣(Lactuca sativa)。

本发明的方法中，作为从花粉亲本植物搬运花粉、向种子亲本植物授粉时的花粉传播手段，使用访花昆虫。作为这样的访花昆虫，使用已知对莴苣属植物进行访花的切叶蜂属的蜂。这样的切叶蜂属的蜂没有特别限定，具体而言，可举出例如苜蓿切叶蜂(Megachile rotundata)、M.latimanus(参考文献5)、M.brevis(参考文献6)、M.montivaga(参考文献7)、M.onobrychidis(参考文献8)、M.dentitarsus(参考文献9)、M.relativa(参考文献10)。它们可以单独使用，也可以组合使用多种。本发明中，作为用作访花昆虫的切叶蜂属的蜂，从容易在市场上获得的方面考虑，优选苜蓿切叶蜂。

本发明中生产的莴苣属植物的种子优选为杂交第一代种子(F1种子)。此处，杂交第一代(F1)是通过以纯合形式具有某等位基因中的各基因的双亲之间的杂交而产生的子一代。

本发明中，种子亲本是指利用本发明的方法生产的种子的亲本株系、且是被处理(利用水冲走花粉等)或培育(即，培育成具有雄性不育性)成不被自身的具有授精能力的花粉授粉的亲本植物。本发明中生产的种子为F1种子时，种子亲本优选为以自身无法形成具有授精能力的花粉的方式培育而成的株系(雄性不育株系)。具体而言，例如，以具有雄性不育细胞质的株系作为母本和非轮回亲本，以已确认不具有育性恢复因子的目标株系作为轮回亲本进行回交，将目标株系的细胞质置换为雄性不育细胞质，从而能够赋予雄性不育性，由此可以得到种子亲本株系。

另外，本发明中，种子亲本莴苣属植物表示成为种子亲本的莴苣属植物。种子亲本莴苣属植物优选为雄性不育株系，更优选为细胞质雄性不育(CMS)株系。作为这样的CMS株系的例子，可举出例如专利文献1中记载的株系等。

本发明中，花粉亲本是指利用本发明的方法生产的种子的亲本株系、且是供给花粉的株系。本发明中生产的种子为F1种子时，该花粉亲本为雄性可育株系。

另外，本发明中，花粉亲本莴苣属植物表示成为花粉亲本的莴苣属植物。花粉亲本莴苣属植物优选为雄性可育株系。

通常，在采种场圃中，为了使花粉的传粉均匀，期望花粉亲本(优选为雄性可育株系)和种子亲本(优选为雄性不育株系)根据花粉亲本与种子亲本的比率而按列定植、或以其为基准交替地定植。

本发明中，除了花粉亲本植物和种子亲本植物之外，还使用辅助蜜源植物。

莴苣属植物的花、例如莴苣的花具有在上午较早的时间段开花、于数小时后闭花的开花习性。因此，为了防止作为花粉传播手段的蜂在莴苣闭花后由于蜜源不足而饿死的情况，本发明中，使用辅助蜜源植物。在蜂的巢箱的周边、或者、作为花粉亲本及/或种子亲本的莴苣属植物的周边准备辅助蜜源植物，使其于该处开花，作为蜜源。

因此，本发明中的辅助蜜源植物是切叶蜂属的蜂具有访花偏好性、并且该访花偏好性等于或低于莴苣属植物的植物种。即使在访花偏好性等于莴苣属植物的情况下，只要能在莴苣属植物闭花时成为蜜源，就能够高效地进行使用了切叶蜂属的蜂的莴苣属植物的种子生产。需要说明的是，针对植物种，可通过例如后述的实施例1中记载的方法来确认蜂的访花偏好性是否等于或低于莴苣属植物。辅助蜜源植物优选为苜蓿切叶蜂具有访花偏好性、并且该访花偏好性等于或低于莴苣的植物种。

辅助蜜源植物更优选为切叶蜂属的蜂具有访花偏好性、并且该访花偏好性低于莴苣属植物的植物种，进一步优选为苜蓿切叶蜂具有访花偏好性、并且该访花偏好性低于莴苣的植物种。

作为能成为辅助蜜源植物的植物种，优选不仅具有前述的访花偏好性、还具有在莴苣闭花时也开花的开花习性的植物种。作为能成为辅助蜜源植物的植物种，具体而言，优选为后述的实施例1中示出的开花持续性也优异的植物种。此外，就能成为辅助蜜源植物的植物种而言，耐暑性优异的植物种是有利的。此处所谓的耐暑性可通过例如后述的实施例1中记载的方法进行评价。

本发明中，作为能成为辅助蜜源植物的植物，没有特别限定，可举出例如春黄菊属植物、芫荽属植物、神香草属植物、美国薄荷属植物、荆芥属植物、午时花属植物、鼠尾草属植物、飞蓬属植物、茴香属植物、美兰菊属植物、马齿苋属植物、及蝴蝶草属植物。根据本发明的一个优选方式，作为辅助蜜源植物，可使用选自上述被列举的属的植物中的1种以上。本发明中，上述被列举的属的植物中优选使用的是，上述属的植物之中，不仅具有前述的访花偏好性，还具有在莴苣闭花时也开花的开花习性的植物。

根据本发明的进一步优选的方式，作为能成为辅助蜜源植物的植物，可使用选自飞蓬属植物、茴香属植物、美兰菊属植物、马齿苋属植物、及蝴蝶草属植物中的1种以上，进一步更优选使用选自由美兰菊属植物、及蝴蝶草属植物组成的组中的1种或2种，特别优选使用美兰菊属植物。

根据本发明的优选方式，作为能成为辅助蜜源植物的植物种，可举出春黄菊(Anthemis tinctoria)、芫荽(Coriandrum sativum)、牛膝草(Hyssopus officinalis)、美国薄荷(Monarda didyma)、荆芥(Nepeta cataria)、午时花(Pentapetes phoenicea)、蓝色鼠尾草(Salvia azurea)、加勒比飞蓬菊(Erigeron karvinskianus)、茴香(Foeniculum vulgare)、美兰菊(Melampodium paludosum)、大花马齿苋(Portulaca grandiflora)、及夏堇(Torenia fournieri)。根据本发明的一个优选方式，作为辅助蜜源植物，可使用选自上述被列举的植物种中的1种以上。

根据本发明的更优选方式，本发明的方法中，作为辅助蜜源植物，使用选自由加勒比飞蓬菊、茴香、美兰菊、大花马齿苋、及夏堇组成的组中的1种以上。更优选的是，作为辅助蜜源植物，使用选自由美兰菊及夏堇组成的组中的1种或2种，特别优选使用美兰菊。

对于辅助蜜源植物而言，期望根据其开花特性而以配合莴苣属植物的开花期的方式适当调节定植时期。例如，美兰菊及夏堇具有在春季播种后1.5个月左右开花、然后持续开放至深秋的连续开花性，因此无需配合莴苣属植物的开花期，但通过与莴苣属植物同时地播种、定植，能够使操作变得高效。因此，期望美兰菊及夏堇与莴苣属植物同时地播种、定植。另一方面，使用连续开花性低的植物种作为辅助蜜源植物时，需要根据其开花特性而以配合莴苣属植物的开花期的方式适当调节定植时期。

辅助蜜源植物与莴苣属植物的定植数量的比率没有特别限定，可根据辅助蜜源植物的种类、栽培环境而任意地调节。例如，定植数量的比率为莴苣属植物：辅助蜜源植物＝2:1～20:1的范围，优选莴苣属植物：辅助蜜源植物＝2:1～4:1，更优选莴苣属植物：辅助蜜源植物＝5:2左右。

辅助蜜源植物的定植场所期望为作为花粉传播手段的蜂的巢的周边，但也可分散地配置在场圃内或场圃的周边。

切叶蜂属的蜂(例如，苜蓿切叶蜂)的活跃的访花活动通常需要25℃以上的温度。因此，期望在开花期的温度为昼间25℃以上的环境中栽培用于采种的莴苣属植物。

由于切叶蜂属的蜂(例如，苜蓿切叶蜂)具有归巢性，因此不仅可利用封闭式的网室，还可利用开放式的场圃等。即，本发明可在开放式或封闭式中任一者的场圃设施中实施。因此，若在周边不存在具有杂交可能性的莴苣属植物的环境下，则期望在生产成本低的开放式的场圃中使用。

关于切叶蜂属的蜂的孵育及放养的方法等，可利用本领域技术人员已知的惯用方法。例如，可适当参照参考文献3等。另外，苜蓿切叶蜂的孵育及放养的方法等可依照惯用的苜蓿的采种方法实施。

将切叶蜂属的蜂(例如，苜蓿切叶蜂)用于莴苣属植物的采种时，优选以1～2个星期的间隔进行放养。

另外，关于切叶蜂属的蜂(例如，苜蓿切叶蜂)的期望的放养密度，期望每1次放养、每1株为5只以上，但也受到所使用的莴苣属植物的株系差异、栽培环境的影响，因此优选也考虑成本方面而进行适当调节。

切叶蜂属的蜂(例如，苜蓿切叶蜂)的放养优选在前一天的黄昏或日出之前的清晨实施。由于莴苣属植物的花粉亲本在结实后即停止开花，因此，期望以花粉亲本连续开花、能够长期供给花粉的方式适当缩剪。

[参考文献]

[参考文献1]W.P.KEMP等，“Development and Emergence of the AlfalfaPollinator Megachile rotundata(Hymenoptera:Megachilidae)”，Annals of theEntomological Society of America，93(4):904-911(2000)

[参考文献2]Eric Mader等，“Managing Alternative Pollinators:A Handbookfor Beekeepers,Growers,and Conservationists”，SARE Handbook 11(2010)，p10

[参考文献3]松香光男，“昆虫利用科学系列7传粉者的利用”，第1版，ScienceHouse Co.,Ltd.，1996年2月，p.97-112

[参考文献4]Dave Goulson，“EFFECTS OF INTRODUCED BEES ON NATIVEECOSYSTEMS”，Annu.Rev.Ecol.Evol.Syst.34:1-26(2003)，p6，

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实施例

通过下述实施例来具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例的任何限定。

实施例1：辅助蜜源植物的研究

本发明中，作为辅助蜜源植物重要的特性是，切叶蜂属的蜂具有访花偏好性、并且该访花偏好性等于或低于莴苣属植物。因此，进行了具有如上所述特性的植物种的筛选、研究。

试验中，作为切叶蜂属的蜂，使用了苜蓿切叶蜂，作为莴苣属植物，使用了莴苣。

莴苣的主要采种地为高温且干燥的内陆性气候的美国加利福尼亚州圣华金河谷等。在圣华金河谷的采种中，莴苣的开花、结实时期的最高气温高达40℃以上，因此对于辅助蜜源植物而言，耐暑性是必须的。一般而言，认为莴苣的生长适温为20℃左右。但是，由于在高温环境下，传播病毒的蚜虫无法生存，因此，基于生产无病毒种子的目的，在高温环境下进行采种。莴苣虽然在具有结球叶的状态下耐暑性低，但通过适当去除结球叶，耐暑性提高，在开始抽苔时会显示出极高的耐暑性。

莴苣的开花时期可达1～2个月，而辅助蜜源植物也必须在该时期开花，因此，期望辅助蜜源植物为具有连续开花性的植物种。另外，若辅助蜜源植物的栽培面积变大，则莴苣的栽培面积受到限制，每单位面积的莴苣的采种产量减少，因此，期望为花数多的多花性植物种。

因此，为了发现成为采集莴苣F1种子时的辅助蜜源植物的候选的植物种，筛选耐暑性较高、在夏季开花的57种植物种，对它们的特性进行了评价。

对于莴苣和作为辅助蜜源候选的各植物种而言，使用位于静冈县挂川市的无加温玻璃温室，于5月上旬开始进行播种、或育苗。

各植物种在合适的时期以单株～2株种植的方式定植于直径为15cm的塑料制的盆中。为了筛选能耐受主要采种地的高温的植物种，各植物的栽培设定为高于栽培适温的35℃。实际的7月～8月的晴天昼间，当天温室内的气温超过40℃的情况也时有发生，形成了相当高的温度条件。莴苣的栽培以实际的采种的方法为基准，因此实施去除结球叶的操作直至抽苔。

因此，为了评价苜蓿切叶蜂的访花偏好性，实施了以下的试验。

具体而言，调查了从苜蓿切叶蜂的访花开始到向其他植物种访花为止的时间。将其作为筛选最合适的辅助蜜源植物种的基准。

(访花偏好性的评价)

在同一温室内栽培筛选出的57种植物，在栽培棚上以30cm的间隔配置。将作为调查对象的植物种的盆移至相隔1m的其他栽培棚，调查苜蓿切叶蜂的访花行动。在玻璃温室内放养约300只苜蓿切叶蜂，调查每1个植物种访花5次的时间，算出平均访花时间。

对于访花偏好性而言，将从访花开始到向其他植物种访花为止的平均访花时间分成以下5个等级的评分进行评价。

结果如表1中所示。

需要说明的是，表中的“-”表示在莴苣开花时期未能见到该植物种的开花，或者由于在栽培过程中枯死而未能见到开花。

对苜蓿切叶蜂的访花时的行动进行了观察，结果，访花偏好性高的植物种中，从访花开始直到向之后的其他植物种移动为止的时间长，观察到对相同的植物种重复进行访花的趋势。

根据表1的访花偏好性的评价结果，确认了苜蓿切叶蜂对达成开花的33种植物中的30种进行了访花，对广范围的植物种显示出访花偏好性。

因此，莴苣的访花偏好性的评分为3。

苜蓿切叶蜂具有访花偏好性、但该访花偏好性被认为等于莴苣的植物种为：访花性的评分为3的春黄菊、芫荽、牛膝草、美国薄荷、荆芥、午时花、蓝色鼠尾草这7种。

苜蓿切叶蜂具有访花偏好性、但该访花偏好性被认为低于莴苣的植物种为：访花性的评分为2的加勒比飞蓬菊、茴香、美兰菊、大花马齿苋、夏堇这5种。

(耐暑性的评价)

除了上述的访花偏好性的评价试验以外，还实施了耐暑性的评价。

耐暑性的试验中，在设定为35℃的温室内实施栽培，通过目视观察莴苣的开花期中的各植物种的生长状况，进行评价。具体而言，将导致了枯死的植物种评价为1分(枯死)，将与在适温环境下的通常的生长相比可见生长变得弱势的植物种评价为2分(耐暑性弱)，将与在适温环境下的通常的生长相比显示出同等的生长的植物种评价为3分(耐暑性强)。

结果如表1中所示。

该试验中，虽然已选出耐暑性较高、在夏季开花的植物种作为候选，但由于是极高温度的环境，因此如表1的耐暑性的评价的结果所示，得到了如下结果：21种植物发生枯死(耐暑性评分为1)，20种植物由于高温而生长不良(耐暑性评分为2)。

该试验中，莴苣的耐暑性评分为3，完全没有观察到生长不良，已抽苔的莴苣的耐暑性极高，因此认为辅助蜜源植物也需要同等的耐暑性。

因此，若将耐暑性与访花性评价的结果综合考虑，则认为，由于加勒比飞蓬菊、茴香、大花马齿苋的耐暑性略差，因此，美兰菊、夏堇是更有希望作为辅助蜜源植物的候选。

(开花持续性的评价)

开花持续性的评价试验也与上述的访花偏好性的评价试验一并实施。

具体而言，对于开花持续性而言，将从开花开始到闭花结束为止的时间分成以下5个等级进行评价。

结果如表1中所示。

开花持续性的评价中，莴苣自8月中旬起开始开花，与此相对，美兰菊自6月下旬起开始开花，夏堇自7月上旬起开始开花，直到莴苣的F1种子的收获完成为止，两个植物种均连续地开花，可以确认就开花持续性而言没有任何问题。

根据以上的结果，认为对于加勒比飞蓬菊、茴香、大花马齿苋而言，若在非高温环境下的采种地，则可用作辅助蜜源植物，另一方面，在当前的主要的莴苣采种地这样的高温环境下，美兰菊和夏堇更有希望作为辅助蜜源植物。

[表1A]

表1辅助蜜源植物的特性评价

[表1B]

实施例2：苜蓿切叶蜂的耐饥饿性的调查

莴苣的花具有在上午较早的时间段开花、于数小时后闭花的特殊开花习性，因此，在莴苣的采种场圃中直接放养苜蓿切叶蜂的情况下，在莴苣闭花后会失去蜜源。苜蓿切叶蜂具有在气温为25℃以上的晴天时活跃地持续采食活动的性质。

因此，对失去蜜源导致的影响、即苜蓿切叶蜂的耐饥饿性进行了评价。

试验如下实施。

在位于静冈县挂川市的玻璃温室中分别配置8盆在10号盆(直径约为30cm)中栽培的开花期的莴苣，并仅在一个玻璃温室中配置4盆美兰菊。将未配置美兰菊的玻璃温室设为试验区A，将配置美兰菊的玻璃温室设为试验区B。

在调查前一天的黄昏向各玻璃温室中导入约50只苜蓿切叶蜂，调查苜蓿切叶蜂的访花虫数量。

访花虫数量的调查在早晨莴苣开花时实施，通过目视计测访问8盆莴苣的花的苜蓿切叶蜂的数量，以约5分钟的间隔重复3次。

作为访花虫数量，求出对莴苣进行了访花的苜蓿切叶蜂的访花虫数量的平均值。

结果如表2中所示。

[表2]

表2苜蓿切叶蜂的耐饥饿性的调查

在试验期间，莴苣的花于上午7点左右开花，于上午9点左右闭花。

第一天(导入苜蓿切叶蜂的翌日)早晨的苜蓿切叶蜂的访花虫数量在试验区A为28.0只，在试验区B为25.7只，未观察到大的差异。

第二天，在试验区A为3.7只，在试验区B为23.0只，呈较大差异。

认为在试验区A中，由于在莴苣闭花后从温室内失去蜜源，因此苜蓿切叶蜂中的大部分消耗体力，饿死或者丧失了访花余力。试验区A中，在第三天为2只，在第四天以后未观察到访花，认为全部苜蓿切叶蜂均被饿死。

在试验区B中，虽然有访花虫数量减少的趋势，但在第五天也确认到近20只苜蓿切叶蜂的访花，其在玻璃温室内定居，观察到稳定的传粉活动。

在本试验期间，天气状况良好，因此，苜蓿切叶蜂的活动自上午7点左右开始，持续至下午4点左右。即，认为苜蓿切叶蜂在试验区A中、于自上午9点起至下午4点为止的约7小时期间成为失去蜜源的状态。

根据以上的结果，认为即使是在莴苣闭花、没有蜜源的环境中，苜蓿切叶蜂仍然企图继续采食活动，因此在失去蜜源的7小时期间消耗体力，大部分饿死或者丧失了访花余力。因此认为，如专利文献5(0048段)中所记载的那样，以使苜蓿切叶蜂集中于莴苣的方式切下苜蓿的花是使苜蓿切叶蜂自翌日起的传粉减少的重大原因。

另一方面，在配置了辅助蜜源植物的情况下，即使在莴苣闭花后，仍然在直到下午4点左右的归巢为止，观察到苜蓿切叶蜂的利用了辅助蜜源的正常采食活动，确认了能够防止由失去蜜源导致的饿死，并且能够使自翌日起的传粉活动继续。

实施例3：基于植物种的差异的访花频率的调查

对将莴苣、美兰菊及夏堇配置在同一玻璃温室内的情况下的苜蓿切叶蜂的采食活动、即访花频率进行了调查。

试验如下实施。

在位于静冈县挂川市的玻璃温室中，配置在10号盆中栽培的开花期的莴苣8盆、美兰菊2盆、夏堇2盆。

导入了约100只苜蓿切叶蜂。温室的设定温度为与主要采种地的温度接近的35℃。

试验中，求出进行了访花的苜蓿切叶蜂的数量(VN)、和进行了访花的苜蓿切叶蜂的占有率(VS)。

结果如表3及图1中所示。

不同植物种间的访花频率的调查结果示于表3，将其结果制成曲线图并示于图1。

[表3]

表3不同植物种间的访花频率的调查

VN：进行了访花的苜蓿切叶蜂的数量

VS：进行了访花的苜蓿切叶蜂的占有率

莴苣的花自上午7点左右开始开花。

采食活动的调查自上午8点开始，大部分的苜蓿切叶蜂对莴苣的花进行了访花。莴苣的花自上午8点30分左右开始闭合。

就苜蓿切叶蜂而言，自莴苣的花开始闭合的上午8点35分左右起，针对美兰菊的访花频率(即，访花占有率(VS))缓缓升高，在上午8点55分时，莴苣与美兰菊的访花频率逆转。此时，成为了大部分的莴苣的花闭合的状态，苜蓿切叶蜂针对莴苣的采食活动变得困难。在上午9点25分时，全部莴苣的花完全闭合，大部分的苜蓿切叶蜂对美兰菊进行了访花。此时，针对夏堇的访花频率被抑制为10％以下。认为这是由于，就美兰菊而言，苜蓿切叶蜂的访花偏好性高于夏堇，并且访花偏好性低于莴苣。

根据以上的结果，可以确认苜蓿切叶蜂在莴苣的开花期间集中性地针对莴苣访花，在莴苣闭花后，集中于美兰菊进行访花。因此认为，美兰菊是在莴苣F1种子的采种中最适合的辅助蜜源植物。认为苜蓿切叶蜂的访花偏好性从高至低依次为莴苣、美兰菊、夏堇。根据本试验的结果，可以确认夏堇的苜蓿切叶蜂的访花偏好性低于莴苣，暗示了在仅配置莴苣和夏堇时可以将夏堇用作辅助蜜源植物。

实施例4：使用了美兰菊作为辅助蜜源植物的莴苣F1种子的采种试验

为了评价在莴苣的F1种子的采种中使用美兰菊作为辅助蜜源植物的方法的实用性，使用玻璃温室，实施了采种试验。

作为花粉亲本，将作为雄性可育株系的“V莴苣”供于试验，作为种子亲本，将作为细胞质雄性不育株系的“CMS V莴苣”供于试验。

莴苣在静冈县挂川市于2016年2月10日播种至72孔育苗穴盘，在设定为20℃的人工气象仪(昼长为16小时)中育苗。于3月16日将种生苗移植至3号盆(直径为9cm)，在无加温的玻璃温室中继续育苗。于4月11日定植至10号盆，在设定为30℃的玻璃温室中栽培。另外，作为辅助蜜源植物使用的美兰菊、苜蓿在与莴苣相同的时期于同一环境、使用同一方法进行播种、移植、定植、栽培。

为了比较美兰菊和苜蓿的作为辅助蜜源植物的有用性，使用了位于静冈县挂川市的同一环境的2间温室。各温室中，在玻璃温室内如图2所示那样配置莴苣的花粉亲本5株和种子亲本5株。在各温室中将美兰菊和苜蓿各4株配置于图2的蜜源植物的位置。

但是，由于苜蓿在结实时能量被挪用于结实而暂时停止开花，因此，需要在预期莴苣开花的2个星期前进行缩剪，以配合莴苣的开花时期。

苜蓿切叶蜂预先保存于4℃的冰箱中直至使用，在放养日的23天前将叶巢(leafcell)移至设定为30℃的人工气象仪中，实施孵育以使其羽化。放养在6月28日、7月14日、8月5日的黄昏以2个星期的间隔分成3次实施。每1次的放养量以叶巢的容量计为200ml(约250只)。

由于雄性可育株系的莴苣在结实时会停止开花，因此，对于花粉亲本，于6月27日缩剪一半的量，然后于7月11日、7月25日以2个星期的间隔各缩剪一半的量，以花粉亲本连续开花的方式进行了处理。

在自第1朵花的开花起2个月后的8月25日，针对每1株种子亲本分别收获种子。收获的种子进行优选，针对每1株种子亲本分别利用电子天平计测种子重量。

结果如表4中所示。

[表4]

表4使用了苜蓿、美兰菊作为辅助蜜源植物的莴苣F1种子的采种结果

在使用了苜蓿作为辅助蜜源植物的实验区C中，每1株的平均采种量为5.5g。在使用了美兰菊作为辅助蜜源植物的实验区D中，每1株的平均采种量为12.3g，与使用苜蓿的情况相比为2.2倍。

使用苜蓿作为辅助蜜源植物的情况下，苜蓿切叶蜂对于苜蓿的访花偏好性较之莴苣而言非常高，即使莴苣开花，对于苜蓿的访花频率仍然较高，因此，认为莴苣的花粉从花粉亲本向种子亲本的传粉量少。与此相对，使用美兰菊作为辅助蜜源植物的情况下，由于苜蓿切叶蜂对于美兰菊的访花偏好性比莴苣低，因此，在莴苣开花期间，苜蓿切叶蜂对于莴苣的访花频率高，认为莴苣的花粉从花粉亲本向种子亲本的传粉量多。苜蓿切叶蜂在莴苣的花闭合后，对美兰菊进行访花而转向通常的采食活动，因此认为其作为辅助蜜源植物有效地发挥了作用。

莴苣F1种子的采种量为2倍以上的结果表明，通过使用美兰菊作为辅助蜜源植物，能够将生产成本削减至一半以下，认为利用价值非常高。另外，苜蓿一旦结实则停止开花，因此需要配合莴苣的开花期进行缩剪操作，而美兰菊的连续开花性高，不需要缩剪的操作。因此认为，利用美兰菊作为辅助蜜源植物的方法在削减劳力的方面也有较大优势。

实施例5：使用了夏堇作为辅助蜜源植物的莴苣F1种子的采种试验

为了评价在莴苣的F1种子的采种中使用夏堇作为辅助蜜源植物的方法的实用性，使用玻璃温室，另行实施了采种试验。

作为花粉亲本，将作为雄性可育株系的“V莴苣”供于试验，以及，作为种子亲本，将作为细胞质雄性不育株系的“CMS V莴苣”供于试验。

莴苣在静冈县挂川市于2017年4月16日播种至72孔育苗穴盘，在设定为20℃的无加温的玻璃温室中育苗。

于5月8日将种生苗移植至3号盆(直径为9cm)，在无加温的玻璃温室中继续育苗。于5月29日定植至10号盆，在设定为30℃的玻璃温室中栽培。另外，作为辅助蜜源植物使用的夏堇在与莴苣相同的时期于同一环境、使用同一方法进行播种、移植、定植、栽培。为了调查夏堇的作为辅助蜜源植物的有用性，在玻璃温室中，将莴苣的花粉亲本5株和种子亲本5株如图3所示那样配置于玻璃温室内。

将4株夏堇配置于图3的蜜源植物的位置。针对莴苣种子亲本、花粉亲本合计8株，将4盆夏堇供于试验。苜蓿切叶蜂的放养在7月19日、8月2日、8月16日的黄昏以2个星期的间隔分成3次实施。每1次的放养量以叶巢的容量计为200ml(约250只)。由于雄性可育株系的莴苣在结实时会停止开花，因此，对于花粉亲本，于7月21日缩剪一半的量，然后于8月4日、8月18日以2个星期的间隔各缩剪一半的量，以花粉亲本连续开花的方式进行了处理。

在自第1朵花的开花起2个月后的9月19日，针对每1株种子亲本分别收获种子。收获的种子进行精选，针对每1株种子亲本分别利用电子天平计测种子重量。

结果如表5中所示。

[表5]

表5使用了夏堇作为辅助蜜源植物的莴苣F1种子的采种结果

在使用了夏堇作为辅助蜜源植物的实验区E中，每1株的平均采种量为8.9g，与实施例4的使用苜蓿的情况相比为1.6倍。可以确认夏堇虽然与使用美兰菊的情况相比采种量差，但其也可用作辅助蜜源植物。