阅读说明：本技术 具有人源化FC-γ受体的非人动物 (Non-human animals with humanized FC-gamma receptors ) 是由 A·J·莫菲 L·麦克唐纳 C·古雷尔 K·A·梅格尔 N·图 于 2015-04-08 设计创作，主要内容包括：本发明提供了经基因修饰的小鼠及用于制备和使用所述小鼠的方法和组合物,其中所述基因修饰包括FcγRI蛋白的人源化。(The present invention provides genetically modified mice, including humanization of Fc γ RI proteins, and methods and compositions for making and using the same.)

具有人源化FC-γ受体的非人动物

本申请是申请号为201580019102.0、申请日为2015年4月8日、发明名称为“有人源化FC-γ受体的非人动物”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2015/024920的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2014年4月8日，申请号为61/977,037的美国申请的优先权。

相关专利申请

本申请要求2014年4月8日提交的临时申请No.61/977,037的优先权权益，该临时申请特此全文以引用方式并入本文。

背景技术

Fc受体(FcR)是存在于免疫系统的细胞表面上并可在哺乳动物体内发挥免疫系统的多种功能的蛋白质。FcRs以多种类型存在于多种细胞上，并且介导多种免疫功能，诸如与附着于受感染细胞或入侵性病原体的抗体结合、通过抗体介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)来刺激吞噬细胞或细胞毒性细胞破坏微生物或受感染细胞。

ADCC是免疫系统的效应子细胞裂解抗体所结合的靶细胞的过程。该过程依赖于预先暴露于外源抗原或细胞，从而产生抗体应答。可借助效应子细胞诸如自然杀伤(NK)细胞来介导ADCC，具体方式是使效应子细胞表面上表达的FcR与抗体的Fc部分结合，而抗体的Fc部分自身又与外源抗原或细胞结合。高亲和力FcγR1受体信号传导在免疫系统调节和效应子细胞功能方面起着重要作用。

发明内容

本发明涵盖这样的认识：希望对非人动物诸如小鼠进行工程化改造，以表达人或杂合FcγRI蛋白，从而可以对人免疫效应子应答进行实验，这种实验是不能在人体内开展的。

本发明还涵盖这样的认识：希望用人源化(人或杂合)FcγRI基因替换内源小鼠FcγRI基因。

在一些实施例中，本发明提供了表达FcγRI蛋白的小鼠，该蛋白包含人FcγRIα链的细胞外部分及小鼠FcγRIα链的细胞内部分。在一些实施例中，人FcγRIα链的细胞外部分包含EC1结构域、EC2结构域、EC3结构域，或它们的组合。

在一些实施例中，EC1结构域由与SEQ ID NO:3的外显子3具有至少50％、70％、85％、90％或95％同一性的外显子编码。

在一些实施例中，EC2结构域由与SEQ ID NO:3的外显子4具有至少50％、70％、85％、90％或95％同一性的外显子编码。

在一些实施例中，EC3结构域由与SEQ ID NO:3的外显子5具有至少50％、70％、85％、90％或95％同一性的外显子编码。

在一些实施例中，本发明提供了表达FcγRI蛋白的小鼠，该蛋白质包含人FcγRIα链的细胞外部分及小鼠FcγRIα链的细胞内部分，其中该小鼠无法可检测地表达全长小鼠FcγRIα链。在一些实施例中，FcγRIα链的细胞内部分包含整体或部分的小鼠FcγRIα链细胞质结构域。在一些实施例中，小鼠还表达包含整体或部分的小鼠FcγRIα链跨膜结构域的FcγRIα链。

在一些实施例中，本发明提供了表达与SEQ ID NO:5具有至少70％、85％、90％或95％同一性的FcγRIα链氨基酸序列的小鼠。在一些实施例中，人或杂合FcγRI蛋白可检测地表达于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞和/或它们的组合上。

在一些实施例中，施用鼠粒细胞集落刺激因子(mG-CSF)会升高人FcγRI蛋白水平。在一些实施例中，施用鼠粒细胞集落刺激因子(mG-CSF)不会升高单核细胞、中性粒细胞或树突细胞中的小鼠FcγRI蛋白水平。

在一些实施例中，本发明提供了表达FcγRI基因的小鼠，该基因包含与小鼠FcγRI基因的一个或多个外显子有效连接的人FcγRI基因的一个或多个外显子。在一些实施例中，人FcγRI基因的外显子编码人FcγRI蛋白的一个或多个细胞外部分。在一些实施例中，小鼠FcγRI基因的外显子编码小鼠FcγRI蛋白的一个或多个细胞内部分。在一些实施例中，人FcγRI的外显子选自外显子3、4、5以及它们的组合。

在一些实施例中，小鼠FcγRI的细胞内部分有效连接至一个或多个小鼠细胞内信号传导级联。

在一些实施例中，本发明提供了表达人FcγRI的小鼠，其中小鼠的生殖系细胞缺少功能性小鼠FcγRI基因。在一些实施例中，本发明提供了表达人FcγRI的小鼠，其中小鼠的生殖系细胞缺少任何小鼠FcγRI基因。

在一些实施例中，本发明提供了其基因组包含FcγRI基因的胚胎干细胞，该基因编码人FcγRI蛋白的细胞外部分及小鼠FcγRI蛋白的细胞内部分。在一些实施例中，FcγRI基因包含人FcγRI基因的外显子3、4和5。在一些实施例中，FcγRI基因还包含位于人外显子1旁侧的一个或多个人5’非翻译区。在一些实施例中，人FcγRI蛋白的细胞外部分包含EC1、EC2和EC3中的一者或多者。

在一些实施例中，本发明提供了胚胎干细胞，其基因组包含与SEQ ID NO:5具有至少70％、85％、90％或95％同一性的FcγRIα链氨基酸序列。

在一些实施例中，胚胎干细胞包含的FcγRI基因具有小鼠FcγRI基因外显子6的氨基酸残基。在一些实施例中，小鼠FcγRI蛋白的细胞内部分包含整体或部分的小鼠FcγRI蛋白细胞质结构域。

在一些实施例中，本发明提供了包含人FcγRI基因的胚胎干细胞，其中人FcγRI基因位于内源FcγRI基因座处，该基因座如自然界中所存在的那样出现于小鼠基因组中。

在一些实施例中，本发明提供了由本文所述的胚胎干细胞生成的小鼠胚胎。

在一些实施例中，本发明提供了本文所述的小鼠胚胎干细胞用于制备转基因小鼠的用途。

在一些实施例中，公开了制备表达FcγRI蛋白的小鼠的方法，该蛋白包含人FcγRI蛋白的细胞外部分及小鼠FcγRI蛋白的细胞内部分，该方法包括以下步骤：(a)获取小鼠胚胎干细胞；(b)在胚胎细胞中用包含这样的核酸分子的基因组片段替换内源小鼠FcγRI基因，该核酸分子编码人FcγRI蛋白的具有人细胞外区域的部分；以及(c)使用(b)的胚胎细胞产生小鼠。

在一些实施例中，本发明提供了基因组片段，其包含编码人FcγRI蛋白的具有人细胞外区域的部分的核酸分子，以及编码小鼠FcγRI蛋白的细胞内部分的核酸分子。

如本申请中所用，术语“约”和“大约”作为等义词使用。本申请中所用的任何由或不由约/大约修饰的数字，都意欲涵盖相关领域普通技术人员所了解的任何正常波动。

本发明的其他特征、目的和优点在以下

具体实施方式

中是显而易见的。然而，应当理解，虽然具体实施方式指示了本发明的实施例，但仅以说明的方式给出，而并无限制性。对于本领域的技术人员而言，通过以下的具体实施方式，本发明范围内的各种变化和修改将变得显而易见。

附图说明

本文所包括的附图仅出于说明目的，而不具有限制性。

图1示出了实验小鼠和野生型对照的FcγRI小鼠等位基因的基因分型。

图2示出了实验小鼠和野生型对照的人FcγRI基因的相对拷贝数。

图3示出了基于具有一个拷贝的人FcγRI的Het(+/-)小鼠、并采用平均ΔCt校准的基因拷贝数的变换数据。

图4示出了从人类献血者获取的细胞中FcγRI受体的表达。

图5示出了人FcγRI基因、小鼠FcγRI基因和人源化FcγRI基因的示意图(未按比例绘制)。

图6示出了MAID 6074盒制备过程的示意图(未按比例绘制)。

图7示出了具有人源化FcγRI基因的小鼠在脾和血液中表现出正常的细胞频率。

图8示出了具有人源化FcγRI基因的小鼠体内的髓系脾细胞群。

图9示出了巨噬细胞上鼠FcγRI表达的丧失，这些巨噬细胞来自具有人源化FcγRI基因的小鼠的脾。

图10示出了单核细胞上人FcγRI表达的获得，这些单核细胞来自具有人源化FcγRI基因的小鼠的脾。

图11示出了在巨噬细胞的FACS分析期间的设门策略，这些巨噬细胞从具有内源小鼠FcγRI基因的小鼠(MAID 6074 WT)以及人源化FcγRI基因纯合型小鼠(MAID 6074 HO)的腹腔纯化得到。

图12示出了巨噬细胞中的人FcγRI和小鼠FcγRI的表达，这些巨噬细胞来自具有内源小鼠FcγRI基因的小鼠(MAID 6074 WT)以及人源化FcγRI基因纯合型小鼠(MAID6074 HO)的腹腔。

图13示出了在骨髓来源巨噬细胞的FACS分析期间的设门策略，这些骨髓来源巨噬细胞来自具有内源小鼠FcγRI基因的小鼠(MAID 6074 WT)和人源化FcγRI基因纯合型小鼠(MAID 6074 HO)。

图14示出了骨髓来源巨噬细胞中的人FcγRI和小鼠FcγRI的表达，这些骨髓来源巨噬细胞来自具有内源小鼠FcγRI基因的小鼠(MAID 6074 WT)和人源化FcγRI基因纯合型小鼠(MAID 6074 HO)。

图15示出了在骨髓来源巨噬细胞的FACS分析期间的设门策略，这些骨髓来源巨噬细胞来自具有内源小鼠FcγRI基因的小鼠(对照75/25)和人源化FcγRI基因杂合型小鼠(MAID 6074 HET)。

图16示出了骨髓来源巨噬细胞中的人FcγRI和小鼠FcγRI的表达，这些骨髓来源巨噬细胞来自具有内源小鼠FcγRI基因的小鼠(对照75/25)和人源化FcγRI基因杂合型小鼠(MAID 6074 HET)。

图17示出了在用PBS处理后48小时的MAID 6074 HO小鼠的髓系血细胞群，并与MAID 6074 WT进行比较。

图18示出了在用mG-CSF处理后48小时的MAID 6074 HO小鼠的髓系血细胞群，并与MAID 6074 WT小鼠进行比较。

图19示出了在用PBS处理后48小时的MAID 6074 WT小鼠和MAID 6074 HO小鼠的血液中不存在人FcγRI表达。

图20示出了在用mG-CSF处理后48小时的MAID 6074 HO小鼠的血液中的人FcγRI表达，并与MAID 6074 WT小鼠进行比较。

图21示出了在用PBS处理后48小时的MAID 6074 WT和MAID 6074 HO小鼠的血液中不存在鼠FcγRI表达。

图22示出了在用mG-CSF处理后48小时的MAID 6074 WT的血液中的鼠FcγRI表达，并与MAID 6074 HO小鼠进行比较。

图23示出了在用PBS处理后48小时的MAID 6074 HO中的髓系脾细胞群，并与MAID6074 WT小鼠进行比较。

图24示出了在用mG-CSF处理后48小时的MAID 6074 HO小鼠的髓系脾细胞群，并与MAID 6074 WT小鼠进行比较。

图25示出了在用PBS处理后48小时的MAID 6074 HO小鼠和6074 WT小鼠的脾单核细胞中不存在人FcγRI表达。

图26示出了在用mG-CSF处理后48小时的MAID 6074 HO小鼠的脾中的人FcγRI表达，并与MAID 6074 WT小鼠进行比较。

图27示出了在用PBS处理后48小时的MAID 6074 WT小鼠的脾中的鼠FcγRI表达，并与MAID 6074 HO小鼠进行比较。

图28示出了在用mG-CSF处理后48小时的MAID 6074 WT小鼠的脾中的鼠FcγRI表达，并与MAID 6074 HO小鼠进行比较。

图29示出了在用PBS或mG-CSF处理后的MAID 6074 WT和MAID 6074 HO小鼠的细胞群中人FcγRI表达情况的概要。

图30示出了MAID 6074 HO小鼠血液和脾中由mG-CSF诱导的人FcγRI mRNA的上调(归一化为mHPRT1)。

图31示出了MAID 6074 HO小鼠血液和脾中由mG-CSF诱导的人FcγRI mRNA的上调。

图32示出了小鼠FcγRI人源化的示意图及示例性策略。

定义

本发明不限于所述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变动。还应当理解，本文所用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的，而非意图进行限制，因为本发明的范围由权利要求限定。

除非另有限定，否则本文所用的所有术语和短语皆包括该术语和短语已在本领域中获得的含义，除非文中明确指出有相反意思，或从使用该术语或短语的上下文可以明显看出有相反意思。尽管与本文所述方法和材料相似或等同的任何方法和材料也可用于实践或测试本发明，但是现将描述特定的方法和材料。

本文用于一个或多个所关注值的术语“大约”是指与所述参考值近似的值。在某些实施例中，除非另作说明或除非从上下文可以明显看出(除此类数字将超过一个可能值的100％的情形之外)，否则术语“大约”或“约”是指在所述参考值的任一方向(大于或小于)上偏差在25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小百分比以内的值范围。

如本文所用，术语“生物活性的”是指任何因子(agent)在体外或体内(例如，生物体内)生物系统中具有活性的这一特征。例如，若因子存在于生物体内时在该生物体内具有生物效应，则被视为有生物活性。在特定实施例中，若蛋白质或多肽是有生物活性的，则该蛋白质或多肽中具有该蛋白质或多肽的至少一种生物活性的部分通常被称为“生物活性”部分。

如本文所用，术语“可比较的”是指两个或更多个因子、实体、情形、条件组等可能彼此不相同但足够相似，从而允许在其间作比较，由此可基于所观察到的差异或相似性合理地得出结论。本领域普通技术人员根据上下文将理解，在任何给定情况下要使两个或更多个此类因子、实体、情形、条件组等被视为可比较的，需要多大的同一性程度。

术语“保守”在本文用来描述保守氨基酸置换时，是指氨基酸残基被具有化学特性(例如，电荷或疏水性)相似的侧链R基团的另一个氨基酸残基置换。一般来讲，保守氨基酸置换实质上不会改变蛋白质的所关注功能特性，例如，受体结合于配体的能力。具有化学特性相似的侧链的氨基酸组的例子包括脂族侧链，诸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂族羟基侧链，诸如丝氨酸和苏氨酸；含酰胺的侧链，诸如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳族侧链，诸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；碱性侧链，诸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性侧链，诸如天冬氨酸和谷氨酸；以及含硫的侧链，诸如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸置换组包括例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、丙氨酸/缬氨酸、谷氨酸/天冬氨酸以及天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些实施例中，保守氨基酸置换可为蛋白质中的任何天然残基被置换为丙氨酸，如用于例如丙氨酸扫描诱变。在一些实施例中，所进行的保守置换在如下文献中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值：Gonnet et al.(1992)Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database,Science 256:1443-45(Gonnet等人，1992年，整个蛋白质序列数据库的穷举匹配，《科学》，第256卷，第1443-1445页)，该文献特此以引用方式并入。在一些实施例中，该置换是适度保守的置换，其中该置换在PAM250对数似然矩阵中具有非负值。

如本文所用，术语“破坏”是指与DNA分子(例如，与内源同源序列诸如基因或基因座)的同源重组事件的结果。在一些实施例中，破坏可实现或表示DNA序列的***、缺失、置换、替换、错义突变或移码或它们的任何组合。***可包括***可能并非起源于内源序列的整个基因或基因片段(例如，外显子)。在一些实施例中，破坏可提高基因或基因产物(例如，由基因编码的蛋白质)的表达和/或活性。在一些实施例中，破坏可降低基因或基因产物的表达和/或活性。在一些实施例中，破坏可改变基因或所编码的基因产物(例如，所编码的蛋白质)的序列。在一些实施例中，破坏可使基因或所编码的基因产物(例如，所编码的蛋白质)截短或片段化。在一些实施例中，破坏可延伸基因或所编码的基因产物；在一些此类实施例中，破坏可实现融合蛋白质的组装。在一些实施例中，破坏可影响基因或基因产物的水平，但不影响基因或基因产物的活性。在一些实施例中，破坏可影响基因或基因产物的活性，但不影响基因或基因产物的水平。在一些实施例中，破坏对基因或基因产物的水平可不造成显著影响。在一些实施例中，破坏对基因或基因产物的活性可不造成显著影响。在一些实施例中，破坏对基因或基因产物的水平或活性可不造成显著影响。

如本文所用，短语“内源基因座”或“内源基因”是指在引入如本文所述的破坏、缺失、替换、变更或修饰之前，存在于亲本或参考生物体内的遗传基因座。在一些实施例中，内源基因座具有存在于自然界中的序列。在一些实施例中，内源基因座为野生型。在一些实施例中，参考生物体为野生型生物体。在一些实施例中，参考生物体为经工程改造的生物体。在一些实施例中，参考生物体为实验室繁育的生物体(不论是野生型还是经工程改造的)。

如本文所用，短语“内源启动子”是指例如在野生型生物体中与内源基因天然关联的启动子。

如本文所用，术语“FcγRI蛋白”是指高亲和力免疫球蛋白Fc受体，其包含具有三个细胞外结构域、一个跨膜结构域和一个细胞内结构域的α链。

举例来说，表3中提供了小鼠和人FcγRIα基因的代表性核苷酸和氨基酸序列。技术人员在阅读本公开后将认识到，基因组中的一个或多个内源FcγRI受体基因(或全部)可被替换为一个或多个异源FcγRI基因(例如，多态变体、亚型或突变体、来自另一物种的基因等)。

如本文所用，“FcγRI表达细胞”是指能表达FcγRI的细胞。在一些实施例中，FcγRI表达细胞能在其表面上表达FcγRI受体。在一些实施例中，FcγRI受体以一定量表达于细胞的表面上，该量足以经由细胞表面上所表达的FcγRI蛋白来介导细胞与细胞间的相互作用。示例性FcγRI表达细胞包括淋巴细胞、骨髓细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和自然杀伤(NK)细胞。FcγRI表达细胞调节免疫细胞的相互作用，从而调节对各种外源抗原或病原体的免疫应答。在一些实施例中，本发明的非人动物展现出经由非人动物的一个或多个细胞表面上所表达的人源化FcγRI受体而进行的免疫细胞调节。如本文所用，术语“异源”是指来自不同来源的因子或实体。例如，当用来指多肽、基因或基因产物或存在于特定细胞或生物体中时，该术语阐明，相关的多肽、基因或基因产物：1)由人手动改造；2)通过人手动(例如，经由基因工程)引入细胞或生物体(或其前体)中；和/或3)不由相关细胞或生物体(例如，相关细胞类型或生物体类型)天然产生，或不天然存在于相关细胞或生物体中。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指已在其中引入异源(例如，外源)核酸或蛋白质的细胞。技术人员在阅读本公开后将理解，此类术语不仅是指特定的主体细胞，而且用来指这种细胞的子代。由于某些修饰可因突变或环境影响而存在于后续几代中，因此这种子代实际上可能不同于亲本细胞，但仍然包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。在一些实施例中，宿主细胞为原核或真核细胞，或者包括原核或真核细胞。一般来讲，宿主细胞为适用于接受和/或产生异源核酸或蛋白质的任何细胞，而不论该细胞被指定为何种生物界。示例性细胞包括原核生物和真核生物的那些细胞(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如，大肠杆菌、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)、链霉菌属物种(Streptomyces spp.)等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、甲醇毕赤酵母(P.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人动物细胞、人类细胞、或细胞融合体，诸如杂交瘤或四源杂交瘤。在一些实施例中，所述细胞为人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施例中，所述细胞为真核的，并选自以下细胞：CHO(例如，CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如，COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾细胞(例如，HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60(例如，BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、Sertoli细胞、BRL 3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞以及来源于上述细胞的细胞系。在一些实施例中，所述细胞包含一个或多个病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如，PER.C6^TM细胞)。在一些实施例中，宿主细胞为分离的细胞，或者包括分离的细胞。在一些实施例中，宿主细胞为组织的一部分。在一些实施例中，宿主细胞为生物体的一部分。

如本文所用，短语“人FcγRI基因”是指编码FcγRI蛋白的全人源部分、实质上人源部分或人源化部分的核苷酸序列，具体取决于上下文。在一些实施例中，“人FcγRI”基因是指与全小鼠源FcγRI基因截然不同的人源化FcγRI基因。在一些实施例中，人FcγRI基因含有一个或多个置换、添加、缺失或突变。在一些实施例中，人FcγRI基因包含FcγRIA(CD64A)、FcγRIB(CD64B)、FcγRIC(CD64C)或它们的组合。

短语“人FcγRI蛋白”是指由全人源、实质上人源或人源化FcγRI基因编码的蛋白质，具体取决于上下文。在一些实施例中，“人FcγRI”蛋白质是指与全小鼠源FcγRI蛋白截然不同的人源化FcγRI蛋白。在一些实施例中，人FcγRI蛋白包含一个或多个氨基酸置换、添加、缺失或突变。在一些实施例中，FcγRI蛋白包含FcγRIA(CD64A)、FcγRIB(CD64B)、FcγRIC(CD64C)或它们的组合。

短语“杂合FcγRI基因”或“杂合FcγRI蛋白”是指包含至少两种不同动物物种的FcγRI序列的FcγRI基因或蛋白质。在一些实施例中，杂合FcγRI基因包含人核酸序列的一部分和小鼠核酸序列的一部分。在一些实施例中，杂合FcγRI蛋白包含人氨基酸序列的一部分和小鼠氨基酸序列的一部分。

术语“人源化”根据其在本领域公知的含义在本文用于指这样的核酸或蛋白质：它们的结构(即，核苷酸或氨基酸序列)包含实质上或完全与天然存在于非人动物中的特定基因或蛋白质的结构对应的部分，并且还包含与存在于相关特定非人基因或蛋白质中的部分不同、而是与存在于相应人基因或蛋白质中的可比较结构更密切对应的部分。在一些实施例中，“人源化”基因是这样的基因：该基因编码的多肽具有与人多肽(例如，人蛋白质或其部分—例如，其特征部分)实质上相同的氨基酸序列。仅举一例，在膜受体的情况下，“人源化”基因可编码如下多肽，该多肽所具有的细胞外部分的氨基酸序列与人细胞外部分相同，并且其余序列与非人(例如，小鼠)多肽相同。在一些实施例中，人源化基因包含人基因的DNA序列的至少一部分。在某个实施例中，人源化基因包含人基因的整个DNA序列。在一些实施例中，人源化蛋白质包含这样的序列，该序列具有出现于人蛋白质中的部分。在一些实施例中，人源化蛋白质包含人蛋白质的整个序列，并且由与人基因的同源物或直向同源物对应的非人动物的内源基因座表达。

如本文针对序列比较所用的术语“同一性”是指，通过本领域已知的可用于测量核苷酸和/或氨基酸序列同一性的多种不同算法所测得的同一性。在一些实施例中，如本文所述的同一性是使用采用开放空位罚分10.0、延伸空位罚分0.1的ClustalW v.1.83(slow模式)比对且使用Gonnet相似性矩阵(MACVECTOR^TM 10.0.2，MacVector公司，2008)测得的。

如本文所用，术语“细胞内信号级联”或“细胞内信号转导”是指信号从细胞表面向一个或多个细胞内靶标的传输。在一些实施例中，细胞内信号转导包括靶分子(例如，免疫球蛋白Fc区)与FcγR1受体的细胞外组分结合所引发的细胞生理应答。

如本文所用，术语“分离的”是指如下物质和/或实体：(1)已与在初始产生时(不论在自然界中和/或在实验环境中)与之结合的至少一些组分分离，和/或(2)由人手动设计、产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可与约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％的初始与之结合的其他组分分离。在一些实施例中，分离的因子的纯度为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％。如本文所用，如果物质实质上不含其他组分，则该物质为“纯的”。在一些实施例中，本领域技术人员会理解，物质在与某些其他组分诸如一种或多种载体或赋形剂(例如，缓冲液、溶剂、水等)组合之后，仍可被视为“分离的”或甚至“纯的”；在此类实施例中，该物质的百分比分离度或纯度是在不计入此类载体或赋形剂的情况下计算而得的。仅举一例，在一些实施例中，生物聚合物诸如天然存在的多肽或多核苷酸在以下情况下被视为“分离的”：a)由于其起源和衍生来源的原因，不与在自然界中在其天然状态下与其相伴的一些或所有组分结合；b)实质上不含与在自然界中产生其的物种相同的物种的其他多肽或核酸；c)由不属于在自然界中产生其的物种的细胞或其他表达系统表达，或者与来自所述细胞或其他表达系统的组分结合。因此，例如，在一些实施例中，经化学合成的或在与在自然界中产生其的细胞系统不同的细胞系统中合成的多肽被视为“分离的”多肽。作为另外一种选择或除此之外，在一些实施例中，已经历一种或多种纯化技术的多肽只要其已与其他组分分离，即可被视为“分离的”多肽，这些其他组分a)天然与该多肽结合；和/或b)在该多肽初始产生时与该多肽结合。

如本文所用，短语“小鼠FcγRI基因”是指这样的基因，其包含如SEQ ID NO:1所示的核酸分子，或与如SEQ ID NO:1所示的分子具有实质同一性的核酸分子。

如本文所用，短语“小鼠FcγRI蛋白”是指包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白质，包括与如SEQ ID NO:2所示的蛋白质具有实质同一性的蛋白质在内。

如本文所用，短语“非人动物”是指非人的任何脊椎生物。在一些实施例中，非人动物为圆口纲脊椎动物、硬骨鱼、软骨鱼(例如，鲨鱼或鳐鱼)、两栖动物、爬行动物、哺乳动物和鸟类。在一些实施例中，非人哺乳动物为灵长类、山羊、绵羊、猪、狗、奶牛或啮齿动物。在一些实施例中，非人动物为啮齿动物，诸如大鼠或小鼠。

如本文中以其最广义意义所用的那样，短语“核酸”是指任何被并入或可被并入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。在一些实施例中，核酸是经由磷酸二酯键被并入或可被并入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。从上下文可以清楚看出，在一些实施例中，“核酸”是指单独的核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施例中，“核酸”是指包含单独核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施例中，“核酸”为RNA或包含RNA；在一些实施例中，“核酸”为DNA或包含DNA。在一些实施例中，核酸为一个或多个天然核酸残基、包含一个或多个天然核酸残基，或由一个或多个天然核酸残基组成。在一些实施例中，核酸为一个或多个核酸类似物、包含一个或多个核酸类似物，或由一个或多个核酸类似物组成。在一些实施例中，核酸类似物与核酸的不同之处在于其不采用磷酸二酯骨架。例如，在一些实施例中，核酸为如下物质、包含如下物质或由如下物质组成：本领域已知的且骨架中具有肽键而非磷酸二酯键的一个或多个“肽核酸”，其被视为在本发明的范围内。作为另外一种选择或除此之外，在一些实施例中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5’-N-亚磷酰胺键，而非磷酸二酯键。在一些实施例中，核酸为如下物质、包含如下物质或由如下物质组成：一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)。在一些实施例中，核酸为如下物质、包含如下物质或由如下物质组成：一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧腺苷、8-氧鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、嵌入性(intercalated)碱基、以及它们的组合)。在一些实施例中，相较于天然核酸中的糖，核酸包含一种或多种改性糖(例如，2’-氟代核糖、核糖、2’-脱氧核糖、***糖和己糖)。在一些实施例中，核酸具有编码功能性基因产物诸如RNA或蛋白质的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸包含一个或多个内含子。在一些实施例中，通过如下一种或多种方式制备核酸：从天然来源分离，通过基于互补模板的聚合进行的酶促合成(体内或体外)，重组细胞或系统中的复制，以及化学合成。在一些实施例中，核酸的长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个残基。在一些实施例中，核酸为单链的；在一些实施例中，核酸为双链的。在一些实施例中，核酸具有包含至少一个这样的元件的核苷酸序列，该元件编码多肽，或为编码多肽的序列的互补序列。在一些实施例中，核酸具有酶活性。

如本文所用，短语“有效连接”是指这样的毗邻状态，在该毗邻状态中，所描述的组分处于允许它们以它们预期方式发挥功能的关系。“有效连接”至编码序列的控制序列以使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达的方式被连接。“有效连接”的序列包括与所关注基因邻接的表达控制序列，以及以反式或在一定距离处发挥作用而控制所关注基因的表达控制序列。如本文所用，术语“表达控制序列”是指实现与之连接的编码序列的表达和加工所需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，诸如剪接和多聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及在需要时，增强蛋白质分泌的序列。此类控制序列的性质随宿主生物体而不同。例如，在原核生物中，此类控制序列一般包含启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，而在真核生物中，通常此类控制序列包含启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包括其存在对于表达和加工至关重要的组分，并且还可包括其存在具有有利性的额外组分，例如，前导序列和融合伴侣序列。

如本文所用，术语“多肽”是指氨基酸的任何聚合物链。在一些实施例中，多肽具有天然存在的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽具有非天然存在的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽具有经工程改造的氨基酸序列，即其通过人手动操作而设计和/或产生。

如本文所用，术语“重组”旨在指通过重组手段设计、工程改造、制备、表达、产生或分离的多肽(例如，如本文所述的信号调节蛋白质)，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的多肽，从重组的人多肽组合文库分离的多肽(Hoogenboom H.R.,(1997)TIBTech.15:62-70(Hoogenboom H.R.，1997年，《生物技术趋势》，第15卷，第62-70页)；AzzazyH.,and Highsmith W.E.,(2002)Clin.Biochem.35:425-445(Azzazy H.和HighsmithW.E.，2002年，《临床生物化学》，第35卷，第425-445页)；Gavilondo J.V.,and LarrickJ.W.(2002)BioTechniques 29:128-145(Gavilondo J.V.和Larrick J.W.，2002年，《生物技术》，第29卷，第128-145页)；Hoogenboom H.,and Chames P.(2000)Immunology Today21:371-378(Hoogenboom H.和Chames P.，2000年，《今日免疫学》，第21卷，第371-378页))，从人免疫球蛋白基因转基因动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor,L.D.,et al.(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295(Taylor,L.D.等人，1992年，《核酸研究》，第20卷，第6287-6295页)；Kellermann S-A.,and Green L.L.(2002)Current Opinion inBiotechnology 13:593-597(Kellermann S-A.和Green L.L.，2002年，《生物技术新见》，第13卷，第593-597页)；Little M.et al(2000)Immunology Today 21:364-370(Little M.等人，2000年，《今日免疫学》，第21卷，第364-370页))或通过任何其他涉及将所选序列元件剪接到彼此的手段制备、表达、产生或分离的多肽。在一些实施例中，此类所选序列元件中的一者或多者是天然存在的。在一些实施例中，在计算机上设计此类所选序列元件中的一者或多者。在一些实施例中，一个或多个此类所选序列元件由对已知序列元件(例如，来自天然或合成来源)进行诱变(例如，体内或体外诱变)而得到。例如，在一些实施例中，重组多肽由存在于所关注的源生物体(例如，人、小鼠等)的基因组中的序列构成。在一些实施例中，重组多肽具有由诱变(例如体外或体内诱变，例如在非人动物中进行)产生的氨基酸序列，因此重组多肽的氨基酸序列虽然是来源于多肽序列并与之相关的序列，但可能不天然存在于非人动物体内的基因组内。

术语“替换”本文用来指这样的过程，通过该过程将存在于宿主基因座中(例如，基因组中)的“被替换的”核酸序列(例如，基因)从该基因座移除，并且让不同的“替换”核酸位于其位置中。在一些实施例中，被替换的核酸序列和替换核酸序列由于如下原因而彼此相当，例如它们彼此同源和/或包含对应元件(例如，蛋白质编码元件、调节元件等)。在一些实施例中，被替换的核酸序列包含以下一者或多者：启动子、增强子、剪接供***点、剪接受***点、内含子、外显子、非翻译区(UTR)；在一些实施例中，替换核酸序列包含一个或多个编码序列。在一些实施例中，替换核酸序列为被替换的核酸序列的同源物。在一些实施例中，替换核酸序列为被替换的序列的直向同源物。在一些实施例中，替换核酸序列为或包含人核酸序列。在涵盖替换核酸序列为或包含人核酸序列的情形的一些实施例中，被替换的核酸序列为或包含啮齿动物序列(例如，小鼠序列)。如此设置的核酸序列可包含一个或多个调节序列(属于用于获得如此设置的序列的源核酸序列的一部分，例如启动子、增强子、5'-或3'-非翻译区等)。例如，在各种实施例中，该替换是内源序列被异源序列置换，从而由如此设置的核酸序列(包含异源序列)产生基因产物，而不表达内源序列；该替换是内源基因组序列替换为编码这样的蛋白质的核酸序列，该蛋白质具有与内源序列编码的蛋白质相似的功能(例如，内源基因组序列编码FcγRI蛋白，并且DNA片段编码一种或多种人FcγRI蛋白)。在各种实施例中，内源基因或其片段被替换为对应的人基因或其片段。对应的人基因或其片段是这样的人基因或片段，其是被替换的内源基因或其片段的直向同源物，或在结构和/或功能方面实质上与被替换的内源基因或其片段相似或相同。

如本文所用，术语“实质上”是指展现所关注特征或特性的完全或近乎完全范围或程度的定性状况。生物学领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有的话)达到完全和/或进行完整，或者获得或避免绝对结果。术语“实质上”因此在本文中用来体现许多生物和化学现象所固有的潜在完整性缺乏。

如本文所用，短语“实质同源性”是指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员将认识到，如果两个序列在对应位置中包含同源残基，则它们一般被视为“实质上同源的”。同源残基可为相同残基。作为另外一种选择，同源残基可为结构和/或功能特征将适当相似的不相同残基。例如，如本领域普通技术人员所熟知，某些氨基酸通常被归类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸，和/或被归类为具有“极性”或“非极性”侧链。用一种氨基酸置换另一种相同类型的氨基酸，通常可被视为“同源性”置换。典型的氨基酸分类汇总于表1和表2中。

表1

表2

如本领域所熟知，可使用多种算法中的任一种来比较氨基酸或核酸序列，这些算法包括商业计算机程序中可用的那些算法，诸如用于核苷酸序列的BLASTN，以及用于氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST和PSI-BLAST。示例性的此类程序描述于Altschul,et al.,Basic local alignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990(Altschul等人，基本局部比对搜索工具，《分子生物学杂志》，第215卷，第3期，第403-410页，1990年)；Altschul,et al.,Methods in Enzymology(Altschul等人，《酶学方法》)；Altschul,etal.，“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database searchprograms”，Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997(Altschul等人，“空位BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序”，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页，1997年)；Baxevanis,et al.,Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis of Genesand Proteins,Wiley,1998(Baxevanis等人，《生物信息学：基因和蛋白质分析的实用指南》，威立出版社，1998年)；以及Misener,et al.,(eds.),Bioinformatics Methods andProtocols(Methods in Molecular Biology,Vol.132),Humana Press,1999(Misener等人编辑，生物信息学方法指南(《分子生物学方法》，第132卷)，胡马纳出版社，1999年)。除了识别同源序列之外，上述程序通常还提供同源性程度的指示。在一些实施例中，如果两个序列的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的对应残基在相关残基区段内为同源的，则这两个序列被视为实质上同源的。在一些实施例中，相关区段为全序列。在一些实施例中，相关区段为至少9、10、11、12、13、14、15、16、17或更多个残基。在一些实施例中，相关区段包含沿着全序列的连续残基。在一些实施例中，相关区段包含沿着全序列的不连续残基。在一些实施例中，相关区段为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个残基。

如本文所用，短语“实质同一性”是指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员将认识到，如果两个序列在对应位置中包含相同残基，则它们一般被视为“实质上相同的”。如本领域所熟知，可使用多种算法中的任一种来比较氨基酸或核酸序列，这些算法包括商业计算机程序中可用的那些算法，诸如用于核苷酸序列的BLASTN，以及用于氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST和PSI-BLAST。示例性的此类程序描述于Altschul,et al.,Basic local alignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990(Altschul等人，基本局部比对搜索工具，《分子生物学杂志》，第215卷，第3期，第403-410页，1990年)；Altschul,et al.,Methods in Enzymology(Altschul等人，《酶学方法》)；Altschul etal.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997(Altschul等人，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页，1997年)；Baxevanis et al.,Bioinformatics:A Practical Guide to theAnalysis of Genes and Proteins,Wiley,1998(Baxevanis等人，《生物信息学：基因和蛋白质分析的实用指南》，威立出版社，1998年)；以及Misener,et al.,(eds.),Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology,Vol.132),Humana Press,1999(Misener等人编辑，生物信息学方法指南(《分子生物学方法》，第132卷)，胡马纳出版社，1999年)。除了识别相同序列之外，上述程序通常还提供同一性程度的指示。在一些实施例中，如果两个序列的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的对应残基在相关残基区段内为相同的，则这两个序列被视为实质上相同的。在一些实施例中，相关区段为全序列。在一些实施例中，相关区段为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个残基。

如本文所用，短语“靶向载体”或“靶向构建体”是指包含靶向区域的多核苷酸分子。靶向区域包含与靶细胞、组织或动物中的序列相同或实质上相同的序列，并经由同源重组实现靶向构建体向细胞、组织或动物的基因组内的位置中的整合。还包括使用位点特异性重组酶识别位点(例如，loxP或Frt位点)进行靶向的靶向区域。在一些实施例中，本发明的靶向构建体还包含特别关注的核酸序列或基因、选择标记、控制序列和/或调节序列以及其他核酸序列，所述其他核酸序列允许通过外源添加有助于或有利于涉及此类序列的重组的蛋白质而介导的重组。在一些实施例中，本发明的靶向构建体还包含整体或部分的所关注基因，其中该所关注基因为编码整体或部分的蛋白质的异源基因，该蛋白质具有与内源序列所编码的蛋白质相似的功能。

如本文所用，术语“变体”是指这样的实体，与参考实体相比，其显示出与参考实体具有显著的结构同一性，但在一个或多个化学部分的存在或水平方面与该参考实体在结构上不同。在许多实施例中，变体在功能上也与其参考实体不同。一般来讲，特定实体是否被适当地视为参考实体的“变体”，是以其与参考实体的结构同一性程度为依据的。本领域技术人员会认识到，任何生物或化学参考实体都具有某些特征结构元件。按照定义，变体是共用一个或多个此类特征结构元件的不同化学实体。仅举数例，小分子可具有特征核心结构元件(例如，大环核心)和/或一个或多个特征侧基部分，以使得该小分子的变体是共用核心结构元件和特征侧基部分、但在其他侧基部分方面和/或在该核心内所存在的键类型方面(例如，是单键还是双键，是E还是Z等)不同的变体；多肽可具有由多个氨基酸构成的特征序列元件，这些氨基酸具有在线性或三维空间中相对于彼此的指定位置和/或引起特定生物学功能；核酸可具有由多个核苷酸残基构成的特征序列元件，这些核苷酸残基具有在线性或三维空间中相对于彼此的指定位置。例如，由于氨基酸序列中的一种或多种差异和/或共价连接到多肽主链的化学部分(例如，碳水化合物、脂质等)中的一种或多种差异，变体多肽可不同于参考多肽。在一些实施例中，变体多肽显示出与参考多肽的总体序列同一性为至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％。作为另外一种选择或除此之外，在一些实施例中，变体多肽不与参考多肽共用至少一个特征序列元件。在一些实施例中，参考多肽具有一种或多种生物活性。在一些实施例中，变体多肽共有参考多肽的生物活性中的一者或多者。在一些实施例中，变体多肽缺少参考多肽的生物活性中的一者或多者。在一些实施例中，与参考多肽相比，变体多肽显示出降低水平的一种或多种生物活性。在许多实施例中，如果除特定位置处的少量序列变更外，所关注多肽具有与亲本多肽相同的氨基酸序列，则该所关注多肽被视为亲本或参考多肽的“变体”。通常，与亲本相比，变体中少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％的残基被置换。在一些实施例中，与亲本相比，变体具有10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个被置换的残基。通常，变体具有极少数(例如，少于5、4、3、2或1个)被置换的功能残基(即，参与特定生物活性的残基)。此外，与亲本相比，变体通常具有不超过5、4、3、2或1个添加或缺失，并且通常没有添加或缺失。此外，任何添加或缺失通常少于约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约10、约9、约8、约7、约6且一般少于约5、约4、约3或约2个残基。在一些实施例中，亲本或参考多肽是天然存在的多肽。本领域普通技术人员会理解，特定所关注多肽的多个变体一般可天然存在，特别是当该所关注多肽是感染因子多肽时。

如本文所用，术语“载体”是指能够转运与之相关联的另一种核酸的核酸分子。在某个实施例中，载体能够在宿主细胞诸如真核和/或原核细胞中对与之相连的核酸进行染色体外复制和/或表达。能够引导有效连接的基因的表达的载体在本文称为“表达载体”。

如本文所用，术语“野生型”具有其本领域公知的含义，是指具有在自然界中以“正常的”(与突变的、病态的、改变的等相反)状态或背景存在的结构和/或活性的实体。本领域普通技术人员会认识到，野生型基因和多肽通常以多种不同形式存在(例如，等位基因)。

本发明的各个方面在以下部分中详细描述。这些部分的使用并非意图限制本发明。每个部分可适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另作说明，否则“或”的使用意指“和/或”。

具体实施方式

除了别的以外，本发明提供了改良和/或工程改造的非人动物，这些动物具有编码FcγRI受体的人源化遗传物质，以便对人或类似人的免疫效应子应答开展实验。

Fc受体

免疫球蛋白的Fc(即，恒定)区的受体(FcR)在免疫应答的调节方面起着重要作用。FcR存在于宿主免疫系统的辅助细胞上，从而有利于处置抗体所结合的外来抗原。FcR在平衡免疫系统辅助细胞的激活应答和抑制应答方面也起着重要作用。FcR参与巨噬细胞的吞噬作用、肥大细胞的脱颗粒、抗体-抗原复合物的摄取和免疫应答的调节，以及其他免疫系统过程。

在小鼠和人类中，不同FcR在不同辅助细胞的表面上差异表达，这些FcR各自对于所表达的抗体组库中存在的免疫球蛋白同种型来说是特异性的。例如，免疫球蛋白G(IgG)抗体通过IgG受体(FcγR)介导效应子功能。FcγR已被分类为四组：高亲和力激活FcγRI(CD64)、低亲和力抑制FcγRIIb(CD32b)、低亲和力激活FcgRIIa/c(CD32a/c)和低亲和力激活FcγRIII(CD16)。虽然每组均存在于小鼠和人类两者中，但存在这些组的免疫细胞的同等型(isoform)和亚型(subset)的数目是不同的。例如，FcγRIIA和FcγRIIIB在人类中表达于辅助细胞上，但据报道不存在于小鼠中。此外，不同IgG同种型(isotype)(例如，IgG 1)对每种FcγR的亲和力在小鼠与人类之间不同。

高亲和力人FcγRI

人高亲和力FcγRI(CD64)是以高亲和力(通常Ka大约为10^-8至10^-9M)结合单体IgG型抗体的膜内在糖蛋白。在结合IgG后，CD64与称为共同γ链(γ链)的辅助链相互作用，该链具有触发细胞活化的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。在人类中，已报道CD64组成型地表达于巨噬细胞和单核细胞上，且可通过细胞因子(诸如IFNγ和G-CSF)在多形核白细胞上诱导表达。

FcγRI序列

人、小鼠和杂合FcγRI的示例性序列示于表3中。对于cDNA序列，连续外显子由交替下划线文本分隔。对于蛋白质序列，细胞外序列加有下划线。参考序列是示例性的；本领域技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

表3

人源化FcγRI非人动物

提供了非人动物，由于非人动物中编码FcγRI蛋白的内源基因座的基因修饰，而在非人动物的免疫细胞(例如，骨髓细胞)的表面上表达人源化FcγRI受体蛋白质。本文所述的合适例子包括啮齿动物，特别是小鼠。

人源化内源FcγRI基因在一些实施例中包含来自异源物种(例如，人)的遗传物质，其中人源化内源FcγRI基因所编码的FcγRI蛋白包含来自异源物种的遗传物质所编码的部分。在一些实施例中，本发明的人源化内源FcγRI基因包含异源物种的基因组DNA，该基因组DNA对应于细胞质膜上表达的FcγRI蛋白的细胞外部分。还提供了非人动物、胚胎、细胞和靶向构建体，以便制备包含所述人源化内源FcγRI基因的非人动物、非人胚胎和细胞。

在一些实施例中，内源FcγRI基因座被缺失。在一些实施例中，内源FcγRI基因座被变更，其中内源FcγRI基因座的一部分被替换为异源序列(例如，整体或部分的人FcγRI序列)。在一些实施例中，内源FcγRI基因座的全部或实质上全部被替换为异源基因座(例如，人FcγRI基因座)。在一些实施例中，异源FcγRI基因座的一部分***到内源非人FcγRI基因座中。在一些实施例中，异源基因座为人基因座。

本发明的非人动物在内源非人FcγRI基因座处包含整体或部分的人FcγRI基因。因此，此类非人动物可被描述为具有异源FcγRI基因。可使用多种方法检测经替换、***或修饰的内源FcγRI基因座，所述方法包括例如PCR、蛋白质印迹、DNA印迹、限制性片段长度多态性(RFLP)或等位基因获得或丢失测定法。

在各种实施例中，根据本发明的人源化FcγRI基因包括具有第三、第四和第五外显子的FcγRI基因，每个外显子具有与SEQ ID NO:3的人FcγRI基因中出现的第三、第四和第五外显子具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的序列。

在各种实施例中，根据本发明的人源化FcγRI基因包括这样的FcγRI基因，其具有与SEQ ID NO:5中出现的核苷酸具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的核苷酸编码序列(例如，cDNA序列)。

在各种实施例中，本发明的非人动物所产生的人源化FcγRI蛋白具有细胞外部分，该细胞外部分具有与表3中出现的人FcγRI蛋白的细胞外部分具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的序列。

在各种实施例中，本发明的非人动物所产生的人源化FcγRI蛋白具有细胞外部分，该细胞外部分具有与SEQ ID NO:4的人FcγRI蛋白中出现的第18-288位氨基酸残基具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的序列。

在各种实施例中，本发明的非人动物所产生的人源化FcγRI蛋白具有与以SEQ IDNO:5示例的人源化FcγRI蛋白的氨基酸序列具有至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一性的氨基酸序列。

提供了用于制备表达人源化FcγRI蛋白(包括特定多态形式或等位基因变体(例如，单氨基酸差异))的非人动物的组合物和方法，包括用于制备由人类启动子和人类调节序列表达此类蛋白质的非人动物的组合物和方法在内。在一些实施例中，还提供了用于制备由内源启动子和内源调节序列表达此类蛋白质的非人动物的组合物和方法。所述方法包括将编码整体或部分人FcγRI蛋白的遗传物质***到非人动物基因组中对应于内源FcγRI基因的精确位置处，从而形成表达整体或部分人源的FcγRI蛋白的人源化FcγRI基因。在一些实施例中，所述方法包括***与人源化基因的外显子3-5对应的基因组DNA，该人源化基因编码包含人源部分的FcγRI蛋白，该人源部分包含由所***的外显子编码的氨基酸。

在各种实施例中，人源化内源FcγRI基因方法采用内源基因的相对最少修饰，并且在非人动物中引起天然FcγRI介导的效应子应答，原因在于FcγRI序列的基因组序列在单一片段中被修饰，因而通过包含必需的调节序列而保持正常功能。因此，在此类实施例中，FcγRI基因修饰不会影响其他周围基因或其他内源FcγRI基因。此外，在各种实施例中，该修饰不会影响细胞质上功能受体的组装，并且经由结合该受体的细胞质部分及后续穿过该受体的细胞质部分的信号转导来保持正常效应子功能，该受体的细胞质部分最低限度地受到该修饰的影响，或不受到该修饰的影响。

内源鼠FcγRI基因和人源化内源FcγRI基因的示意图(未按比例绘制)提供于图5中。如图所示，通过靶向构建体将包含人FcγRI基因的外显子3-5的基因组DNA***到内源鼠FcγRI基因座中。该基因组DNA包含该基因的编码人FcγRI蛋白的一个或多个细胞外结构域区(例如，第28–362位氨基酸残基)的部分，该人FcγRI蛋白参与Fc结合。

可通过本领域已知的任何方法制备具有人源化内源FcγRI基因的非人动物(例如，小鼠)。例如，可制备靶向载体，从而将整体或部分的人FcγRI基因与选择标记基因一起引入。图5示出了小鼠基因组，其包含人FcγRI的外显子1-5的***。如图所示，该靶向构建体包含：包含位于内源鼠FcγRI基因外显子1上游的序列的5’同源臂、接着是包含人FcγRI基因外显子1-5的基因组DNA片段、药物选择盒(例如，两侧侧接有loxP序列的新霉素抗性基因)、以及包含位于内源鼠FcγRI基因外显子6下游的序列的3’同源臂。在同源重组后，内源鼠FcγRI基因的外显子1-5及该基因的外显子6的一部分被替换为该靶向载体中所含的序列。产生人源化内源FcγRI基因，得到表达人源化FcγRI蛋白的细胞或非人动物，该人源化FcγRI蛋白包含人FcγRI基因外显子1-5所编码的氨基酸。可任选地通过后续添加重组酶(例如，通过Cre处理)来移除药物选择盒。

除了如本文所述具有人源化FcγRI基因的小鼠之外，本文还提供了包含人源化FcγRI基因的其他经基因修饰的非人动物。在一些实施例中，此类非人动物包含有效连接至内源FcγRI启动子的人源化FcγRI基因。在一些实施例中，此类非人动物由内源基因座表达人源化FcγRI蛋白，其中该人源化FcγRI蛋白包含人FcγRI蛋白的第16-290位氨基酸残基。

此类非人动物可选自小鼠、大鼠、兔、猪、牛(例如，奶牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类(例如，狨猴、猕猴)。对于不易获得合适的可经基因修饰的ES细胞的非人动物，可采用其他方法制备包含如本文所述的基因修饰的非人动物。此类方法包括例如修饰非ES细胞基因组(例如，成纤维细胞或诱导性多能细胞)并采用核移植将经修饰的基因组转移到合适细胞，例如***，然后将经修饰的细胞(例如，经修饰的***)在非人动物中于合适条件下孕育，从而形成胚胎。

在一些实施例中，本发明的非人动物为哺乳动物。在一些实施例中，本发明的非人动物为小型哺乳动物，例如属于跳鼠总科(Dipodoidea)或鼠总科(Muroidea)。在一些实施例中，本发明的基因修饰动物为啮齿动物。在一些实施例中，本发明的啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一些实施例中，本发明的啮齿动物选自鼠总科。在一些实施例中，本发明的基因修饰动物来自选自以下的科：暮鼠科(Calomyscidae)(例如，丽仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如，仓鼠、新世界鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩攀鼠、白尾鼠、马岛鼠)、刺山鼠科(Platacanthomyidae)(例如，刺山鼠)和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如，鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一些特定实施例中，本发明的基因修饰啮齿动物选自真鼠(鼠科)、沙鼠、刺毛鼠和冠鼠。在一些特定实施例中，本发明的基因修饰小鼠来自鼠科的成员。在某个实施例中，本发明的非人动物为啮齿动物。在一些特定实施例中，本发明的啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一些实施例中，本发明的非人动物为小鼠。

在一些实施例中，本发明的非人动物为啮齿动物，该啮齿动物为选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL品系的小鼠。在一些特定实施例中，本发明的小鼠为选自下列品系的129品系：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如，129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129/SvJae、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如Festing et al.,1999,Mammalian Genome 10:836(Festing等人，1999年，《哺乳动物基因组》，第10卷，第836页)；Auerbach et al.,2000,Biotechniques 29(5):1024-1028,1030,1032(Auerbach等人，2000年，《生物技术》，第29卷，第5期，第1024-1028、1030、1032页))。在一些特定实施例中，本发明的基因修饰小鼠为上述129品系和上述C57BL/6品系的杂交品系。在一些特定实施例中，本发明的小鼠为上述129品系的杂交品系，或上述BL/6品系的杂交品系。在一些特定实施例中，本文所述杂交品系的129品系为129S6(129/SvEvTac)品系。在一些实施例中，本发明的小鼠为BALB品系，例如BALB/c品系。在一些实施例中，本发明的小鼠为BALB品系和另一种上述品系的杂交品系。

在一些实施例中，本发明的非人动物为大鼠。在一些特定实施例中，本发明的大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、Sprague Dawley品系、Fischer品系、F344、F6和Dark Agouti。在一些特定实施例中，本文所述的大鼠品系为两种或更多种选自下列品系的杂交品系：Wistar、LEA、Sprague Dawley、Fischer、F344、F6和Dark Agouti。

具有人源化FcγRI基因的非人动物

FcγR突变型和转基因型非人动物(例如，小鼠)已例如由van de Winkel等人在美国专利No.6,111,166中报道。

已在测定法中采用此类动物来评估FcγRI表达、功能和调节的分子方面。然而，它们并非没有局限性和缺点。例如，‘166专利中所公开的小鼠包含随机***其基因组中的人FcγRI，这(1)可无意地破坏其他基因的表达和/或功能，无论检测到与否，并且(2)会导致全人源和全小鼠源FcγRI均表达，从而使单种类型FcγR的特定研究变复杂或受干扰。此外，FcγRIα链的细胞内信号转导区可被扰乱、破坏或以其他方式与‘116专利所公开的小鼠中的正常FcγRI不一致，因为参与信号转导的FcγRIα链的细胞内区域为人源的，而非小鼠源的。

本发明提供了克服这些及其他缺点的手段。除了别的以外，本发明还提供了在内源小鼠基因座处***的人源化FcγRI转基因，以便用人或杂合FcγRI基因替换小鼠FcγRI。在一些实施例中，在内源小鼠基因座处***杂合FcγRI基因，其中细胞外结构域包含人序列，而细胞内结构域包含小鼠序列。在一些实施例中，在小鼠FcγRI基因的内源基因座处***杂合FcγRI基因会导致FcγRI蛋白在免疫细胞上的表达，与另外表达内源小鼠FcγRI蛋白的小鼠免疫细胞上的人FcγRI蛋白表达分布相比，这更近似于人免疫细胞上的人FcγRI蛋白分布。在一些实施例中，在小鼠FcγRI基因的内源基因座处***杂合FcγRI基因会导致FcγRI蛋白在免疫细胞上的表达，这受适当的信号和刺激物诱导和调节。

在一些实施例中，FcγRIα链介导的MHC II类抗原递呈在包含具有人源化细胞外区域和小鼠FcγRIα链细胞内区域的杂合FcγRI蛋白的小鼠中得到了功能上的维持。在一些实施例中，与具有全人源FcγRI蛋白或含非鼠源细胞内区域的FcγRI蛋白的小鼠相比，在具有含小鼠细胞内区域的杂合FcγRI蛋白的小鼠中，内化的FcγRI的细胞内加工得以保持。

本发明的非人动物提供了可用于多种测定法的表达人FcγRI的生物材料(例如，细胞)的改良体内系统和来源。在各种实施例中，本发明的非人动物用于开发靶向FcγRI和/或调节FcγRI信号转导及免疫效应子应答的治疗剂。在各种实施例中，本发明的小鼠用于筛选和开发FcγRI与之结合的候选治疗剂(例如，抗体)。在各种实施例中，本发明的非人动物用于确定与特定治疗性抗体相关联的免疫效应子应答。

不表达内源高亲和力小鼠FcγR基因的基因修饰非人动物可用于例如：阐明各个高亲和力FcγR基因在免疫应答中的不同功能，经由细胞介导免疫(例如，ADCC)测量人治疗性抗体的疗效以确定FcγR在免疫疾病或紊乱中的作用，用作免疫疾病或紊乱的模型，产生抗一种或多种FcγR蛋白质的抗体，以及用作繁殖交配以产生其他所关注的基因修饰小鼠。

在一个实施例中，根据本发明的小鼠可用于通过向不表达高亲和力FcγR基因的小鼠施用药剂，来确定这种小鼠所丧失的细胞毒性效应(与野生型小鼠相比)，其中已知所述药剂会在野生型小鼠中引发FcγR依赖性细胞毒性效应。在一个实施例中，在本发明的小鼠体内植入肿瘤细胞，并在随后一段时间后注射对于肿瘤细胞表面上所表达的抗原具有特异性的抗体。该抗体的同种型在注射之前是已知的，并通过与野生型动物中所观察到的ADCC比较，对动物分析FcγR依赖性ADCC的减损情况。

在一个方面，缺乏内源高亲和力受体的小鼠可与其他免疫缺陷小鼠结合(例如，通过繁殖)，以开发自体免疫疾病的体内模型。例如，重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠在本领域中常规用作用于研究内部系统的模式生物。Scm小鼠制造Tor B淋巴细胞或激活补体系统中一些组分的能力受损，并且不能有效地对抗感染、排斥肿瘤及排斥移植物。可将本发明的高亲和力FcγR a-亚基基因缺陷小鼠与SCID小鼠交配，以探知宿主动物体内对施用抗体治疗剂(例如，抗肿瘤抗体)作出响应时的细胞清除，这将确定ADCC和补体依赖性细胞毒作用(CDC)在体内肿瘤细胞清除中的作用。

在一些实施例中，提供了经基因修饰的非人动物，所述经基因修饰的非人动物包含高亲和力人FcγR基因对内源高亲和力FcγR基因的替换。此类动物可用于研究全人源抗体的药代动力学和FcγR介导的ADCC。另外，已表明人FcγR基因具有与疾病相关的多态性或等位基因变体。因此，包含人FcγR基因的特定等位基因形式或多态形式对内源高亲和力FcγR基因的替换的基因修饰非人动物，可用于在动物中研究人类自体免疫疾病及与多态性相关的性状。在一些实施例中，人FcγR基因的等位基因形式与人IgG的增强疗效相关联。

在一些实施例中，确定了人高亲和力FcγR多态性对人抗体治疗剂疗效的影响。在一些实施例中，将抗肿瘤抗体施用给包含人FcγR第一多态性的第一人源化小鼠，并且还施用给包含人FcγR第二多态性的第二人源化小鼠，其中第一小鼠和第二小鼠各自包含人肿瘤细胞；并且在第一小鼠和第二小鼠中评估抗肿瘤抗体的抗肿瘤活性。

在一些实施例中，由医生依据抗肿瘤抗体在第一小鼠和第二小鼠中的疗效评估，针对治疗具有第一多态性或第二多态性以及患有与人肿瘤细胞对应的肿瘤的人类，来选择治疗方案。

内源FcγRIα-链替换方法采用了相对最少的对动物中天然FcγR介导的信号转导的破坏。在各种实施例中，FcγRα-链的基因组序列在单一片段中被替换，从而通过包含必需调节序列来保持正常功能。因此，在此类实施例中，FcγRα-链修饰不会损害其他依赖于功能性FcRγ-链分子的内源FcRs。此外，在各种实施例中，该修饰不会影响涉及FcγRα-链和内源FcRγ-链的功能受体复合物的组装，所述组装对于细胞表面上一些FcγRα-链的恰当表达及对于由活化受体所引起的特定下游信号转导而言可能很重要。由于FcRγ-链未缺失，在各种实施例中，包含人FcγRα-链基因对内源FcγRα-链基因的替换的动物可通过使IgG免疫球蛋白的Fc部分与存在于辅助细胞表面上的人FcγRα-链结合，来处理来自抗体的正常效应子功能。

本发明的非人动物表达人源化FcγRI蛋白，因此可产生细胞、细胞系和细胞培养物来充当用于结合和功能测定法(例如，测定FcγRI对潜在治疗性抗体的结合或功能)的人源化FcγRI的来源。在各种实施例中，由本文所述非人动物表达的人源化FcγRI蛋白可包含变体氨基酸序列。已报道了具有与配体结合残基相关联的变异的变体人FcγRI蛋白。在各种实施例中，本发明的非人动物表达人源化FcγRI蛋白变体。在各种实施例中，该变体在与配体结合相关联的氨基酸位置处表现出多态性。在各种实施例中，本发明的非人动物用于确定治疗性抗体通过与人FcγRI多态变体相互作用所引起的免疫效应子应答。

来自本发明的非人动物的细胞可随时分离和使用，或者可在培养中保持多代。在各种实施例中，来自本发明的非人动物的细胞被永生化，并在培养中无限期保持(例如，连续培养)。

本发明的非人动物提供改良的体内系统，从而阐明抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用的机制。

本发明提供的各个方面的实施方案也通过以下任意一个段落进行了描述。

1.一种表达FcγRI蛋白的小鼠，所述FcγRI蛋白包含人FcγRIα链的细胞外部分及小鼠FcγRIα链的细胞内部分。

2.根据段落1所述的小鼠，其中所述人FcγRIα链细胞外部分包含EC1结构域、EC2结构域、EC3结构域，或它们的组合。

3.根据段落2所述的小鼠，其中所述EC1结构域由与SEQ ID NO:3的外显子3具有至少90％同一性的外显子编码。

4.根据段落2所述的小鼠，其中所述EC2结构域由与SEQ ID NO:3的外显子4具有至少90％同一性的外显子编码。

5.根据段落2所述的小鼠，其中所述EC3结构域由与SEQ ID NO:3的外显子5具有至少90％同一性的外显子编码。

6.根据段落1所述的小鼠，其中所述小鼠不能可检测地表达全长小鼠FcγRIα链。

7.根据段落1所述的小鼠，其中所述FcγRIα链细胞内部分包含整体或部分的小鼠FcγRIα链细胞质结构域。

8.根据段落1所述的小鼠，其中所述FcγRI蛋白还包含整体或部分的小鼠FcγRIα链跨膜结构域。

9.根据段落1所述的小鼠，其中所述FcγRI蛋白包含与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的FcγRIα链氨基酸序列。

10.根据段落1所述的小鼠，其中所述FcγRI蛋白在单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞或树突细胞上表达。

11.根据段落10所述的小鼠，其中在向所述小鼠施用鼠粒细胞集落刺激因子(mG-CSF)后，所述FcγRI蛋白的所述表达升高。

12.一种包含FcγRI基因的小鼠，所述FcγRI基因包含有效连接在一起的至少一个人FcγRI基因外显子和至少一个小鼠FcγRI基因外显子，所述人FcγRI基因编码人FcγRI蛋白的细胞外部分，所述小鼠FcγRI基因编码小鼠FcγRI蛋白的细胞内部分。

13.根据段落12所述的小鼠，其中所述人FcγRI基因的所述外显子选自外显子3、外显子4和外显子5。

14.根据段落12所述的小鼠，其中所述小鼠不表达功能性小鼠FcγRI基因。

15.一种其基因组包含FcγRI基因的胚胎干细胞，所述FcγRI基因编码人FcγRI蛋白的细胞外部分及小鼠FcγRI蛋白的细胞内部分。

16.根据段落15所述的细胞，其中所述FcγRI基因包含人FcγRI基因的外显子3、外显子4和外显子5。

17.根据段落15所述的细胞，其中所述FcγRI基因还包含位于人外显子1旁侧的一个或多个人5′非翻译区。

18.根据段落15所述的细胞，其中所述人FcγRI蛋白的所述细胞外部分包含EC1、EC2和EC3中的一者或多者。

19.根据段落15所述的细胞，所述细胞包含与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的FcγRIα链氨基酸序列。

20.根据段落15所述的细胞，其中所述FcγRI基因包含小鼠FcγRI基因的外显子6。

21.根据段落15所述的细胞，其中所述小鼠FcγRI蛋白的所述细胞内部分包含整体或部分的所述小鼠FcγRI蛋白细胞质结构域。

22.根据段落15所述的细胞，其中所述FcγRI基因位于内源FcγRI基因座处。

23.一种小鼠胚胎，所述小鼠胚胎由根据段落15所述的胚胎干细胞产生。

24.一种制备表达FcγRI蛋白的小鼠的方法，所述FcγRI蛋白包含人FcγRI蛋白的细胞外部分及小鼠FcγRI蛋白的细胞内部分，所述方法包括以下步骤：

(a)获取根据段落15所述的小鼠胚胎干细胞；以及

(b)使用(a)的所述胚胎细胞产生小鼠。

25.一种制备小鼠的方法，所述方法包括对所述小鼠进行基因工程改造，使得其表达FcγRI蛋白，所述FcγRI蛋白包含人FcγRIα链的细胞外部分及小鼠FcγRIα链的细胞内部分。

26.根据段落25所述的方法，其中所述小鼠经基因工程改造，使得所述人FcγRIα链细胞外部分包含EC1结构域、EC2结构域、EC3结构域，或它们的组合。

27.根据段落26所述的方法，其中所述小鼠经基因工程改造，使得所述EC1结构域由与SEQ ID NO:3的外显子3具有至少90％同一性的外显子编码。

28.根据段落26所述的方法，其中所述小鼠经基因工程改造，使得所述EC2结构域由与SEQ ID NO:3的外显子4具有至少90％同一性的外显子编码。

29.根据段落26所述的方法，其中所述小鼠经基因工程改造，使得所述EC3结构域由与SEQ ID NO:3的外显子5具有至少90％同一性的外显子编码。

30.根据段落25所述的方法，其中所述小鼠经基因工程改造，使得其不能可检测地表达全长小鼠FcγRIα链。

31.根据段落25所述的方法，其中所述小鼠经基因工程改造，使得所述FcγRIα链细胞内部分包含整体或部分的小鼠FcγRIα链细胞质结构域。

32.根据段落25所述的方法，其中所述小鼠经基因工程改造，使得所述FcγRI蛋白还包含整体或部分的小鼠FcγRIα链跨膜结构域。

33.根据段落25所述的方法，其中所述小鼠经基因工程改造，使得所述FcγRI蛋白包含与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的FcγRIα链氨基酸序列。

34.根据段落25所述的方法，其中所述小鼠经基因工程改造，使得所述FcγRI蛋白在单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞或树突细胞上表达。

35.根据段落34所述的方法，其中所述小鼠经基因工程改造，使得在向所述小鼠施用鼠粒细胞集落刺激因子(mG-CSF)后，所述FcγRI蛋白的所述表达升高。

36.一种制备小鼠的方法，所述方法对所述小鼠进行基因工程改造，以使其基因组中包含FcγRI基因，所述FcγRI基因包含有效连接在一起的至少一个人FcγRI基因外显子和至少一个小鼠FcγRI基因外显子，所述人FcγRI基因编码人FcγRI蛋白的细胞外部分，所述小鼠FcγRI基因编码小鼠FcγRI蛋白的细胞内部分。

37.根据段落36所述的方法，其中所述小鼠经基因工程改造，使得所述人FcγRI基因的所述外显子选自外显子3、外显子4和外显子5。

38.根据段落36所述的方法，其中所述小鼠经基因工程改造，使得所述小鼠不表达功能性小鼠FcγRI基因。

实例

提供了以下实例，以便向本领域普通技术人员描述如何制备和使用本发明的方法和组合物，并且不意在限制本发明人所认定的其发明的范围。除非另外指明，否则温度以摄氏度指示，压力是大气压或接近大气压。

实例1.内源FcγRI基因的人源化。

本实例说明了使非人哺乳动物诸如啮齿动物(例如，小鼠)中编码高亲和力FcγRI的内源基因人源化的示例性方法。

人源化FcγRI靶向载体(MAID6074)的构建

通过使用人Fcγ受体1基因(启动子区、信号加胞外域区)替换鼠染色体3上的小鼠对应序列，构建大靶向载体(LTVEC)。

基于BAC的靶向载体(MAID6073)的生成

基于NCBI和Ensemble的数据库，使用blast和BAC末端序列鉴定含有FcγRI基因的小鼠BAC RP23-477p23和人BAC CTD-2339o22。

生成靶向载体的方法涉及以下步骤，其中LTVEC含有人FcγRI基因的从(5’远端)FcγRI基因启动子(25kb)到3’近端基因密码子W290处(在其跨膜结构域(TM)之前)的人序列，(之后是小鼠跨膜结构域和基因的其余部分)。

首先，通过细菌中的同源重组，移除来自人BAC(CTD-2339o22)的人序列的5’端，留下I-Ceu1位点及FcγRI基因的25kb启动子区，利用位于FcγR1基因的内含子5(TM结构域上游404bp)中的带loxp的pgk-Neo盒移除3’端人序列，后接AsiS1位点。

第二，通过细菌中的同源重组，在小鼠BAC RP23-477p23中，利用侧接I-Ceu1位点和AsiS1位点的Spec盒(在小鼠TM之前添加的人FcγRI序列的EC3结构域的8个氨基酸(一直到密码子W290))移除小鼠FcγRI基因(从其启动子(20kb)一直到跨膜结构域)。

第三，通过I-Ceu1位点和AsiS1位点进行消化和连接，生成LTVEC(MAID6073)，其含有从(5’远端)FcγRI基因启动子(25kb)到人FcγRI的密码子W290处的3’近端(在跨膜结构域之前)的人序列，之后是小鼠跨膜结构域和基因的其余部分。

图32示出了小鼠FcγRI人源化的示意图及示例性策略。MAID6074是MAID6073的盒移除型式。图6中示出了连接序列。

被靶向的小鼠ES细胞的选择

MAID 6074LTVEC通过电穿孔导入到小鼠ES细胞系F1H4中。

实例2.高亲和力FcγRI人源化小鼠的产生

本实例说明了小鼠的转化和繁殖。hFcgR1胞外域(MAID 6073)LTVEC通过电穿孔导入到亲本F1H4小鼠胚胎干(ES)细胞中。挑取G418药物选择后存活的集落，并从中筛选人FcγRI序列同源重组到FcγRI小鼠基因座中的集落。八个克隆被鉴定为具有适当修饰且为人FcγRI胞外域杂合型，其中一个为克隆6073F-D2。所有这些克隆均含有neo盒。

通过电穿孔法向克隆6073F-D2中导入2μg的Cre质粒，以移除neo盒。挑取集落，然后从中筛选没有neo盒的集落。在确定已移除了neo盒的克隆中，使用VelociMouse方法对ES克隆6074B-A1和6074B-A10进行显微注射。

由克隆6074B-A1和6074B-A10生成雄性和雌性(XY雌性)F0VelociMice。这些F0小鼠彼此以克隆配对和非克隆配对进行交配。产生F1小鼠，这些小鼠显示为人FcγRI杂合型和纯合型(及野生型)。F1小鼠表现正常，并且Hom:Het:WT小鼠的比率遵循预测的1:2:1孟德尔比率。转移人FcγRI野生型和纯合型的雄性和雌性群组进行研究。

实例3.高亲和力FcγRI人源化小鼠的表征

本实例说明了高亲和力FcγRI蛋白在取自非人动物的细胞表面上的特征性表达，这些非人动物经工程改造而在内源FcγRI基因座处含有如实例1所述的人源化FcγRI基因构建体。

图1-3中示出了高亲和力FcγRI人源化小鼠的基因型表征。在人源化FcγRI纯合型小鼠中未检测到小鼠FcγRI的转录物。

图4及图7-16中示出了表型表征的结果。

实例4.用鼠粒细胞集落刺激因子(mG-CSF)处理的高亲和力FcγRI人源化小鼠的 表型表征

对用鼠G-CSF(mG-CSF)处理的MAID 6074(hFcγRI)HO小鼠进行表型分析，并与磷酸盐缓冲盐水(PBS)对照作比较。在皮下注射后48小时检查小鼠。显示了用PBS(n＝2)或mG-CSF(n＝2)处理的6-7周龄MAID 6074 WT小鼠与用PBS(n＝2)或mG-CSF(n＝3)处理的MAID6074 HO小鼠比较的数据。对于用PBS(n＝1)或mG-CSF(n＝1)处理的16-17周龄MAID 6074WT小鼠与用PBS(n＝1)或mG-CSF(n＝1)处理的MAID 6074 HO小鼠的比较，结果是相似的。图17-31中示出了MAID 6074 WT小鼠和MAID 6074 HO小鼠的血液和脾中单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞中的小鼠FcγRI或杂合FcγRI的基线(PBS)表达和mG-CSF诱导表达。

未经处理的MAID 6074 HO小鼠在血液中表达FcγRI(CD64)mRNA，但通过FACS未检测到蛋白质。G-CSF(48小时)诱导血液和脾中FcγRI(CD64)mRNA的升高，并且通过FACS检测到蛋白质。

实例5.表达人源化高亲和力和低亲和力Fcγ受体的小鼠的表型表征通过使用标准繁殖技术，产生表达人源化高亲和力和低亲和力Fcγ受体的小鼠。具体地讲，将如实例1和2中所述的那样产生的表达人源化高亲和力FcγRI的小鼠与如美国专利申请公布No.2014/0154701的实例1-6和图1-6中所述的那样产生的表达人源化低亲和力FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγRIIIb的小鼠杂交，该专利申请公布以引用方式并入本文。让所得小鼠交配得到纯合体。

在用鼠G-CSF(mG-CSF)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)对照进行处理后，对人源化高亲和力和低亲和力FcγR小鼠进行表型分析。以皮下注射方式向小鼠施用PBS或mG-CSF(62μg皮下施用，单剂量)。48小时后，从经处理的小鼠采集血液和脾，并如实例4中所述的那样通过FACS进行表型表征。人源化高亲和力和低亲和力FcγR小鼠的细胞表面表型与在高亲和力FcγR人源化小鼠中观察到的表型相似。并且，与高亲和力Fcγ受体人源化小鼠相似，高亲和力和低亲和力Fcγ受体均被人源化的小鼠显示出血液和脾的单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞中人FcγRI的表达升高。概括地说，FcγRI人源化小鼠中低亲和力Fcγ受体的人源化未产生显著的表型变化。

等同实施例

至此已描述了本发明的至少一个实施例的若干方面，本领域技术人员应当认识到，本领域技术人员将很容易想到各种变化、修改和改进。此类变化、修改和改进旨在作为本公开的一部分，并且旨在落入本发明的精神和范围之内。因此，以上说明和附图只作举例之用，随后的权利要求对本发明有详细描述。

权利要求中为了修饰权利要求要素而使用的序数词诸如“第一”、“第二”、“第三”等自身并不意味着一个权利要求要素较之另一个权利要求要素的任何优先级、先后顺序或次序，也不意味着执行方法的行为的时间顺序，而是仅用作标号来将具有某个名称的一个权利要求要素与具有相同名称(除了序数词的使用以外是相同的)的另一个要素区分开，以便区分权利要求要素。

除非有明确相反的说明，否则本文在说明书和权利要求书中所用的词语“一个”和“一种”应被理解为包括复数指代物。除非有相反的说明或从上下文中显而易见，否则如果在给定产物或过程中存在、采用了一个、不止一个或全部群组成员，或者一个、不止一个或全部群组成员与给定产物或过程有关，则在一群组中的一个或多个成员之间包括“或”、“或者”的权利要求或说明被视为得到满足。本发明包括在给定产物或过程中存在、采用了群组中的正好一个成员或者群组中的正好一个成员与给定产物或过程有关的实施例。本发明还包括在给定产物或过程中存在、采用了不止一个或全部群组成员或者不止一个或全部群组成员与给定产物或过程有关的实施例。此外，应当理解，除非另外指明或者除非本领域普通技术人员可明显预见将出现矛盾或不一致，否则本发明涵盖所有这样的变化、组合和排列，其中将一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、要素、条款、描述性术语等引入从属于该相同基础权利要求的另一权利要求(或在相关的情况下，任何其他权利要求)中。当以列举形式(例如以马库什群组(Markush group)或相似格式)提供要素时，应当理解，也公开了所述要素的每个子群组，并且可从群组中除去任何要素。应当理解，一般来讲，当本发明或本发明的方面被称作包含特定要素、特征等时，本发明或本发明的方面的某些实施例由此类要素、特征等组成或实质上由此类要素、特征等组成。为简单起见，本文未在每种情况中对那些实施例作具体详述。还应当理解，本发明的任何实施例或方面均可从权利要求中明确排除，不论说明书中是否叙述了该具体排除项。

本领域技术人员会认识到，在本文所述测定法或其他过程中所获得的值可具有典型标准偏差或误差。