一种螺旋藻生物活性物质分级分离方法
阅读说明：本技术 一种螺旋藻生物活性物质分级分离方法 (Spirulina bioactive substance grading separation method ) 是由 袁丽 韩丹翔 胡强 余磊 杨小红 于 2020-07-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种螺旋藻生物活性物质分级分离方法,其按照顺序依次进行如下步骤：S1:以螺旋藻粉为原料,提取和纯化螺旋藻粉中的藻蓝蛋白,螺旋藻粉变成一级藻渣；S2:以上述一级藻渣为原料,采用超临界二氧化碳萃取法或有机试剂萃取法提取藻渣中的油脂,并进一步纯化得糖脂,所述一级藻渣变成二级藻渣；S3:将二级藻渣置于通风条件下,待有机试剂充分挥发干净后,分装保存,二级藻渣富含其它蛋白和多糖,作为蛋白和多糖的粗产物。本发明不仅可分级分步将不同的活性物质依次提取出来,且保证了提取效率和避免功能性物质失活等问题,该方法藻蓝蛋白和油脂提取率高,具有操作简单、能耗低、易工业化放大等特点,该方案可最大化螺旋藻利用价值,为开发螺旋藻产品提供技术支持。(The invention relates to a spirulina bioactive substance grading separation method, which sequentially comprises the following steps: s1, extracting and purifying phycocyanin in the spirulina powder by taking the spirulina powder as a raw material, and changing the spirulina powder into first-level algae residue; s2, extracting the grease in the primary algae residues as raw materials by a supercritical carbon dioxide extraction method or an organic reagent extraction method, and further purifying to obtain glycolipids, wherein the primary algae residues become secondary algae residues; and S3, placing the secondary algae residue under a ventilation condition, subpackaging and storing after the organic reagent is fully volatilized, wherein the secondary algae residue is rich in other proteins and polysaccharides and is used as a crude product of the proteins and the polysaccharides. The method can sequentially extract different active substances step by step, ensures the extraction efficiency, avoids the problems of inactivation of functional substances and the like, has the characteristics of high extraction rate of phycocyanin and grease, simple operation, low energy consumption, easy industrial amplification and the like, can maximize the utilization value of the spirulina, and provides technical support for developing spirulina products.)
技术领域
本发明涉及天然活性成分提取技术领域，尤其涉及一种螺旋藻生物活性物质分级分离方法。
背景技术
螺旋藻(Spirulina)隶属于蓝藻门，是一种由单细胞或多细胞聚集而成的丝状体原核生物，也称为“节旋藻(Arthrospira)”。当前国内外大规模人工培养的螺旋藻，主要有钝顶螺旋藻(Arthrospira platensis)和极大螺旋藻(Arthrospira maxima)等种类。螺旋藻不仅营养丰富，而且富含多种具有生物活性功能的物质，主要包括藻蓝蛋白、γ-亚麻酸、多糖等。
藻蓝蛋白是一种市场稀缺的天然蓝色素，目前在欧美市场已经广泛用于食品行业。藻蓝蛋白也是一种具有多种生物活性的大分子，具有较强的抗氧化能力，因此能有效预防和缓解一系列由氧化压力导致的疾病，如神经退行性疾病(阿尔茨海默病、帕金森症等)、糖尿病性肾病、白内障、心血管疾病等。除此之外，近年来藻蓝蛋白也逐渐在抗肿瘤方面表现突出，有望发展成为一种天然的抗肿瘤保健品，以及肿瘤治疗过程中的辅助性治疗药物。
γ-亚麻酸因具有多种生物活性而逐渐受到人们的关注，螺旋藻中的γ-亚麻酸是与乳糖结合形成糖脂(主要包含单半乳糖二乙酰甘油脂和双半乳糖二乙酰甘油脂)，兼具γ-亚麻酸和糖脂的功能，使其具有更加广泛的应用范围和价值。γ-亚麻酸为全顺式6,9,12-十八碳三烯酸，是ω-6系列多不饱和脂肪酸。γ-亚麻酸的重要生理活性在于他是人体合成***素的前体。除此之外，γ-亚麻酸对风湿性关节炎、湿疹、结肠综合症和神经痛等疾病都具有缓解作用。
螺旋藻中多糖的含量约为15-20％，研究表明，螺旋藻多糖具有显著的抗病毒以及调节机体免疫力的功能。
生物活性肽是对机体的功能或状态具有积极作用并最终影响机体健康的特殊蛋白质片段。将螺旋藻蛋白进行水解，不仅能提高螺旋藻蛋白的溶解性和体内吸收利用率，还有可能获得具有特殊生理功能的生物活性肽。目前已有报道从螺旋藻酶解物中成功提取到抗氧化肽、ACE抑制肽、抑菌肽及抗肿瘤肽等多种生物活性肽。
虽然提取螺旋藻中某种单一的活性物质，如藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、叶绿素、多糖等的方法已多有研究和报道，但是如何从螺旋藻中分级分步将不同的活性物质依次提取出来、在提取一种物质时不破会或少破坏其他成分，并尽可能保证提取效率和避免功能性物质的活性失活的研究还非常缺乏。选取哪些提取方法进行组合、提取的先后顺序、提取效率如何保证等等，目前均未有相关的技术报道公开。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于上述问题，本发明希望提供一种螺旋藻生物活性物质分级分离方法，以充分将螺旋藻中的多种生物活性成分分离提取出来，从而最大化螺旋藻利用价值，为开发螺旋藻产品提供技术支持。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
第一方面，本发明实施例提供一种螺旋藻生物活性物质分级分离方法，其按照顺序依次进行如下步骤：
S1:以螺旋藻粉为原料，提取和纯化螺旋藻粉中的藻蓝蛋白，螺旋藻粉变成一级藻渣；
S2:以上述一级藻渣为原料，采用超临界二氧化碳萃取法或有机试剂萃取法提取藻渣中的油脂，并进一步纯化得糖脂，所述一级藻渣变成二级藻渣；
S3:将二级藻渣置于通风条件下，待有机试剂充分挥发干净后，分装保存，二级藻渣中含有丰富的蛋白和多糖，作为蛋白和多糖的粗产物。
根据本发明较佳实施例，其中，所述步骤S1包括：
S11:称取螺旋藻粉与磷酸钾缓冲液混合，磷酸钾缓冲液中磷酸钾浓度为0.05-0.08M，二者以质量克数与体积毫升按照1:10-14混合均匀，于30-42℃搅拌或振荡提取1-5小时；
S12:向上述混合液中加入2-4％质量体积百分数的氯化钙溶液，继续搅拌或振荡抽提1-3小时；质量体积百分数是克/毫升百分数；
S13:离心处理，收集上清液；
S14:加入磷酸钾浓度为0.05-0.08M的磷酸钾缓冲液，重悬沉淀，继续搅拌或振荡抽提1-3小时；
S15:离心处理，收集上清液；
S16:重复至少一次上述步骤S14-S15，以充分提取富含藻蓝蛋白的上清，将每次的上清液合并；将每次的离心沉淀物合并得到一级藻渣；
S17:对合并的上清液进行超滤纯化和浓缩；
S18:干燥，得到高含藻蓝蛋白的粉料，测定其中藻蓝蛋白的含量。
进一步地，所述S1包括如下步骤：
S11:称取螺旋藻粉与0.06M磷酸钾缓冲液，按克/毫升1:11.5混合均匀，于40℃搅拌或振荡提取1-5小时；
磷酸钾缓冲液的配制方法为：配1M磷酸二氢钾溶液和1M磷酸氢二钾溶液，以45:55的体积比混合，然后稀释10倍，调节pH＝7.0；
S12:向螺旋藻悬液中加入2.5％质量体积百分数的氯化钙溶液，继续搅拌或振荡10-30分钟；
S13:4500g离心10分钟，收集上清；
S14:加入0.06M磷酸钾缓冲液，重悬沉淀，继续搅拌或振荡抽提1小时；
S15:4500g离心10分钟，收集上清；
S16:重复上述步骤S14-S15一次，充分提取富含藻蓝蛋白的上清；将每次的上清液合并；将每次的离心沉淀物合并得到一级藻渣；
S17:对合并的上清液进行超滤纯化和浓缩；超滤采用50kDa滤膜；
S18:干燥，进行藻蓝蛋白含量测定。
根据本发明较佳实施例，其中，所述步骤S2包括：
S21：以一级藻渣为原料，采用原料质量的0.25-1.0倍的多孔材料与一级藻渣混合均匀后备用；
S22：对所述螺旋藻原料进行超临界CO2萃取，其中所述超临界CO2萃取过程中使用有机溶剂作为夹带剂，夹带剂与原料ml/g体积质量比为0.5:1-3:1；
S23:收集萃取物，所述萃取物为来自一级藻渣的油脂；经萃取后产生二级藻渣；
S24：进一步从所述萃取物分离以获得糖脂。
根据本发明较佳实施例，所述步骤S21中，所述多孔材料选自以下组中：硅藻土、大孔树脂和分子筛，优选硅藻土。
根据本发明较佳实施例，所述步骤S22中，所述有机溶剂选自以下组中：低级醇，如甲醇、乙醇、异丙醇等；低级酯，如乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯等；丙酮；正己烷；或上述一种或多种的混合物；优选选自甲醇、乙醇和乙酸乙酯或其混合物；更优选乙醇；更优选食品级乙醇。与一些超临界二氧化碳萃取过程中所用的夹带剂如石油醚(沸点高，易燃易爆)相比，选择上述溶剂作为夹带剂有助于后续萃取物与溶剂的分离，减少溶剂残留，提高产品性能。
根据本发明较佳实施例，所述步骤S22的方法包括：
S221：按乙醇：原料＝0.5:1-3:1(ml/g体积质量比)添加夹带剂，与步骤S21的混合物混合均匀，装入物料袋，放入萃取釜，安装萃取釜密封端盖；
S222：打开萃取釜进出口阀门，用CO2吹扫整个系统管路，排除空气；
S223：打开制冷机开关，预冷15-25分钟，通过设备控制面板设定系统的萃取条件，其中萃取釜的温度为30-50℃，出口阀温度为40-60℃，压力为4000-8000psi；
S224：待萃取釜温度稳定后，CO2通过高压泵输入萃取釜；
S225：保证15-60分钟萃取停留时间后打开萃取釜的出口阀，夹带剂与超临界CO2的混合流体通过降压阀节流膨胀后出料，收集后浓缩，获得油脂萃取物。
根据本发明较佳实施例，所述步骤S24中，从所述萃取物分离获得糖脂的方法为：利用大孔树脂HP20吸附再采用乙醇洗脱以去除极性酯、磷脂，使糖脂得到初步的富集；再借助硅胶柱层析法，配合洗脱体系，从油脂萃取物中得到糖脂。
(三)有益效果
本发明通过对螺旋藻中主要的活性物质：藻蓝蛋白、糖脂及富含蛋白质和多糖进行逐一提取的方法，其提取效率最高且能耗较低，该方法综合考虑了上述螺旋藻活性物质的活性、提取效率、操作难易程度和能耗。本发明不仅可以分级分步将不同的活性物质依次提取出来，且保证了提取效率和避免功能性物质的活性失活等问题。
该方法藻蓝蛋白和油脂提取率高，具有操作简单、能耗低、易工业化放大等特点，且由于提取和纯化的条件温和，故所提取物质的生物活性不易被破坏，因而是一套易于工业化放大的技术流程。利用本发明方案可最大化螺旋藻利用价值，为开发螺旋藻产品提供技术支持。
附图说明
图1为本发明实施例1得到的二级藻渣。
图2为本发明实施例2得到的二级藻渣。
图3本发明实施例1的每一步骤获得的样品中藻蓝蛋白的相对含量和纯度，图中为蛋白质SDS-PAGE分析结果(17-18kDa大小的主条带为藻蓝蛋白亚基，该图显示在实施案例中各步骤获得的样品中藻蓝蛋白的相对含量和纯度)。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
本发明提出一种螺旋藻生物活性物质分级分离方法，其包含依次顺序进行的S1-S3。其中，S1:以螺旋藻粉为原料，提取和纯化螺旋藻粉中的藻蓝蛋白，螺旋藻粉变成一级藻渣；S2:以上述一级藻渣为原料，采用超临界二氧化碳萃取法或有机试剂萃取法提取藻渣中的油脂，并进一步纯化得糖脂，所述一级藻渣变成二级藻渣；S3:将二级藻渣置于通风条件下，待有机试剂充分挥发干净后，分装保存，二级藻渣中含有丰富的蛋白和多糖，作为蛋白和多糖的粗产物。
本发明的主要创新之一为提取顺序，即先提取螺旋藻中的藻蓝蛋白，然后是γ-亚麻酸，最后得到富含蛋白质和多糖的藻渣的提取顺序；创新之二则在于这几类类物质的具体获得技术方法。
为了更好的理解上述技术方案，下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。
实施例1
本实施例是一种螺旋藻生物活性物质分级分离方法，其包括如下步骤：
(1)藻蓝蛋白提取和纯化，包括(a)-(j):
(a)称取螺旋藻粉100克，加入1150毫升0.06M磷酸钾缓冲液，混合均匀，配成终浓度约为8％的螺旋藻悬液，使悬液尽量均匀，结块部分可用按压及搅拌的方法使其充分分散混匀。
(b)将螺旋藻悬液置于2升的三角瓶中，于40℃摇床中150转/分钟振荡抽提3小时。
(c)向螺旋藻悬液中加入30克氯化钙，继续于40℃摇床中振荡30分钟。
(d)4500g离心10分钟，收集上清。
(e)加入600毫升0.06M磷酸钾缓冲液，重悬沉淀，于40℃摇床中150转/分钟振荡抽提1小时。
(f)4500g离心10分钟，收集上清。
(g)重复上述步骤(e)-(f)一次。
(h)将3次提取上清混合，共获得2升藻蓝蛋白上清液，采用SNT1113-2002《进出口螺旋藻粉中藻蓝蛋白、叶绿素含量的测定方法方法》方法测得藻蓝蛋白浓度为：提取藻蓝蛋白总得率为：12.5克/100克螺旋藻干粉。
(i)用50kDa孔径的错流膜进行超滤浓缩。
(j)冷冻干燥，留样进行藻蓝蛋白含量测定，推算出得率为11.3克/100克螺旋藻干粉，纯度A620nm/A280nm＝3.1。
(2)油脂提取及糖脂型γ-亚麻酸的分离纯化,包括(a)-(c):
(a)取一部分上述步骤(1)中提取藻蓝蛋白后的藻泥：130.3克(干重：29.6克，对应的藻粉质量：41.1克)。
(b)超临界萃取3次(7000psi，40℃，CO2流量20毫升/分钟，乙醇作夹带剂1克:4毫升，萃取1.5小时)。
(c)计算油脂得率：10克/100克螺旋藻干粉；14克/100克提取藻蓝蛋白后的藻渣。
以油脂为原料，利用大孔树脂HP20吸附再采用乙醇洗脱以去除极性酯、磷脂，使糖脂得到初步的富集；再借助硅胶柱层析法，配合洗脱体系，从油脂萃取物中得到糖脂。
(3)藻渣的处理
将上述步骤(1)–(2)提取后的藻渣置于通风橱中，待有机试剂充分挥发干净后，进一步冷冻抽干，测总蛋白和总糖含量：总蛋白含量为：28.8克/100克藻渣(提取藻蓝蛋白和油脂后的藻渣)，总糖含量为：2.9克/100克藻渣，油脂含量为3.36克/100克藻渣。藻渣如图1。
以上各步骤提取物中蛋白质分析结果见图3。图中，M.表示蛋白质Marker；1为全藻lysate：取螺旋藻粉10mg溶于1150μl buffer，充分混匀后取6μl上样的测试结果；2为实施例1中步骤(d)的上清液，取4μl上样的测试结果；3为实施例1中步骤(i)经过50kDa超滤后的样品，取2μl上样的测试结果；4为实施例1中步骤(i)经过50kDa超滤后的流穿液，取2μl上样的测试结果；5为实施例1中步骤(f)的上清液，取5μl上样的测试结果；6为实施例1中步骤g)的上清液，取5μl上样的测试结果；7为实施例1中步骤(3)藻渣6mg溶于1150μl buffer，充分混匀后取6μl上样的测试结果。
结果表明，螺旋藻粉经过磷酸钾缓冲液抽提，氯化钙絮凝沉淀后，所获提取上清中藻蓝蛋白占总蛋白的95％以上。经过50kDa滤膜纯化浓缩后，藻蓝蛋白纯度进一步提高，并且藻蓝蛋白溶液得到浓缩，有利于降低后续冷冻干燥或喷雾干燥的成本。50kDa滤膜可以完全截留藻蓝蛋白，在流穿液样品中没有检测到藻蓝蛋白。提取后的藻渣中藻蓝蛋白含量已经很低，而其他种类的蛋白质含量相对较高。
实施例2
本实施例是一种螺旋藻生物活性物质分级分离方法，其包括如下步骤：
(1)藻蓝蛋白提取和纯化，包括(a)-(j):
(a)称取螺旋藻粉150克，加入1725毫升0.06M磷酸钾缓冲液，混合均匀，配成终浓度约为8％的螺旋藻悬液，使悬液尽量均匀，结块部分可用按压及搅拌的方法使其充分分散混匀。
(b)将螺旋藻悬液置于5升反应釜40℃搅拌提取2小时。
(c)向螺旋藻悬液中加入47克氯化钙，继续于40℃反应釜中搅拌30分钟。
(d)4500g离心10分钟，收集上清。
(e)加入600毫升0.06M磷酸钾缓冲液，重悬沉淀，于40℃摇床中150转/分钟振荡抽提1小时。
(f)4500g离心10分钟，收集上清。
(g)重复上述步骤(e)-(f)一次。
(h)将3次提取上清混合，采用SNT 1113-2002《进出口螺旋藻粉中藻蓝蛋白、叶绿素含量的测定方法方法》测得藻蓝蛋白浓度为：提取藻蓝蛋白总得率为：15.2克/100克螺旋藻干粉。
(2)油脂提取及糖脂型γ-亚麻酸的分离纯化,包括(a)-(c):
(a)取一部分上述步骤(1)中提取藻蓝蛋白后的藻泥：43.25克(干重：9.5克，对应的藻粉质量：13.2克)。
(b)用丙酮1:10(克/毫升)，50℃，萃取3次，每次2小时。
(c)计算油脂得率：8克/100克螺旋藻干粉；11克/100克提取藻蓝蛋白后的藻渣。
(3)提取后藻渣的处理
将上述步骤(1)–(2)提取后的藻渣置于通风橱中，待有机试剂充分挥发干净后，进一步冷冻抽干，测总蛋白和总糖含量：总蛋白含量为：44.6g/100g藻渣(提取藻蓝蛋白和油脂后的藻渣)，总糖含量为：2.7克/100克藻渣，油脂含量为6.98克/100克藻渣。藻渣如图2。参见图3所示，8为实施例2中步骤(3)的藻渣6mg溶于1150μl buffer，充分混匀后取6μl上样的测试结果。
对比例
本对比例将实施例1的提取步骤(2)和步骤(1)颠换处理顺序，处理条件相同，只是先以螺旋藻粉为原料提取油脂，再以提取完油脂的藻渣为原料提取藻蓝蛋白。经实验发现，按照这种方式，得到藻蓝蛋白的得率为1.7克/100克螺旋藻干粉，油脂得率为9.4克/100克螺旋藻干粉。
根据比较，本发明所提供的方法，螺旋藻中藻蓝蛋白和油脂提取率高，具有操作简单、能耗低、易工业化放大等特点，而且提取和纯化的条件温和，提取物质的生物活性不易被破坏。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。