阅读说明：本技术 一种***SiHa细胞系β-hCG实时监控方法 (Real-time monitoring method for cervical cancer SiHa cell line beta-hCG ) 是由 傅善基 于 2020-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种宫颈癌SiHa细胞系β-hCG实时监控方法,具体涉及肿瘤细胞监控方法领域,包括以下操作步骤：S1、通过转染pCIneo-βhCG质粒建立稳定表达βhCG的SiHa细胞系；S2、皮下接种BALB/C小鼠建立肿瘤模型,通过监测尿β-hCG/肌酐比值监测肿瘤生长情况,以及腹腔顺铂化疗后,尿β-hCG/肌酐比值对监测其抗肿瘤作用的效果。本发明采用分子生物学手段,发明一种分泌肿瘤标志物——β-hCG的动物模型,用以体外监控肿瘤大小变化,本发明β-hCG肿瘤表达体系,可持续、简便的监测动物体内肿瘤生长变化,为宫颈癌研究提供新的动物模型方法。(The invention discloses a real-time monitoring method for a cervical cancer SiHa cell line beta-hCG, in particular to the field of tumor cell monitoring methods, which comprises the following operation steps: s1, establishing a SiHa cell line for stably expressing beta hCG by transfecting a pCIneo-beta hCG plasmid; s2, subcutaneously inoculating BALB/C mice to establish a tumor model, monitoring the growth condition of the tumor by monitoring the urine beta-hCG/creatinine ratio, and monitoring the anti-tumor effect of the urine beta-hCG/creatinine ratio after the abdominal cavity cis-platinum chemotherapy. The invention adopts molecular biology means to invent an animal model for secreting a tumor marker beta-hCG, and is used for monitoring the change of the size of a tumor in vitro.)

一种***SiHa细胞系β-hCG实时监控方法

技术领域

本发明实施例涉及肿瘤细胞监控方法技术领域，具体涉及一种***SiHa细胞系β-hCG实时监控方法。

背景技术

***是妇女第二大肿瘤，约占妇女恶性肿瘤的25％，每年造成约20万例病人的死亡，针对***的预防及治疗研究非常之多。动物模型在***研究非常常用，特别是肿瘤大小的测定对于肿瘤预防治疗研究意义重大，但目前的***动物模型一般是通过将瘤细胞注射在动物皮下，通过目测和大体触摸来估计动物肿瘤的大小，误差很大，难以量化，且很难评价转移、浸润的肿瘤细胞量。要定量测定肿瘤大小只能将动物处死，解剖取出肿瘤，只能用一个时间点研究肿瘤的变化，不能持续研究肿瘤细胞在体内的动态变化。

人绒毛膜***β两亚单位(β-hCG)长期被作为检测妊娠滋养细胞瘤的指标，血液及尿液β-hCG含量与肿瘤大小呈良好正相关，非常便于体外检测肿瘤的存在和大小^[2]，在此基础上John Hopkins大学Shih教授等建立了一套简便易行的肿瘤细胞代谢的实时监控体系^[1]，本发明参考此体系，将pCIneo-hCG质粒转入SiHa***细胞系；将携带β-hCG基因的***细胞接种免疫缺陷小鼠，形成荷瘤动物模型，从而建立***实时监控模型，并评估β-hCG分泌与肿瘤生长及治疗的关系。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种***SiHa细胞系β-hCG实时监控方法，通过采用分子生物学手段，为肿瘤细胞人为的添加一种肿瘤标志物——β-hCG，用以监控肿瘤大小变化，以解决现有技术中存在的问题。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：一种***SiHa细胞系β-hCG实时监控方法，包括以下操作步骤：

S1、通过转染pCIneo-βhCG质粒建立稳定表达βhCG的SiHa细胞系；

S2、皮下接种BALB/C小鼠建立肿瘤模型，通过监测尿β-hCG/肌酐比值监测肿瘤生长情况，以及腹腔顺铂化疗后，尿β-hCG/肌酐比值对监测其抗肿瘤作用的效果。

进一步地，步骤S1中，SiHa细胞系的建立方法如下：

S1.1、质粒扩增、提取及鉴定：

1)将pCIneo-βhCG质粒常规转化CaCl2法制备的DH5α感受态细菌，接种LA平板筛选，挑取单菌落接种于LA液体培养基培养过夜；

2)按照质粒提取试剂盒说明，采用SDS碱裂解小量提取质粒DNA，置于ElutionBuffer中，紫外分光光度计检测质粒DNA浓度，采用用Sac I和Kpn I双酶切，及KpnI单酶切琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察并扫描记录；

S1.2、细胞培养及βhCG稳定表达细胞系的建立；

1)SiHa细胞采用DMEM+10％胎牛血清，为不影响细胞生长及转染效果，不使用抗生素，置于37℃5％二氧化碳培养箱培养，正常情况下每2天换液一次，0.25％胰酶消化传代；

2)按照lipofectin2000转染试剂盒说明，以10e5的细胞接种24孔板，完全培养基培养36小时，待细胞铺满90％以上时，以0.8ug质粒加4uL lipofectin2000比例，转染换有无血清培养基的细胞，37℃5％二氧化碳培养箱培养4小时后更换完全培养基；

3)48小时后，以1:5比例消化传代，培养12小时待细胞贴壁后加入筛选剂量的G418，按照文献及预试验结果，SiHa细胞筛选剂量为750ug/uL，5天后挑取单细胞集落，完全培养基培养，加入维持剂量的G418以维持筛选压力，维持剂量为200ug/mL，继续培养20天后试验^[5]，所建立细胞系命名为SiHa-hCG。

进一步地，步骤S1中，细胞hCG表达检测步骤包括：

将稳定转染后的SiHa细胞，消化传代后，以5×10e4/孔浓度梯度，接种24孔板，共4孔，分别加入1mL完全培养基，24h后，吸取培养基上清，罗氏E170电化学发光检测仪检测β-hCG含量，同样处理未转染的SiHa细胞作为正常对照。

进一步地，步骤S1中，评估稳定转染β-hCG基因后细胞的生长状态有无变化的方法为MTT生长曲线测定，包括：

采用MTT生长曲线实验验证，将转染β-HCG后的和未经转染处理的Hela、SiHa细胞胰酶常规传代后，以10e3/孔细胞，100ul/孔培养基接种96孔板，每组4孔复孔，共6块，每2天换液一次，每天取出1块进行MTT测定，每孔加MTT(5mg/ml)10ul，37℃培养4小时，吸弃培养基后每孔加入100ulDMSO，振荡溶解后570nm处测定吸光度，绘制生长曲线。

进一步地，步骤S2中，肿瘤细胞监测方法如下：

S2.1、荷瘤小鼠的创建；

1)选取健康雌性BALB/C小鼠，6-8周龄，体重20-25g，SPF条件饲养，以1×10e7细胞/只分别皮下接种SiHa细胞3只，作为对照组，每2天收集一次尿液，15天后处死，解剖肿瘤称取重量；

2)SiHa-hCG细胞另接种12只，每2天收集尿液测定，分别在第9天、11天、13天、15天分别处死3只小鼠，分别记为解剖试验1组、2组、3组和4组，解剖肿瘤称取重量，并于尿液β-hCG/肌酐比值进行相关性分析；

S2.2、顺铂腹腔化疗对尿β-hCG/肌酐比值的影响；

另取3只小鼠按上述方法接种SiHa-hCG细胞，记为化疗试验组，每2天收集尿液测定，15天后当皮下出现明显肿瘤时，腹腔内注射顺铂，第15天、第18天各一次，每只每次10mg/Kg，共2次，描记尿β-hCG/肌酐比值的变化至第21天；

S2.3、小鼠尿液的收集和测定；

每天下午5时，将小鼠放入采用干净的旧96孔板铺底的小笼内，3h后，采集小鼠的尿液，采用罗氏E-170电化学发光仪检测尿液中β-hCG量，由于尿肌酐相对比较恒定，受体液平衡影响较小，计算β-hCG/肌酐比值可屏蔽尿浓度的影响^[3]，引入尿肌酐做标化真实反映血液中β-hCG的含量^[4]，使用罗氏7600全自动生化分析仪，采用Jaffe反应法测定尿肌酐量。

进一步地，步骤S2.1中，每两天收集一次尿液的具体方法为：第0天、第1天收集一次，此后每2天收集一次。

进一步地，步骤S2中，数据分析采用SPSS 11.5统计学分析软件，线图绘制使用Excel 2003软件。

本发明实施例具有如下优点：

1、本发明采用分子生物学手段，发明一种分泌肿瘤标志物——β-hCG的动物模型，用以监控肿瘤大小变化，本发明β-hCG肿瘤表达体系，可持续、简便的监测动物体内肿瘤生长变化，为***研究提供新的动物模型方法；

2、本发明体外生长曲线试验表明，β-hCG基因的导入并未明显改变SiHa细胞的生长特性，体内肿瘤接种试验也表明，导入β-hCG基因后，SiHa细胞的成瘤性和生长能力并未发生明显改变；解剖试验表明：鼠尿βhCG/肌酐比值与体内SiHa-hCG肿瘤重量成线性正相关，该试验体系对于监测动物体内肿瘤生长效果显著；

3、目前，由于βhCG测定和肌酐测定都是临床检验科常规开展的项目，故肿瘤βhCG表达细胞系建立成功，就是一种简便而理想的肿瘤生长实时监控体系，因此本发明这一体系有着广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引申获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

图1为本发明提供的pCI-neo-βhCG酶切电泳示意图；

图2为本发明提供的SiHa细胞转染过程中形态学对比示意图；

图3为本发明提供的SiHa-hCG和SiHa细胞生长曲线对比示意图；

图4为本发明提供的尿βhCG/肌酐比值与肿瘤生长的关系示意图；

图5为本发明提供的肿瘤重量与尿βhCG/肌酐比值示意图；

图6为本发明提供的尿βhCG/肌酐比值检测顺铂腹腔注射治疗***SiHa-hCG肿瘤模型的效果示意图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

该实施例的一种***SiHa细胞系β-hCG实时监控方法，包括以下操作步骤：

S1、通过转染pCIneo-βhCG质粒建立稳定表达βhCG的SiHa细胞系；

SiHa细胞系的建立方法如下：

S1.1、质粒扩增、提取及鉴定：

1)将pCIneo-βhCG质粒常规转化CaCl2法制备的DH5α感受态细菌，接种LA平板筛选，挑取单菌落接种于LA液体培养基培养过夜；

2)按照质粒提取试剂盒说明(质粒提取试剂盒采用TaKaRa MiniBEST V2.0)，采用SDS碱裂解小量提取质粒DNA，置于Elution Buffer中，紫外分光光度计检测质粒DNA浓度，采用用Sac I和Kpn I双酶切，及Kpn I单酶切琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察并扫描记录；

S1.2、细胞培养及βhCG稳定表达细胞系的建立；

1)SiHa细胞采用DMEM+10％胎牛血清，为不影响细胞生长及转染效果，不使用抗生素，置于37℃5％二氧化碳培养箱培养，正常情况下每2天换液一次，0.25％胰酶消化传代；

2)按照lipofectin2000转染试剂盒说明，以10e5的细胞接种24孔板，完全培养基培养36小时，待细胞铺满90％以上时，以0.8ug质粒加4uL lipofectin2000比例，转染换有无血清培养基的细胞，37℃5％二氧化碳培养箱培养4小时后更换完全培养基；

3)48小时后，以1:5比例消化传代，培养12小时待细胞贴壁后加入筛选剂量的G418，按照文献及预试验结果，SiHa细胞筛选剂量为750ug/uL，5天后挑取单细胞集落，完全培养基培养，加入维持剂量的G418以维持筛选压力，维持剂量为200ug/mL，继续培养20天后试验^[5]，所建立细胞系命名为SiHa-hCG；

细胞hCG表达检测步骤包括：

将稳定转染后的SiHa细胞，消化传代后，以5×10e4/孔浓度梯度，接种24孔板，共4孔，分别加入1mL完全培养基，24h后，吸取培养基上清，罗氏E170电化学发光检测仪检测β-hCG含量，同样处理未转染的SiHa细胞作为正常对照；

评估稳定转染β-hCG基因后细胞的生长状态有无变化的方法为MTT生长曲线测定，包括：

采用MTT生长曲线实验验证，将转染β-HCG后的和未经转染处理的Hela、SiHa细胞胰酶常规传代后，以10e3/孔细胞，100ul/孔培养基接种96孔板，每组4孔复孔，共6块，每2天换液一次，每天取出1块进行MTT测定，每孔加MTT(5mg/ml)10ul，37℃培养4小时，吸弃培养基后每孔加入100ulDMSO，振荡溶解后570nm处测定吸光度，绘制生长曲线；

S2、皮下接种BALB/C小鼠建立肿瘤模型，通过监测尿β-hCG/肌酐比值监测肿瘤生长情况，以及腹腔顺铂化疗后，尿β-hCG/肌酐比值对监测其抗肿瘤作用的效果；

肿瘤细胞监测方法如下：

S2.1、荷瘤小鼠的创建；

1)选取健康雌性BALB/C小鼠，6-8周龄，体重20-25g，SPF条件饲养，以1×10e7细胞/只分别皮下接种SiHa细胞3只，作为对照组，每2天收集一次尿液，15天后处死，解剖肿瘤称取重量；

2)SiHa-hCG细胞另接种12只，每2天收集尿液测定，分别在第9天、11天、13天、15天分别处死3只小鼠，分别记为解剖试验1组、2组、3组和4组，解剖肿瘤称取重量，并于尿液β-hCG/肌酐比值进行相关性分析；

S2.2、顺铂腹腔化疗对尿β-hCG/肌酐比值的影响；

另取3只小鼠按上述方法接种SiHa-hCG细胞，记为化疗试验组，每2天收集尿液测定，15天后当皮下出现明显肿瘤时，腹腔内注射顺铂，第15天、第18天各一次，每只每次10mg/Kg，共2次，描记尿β-hCG/肌酐比值的变化至第21天；

S2.3、小鼠尿液的收集和测定；

每天下午5时，将小鼠放入采用干净的旧96孔板铺底的小笼内，3h后，采集小鼠的尿液，采用罗氏E-170电化学发光仪检测尿液中β-hCG量，由于尿肌酐相对比较恒定，受体液平衡影响较小，计算β-hCG/肌酐比值可屏蔽尿浓度的影响^[3]，引入尿肌酐做标化真实反映血液中β-hCG的含量^[4]，使用罗氏7600全自动生化分析仪，采用Jaffe反应法测定尿肌酐量。

进一步地，步骤S2.1中，每两天收集一次尿液的具体方法为：第0天、第1天收集一次，此后每2天收集一次。

进一步地，步骤S2中，数据分析采用SPSS 11.5统计学分析软件，线图绘制使用Excel 2003软件。

BALB/C小鼠购自山东大学动物实验中心，β-hCG检测采用罗氏E170电化学发光检测仪，罗氏HCG+β试剂盒，电化学发光免疫测定；肌酐检测采用罗氏7600全自动生化分析仪，罗氏CREA试剂盒，Jaffe反应法测定；MTT为Sigma公司产品。

实施例2

质粒扩增及鉴定：

紫外分光光度计检测pCIneo-βhCG质粒DNA浓度约200ng/uL，Sac I和Kpn I酶切位点位于载体729、1112、2051bp处，pCI-neo-βhCG质粒由于目的基因的***，破坏了Kpn I在1112bp处的酶切位点，双酶切产生片段长度为4152、1833bp。Marker采用λDNA/HindⅢ+EcoRI。

pCI-neo-βhCG质粒酶切鉴定结果见图1，图1中：M：marker；1：双酶切电泳；2：单酶切电泳。

实施例3

细胞培养及转染：转染pCIneo-hCG质粒前后的细胞培养照片对比以及单细胞克隆如图2。

实施例4

SiHa细胞βhCG表达检测，具体见图2；

SiHa细胞和SiHa-hCG细胞培养上清βhCG含量检测结果见表1：

表1：SiHa细胞和SiHa-hCG细胞培养上清βhCG含量检测结果(mIU/mL)

两样本均数t检验，t＝59.91,P＝0.0000，差异显著，SiHa-hCG细胞表达βhCG量远高于正常SiHa细胞，SiHa-hCG细胞系创建成功。

实施例5

生长曲线测定：

如图3所示，SiHa-hCG和SiHa细胞生长曲线基本重合，证明βhCG基因的导入并未对细胞生长产生明显影响.

实施例6

接种SiHa-hCG和SiHa细胞的小鼠肿瘤重量对比，见表2；

解剖试验4组和对照组各3只小鼠，分别接种同样数量的SiHa-hCG和SiHa细胞，均于第15天处死，解剖称取肿瘤重量，结果如下：

表2接种SiHa-hCG和SiHa细胞的小鼠第15天肿瘤重量

接种细胞小鼠肿瘤重量(g)

SiHa 1.48 1.51 1.73

SiHa-hCG 1.38 1.62 1.85

两组数据采用SPSS两样本均数t检验，t＝0.2509，P＝0.8143>0.05，故尚不能认为两个总体均数不等，即，尚不能认为SiHa-hCG和SiHa细胞体内生长速度有差异。

实施例7

小鼠尿βhCG/肌酐比值与肿瘤生长的相关性：

如步骤S2.1和S2.2中所述，共有6只接种SiHa-hCG的小鼠未做任何其他处理存活至第15天(解剖试验4组和化疗试验组)，其尿βhCG/肌酐比值与肿瘤生长的相关性如图4和图5。低平曲线为接种正常SiHa细胞小鼠(对照组)尿βhCG/肌酐比值变化。由图可知：接种SiHa-hCG的小鼠尿βhCG/肌酐比值随肿瘤生长逐渐增加，而接种正常SiHa细胞小鼠尿βhCG/肌酐比值则一直处于基线位置。

分析统计12只小鼠解剖所得肿瘤重量与当日尿βhCG/肌酐比值之间关系，采用SPSS 11.5线性相关分析：相关系数(r)＝0.983，相关系数的假设检验：t＝16.865,P＝0.000，可以认为肿瘤重量与尿βhCG/肌酐比值之间有直线相关性。

实施例8

小鼠尿βhCG/肌酐检测顺铂腹腔注射治疗SiHa-hCG肿瘤模型的效果，具体见图6所示。

结论：

***的预防及治疗研究中，动物模型不可或缺，但对于肿瘤大小的监控，一直以来缺乏理想的手段，选择一种理想的肿瘤标志物检测肿瘤大小并不容易，而且难以标化。

人绒毛膜***(Human Chorionic Gonadotropin,hCG)是一种糖蛋白激素，由α和β两个亚单位，各自在游离状态下没有激素活性。β亚单位是HCG所特异的，可以自尿液中排出，便于检测，长期作为妊娠滋养细胞瘤的肿瘤标志物，本发明采用分子生物学手段，为肿瘤细胞人为的添加一种肿瘤标志物——β-hCG，用以监控肿瘤大小变化。

体外生长曲线试验表明，β-hCG基因的导入并未明显改变SiHa细胞的生长特性，体内肿瘤接种试验也表明，导入β-hCG基因后，SiHa细胞的成瘤性和生长能力并未发生明显改变。

解剖试验表明，小鼠尿βhCG/肌酐比值与体内SiHa-hCG肿瘤重量成线性正相关，相关系数(r)＝0.983。小鼠尿βhCG/肌酐比值随肿瘤生长逐渐增加，顺铂化疗后，小鼠体内存活肿瘤细胞减少，尿βhCG/肌酐比值则迅速下降。该试验体系对于监测动物体内肿瘤生长效果显著。目前，βhCG测定和肌酐测定都是临床检验科常规开展的项目，故肿瘤βhCG表达细胞系一旦建立成功，就是一种简便而理想的肿瘤生长实时监控体系。Shih等人的研究试验了不同注射方式包括尾静脉注射、腹腔注射以及原位移植等，显示不同的接种肿瘤细胞方式并不影响尿βhCG，提示这一体系有着广阔的应用前景^[1]。

本发明目前所使用的动物数量较少，今后将进一步增加动物数量并重点评价转染βhCG基因后肿瘤细胞成瘤性有无改变。

参考文献

1、Shin IM,Torrance C,Sokoll LJ.Et al.Assessing tumors in livinganimals through measurement of urinary beta-human chronic gonadotropin.NatMed.2000,6(6):711-4

2、Cole,L.hCG,its free subunits and its metabolites：Roles in pregnancyand trophoblastic disease.J.Reprod.Med.43,3–10(1998).

3、Alessio L,BerlinA,Dell`OrtoA,Et al.Reliability ofurinary creatinineas a parameter used to adjust values of urinary biological indicators.IntArch Occup Environ Health.1985(55):99-106.

4、张培海，范俊，王世华，等。尿β-HCG定量在妊娠相关疾病治疗监测中应用价值的分析，实用妇产科杂志2003，19(1)：30-31

5、曹亚，实用分子生物学操作指南[M]，北京，人民卫生出版社，2003：204-207。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。