调节骨骼肌发育的方法和应用
阅读说明：本技术 调节骨骼肌发育的方法和应用 (Methods and uses for modulating skeletal muscle development ) 是由 吴珍芳 顾婷 谭宝华 周健 甘炎民 邢萍萍 乔佳鑫 严冠豪 蔡更元 李紫聪 洪林 于 2020-07-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种调节骨骼肌发育的方法,该方法包括在胚胎水平超表达RASGRP1基因。由此,不仅发现了一个在猪骨骼肌发育过程中受H3K27me3修饰作用的一个关键靶基因RASGRP1,该基因的富集水平在猪骨骼肌肌纤维形成过程中在H3K27me3的修饰作用下先上调后下调,并能够促进猪骨骼肌卫星细胞的增殖功能进而促进猪骨骼肌的发育；还可以通过超表达RASGRP1基因,来促进猪骨骼肌的发育,从而为提高猪的瘦肉率提供了一种新的方法和靶点,以及研究的新方向；再者,超表达RASGRP1基因在促进骨骼肌发育上的应用,可为瘦肉型猪的选育提供新的思路和靶点；另外,在猪的胚胎时期通过超表达RASGRP1基因,通过多种不同的方法均能达到促进骨骼肌发育的效果,具有广泛的适用性。(The invention discloses a method for regulating skeletal muscle development, which comprises the overexpression of RASGRP1 gene at an embryo level. Therefore, a key target gene RASGRP1 which is modified by H3K27me3 in the pig skeletal muscle development process is found, the enrichment level of the gene is firstly up-regulated and then down-regulated under the modification effect of H3K27me3 in the pig skeletal muscle fiber forming process, and the proliferation function of pig skeletal muscle satellite cells can be promoted so as to promote the development of pig skeletal muscle; the development of skeletal muscle of the pig can be promoted by over-expressing RASGRP1 gene, thereby providing a new method and target spot for improving the lean meat percentage of the pig and a new research direction; moreover, the application of the over-expression RASGRP1 gene in promoting skeletal muscle development can provide a new thought and target spot for the breeding of lean pigs; in addition, the RASGRP1 gene is overexpressed in the embryonic period of the pig, the effect of promoting the development of skeletal muscle can be achieved by various methods, and the application range is wide.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种调节骨骼肌发育的方法和应用。
背景技术
随着人们生活水平的不断提高，优质肉类越来越受到消费者的青睐，而人们对于猪肉的需求量也不断增长。
在自然界中，哺乳动物的个体生长、肌肉质量与骨骼肌的生长发育相关。而骨骼肌的生长发育是影响猪肉产量的重要因素之一，其占动物机体的40％以上，是动物机体的重要组成部分，在处于生长期的动物体中占有比率更高。研究猪骨骼肌的生长发育机制有助于提高猪骨骼肌占有比率，增加猪肉产量，并推进我国养猪业生产水平。
骨骼肌主要由嵌于肌腱旁***的肌纤维组成，每个肌纤维都含有许多肌核。肌纤维的数量决定了骨骼肌的数量及大小，而肌肉质量也是由肌纤维的数目和横截面积决定，肌纤维数目的增加表现为肌肉增生，肌纤维横截面积的增加表现为肌肉肥大。在动物体中，成熟的肌纤维底层含有肌肉干细胞，也被称为卫星细胞(Satellite cells)，激活的卫星细胞可以生成新的成肌细胞(Myoblast)，成肌细胞退出细胞周期并分化形成肌管，肌管与肌肉特异性蛋白融合生成肌纤维，促进骨骼肌的生长和再生。
骨骼肌的形成主要发生在妊娠时期，猪骨骼肌中肌纤维的发育在妊娠后35天左右形成初级纤维，这个过程将一直持续到妊娠第60天；在妊娠50-60天时形成次级纤维，这一过程在约75天达到增殖高峰；此后在到达妊娠第90天时肌纤维数量不再变化。
发明内容
本发明通过western blot技术分析了猪骨骼肌肌纤维形成过程中H3K27me3的修饰水平，并通过高通量测序技术ChIP-seq和RNA-seq联合分析，筛选出在猪骨骼肌肌纤维形成过程中受H3K27me3调控的靶向基因RASGRP1。进一步通过实验证明，RASGRP1基因的富集水平在猪骨骼肌肌纤维形成过程中随着H3K27me3修饰水平的上调而不断下调。同时，在C2C12成肌细胞中初步验证得到RASGRP1基因的超表达能够促进细胞的增殖功能，最终促进猪骨骼肌的发育。由此，可通过在胚胎水平超表达RASGRP1基因来促进骨骼肌的发育，进一步改进动物的肌肉含量，培育瘦肉型动物品系。
本发明的目的是提供一种调节骨骼肌发育的方法和应用，来促进骨骼肌的发育，进一步改进动物的肌肉含量，培育瘦肉型动物品系。
根据本发明的一个方面，提供了一种调节骨骼肌发育的方法，该方法包括在胚胎水平超表达RASGRP1基因来促进骨骼肌发育。
在某些实施方式中，该方法包括制备超表达RASGRP1基因的转基因动物来促进该动物骨骼肌发育。
在某些实施方式中，该方法包括向受精卵显微注射RASGRP1基因超表达载体，移植入***动物子宫，获得超表达RASGRP1基因动物来促进该动物骨骼肌发育。
在某些实施方式中，该方法包括向囊胚显微注射RASGRP1基因超表达载体，移植入***动物子宫，获得超表达RASGRP1基因动物来促进该动物骨骼肌发育。
在某些实施方式中，该方法包括将RASGRP1基因超表达载体与***共孵育后，进行人工授精获得超表达RASGRP1基因的动物来促进该动物骨骼肌发育。
在某些实施方式中，以上方法适用于猪。
在某些实施方式中，RASGRP1基因超表达载体核苷酸序列包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
根据本发明的另一个方面，提供了一种促进骨骼肌发育的方法在瘦肉型动物培育中的应用。
在某些实施方式中，促进骨骼肌发育的方法在瘦肉型动物培育中的应用是通过如下任一种方法来实现的：在胚胎水平超表达RASGRP1基因；制备超表达RASGRP1基因的转基因动物；向受精卵显微注射RASGRP1基因超表达载体，移植入***动物子宫，获得超表达RASGRP1基因动物；向囊胚显微注射RASGRP1基因超表达载体，移植入***动物子宫，获得超表达RASGRP1基因动物；将RASGRP1基因超表达载体与***共孵育后，进行人工授精获得超表达RASGRP1基因动物。
在某些实施方式中，该瘦肉型动物包括瘦肉型猪。
本发明的有益效果：
1、发现一个在猪骨骼肌发育过程中受H3K27me3修饰作用的一个关键靶基因RASGRP1，该基因的富集水平在猪骨骼肌肌纤维形成过程中在H3K27me3的修饰作用下先上调后下调，并能够促进猪骨骼肌卫星细胞的增殖功能进而促进猪骨骼肌的发育；
2、通过超表达RASGRP1基因，可促进猪骨骼肌的发育，从而为提高猪的瘦肉率提供了一种新的方法和靶点，以及研究的新方向；
3、超表达RASGRP1基因在促进骨骼肌发育上的应用，可为瘦肉型猪的选育提供新的思路和靶点。
4、在猪的胚胎时期通过超表达RASGRP1基因，通过多种不同的方法均能达到促进骨骼肌发育的效果，具有广泛的适用性。
附图说明
图1为胚胎骨骼肌H3K27me3的表达量：图1A表示H3K27me3修饰存在于不同时期的猪胚胎骨骼肌中，图1B表示猪骨骼肌中的H3K27me3修饰水平随着胚胎的发育而不断升高；
图2为RNA-seq与ChIP联合分析结果：其中图2A为ChIP-seq与RNA-seq中共有的差异表达基因，图2B为受H3K27me3修饰的富集水平下降但表达水平上调的基因，图2C为受H3K27me3修饰的富集水平上调但表达水平下降的基因；
图3为在H3K27me3修饰下不同时期的胚胎骨骼肌RASGRP1基因的募集水平；
图4为不同时期的胚胎骨骼肌中RASGRP1基因的相对表达量，其中以65日龄骨骼肌中的RASGRP1基因的平均Ct值为基准；
图5为超表达载体pcDNA3.1-RASGRP1双酶切鉴定结果：1号泳道为pcDNA3.1-RASGRP1重组质粒，2号泳道为pcDNA3.1-RASGRP1被BamHⅠ与EcoRⅠ限制性内切酶双酶切后片段，M为Marker KBLadder；
图6为超表达RASGRP1基因后促进C2C12成肌细胞增殖的效果图，标尺为100μm。
具体实施方式
下面结合附图对发明作进一步详细的说明。
实施例一 3个不同时期猪骨骼肌样本中H3K27me3表达水平检测
取杜洛克猪胚胎33天、65天及90天背最长肌样品共6个组织样品进行检测，具体实验过程如下：
(1)总蛋白的提取
①配制蛋白裂解液。
②用干净的剪刀、镊子剪取约0.1g组织样品，快速放进预冷过的匀浆器中，按1：10比例加入蛋白裂解液。
③冰上匀浆直至组织消化，将样品移至1.5mL离心管中。
④12,000×g 4℃离心10分钟，取上清至新的1.5mL离心管中。
(2)蛋白定量
根据BCA蛋白定量试剂盒进行定量，方法如下：
①取40μl蛋白标准(25mg/mL)，加入1960μlPBS稀释配制成0.5mg/mL蛋白标准。
②加入PBS将BSA标准品按照说明书进行稀释。
③将蛋白标准品按0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl加到96孔板的标准品孔中，加PBS补足到20μl，每一浓度做三个重复。
④加20μl待测的蛋白溶液(1：10稀释)到96孔板的样品孔中，做三个重复。
⑤每孔加入20μl BCA工作液，60℃放置60分钟(具体时间看颜色变化而定)。
⑥孵育完成后冷却至室温，在562nm处读取吸光度值，扣除空白对照组的吸光度值后计算各浓度蛋白标准的平均吸光度，绘制标准曲线，计算回归方程。
(3)Western blotting检测蛋白的表达
①将清洗干净的玻璃板与梳子组装固定好，根据实验检测指标分子量大小选择配制12％分离胶，配制的分离胶加入TEMED后立即摇匀、灌胶(留约1.5cm的高度做浓缩胶)。
②加入400μl超纯水使分离胶面平整成直线。
③约20分钟后可以看到水与胶之间出现一条明显的凝胶线，表明分离胶已充分凝固，将胶上层的水倒掉并用滤纸纸将玻片间的水吸干。
④配制5％浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀，将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子斜着***浓缩胶中，再抚平，避免产生气泡。
⑤等到浓缩胶凝固后，把做好的胶片连同玻板整体拿出并放入电泳槽中夹紧，取出梳子，加入足够的电泳缓冲液(内槽液面需高于胶)。
⑥用微量移液器吸取10μl样品缓慢加入样品孔中。
⑦电压调到80V进行浓缩胶电泳，30分钟左右当指示剂跑到分离胶后，电压调至90V，60分钟后至指示剂即将跑出即终止电泳。
⑧剪取与凝胶样品同样大小的PVDF膜和4张滤纸，膜在甲醇中浸5min，然后连同滤纸，海绵一起浸于转移缓冲液中。
⑨在靠负极端(黑色)依次叠放海绵、两层滤纸、胶、膜、两层滤纸、海绵，放于转移装置上；350mA转膜70min。
⑩将膜浸在封闭液中37℃封闭1～2h或4℃封闭过夜。
将膜取出直接放入一抗中，37℃孵育1h，TBST洗膜5次，每次5分钟。
结果如图1所示，肌肉组织中存在H3K27me3修饰，且H3K27me3修饰水平伴随着胚胎发育时间的增长而提高，胚胎90天骨骼肌组织的H3K27me3表达量高于胚胎65天骨骼肌组织，差异不显著；胚胎65天骨骼肌组织的H3K27me3表达量高于胚胎33天骨骼肌组织，差异不显著；胚胎90天骨骼肌组织的H3K27me3表达量高于胚胎33天骨骼肌组织，差异显著。
实施例二 ChIP-seq与RNA-seq联合分析及差异表达基因的筛选
1、ChIP-seq实验
(1)工作试剂的配制
ChIP-seq实验流程中所用到的工作试剂配制体系如下：
①Douncing Buffer(1mL):分别加入10μl Tris-HCl(pH＝7.5)、4μl MgCl2、2μlCaCl2、10μl PIC、974μl ddH2O；
②IP Buffer(1mL):分别加入10μl Tris-HCl(pH＝8.0)、10μl Triton X-100、10μl Deoxycholate(DOC)、10μl SDS、18μl NaCl、4μl EDTA、10μl PIC、928μl ddH2O；
③Hypotonic Lysis Buffer(1mL):分别加入0.4μl EDTA(pH＝8.0)、0.1μlBenzamidine、1μl PMSF、3μl DTT、10μl PIC、985.5μl ddH2O；
④ChiP Wash Buffer(1mL):分别加入20μl Tris-HCl(pH＝8.0)、10μl SDS、10μlTriton X-100、4μl EDTA、30μl NaCl、10μl PIC、916μl ddH2O；
⑤ChiP Final Wash Buffer(1mL):分别加入20μl Tris-HCl(pH＝8.0)、10μlSDS、10μl Triton X-100、4μl EDTA、100μl NaCl、10μl PIC、846μl ddH2O；
⑥Elution Buffer(1mL):分别加入100μl NaHCO3、100μl SDS、800μl ddH2O。
(2)磁珠的准备
①将蛋白A和蛋白G偶联的磁珠储存液上下颠倒几次，重悬蛋白琼脂糖磁珠，使混合均匀。
②从每管磁珠储存液中取出磁珠各60μl，将两种磁珠加入1.5mL的硅化离心管中，用剪去尖的1mL枪头上下吹打几次混匀。
③向离心管中加入1mL IP Buffer，上下颠倒几次来清洗磁珠。
④4,000rpm 4℃冷冻离心2min，使珠子初步沉淀成块。
⑤将离心管放到磁力架上持续15S直至磁珠全部沉淀，用200μl枪头将上清液吸出去除。
⑥重复步骤④⑤⑥一次。
⑦加入1mL IP Buffer，30μl的10mg/mL的单链鲑鱼***DNA,75μl的10mg/mL BSA到磁珠中。在4℃中旋转混匀封闭3h。4,000rpm 4℃冷冻离心2min，将离心管放到磁力架上持续15S直至磁珠全部沉淀，用200μl枪头将上清液吸出去除。
⑧重复步骤④⑤⑥一次。
⑨用300μl的IP Buffer重悬珠子，悬液储存在4℃直到需要。
(3)微球菌核酸酶消化
①在1.5mL离心管中加入配置好的Douncing Buffer，置于冰上预冷。
②称取20-30mg肌肉组织样品，用干净的剪刀、镊子将肌肉样品移至含有液氮的研钵中，用研磨棒将组织研磨成粉末状。
③用1mL蓝色枪头吹打混匀，然后使用规格为25 5/8gauge l的注射器吸取所有的试剂再全部打出，反复吸入和打出20次。
④加入50U/mL的微球菌核酸酶在37℃水浴锅中孵育7min。
⑤加入5μl 0.5M的EDTA，冰上孵育5min。
⑥加入1mL的Hypotonic Lysis Buffer后混匀，冰上孵育60min。
⑦3,000×g 4℃离心5min，上清液转移到1.5mL的离心管中。
(4)苯酚抽提检测DNA大小
①锁相离心管中加入上步获取的100μl上清液和100μl ddH2O，200μl的25：24:1的苯酚-氯仿-异戊醇。
②颠倒混匀数次，然后最大转速离心5min，转移上层液体到新的1.5mL管子里。
③加入500μl冰无水乙醇和20μl 3M NaOAc，震荡混匀，-20℃静置孵育30min。
④4℃最大转速离心20min，弃上清。
⑤70％酒精清洗，4℃最大转速离心5min，弃上清。
⑥将EP管盖打开在放在空气中风干，加入50μl ddH2O溶解。
⑦取5μl溶液在1.5％的胶检测酶切后的DNA大小。
(5)免疫沉淀
①取100μl封闭的磁珠悬液到微球菌核酸酶消化的部分溶液中，然后4℃旋转2h。
②4,000rpm 4℃冷冻离心2min，取上清液到1.5mL离心管中。
③将步骤②中上清液的10％分到1.5mL离心管中作为Input，冻存于-20℃。剩余上清液分到1.5mL离心管中作为IP管，每管0.2-0.25mL。Input用于计算被各种抗体钓取出来的DNA含量。
④加入IP Buffer至每个IP管的体积达到325μl。
⑤分别加入抗体H3K27me3和对照IgG后4℃旋转混匀1h，用封口膜封好管口。
⑥加入20μl磁珠悬液到每个IP管中，4℃旋转混匀过夜，封口膜封管口。
(6)清洗
①IP管4,000rpm 4℃冷冻离心2min，在磁力架上放置15s使磁珠充分沉淀，200μl的枪头去除上清液。
②加入400μl的ChIP Wash buffer后轻轻震荡10s，在4℃旋转封闭3min，然后4,000rpm 4℃冷冻离心2min，在磁力架上放置15s使磁珠充分沉淀，200μl的枪头去除上清液。
③同样的方法用ChIP Wash buffer再洗一次，然后用ChIP Final wash buffer再洗一次。
④取出Input，加入Elution buffer至体积达到200μl。
⑤IP管中加入100μl Elution buffer。
⑥Input和IP各加入0.5μl 10μlg/μl的RNase，68℃水浴孵育2h。
⑦IP管4000rpm 4℃冷冻离心2min，取上清至1.5mL离心管中。
⑧IP管再加100μl Elution buffer，68℃水浴孵育5min，4,000rpm 4℃冷冻离心2min，取上清至相同的1.5mL离心管中。
(7)试剂盒纯化DNA
采用OMEGA的DNA Clean-Up Kit试剂盒(型号：D6296)进行DNA纯化。具体操作参考说明书。
(8)选取染色质免疫共沉淀中获取的与H3K27me3抗体互作的富集量足够的DNA片段，将所选取的DNA片段送诺禾致源科技公司进行DNA测序。
2、RNA-seq实验
(1)组织RNA抽提
按照OMEGA的Total RNA Kit II试剂盒(型号：R6934-02)操作手册进行RNA抽提，具体操作如下：
①称取20-30mg动物组织样品至含有液氮的研钵中，用研磨棒将组织研磨成粉末状。
②在1.5mL离心管中加入lmL RNA-Solv Reagent和20μl 2-巯基乙醇，将①中粉末转移至离心管中，室温静置5分钟。
③向离心管中分别加入200μl三氯甲烷，涡旋20秒，室温静置2-3分钟。
④12,000×g 4℃离心15min。
⑤转移上清液至新的1.5mL离心管，加入等体积的70％乙醇，涡旋使之充分混匀。
⑥将RNA收集柱套入2mL收集管中，转移700μl步骤⑤混合液至RNA收集柱中。10,000×g室温离心30s，弃去滤液。
⑦重复步骤⑥直至所有的混合液全部通过收集柱过滤。
⑧把RNA收集柱套回收集管中，加入500μl RNA Wash BufferI至收集柱中。10,000×g室温离心1分钟，弃去滤液和收集管。
⑨把
⑩把
(2)RNA反转录合成cDNA
采用TaKaRa的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect RealTime)试剂盒的使用说明使RNA反转录合成cDNA。
(3)将RNA样品送至诺禾致源科技公司测序。
3、ChIP-seq与RNA-seq的数据处理
(1)RNA-seq数据处理
①为了保证数据分析的质量与可靠性，首先对测序获得的原始数据进行过滤。过滤内容为：去除带接头(adapter)的reads、去除含N(N表示无法确定碱基信息)的reads、去除低质量reads(质量值Qphred≤20的碱基数占整个read长度的50％以上的reads)。随后分别进行测序错误率检查、GC含量分布检查，获得后续分析使用的clean reads。在HISAT软件上将预处理后的clean reads进行猪基因组定位分析。
②进行差异分析，基因差异表达分析主要分为三部分：
a.首先对read数据进行标准化；
b.然后根据模型计算假设检验概率(P-value)；
c.最后进行多重假设检验校正，得到FDR值(错误发现率)。
③为了研究差异基因与哪些生物学功能或通路显著性相关，使用clusterProfiler软件对差异基因集进行GO功能富集分析，KEGG通路富集分析。
(2)ChIP-seq数据处理
①数据质量控制
通过Illumina测序平台产生的原始数据(raw reads)进行进行质量控制，使用FastQC v0.11.5软件对原始数据的质量进行初步统计。为了保证数据质量，同时更高效地利用测序数据以方便后续的分析，使用Skewer v0.1.126软件对原始数据进行过滤，数据过滤步骤具体如下：
a.截去低质量reads:平均质量值低于20的reads截去；
b.截去碱基为N的占整个reads所有碱基个数的比例超过15％的reads；
c.去除带接头(adapter)的reads；
d.舍弃修剪后短于18nt的reads。
②序列比对
对于过滤后数据(clean reads)，使用BWA v0.7.12软件将clean data与猪基因组进行比对，将比对结果形成bam文件，通过IGV(Integrative Genomics Viewer)浏览器对bam文件进行可视化分析。
③片段大小预测
Clean reads在其特异性结合位点处会有显著富集，利用MACS2软件预测IP样品的片段大小，统计clean reads的富集程度。
④链互相关系数(Strand Cross Correlation，SCC)分析
测序所得clean reads会近似平均地分配到正负链上，通过对IP和Input数据的链互相关性检测不仅可以获得正负链间相关系数，同时也可以反映染色质免疫共沉淀效果。
⑤峰值分析与注释
利用MACS2软件完成峰检分析(peak calling)，设置阈值为P-value≤0.005，并对峰的个数、宽度、分布等进行统计,筛选出峰的相关基因等。利用PeakAnnotator软件确认峰相关基因，随后利用GOseq软件进行GO功能富集分析，以及利用KOBAS软件进行KEGG通路富集分析。
RNA-seq与ChIP联合分析结果如图2所示。根据以上结果分析H3K27me3富集水平随着胚胎发育时期增长而降低且基因表达量随着胚胎发育时期增长而提高的基因，并从中筛选胚胎90天与胚胎65天、胚胎90天与胚胎33天、胚胎65天与胚胎33天之间表达差异倍数均大于2的基因，最终筛选出可能对骨骼肌生长发育起关键调控作用的RASGRP1基因，其表达趋势与通路预测结果如表1所示。
表1 RASGRP1基因的表达趋势与通路预测
实施例三 差异表达基因RASGRP1的ChIP-qPCR验证
使用引物设计软件Oligo 7.56设计猪基因的定量PCR引物如表2所示。将染色质免疫共沉淀过程中获取的与抗体孵育的IP样品稀释到同一浓度，并将9个样本的Input分别稀释到10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL，不同浓度的Input用于绘制标准曲线，将所有样品按表3配制扩增体系。使用illumina的EcoTM Real-time PCR仪进行绝对定量PCR，每个IP样品和不同浓度的Input进行3个生物学重复，反应条件为：95℃，5min；95℃，10s，60℃，15s，72℃，20s，40-50个循环；95℃，15s；60℃，15s；95℃，15s。
表2 ChIP-qPCR引物
表3 ChIP-qPCR反应体系
结果如图3所示，ChIP-qPCR结果表明，在组蛋白H3K27me3修饰条件下，RASGRP1在胚胎65天的富集量比胚胎33天低55.1％，差异显著(p≤0.05)，RASGRP1在胚胎90天的富集量比胚胎33天低91.4％，差异极显著(p≤0.01)，RASGRP1在胚胎90天的富集量比胚胎65天低81.2％，差异显著(p≤0.05)；。
实施例四 差异表达基因RASGRP1的RT-PCR验证
1、在NCBI(National Center for Biotechnology Information)网站上设计基因及内参基因β-actin的定量PCR引物如表4所示。将反转录所得cDNA稀释到相同浓度，按表5配制扩增体系，每个样品3个生物学重复，随后使用illumina的EcoTM Real-time PCR仪进行实时定量荧光PCR，反应条件为：95℃，5min；95℃，10s，60℃，15s，72℃，20s，40-50个循环；95℃，15s；60℃，15s；95℃，15s。
表4 RT-qPCR引物
表5 RT-qPCR反应体系
2、以β-actin作为内参，通过real-time PCR检测不同时期(胚胎33天、胚胎65天、胚胎90天)猪骨骼肌中RASGRP1基因的相对表达量，以所测得的胚胎65天中RASGRP1基因平均Ct值为基准，按2-△△Ct方法计算基因的相对表达量并将结果绘制成图。
如图4所示，RT-qPCR结果表明，RASGRP1基因表达量在胚胎65天比在胚胎33天高155.4％，差异极显著(p≤0.01)，RASGRP1基因表达量在胚胎90天比在胚胎33天高430.4％，差异极显著(p≤0.01)，RASGRP1基因表达量在胚胎90天比在胚胎65天高107.7％，差异极显著(p≤0.01)。
实施例五 猪RASGRP1基因的克隆
利用OMEGA公司的Total RNA kitⅡ试剂盒从杜洛克猪背最长肌组织中提取总RNA，TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录(具体操作方法参照试剂盒说明书)获得猪RASGRP1基因的cDNA。
(1)引物设计
在美国国立生物研究所网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上查找猪RASGRP1基因(Gene ID：100522721)的CDS区域序列，利用TaKaRa公司的In-Fusion Cloning引物设计工具设计同源重组引物(引物序列如表6所示)。
表6 猪RASGRP1基因CDS的扩增引物
注：F代表上游引物，R代表下游引物，下划线部分为同源重组酶连接位点。
(2)PCR扩增反应
用质量检测合格的cDNA作为模板，并用高保真酶特异性扩增猪RASGRP1基因的CDS，具体PCR反应体系如表7所示；反应条件为：95℃，4min；95℃，30s，58℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，5min；4℃，10min。
表7 PCR反应体系
PCR扩增产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后利用Omega公司的Gel Exteactionkit试剂盒纯化回收，并置于-20℃冰箱存放备用。
实施例六超表达载体pcDNA3.1-RASGRP1的构建
(1)用BamHⅠ与EcoRⅠ对pcDNA3.1(+)真核表达载体进行双酶切，具体反应体系如表8；
表8 pcDNA3.1(+)双酶切反应体系
37℃酶切2h，随后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果并回收目的片段。
(2)将回收的片段(包括目的片段和酶切后的pcDNA3.1(+)载体)按照表9的反应体系配制，于50℃反应15min(此步骤过程按照Takara In-Fusion HD Cloning kits试剂盒操作)；
表9 In-Fusion Cloning反应体系
(3)重组连接产物转化采用北京全式金生物公司的Trans5α感受态细胞进行转化，其具体操作步骤如下：
①取50μL冰浴上融化的感受态细胞，加入目的DNA，轻轻混匀，在冰浴中放置30min；
②42℃水浴中热激45s，然后快速将其转移至冰浴中2min，该过程不要摇动离心管；
③向离心管中加入500μL无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm摇床中复苏1h；
④根据实验要求，吸取适量体积已转化的感受态细胞加到含氨苄抗性的LB琼脂培养基上，将细胞均匀涂开；
⑤将平板置于37℃培养箱中正放培养30min，倒置平板，过夜培养。随后在超净工作台中用灭菌枪头从抗性平板中挑取单克隆菌落到500μL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床扩大培养4-6h，取培养后的菌液1μL为模板，以特异性引物(见表6)进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，确定阳性克隆后测序。利用NCBI网站中的BLASTn比对测序结果，鉴定序列是否正确。参照OMGEA公司的Endo-free Plasmid Mini KitⅡ试剂盒的说明书提取去内毒素质粒，利用BamHⅠ与EcoRⅠ双酶切鉴定抽提的质粒，酶切体系如表10所示，酶切结果见图6，超表达载体pcDNA3.1-RASGRP1构建完成(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)，置于-20℃冰箱备用。
表10 克隆载体双酶切
实施例七 猪RASGRP1基因超表达载体pcDNA3.1-RASGRP1在C2C12成肌细胞增殖中的作用
(1)重组质粒的细胞转染
①转染前一天，将形态良好、生长旺盛的C2C12细胞接种至细胞培养皿中，于37℃、5％CO2的培养箱中培养，待细胞的密度达到60-70％时进行转染；
②用Opti-DEMETM培养基稀释LipofectamineTM 3000试剂并充分混匀，室温静置5min；
③用Opti-DEMETM培养基稀释重组质粒制备预混液，然后添加P3000TM试剂并充分混匀，室温静置5min；
④将②③中液体1：1混匀，室温孵育15min；
⑤将④中混合液体加入至细胞培养孔中，轻轻摇匀，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养；
⑥培养4-6h后，吸弃转染混合液，加入完全培养基继续培养。
(2)EdU细胞增殖检测
实验前，将C2C12细胞以每孔5×103的数量接种于96孔板中于37℃、5％CO2的培养箱中培养24h后，转染重组质粒，转染24h后利用广州锐博生物公司的EdU试剂盒进行细胞增殖成像检测，其具体操作步骤如下：
①用细胞完全培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μM EdU培养基；
②每孔加入100μL 50μM EdU培养基于37℃、5％CO2的培养箱中孵育2h，弃培养基；
③DPBS清洗细胞1-2次，每次5min；
④每孔加入50μL 4％多聚甲醛固定液室温孵育30min，弃固定液；
⑤每孔加入50μL 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5min，弃甘氨酸溶液；
⑥每孔加入100μLDPBS，脱色摇床清洗5min，弃DPBS；
⑦每孔加入100μL渗透剂(含0.5％TritonX-100的DPBS)脱色摇床孵育10min，DPBS清洗5min；
⑧每孔加入100μL的1×Apollo染色反应液，避光室温脱色摇床孵育30min，弃染色反应液；
⑨加入100μL渗透剂脱色摇床清洗2-3次，每次10min，弃渗透剂；
⑩用ddH2O按100：1的比例稀释试剂F，制备适量1×Hoechst33342反应液，避光保存；
结果如图6所示，转染pcDNA3.1-RASGRP1组细胞EdU阳性率高于对照组，说明上调RASGRP1基因的表达促进了C2C12成肌细胞的增殖。
实施例八 超表达RASGRP1基因促进骨骼肌的发育
1)通过制备超表达RASGRP1基因的转基因猪，来促进猪骨骼肌发育和产量
将超表达载体pcDNA3.1-RASGRP1转染猪成纤维细胞，并筛选超表达RASGRP1基因的阳性细胞系，将该阳性细胞系作为核移植的供体细胞进行体细胞克隆。
取上述转基因克隆胚胎33天、65天及90天背最长肌，与同日龄非转基因克隆胚胎进行比对，发现转基因克隆胚胎的RASGRP1基因表达显著增加，同时转基因克隆胚胎的成熟肌纤维数量显著增加。
同时，获得的超表达RASGRP1基因的转基因猪出生后，待出栏时，与同日龄非转基因猪相比，骨骼肌发育更好，肌肉量更高。
由此，超表达RASGRP1基因，可以提高猪骨骼肌发育，提高猪的肌肉含量，有利于培养瘦肉型猪品系，并可通过选育改善猪肉品质。
2)通过向受精卵/囊胚显微注射超表达载体pcDNA3.1-RASGRP1，来提高猪骨骼肌发育和产量
将猪体外受精的受精卵受精卵/囊胚进行显微注射10pL浓度为20nM pcDNA3.1-RASGRP1，然后将处理后的胚胎移植入***母猪子宫。
取上述经处理的胚胎33天、65天及90天背最长肌，与同日龄未经处理胚胎进行比对，发现经处理的受精卵/囊胚发育成的胚胎的RASGRP1基因表达显著增加，同时经处理的受精卵/囊胚发育成的胚胎的成熟肌纤维数量显著增加。
同时，经上述处理的受精卵/囊胚移植至***母猪子宫至小猪出生后，出栏时与未经处理的猪相比，骨骼肌发育更好，肌肉量更高。
由此，超表达RASGRP1基因，可以提高猪骨骼肌发育，提高猪的肌肉含量，有利于培养瘦肉型猪品系，并可通过选育改善猪肉品质。
3)用超表达载体pcDNA3.1-RASGRP1处理猪***，来提高猪骨骼肌发育和产量。
将20nM超表达载体pcDNA3.1-RASGRP1加入***中孵育半小时，并将处理后的***进行猪的体外受精。
取经上述处理的胚胎33天、65天及90天背最长肌，与同日龄未经处理胚胎进行比对，发现经处理胚胎的RASGRP1基因表达显著增加，同时经处理胚胎的成熟肌纤维数量显著增加。
同时，经上述处理的小猪出生后，出栏时与未经处理的猪相比，骨骼肌发育更好，肌肉量更高。
由此，通过超表达载体pcDNA3.1-RASGRP1处理***，来促进胚胎中RASGRP1基因表达，可以提高猪骨骼肌发育，提高猪的肌肉含量，有利于培养瘦肉型猪品系，并可通过选育改善猪肉品质。
在其他实施例中，超表达RASGRP1基因来提高骨骼肌发育和产量的动物包括但不限于猪，还可以为牛、羊、鼠等其他动物。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 调节骨骼肌发育的方法和应用
<130> 20200727
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7805
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 1
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccatgggc accctgggaa agacaaggga 960
ggccccaaga aagccaagcc acggctccag ggctgctcct aagaccagac tggaggctaa 1020
gccagctagc tccccatgcc cttctcaccc tagcctggct cagatcacac agtttaggat 1080
gatggtgtcc ctgggacacc tggctaaggg agcttctctg gacgatctga tcgatagctg 1140
cgtgcagtcc ttcgacgccg atggaaacct gtgcaggagc aaccagctgc tgcaggtcat 1200
gctgaccatg cacagaatcc tgatctctag cgccgagctg ctgcagaaag tgatcaccct 1260
gtacaaggat gccctggcta agaactcccc aggcctgtgc ctgaagatct gttactttgt 1320
gcggtactgg atcaccgagt tttggatcat gttcaagatg gacaccagcc tggcccacac 1380
aatggaggag ttccaggagc tggtgaaggc taacggagag gagctgcact cccgcctgat 1440
cgataccaca cagatcaact ctagggactg gagcaggaag ctgacccagc ggatcaagtc 1500
caacacatct aagaagcgca aggtgagcct gctgtttgat cacctggagc cagaggagct 1560
gtctgagcac ctgacctacc tggagtttaa gagcttcagg agaatcagct tctccgacta 1620
ccagaactac ctggtgaact cctgcgtgaa ggagaacccc accatggaga gatctatcgc 1680
cctgtgcaac ggcatcagcc agtgggtgca gctgatggtg ctgtctaggc caacaccaca 1740
gctgagggct gaggtgttta tcaagttcat ccaggtggct cagaagctgc accagctgca 1800
gaactttaac accctgatgg ctgtgatcgg cggactgtgc cactcctcta tcagcaggct 1860
gaaggagacc agctcccacg tgccacacga gatcaacaag gtgctgggcg agatgacaga 1920
gctgctgtct agctgcagaa actacgacaa ctaccggcgc gcctacggcg agtgtacaca 1980
cttcaagatc cccatcctgg gagtgcacct gaaggatctg atctccctgt acgaggccat 2040
gcctgactac ctggaggagg gaaaggtgaa cgtgcacaag ctgctggctc tgtacaacca 2100
catcaacgag ctggtgcagc tgcaggaggt ggctccacct ctggaggcta acaaggatct 2160
ggtgcacctg ctgaccctga gcctggatct gtactacaca gaggacgaga tctacgagct 2220
gtcctacgct agggagccaa ggaaccacaa ggctccacca ctgaccccaa gcaagcctcc 2280
agtggtggtg gattgggcta gcggcgtgtc ccctaagcca gaccccaaga caatcagcaa 2340
gcacgtgcag cggatggtgg actccgtgtt taagaactac gaccacgatc aggacggcta 2400
catctcccag gaggagttcg agaagatcgc cgcttccttc cccttttctt tctgcgtgat 2460
ggataaggac agggagggac tgatctctag agatgagatc accgcctact tcatgcgcgc 2520
ttcctctatc tacagcaagc tgggcctggg atttcctcac aacttccagg agaccacata 2580
cctgaagcca acattttgcg acaactgtgc cggcttcctg tggggagtga tcaagcaggg 2640
ctaccggtgc aaggattgtg gaatgaactg ccacaagcag tgtaaggacc tggtggtgtt 2700
cgagtgcaag aagcgcgcca agaactccac cgctcctaca gagaactcta ccagcgtggg 2760
ccctacacca aacctgtgct ctctgggagc caaggatctg ctgcacgctc ctgaggaggg 2820
ccccttcacc ttccccaacg gagaggccgt ggagcactct gaggagagca aggacaggac 2880
aatcatgctg atgggcgtga gctcccagaa gatctctgtg aggctgaaga gaaccgtggc 2940
ccacaaggct acccagacag agtccctgtc ttggctgtct agcgagggcc ccagcggaca 3000
ctttgtgctg tcctctccta gaaagaccgc ccaggacaca ctgtacgtgc tgccctcccc 3060
tacatctcca tgcccctccc ctgtgctggt gaggaagaga gctttcgtga agtgggagaa 3120
caaggagagc ctgatcaagt ccaaggagga gctgaggcac ctgaggctgc caacctacca 3180
ggagctggag caggagatca acacactgaa ggccgataac aacgctctga agatccagct 3240
gaagtacgcc cagaagaaga tcgagaccct gcagctggct cggtccaacc acgtgctggc 3300
tcagatggag cacggcgact gttcttgaga attctgcaga tatccagcac agtggcggcc 3360
gctcgagtct agagggcccg tttaaacccg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg 3420
ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc 3480
cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc 3540
tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag 3600
gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc 3660
tagggggtat ccccacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac 3720
gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc 3780
ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt 3840
agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg 3900
ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac 3960
gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta 4020
ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat 4080
ttaacaaaaa tttaacgcga attaattctg tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag 4140
tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc 4200
aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 4260
tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt 4320
tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc 4380
gcctctgcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt 4440
tgcaaaaagc tcccgggagc ttgtatatcc attttcggat ctgatcaaga gacaggatga 4500
ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg 4560
gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg 4620
ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc 4680
ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct 4740
tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa 4800
gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg 4860
gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa 4920
gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat 4980
gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg 5040
cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc 5100
atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac 5160
cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg 5220
gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc 5280
tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag 5340
cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg 5400
gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc 5460
tggagttctt cgcccacccc aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca 5520
atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt 5580
ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg 5640
cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca 5700
acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca 5760
cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 5820
attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt 5880
cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 5940
caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 6000
caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 6060
ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 6120
cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 6180
ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 6240
tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 6300
gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 6360
ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 6420
ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 6480
gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 6540
aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ttttttgttt 6600
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 6660
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 6720
caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 6780
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 6840
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 6900
cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 6960
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 7020
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 7080
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 7140
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 7200
catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 7260
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 7320
ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 7380
gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 7440
cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 7500
tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 7560
gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 7620
atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 7680
ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 7740
gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 7800
acgtc 7805
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