阅读说明：本技术 一种对绿光敏感的光敏蛋白质粒的设计方法 (Design method of photosensitive protein plasmid sensitive to green light ) 是由 郑斌 郭明明 明东 甘霖 刘爽 于 2020-05-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种对绿光敏感的光敏蛋白质粒的设计方法,主要步骤包括:制备上转换纳米颗粒；寻找合适的NpHR基因序列,合成NpHR,构建质粒；检测重组质粒的表达情况,检测NpHR；用AAV包装将连接好的质粒,检测包装情况；用膜片钳检测细胞膜两侧的电位变化。以往的神经疾病的治疗效果差,并需要电极的植入,危险性高。本发明设计了一种可在脑内表达的光敏蛋白,与上转换纳米颗粒同注射进入脑内,在近红外照射下,上转换纳米颗粒可发出绿光,绿光可激发光敏蛋白通道打开,使阴离子内流,从而抑制神经元的兴奋。(The invention discloses a design method of photosensitive protein plasmid sensitive to green light, which mainly comprises the steps of preparing up-conversion nano particles; searching a proper NpHR gene sequence, synthesizing NpHR, and constructing a plasmid; detecting the expression condition of the recombinant plasmid, and detecting NpHR; packaging the connected plasmids by AAV, and detecting the packaging condition; the potential change on both sides of the cell membrane was detected with patch clamp. The conventional treatment of neurological diseases is poor in effect, requires implantation of an electrode, and is highly dangerous. The invention designs photosensitive protein capable of being expressed in brain, the photosensitive protein and the up-conversion nano particles are injected into the brain together, under the irradiation of near infrared rays, the up-conversion nano particles can emit green light, the green light can excite the photosensitive protein channel to be opened, so that anions can flow in, and the excitation of neurons is inhibited.)

一种对绿光敏感的光敏蛋白质粒的设计方法

技术领域

本发明属于生物医学材料领域，拟设计对绿光敏感的光敏蛋白质粒的设计方法，在绿光的照射下可以特异性的表达在细胞膜上，并可以打开细胞膜上的离子通道。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见的神经系统变性疾病，老年人多见，平均发病年龄为60岁左右，40岁以下起病的青年帕金森病较少见。我国65岁以上人群PD的患病率大约是1.7％。大部分帕金森病患者为散发病例，仅有不到10％的患者有家族史。帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体DA含量显著性减少而致病。

光遗传通常是指结合光学与遗传学手段，精确控制特定神经元活动的技术。利用分子生物学、病毒生物学等手段，将外源光敏感蛋白基因导入活细胞中，在细胞膜结构上表达了光敏感通道蛋白；然后通过特定波长光的照射，控制细胞膜结构上的光敏感通道蛋白的激活与关闭；光敏感蛋白的激活和关闭可控制细胞膜上离子通道的打开与关闭，进而改变细胞膜电压的变化，如膜的去极化与超极化。当膜电压去极化超过一定阈值时就会诱发神经元产生可传导的电信号，即神经元的激活；相反，当膜电压超极化到一定水平时，就会抑制神经元动作电位的产生，即神经元的抑制。神经元生物学家经常运用这种技术，通过光学方法无损伤或低损伤地控制特异神经元的活动，来研究该神经网络功能，特别适用于在体、甚至清醒动物行为学实验。

当前光遗传的方法需要往脑袋里植入电极，此方法危险性高且对技术的要求较高，因此，利用上转换材料可以避免这个难题。上转换材料在近红外照射下可以发出绿色光，设计的质粒在绿色光存在的情况下会表达在细胞膜上并使离子通道打开。

设计出该方法有以下几大优点：1)避免了往大脑里植入电极这个危险的方式；2)可以人为地控制细胞膜上离子通道的打开情况；3)为帕金森疾病提供了新的思路。

本发明利用上转换纳米材料及光敏蛋白NpHR实现可控的细胞膜离子流动，在上转换纳米材料发出的绿光的帮助下，NpHR可使氯离子内流，降低神经元的兴奋，可控的使离子内流。

本发明的技术方案是一种对绿光敏感的光敏蛋白质粒的设计方法，包括以下步骤：

1)制备上转换纳米颗粒；

2)寻找合适的NpHR基因序列，合成NpHR，构建质粒hSyn-eNpHR-eYFP；

3)检测重组质粒的表达情况，检测NpHR；

4)用AAV包装将连接好的质粒，检测包装情况；

5)用膜片钳检测细胞膜两侧的电位变化。

所述步骤3)构建质粒hSyn-eNpHR-eYFP。

所述步骤3)构建质粒mCaMKⅡa-eNpHR-eYFP。

所述步骤3)构建质粒hSyn-eNpHR-mCherry。

本发明NpHR基因序列：

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本发明的优势在于：1)避免了往大脑里植入电极这个危险的方式；2)可以人为地控制细胞膜上离子通道的打开情况；3)为帕金森疾病提供了新的思路。

以下结合实施例来对本发明作进一步的说明。

实施例1：

上转换纳米颗粒的制备和质粒的设计以及AAV包装质粒。包括以下步骤：

1)制备上转换纳米颗粒。

2)寻找合适的NpHR基因序列，合成NpHR，构建质粒hSyn-eNpHR-eYFP。

3)检测重组质粒的表达情况，检测NpHR。

4)用AAV包装将连接好的质粒，检测包装情况。

5)用膜片钳检测细胞膜两侧的电位变化。

实施例2：

本发明的技术方案是上转换纳米颗粒的制备和质粒的设计以及AAV包装质粒，以及对帕金森的治疗效果检测。包括以下步骤：

1)制备上转换纳米颗粒。

2)寻找合适的NpHR基因序列，合成NpHR，构建质粒mCaMKⅡa-eNpHR-eYFP。

3)检测重组质粒的表达情况，检测NpHR。

4)用AAV包装将连接好的质粒，检测包装情况。

5)用膜片钳检测细胞膜两侧的电位变化。

实施例3：

本发明的技术方案是上转换纳米颗粒的制备和质粒的设计以及AAV包装质粒，以及对帕金森的治疗效果检测。包括以下步骤：

1)制备上转换纳米颗粒。

2)寻找合适的NpHR基因序列，合成NpHR，构建质粒hSyn-eNpHR-mCherry。

3)检测重组质粒的表达情况，检测NpHR。

4)用AAV包装将连接好的质粒，检测包装情况。

5)用膜片钳检测细胞膜两侧的电位变化。

NpHR基因序列：

Atcatcagccggggtcccagaagcagatggaacatccaaaatgctgccggacacgacagattcgtttgacgtcagatagt tcaggagcaagaatgcgaaaatgtactttgccacgatatccaggaaagaatatccccagctcgtcaccccaacgggcaac accgcgataccctcgactccaagagcccacacaattggataccccagccacatcactactgtcaacagcttcagggtatt gaacatgtcagcggttcccgcggctttggcgtcctgtgcccactccaccagcaggatatacaagaccaccagaaagcatg cacaactgatagcgtaccagaaccatctcatgaggtgggaggaggtagtcagggccgcggcaaggccagtcacgcacata gcgatatcgaaagtgatagctgtgaagagctttgtagcattgcttccggccaggagacccagagcgaggagaatcatggg cgtggaaagtgcccaggtgagataccgtccccacatggtgactacaccatctacctcttctcctcccagcatcactgagc tgccttctgcaaaatggcccgctggcatttcaagaacggaaattgtcaggccgctcgccaatccagtgtaggaggcaatg ctgacgacaggcacaaggatggttgacacagcaataagttttgcccgtggatcatcgagtcctcgggtcataaaaacgaa cagcagtatactcagtcctgcaagtgcgatgttgatatagagactgcttgcaagcaaagggtcgttcagcacgaactcga acaactccctttgggtaacctcggcttgaagggccacggcactct。

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种对绿光敏感的光敏蛋白质粒的设计方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 845

<212> DNA

<213> 嗜盐碱红菌(Halobacterium halobium)

<400> 1

atcatcagcc ggggtcccag aagcagatgg aacatccaaa atgctgccgg acacgacaga 60

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gtcgttcagc acgaactcga acaactccct ttgggtaacc tcggcttgaa gggccacggc 840

actct 845