一种利用核黄素废液发酵生产赤霉素a3的方法
阅读说明：本技术 一种利用核黄素废液发酵生产赤霉素a3的方法 (Method for producing gibberellin A by fermentation of riboflavin waste liquid3Method (2) ) 是由 陆建卫 祝金山 吴烨飞 沈波 陆春锋 冯佩杰 江红杰 俞海燕 于 2020-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用核黄素废液发酵生产赤霉素A<Sub>3</Sub>的方法,属于微生物发酵技术领域,其技术方案要点是发酵培养,将种子液接种至由处理后的核黄素废液和必需营养物质配制成的发酵培养基中发酵,利用核黄素废液发酵生产赤霉素A<Sub>3</Sub>,既解决核黄素生产过程中的废液处理问题,同时也达到降低赤霉素A<Sub>3</Sub>的生产成本的效果。(The invention discloses a method for producing gibberellin A by fermentation of riboflavin waste liquid 3 The method belongs to the technical field of microbial fermentation, and the key point of the technical scheme is fermentation culture, the seed liquid is inoculated into a fermentation culture medium prepared by treated riboflavin waste liquid and essential nutrient substances for fermentation, and the gibberellin A is produced by utilizing the fermentation of the riboflavin waste liquid 3 Not only solves the problem of waste liquid treatment in the production process of riboflavin, but also achieves the aim of reducing gibberellin A 3 The production cost of (a).)
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种利用核黄素废液发酵生产赤霉素A3的方法。
背景技术
赤霉素A3是一种内源性植物调节物质，对于调控植物的茎秆延长、种子萌发、抽苔座果等有显著作用，广泛应用于经济作物的种植生产领域。工业上赤霉素A3常用藤仓赤霉菌液体发酵生产，其发酵培养基主要由玉米淀粉，花生饼粉等有机氮碳源组成，生产成本高。如何优化培养基，降低生产成本是所有赤霉素A3生产企业必须面对的问题。
核黄素又名维生素B2，是一种人和动物必需的水溶性维生素，对抑制消化道病变，神经系统疾病（如帕金森症，偏头痛，多发性硬化等）有显著作用，在临床治疗、饲料工业、化妆品工业及食品工业等领域被广泛应用。核黄素主要是通过微生物发酵法进行生产，在提取阶段会产生大量的废液，随着环保要求的日益提高，废液如何处理才能达到排放要求，是核黄素生产企业面临的一个急需解决的问题。由于核黄素废液中含有部分发酵时未利用完的碳氮源、无机盐以及残留菌丝体，导致核黄素废液粘度高，处理难度大，导致核黄素的生产成本高。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种利用核黄素废液发酵生产赤霉素A3的方法，利用核黄素废液发酵生产赤霉素A3，既解决核黄素生产过程中的废液处理问题，同时也达到降低赤霉素A3的生产成本的效果。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种利用核黄素废液发酵生产赤霉素A3的方法，所述方法包括以下制备步骤：发酵培养，将种子液接种至由处理后的核黄素废液和必需营养物质配制成的发酵培养基中发酵。
本发明进一步设置为，所述核黄素废液的处理方法如下，将核黄素废液置于发酵罐中，在温度为70±5℃的条件下保温30-60min灭活菌丝体，再在5000-8000rpm的条件下离心10-30min得到含菌丝体的轻相，取所得轻相经pH调节剂调整pH至5.5-6.5，得到处理后的核黄素废液。
通过采用上述技术方案，利用处理后的核黄素废液作为赤霉素A3的发酵培养液，不仅有助于降低核黄素废液的处理成本，同时也能充分利用核黄素废液中的有机氮源和碳源，减少了发酵培养基中其他营养物质的量，从而有效降低赤霉素A3的生产成本，同时本申请实验证明，本申请利用核黄素废液作为发酵培养基的成分时，其最后得到的赤霉素A3的产率高于正常发酵生产赤霉素A3的产率。
此外，将核黄素废液先进行处理后，在发酵的过程中无需在增加调节发酵培养基pH的步骤，从而能够保证发酵培养基中其他成分加入时能够在自然pH的条件下进行赤霉素发酵，给操作带来便捷。
本发明进一步设置为，所述pH调节剂为20-30%的氢氧化钠溶液。
通过采用上述技术方案，本申请pH调节剂采用氢氧化钠溶液后，既能够达到对核黄素废液的处理，同时也不会影响核黄素废液中的氮含量，从而为后期发酵提供保障。
本发明进一步设置为，所述核黄素废液为发酵生产核黄素过程中提取阶段产生的废液。
本发明进一步设置为，所述发酵培养前包括种子培养，种子培养分两级培养：
一级种子培养：取藤仓赤霉菌突变株至装有种子培养液的摇瓶中，在250rmp、30±1℃的条件下培养40-60h，得到一级种子液；本申请的藤仓赤霉菌突变株（Fusarium fujikuroi GA-347）购买自中国典型培养物保藏中心，其中，藤仓赤霉菌突变株（Fusarium fujikuroi GA-347）保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC NO：M2019378，保藏日期2019年5月20日；
二级种子培养：将一级种子液以0.5-1.0%的体积比例接种至二级种子罐，在温度为30±1℃、溶氧20-70%、自然pH的条件下，培养40-60h，得到二级种子液。
本发明进一步设置为，所述发酵培养中，将二级种子液以5-10%的体积比例接种于发酵培养基中，在30±1℃、溶氧20-60%、自然pH的条件下，培养7-8天，得到发酵液。
本发明进一步设置为，所述两级培养的培养液均包括如下组成：玉米淀粉20-30g/L、蔗糖5-10g/L、花生粉20-30g/L、KH2PO4 1-2g/L、MgSO4 1-2g/L。
本发明进一步设置为，所述发酵培养基包括核黄素废液400-600g/L、淀粉50-120g/L、花生粉5-10g/L、KH2PO4 0.2-0.5g/L、K2SO4 0.2-0.5g/L、MgSO4 0.1-0.2g/L。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、本申请利用核黄素废液作为生产赤霉素A3发酵培养基的主要成分，不仅降低了核黄素废液的排放量，节约污水处理所消耗的能源，降低核黄素的生产成本，同时利用核黄素废液发酵生产赤霉素A3后，也有效降低了赤霉素A3的生产成本；
2、由于核黄素废液中含有的残糖能够满足单菌落前期生长过程中对碳源的需求量，从而免去赤霉素A3发酵培养基淀粉及米粉的水解步骤，简化了赤霉素A3的生产工艺，节省了成本；
3、本申请中赤霉素A3的产率最高为2458mg/L，而现有生产中赤霉素A3的产率为2123mg/L。
附图说明
图1是标样的高效液相色谱图；
图2是本发明实施例1的高效液相色谱图；
图3是对照例的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
本申请使用的核黄素废液是工业生产得到的核黄素废液，其中核黄素废液为核黄素生产终止时残碳的含量为1%左右得到的核黄素废液。
标样稀释50倍后的浓度为65μg/mL。
标样色谱图如图1所示，赤霉素A3的积分结果如表1所示。
表1标养赤霉素积分结果表
峰#
保留时间
面积
高度
面积%
理论塔板#
1
6.033
1395930
126308
100.000
7017.251
总计
——
1395930
126308
100.000
——
对照例的产率计算公式为：对照例产率=（对照品峰面积/标样品峰面积）×标样品稀释后浓度×稀释倍数。
由于峰面积比与产率的比值呈正比，因此：实施例1的产率计算公式为：实施例产率=（实施例样品峰面积/对照品峰面积）×对照例产率。
实施例1
一种利用核黄素废液发酵生产赤霉素A3的方法，包括如下步骤：
（1）核黄素废液的处理
将核黄素废液置于发酵罐，在温度为70℃的条件下保温45min灭活菌丝体，再经卧螺离心机在6500rpm的条件下离心20min得到含菌丝体的上层轻相，取上层轻相用质量分数为30%的氢氧化钠溶液调整pH至6.0±0.2，待用；
（2）发酵生产赤霉素A3
a.种子培养：分两级培养，两级种子培养的培养液均包括如下组成：玉米淀粉25g/L、蔗糖7.5g/L、花生粉25g/L、KH2PO4 1.5g/L、MgSO4 1.5g/L，自然pH；
一级种子培养：在1000mL的摇瓶中装入250mL的培养液，挑取生产赤霉素A3的藤仓赤霉菌突变株装至摇瓶中，在250rmp、30±1℃的条件下培养48h，得到一级种子液；
二级种子培养：在250L的摇瓶中装入100L的培养液，将一级种子液以1.0%体积的比例接种至二级种子罐，在温度30±1℃、溶氧40-50%、自然pH的条件下，培养40h，得到二级种子液；
b.发酵培养：发酵培养基包括如下组成：淀粉120g/L、花生粉10g/L、KH2PO4 0.5g/L、K2SO4 0.5g/L、MgSO4 0.2g/L、步骤（1）得到的核黄素废液400g/L，自然pH；
在3t的发酵罐中，将二级种子液以5%体积比例接种于发酵培养基中，在30±1℃、溶氧30-40%、自然pH的条件下，培养8天，得到发酵液；
c.产物检测
取0.25mL的发酵液加入4.75mL蒸馏水，强烈震荡10min 后，在4000rpm的条件下离心处理10min，取上清液进行高效液相色谱分析，高效液相色谱分析的条件是：Hypersil BDSC18 反相色谱柱（150mm×4.6mm），流动相为甲醇-水溶液，甲醇与水的体积比为40:60，流速0.80mL/min；紫外检测器波长230nm，进样体积为20μL。色谱图如图2所示，赤霉素A3的积分结果如表2所示，得到赤霉素A3的产率为：2458mg/L。
表1赤霉素积分结果表
峰#
保留时间
面积
高度
面积%
理论塔板#
1
4.735
133544
14666
10.005
5958.443
2
4.997
109779
11019
8.225
5829.390
3
6.055
1056141
95991
79.127
7148.329
4
6.740
35277
3132
2.643
8224.769
总计
——
1334742
124807
100.000
——
图2中的3#峰为目标产物赤霉素A3，1#峰、2#峰、4#峰均为杂质峰，但是由于1#峰、2#峰与赤霉素A3的结构差异相比于4#峰与赤霉素A3的结构差异比较大，所以1#峰和2#峰的杂质在后续的提纯过程中很容易去除，从而不会影响赤霉素A3的纯度，而4#峰与赤霉素A3的结构差异小，很难去除，所以认定4#峰为影响后续提取纯度的主要杂质峰，本申请中4#峰的含量少，为后续的提纯过程提供了便捷。
实施例2
一种利用核黄素废液发酵生产赤霉素A3的方法，包括如下步骤：
（1）核黄素废液的处理
将核黄素废液置于发酵罐，在温度为65℃的条件下保温30min灭活菌丝体，再经卧螺离心机在8000rpm的条件下离心10min得到含菌丝体的上层轻相，取上层轻相用质量分数为20-30%的氢氧化钠溶液调整pH至5.5±0.2，待用；
（2）发酵生产赤霉素A3
a.种子培养：分两级培养，两级种子培养的培养液均包括如下组成：玉米淀粉20g/L、蔗糖10g/L、花生粉20g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4 2g/L，自然pH；
一级种子培养：在1000mL的摇瓶中装入250mL的培养液，挑取生产赤霉素A3的单菌落装至摇瓶中，在180rmp、30±1℃的条件下培养60h，得到一级种子液；
二级种子培养：在250L的摇瓶中装入100L的培养液，将一级种子液以0.5%体积比例接种至二级种子罐，在温度30±1℃、溶氧20-40%、自然pH的条件下，培养60h，得到二级种子液；
b.发酵培养：发酵培养基包括如下组成：淀粉80g/L、花生粉8g/L、KH2PO4 0.3g/L、K2SO40.3g/L、MgSO4 0.15g/L、步骤（1）得到的核黄素废液500g/L；
在3t的发酵罐中，将二级种子液以10%的比例接种于发酵培养基中，在30±1℃、溶氧40-60%、自然pH的条件下，培养7天，得到发酵液；
c.产物检测
取0.25mL的发酵液加入4.75mL蒸馏水，强烈震荡10min 后，在4000rpm的条件下离心处理10min，取上清液进行高效液相色谱分析，高效液相色谱分析的条件是：Hypersil BDSC18 反相色谱柱（150mm×4.6mm），流动相为甲醇-水溶液，甲醇与水的体积比为40:60，流速0.80mL/min；紫外检测器波长230nm，进样体积为20μL。检测结果如下：赤霉素A3的产率为：2210mg/L，检测结果与实施例1的相同，无其他杂质峰出现，所以未附液相色谱图。
实施例3
一种利用核黄素废液发酵生产赤霉素A3的方法，包括如下步骤：
（1）核黄素废液的处理
将核黄素废液置于发酵罐，在温度为75℃的条件下保温60min灭活菌丝体，再经卧螺离心机在5000rpm的条件下离心30min得到含菌丝体的上层轻相，取上层轻相用质量分数为30%的氢氧化钠溶液调整pH至6.5±0.2，待用；
（2）发酵生产赤霉素A3
a.种子培养：分两级培养，两级种子培养的培养液均包括如下组成：玉米淀粉30g/L、蔗糖5g/L、花生粉30g/L、KH2PO4 2g/L、MgSO4 1g/L，自然pH；
一级种子培养：在1000mL的摇瓶中装入250mL的培养液，挑取生产赤霉素A3的单菌落装至摇瓶中，在280rmp、30±1℃的条件下培养40h，得到一级种子液；
二级种子培养：在250L的摇瓶中装入100L的培养液，将一级种子液以1.0%体积比例接种至二级种子罐，在温度30±1℃、溶氧50-70%、自然pH的条件下，培养40h，得到二级种子液；
b.发酵培养：发酵培养基包括如下组成：淀粉50g/L、花生粉5g/L、KH2PO4 0.2g/L、K2SO40.2g/L、MgSO4 0.1g/L、步骤（1）得到的核黄素废液600g/L；
在3t的发酵罐中，将二级种子液以10%体积比例接种于发酵培养基中，在30±1℃、溶氧20-30%、自然pH的条件下，培养8天，得到发酵液；
c.产物检测
取0.25mL的发酵液加入4.75mL蒸馏水，强烈震荡10min 后，在4000rpm的条件下离心处理10min，取上清液进行高效液相色谱分析，高效液相色谱分析的条件是：Hypersil BDSC18 反相色谱柱（150mm×4.6mm），流动相为甲醇-水溶液，甲醇与水的体积比为40:60，流速0.80mL/min；紫外检测器波长230nm，进样体积为20μL。检测结果如下：赤霉素A3的产率为：2279mg/L，实施例3的液相色谱检测结果与实施例1的相同，无新杂质峰出现，所以未附液相色谱图。
对照例
现有生产赤霉素A3的方法与实施例1的不同之处在于，无核黄素发酵废液的处理，发酵培养液组成为：淀粉160g/L、花生粉16g/L、KH2PO4 0.4g/L、K2SO4 0.4g/L、MgSO4 0.2g/L，自然pH，其中控制淀粉水解至发酵培养基中还原糖含量1-2%。色谱图如图3所示，赤霉素A3的积分结果如表3所示，得到赤霉素A3的产率为：2123mg/L。
表3赤霉素积分结果表
峰#
保留时间
面积
高度
面积%
理论塔板#
1
4.737
93448
10441
8.136
6147.529
2
5.001
85528
8704
7.447
6032.989
3
6.064
911916
83291
79.398
7215.675
4
6.750
57646
5090
5.019
8090.448
总计
——
1148538
107525
100.000
——
从表3和表2看出，实施例1中3#峰的相对峰面积与对照例中3#峰的相对峰面积（%）相近，说明本申请得到的赤霉素A3的相对百分含量与对照例中的相对百分含量接近，另外，由于4#峰为影响后续提取赤霉素A3纯度的主要杂质峰，而本申请中4#峰的相对峰面积远低于对照例中4#峰的相对峰面积，说明本申请得到的杂质含量小于对照例中的杂质含量，本申请得到的赤霉素A3的纯度优于对照例中的赤霉素A3的纯度，而且本申请3#峰的峰面积远高于对照例中3#峰的峰面积，从而使得本申请中赤霉素A3的产率也高于对照例中的产率，也因此可以说明，将核黄素废液作为赤霉素A3发酵培养的营养成分后，不仅能够保证赤霉素A3的生产量以及纯度，同时也降低核黄素废液的处理成本。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。