阅读说明：本技术 一种美白保湿护肤品组合物 (Whitening and moisturizing skin care product composition ) 是由 汤涛 邓艳 宋艺 东硕 于 2020-07-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种美白保湿护肤品,包括溶媒、透皮肽和针对MATP基因的小干扰核酸,其中溶媒由下述原料制备而成：水、甘油、凝血酸、谷胱甘肽、丁二醇、牛磺酸、甲氧基水杨酸钾、甘油辛酸酯、辛酰羟肟酸、对羟基苯乙酮、肌肽、产碱杆菌多糖类、甘草酸二钾、透明质酸钠、苯氧乙醇；溶媒、透皮肽和针对MATP基因的小干扰核酸的比例为1g溶媒∶0.1-0.5mg透皮肽∶10-50ng针对MATP基因的小干扰核酸。本发明的美白保湿护肤品还可以包括2-5％的烟酰胺。(The invention discloses a whitening and moisturizing skin care product, which comprises a solvent, transdermal peptide and small interfering nucleic acid aiming at MATP gene, wherein the solvent is prepared from the following raw materials: water, glycerol, tranexamic acid, glutathione, butanediol, taurine, potassium methoxysalicylate, glyceryl caprylate, caprylyl hydroximic acid, p-hydroxyacetophenone, carnosine, Alcaligenes polysaccharide, dipotassium glycyrrhizinate, sodium hyaluronate and phenoxyethanol; the ratio of the solvent, the transdermal peptide and the small interfering nucleic acid aiming at the MATP gene is 1g of solvent, 0.1-0.5mg of transdermal peptide and 10-50ng of small interfering nucleic acid aiming at the MATP gene. The whitening and moisturizing skin care product can also comprise 2-5% of nicotinamide.)

一种美白保湿护肤品组合物

技术领域

本发明涉及化妆品技术领域，具体涉及一种美白保湿护肤品组合物及其制备方法。

背景技术

黑色素(melanin)是由皮肤、毛囊、虹膜和视网膜的黑色素细胞所产生。当受到紫外线等因素刺激时，黑色素细胞能够大量的合成黑色素生物合成所必需的酪氨酸酶，在酪氨酸酶的催化下酪氨酸转化成多巴醌，多巴醌进一步氧化形成多巴色素，最后形成黑色素。过量的黑色素会使皮肤变黑，而非均匀分布的黑色素会导致黄褐斑和祛斑的产生。最早皮肤变白的方法是一种脱皮漂白法。不同的脱皮漂白的配方能进行不同程度的脱皮，常用的配方是一些酸和醇类物质，有一定的危险性，不合适作为常用化妆品的制作方法。继而人们逐渐认识到深浅肤色的差异与黑色素细胞中酪氨酸酶的活性的高低有关，于是，含有各种不同的酪氨酸酶的抑制剂产品不断出现。常用的酪氨酸酶的抑制剂有对笨二酚，曲酸，熊果苷，抗坏血酸和最新的生物制品。此外，新的思路开始出现。

烟酰胺是维生素B3的一种衍生物。美白主要是干扰黑色素的合成，它能阻止已生成的黑色素向表皮层的转运，还能加快表皮层的新陈代谢，让含有黑色素的细胞脱落。通俗来说烟酰胺就是让已经合成的黑色素颗粒没有办法转运出来。无论黑色素细胞生成多少黑色素，但是转运不出来皮肤就不变黑，这样达到美白的效果。一方面，烟酰胺具有保湿、修复皮肤屏障的功能。皮肤屏障有一个重要成分就是神经酰胺，外用烟酰胺能够提高神经酰胺和游离脂肪酸的水平，防止皮肤水分流失，并促进真皮层的微循环，增强皮肤的屏障。

基因美白是一个新的概念，它不同于现有的方法和用来增白的活性成分。它从基因水平来控制与黑色素形成有关的基因的表达。使与黑色素形成有关的基因的表达水平明显降低但又不同于白化病中的有关基因缺陷或缺失。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞内存在与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象。长度为21-23nt的小RNA分子是引起RNA干扰现象的直接原因，这种小RNA分子被称为小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，siRNA被认为是一种快捷、高效的调控体内基因表达的方法。MATP基因与色素沉着有密切的关系，其编码的MATP蛋白对哺乳动物色素沉着起决定性作用，因此，通过RNA干扰而专一性地抑制MATP基因的表达，从而沉默MATP基因的活性，是抑制黑色素合成、改善皮肤颜色的有效途径。

目前，市场上用于美容、护肤的产品很多，主要包括抗衰老、美颜、美白等产品。这些产品对于受环境变化以及工业污染影响所引起的皮肤衰老、皮质老化、颜色变暗、无光泽等具有改善作用。然而，这些制品中大部分都是化学制剂，水溶性较差，因此需要大量或长期使用，才能真正有效地达到美白抗衰老效果，并且由于是化学制剂，大量或长期使用势必会带来较大的副作用，价格也昂贵，难以达到标本兼治的目标。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种针对MATP基因的小干扰核酸分子的护肤品组合物来实现皮肤美白和保湿的解决方案。

本发明提供的美白保湿护肤品组合物，包括护肤品溶媒、透皮肽(在本发明中也称为透皮十肽-4)和针对MATP基因的小干扰核酸(MATP基因siRNA)，其中护肤品溶媒包括下述原料：水、甘油、凝血酸、谷胱甘肽、丁二醇、牛磺酸、甲氧基水杨酸钾、甘油辛酸酯、辛酰羟肟酸、对羟基苯乙酮、肌肽、产碱杆菌多糖类、甘草酸二钾、透明质酸钠、苯氧乙醇；溶媒、透皮肽和针对MATP基因的小干扰核酸的比例为1g溶媒∶0.1-0.5mg透皮肽∶10-50ng针对MATP基因的小干扰核酸。具体地，1g溶媒包含下述原料：

0.925克水、0.05克甘油、0.003克凝血酸、0.002克谷胱甘肽、0.001克丁二醇、0.001克牛磺酸、0.001克甲氧基水杨酸钾、0.001克甘油辛酸酯、0.002克辛酰羟肟酸、0.001克对羟基苯乙酮、0.001克肌肽、0.002克产碱杆菌多糖类、0.003克甘草酸二钾、0.005克透明质酸钠和0.002克苯氧乙醇。

在另外一种实施方案中，本发明提供的美白保湿护肤品组合物还可以包括烟酰胺，浓度为2-5％。

本发明还提供了美白保湿护肤品组合物的制备方法，将上述制备护肤品溶媒的原料按如下重量比加入均质乳化机的水相锅中以400转/分搅拌，搅拌20分钟之后加入透皮肽和MATP基因siRNA，三者的比例为1g溶媒∶0.1-0.5mg透皮肽∶10-50ng MATP基因siRNA，再继续搅拌10分钟。

本发明提供的另外一种美白保湿护肤品的制备方法，将上述制备溶媒的原料按如下配方加入均质乳化机的水相锅中以400转/分搅拌：0.925克水、0.05克甘油、0.003克凝血酸、0.002克谷胱甘肽、0.001克丁二醇、0.001克牛磺酸、0.001克甲氧基水杨酸钾、0.001克甘油辛酸酯、0.002克辛酰羟肟酸、0.001克对羟基苯乙酮、0.001克肌肽、0.002克产碱杆菌多糖类、0.003克甘草酸二钾、0.005克透明质酸钠和0.002克苯氧乙醇，搅拌20分钟之后加入透皮肽、MATP基因siRNA和烟酰胺，四者的比例为1g溶媒∶0.1-0.5mg透皮肽∶10-50ngMATP基因siRNA∶2-5％的烟酰胺，再继续搅拌10分钟。

本发明中制备溶媒所用的原料均采购自广州元基生物科技有限公司，产品目录号如下：

水 目录编号：06260

甘油 目录编号：02421

凝血酸 目录编号：04866

谷胱甘肽 目录编号：02586

丁二醇 目录编号：0003

牛磺酸 目录编号：04876

甲氧基水杨酸钾 目录编号：03354

甘油辛酸酯 目录编号：02478

辛酰羟肟酸 目录编号：07218

对羟基苯乙酮 目录编号：02021

肌肽 目录编号：03150

产碱杆菌多糖类 目录编号：01616

甘草酸二钾 目录编号：02397

透明质酸钠 目录编号：06722

苯氧乙醇 目录编号：01294

透皮肽的序列如中国授权专利CN106084006B所示，由广州元基生物科技有限公司合成。

本发明中使用的烟酰胺采购自广州元基生物科技有限公司，目录编号：07359。

MATP基因siRNA由广州市锐博生物科技有限公司合成。

本发明美白保湿护肤品，美白护肤品效果显著，可增强皮肤的锁水能力，降低皮肤黑色素含量，具有美白保湿的功效。

本发明的有益效果

本发明提供的美白保湿护肤品，能够高效、特异地抑制皮肤中MATP基因的表达，降低黑色素的生成，增强皮肤的锁水能力，同时具有较低的毒副作用，可长期使用并达到标本兼治的目标。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

本发明基于MATP基因(NC_000005.10，Gene ID：51151)序列设计、筛选活性小干扰RNA(siRNA)序列，本发明采用的MATP基因siRNA如SEQ ID No.1-8所示。然而应当理解，其他具有活性的针对MATP基因的siRNA也能实现本发明的技术效果，也在本发明的保护范围内。

MATP基因小干扰核酸序列：

MATP-siRNA1：正义链5’-GCCUACUUAUUUGAUGUCUdTdT-3’ SEQ ID No.1

反义链5’-AGACAUCAAAUAAGUAGGCdTdT-3’ SEQ ID No.2

MATP-siRNA2：正义链5’-GGUUCUAUCGAGAAAGUUAdTdT-3’ SEQ ID No.3

反义链5’-UAACUUUCUCGAUAGAACCdTdT-3’ SEQ ID No.4

MATP-siRNA3：正义链5’-CGUCAAAUCCAGUUUGAAAdTdT-3’ SEQ ID No.5

反义链5’-UUUCAAACUGGAUUUGACGdTdT-3’ SEQ ID No.6

MATP-siRNA4：正义链5’-GCUUUGAUUGCUAACCCAAdTdT-3’ SEQ ID No.7

反义链5’-UUGGGUUAGCAAUCAAAGCdTdT-3’ SEQ ID No.8

(1)寡聚核糖核苷酸的合成：寡聚核糖核苷酸的合成是在自动DNA/RNA合成仪上进行。由于小干扰核酸是由一段19个寡聚核糖核苷酸和2个脱氧胸苷酸组成。因此，起始物为固相连接的5’-O_对二甲氧基-胸苷，具体的每一个循环合成可分为四步来完成，第一步是将与固定连接的胸苷上5’位的保护基在三氯乙酸的作用下洗脱；第二步在活性催化剂S-乙基四唑的作用下，将5’-O-对二甲氧基三苯甲基_胸苷亚磷酰胺偶联至已脱去保护的上一个胸苷上，形成二胸苷亚磷酸三酯，偶合时间偶合次数均按仪器厂家提供的程序来完成；第三步是将偶合的二胸苷亚磷酸三酯在0.05M碘水作用下，氧化成二胸苷磷酸三酯；第四步是乙酰化，将固相上的少量未反应的活性基团(例如，羟基和胺基)在乙酸酐的作用下形成酯或酰胺，从而达到封闭的作用，以减少整体副产物的产生，重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。

(2)脱保护：将合成好的固相小干扰核酸放入至一个可以密封的小瓶中，并加入1毫升的乙醇/胺(体积比为1∶3)，然后密封，置于55-70℃温箱中，孵育2-30小时，取出溶液，并将固相再次用双蒸水淋洗，收集洗脱液，并干燥去除溶剂。然后，加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(IM)，室温放置4-12小时，再经过乙醇沉淀，得到小干扰核酸的粗产物。

(3)纯化分离：将小干扰核酸的粗产物溶解于2毫升的乙酸铵水溶液中，然后经过反应C18高压液相色谱的分离，运用梯度淋洗的方法，收集小干扰核酸主产物(淋洗液A：0.IM乙酸铵；淋洗液B：20％的0.IM乙酸铵和80％的乙腈)，除去主产物中的溶剂，并加入5毫升80％的乙酸水溶液，在室温静置15分钟，然后将此溶液进行阴离子交换的分离(DEAE-5PW，阴离子交换柱)，即可得到纯度在90％以上的小干扰核酸(梯度淋洗，淋洗液A：0.025M的Tris-HCl，0.025M的NaCl，pH＝8，5％的乙腈；淋洗液B：0.025M的Tris-HCl，2.0M的NaCl，PH＝8，5％的乙腈)。

(4)脱盐：纯化的小干扰核酸经过透析，除去盐份，随后将小干扰核酸溶液进行过滤消毒和干燥结晶。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸经过退火处理形成稳定的双链小干扰核酸，其方法是将正义链和反义链的寡聚核糖核苷酸混合溶解在1-2毫升的缓冲液中(IOmM Tris，pH＝7.5-8.0，50mM NaCl)，将此溶液加热至95℃，然后缓缓将此溶液冷却至室温，最后将此溶液存放在4℃冰箱中保存，以备随时使用。

实施例1

将制备溶媒所需的0.925克水、0.05克甘油、0.003克凝血酸、0.002克谷胱甘肽、0.001克丁二醇、0.001克牛磺酸、0.001克甲氧基水杨酸钾、0.001克甘油辛酸酯、0.002克辛酰羟肟酸、0.001克对羟基苯乙酮、0.001克肌肽、0.002克产碱杆菌多糖类、0.003克甘草酸二钾、0.005克透明质酸钠、0.002克苯氧乙醇加入均质乳化机的水相锅中以400转/分搅拌，20分钟后加入透皮十肽-4和MATP-siRNA1，三者的比例为1g溶媒∶0.1mg透皮十肽-4∶10ngMATP-siRNA1，再继续搅拌10分钟，得到实施例1的美白保湿护肤品组合物。

实施例2

与实施例1基本相同，区别仅仅在于三者的比例为1g溶媒∶0.1mg透皮十肽-4∶25ngMATP-siRNA1，得到实施例2的美白保湿护肤品组合物。

实施例3

与实施例1基本相同，区别仅仅在于三者的比例为1g溶媒∶0.1mg透皮十肽-4∶50ngMATP-siRNA1，得到实施例3的美白保湿护肤品组合物。

实施例4

与实施例1基本相同，区别仅仅在于三者的比例为1g溶媒∶0.5mg透皮十肽-4∶10ngMATP-siRNA1，得到实施例4的美白保湿护肤品组合物。

实施例5

与实施例1基本相同，区别仅仅在于三者的比例为1g溶媒∶0.5mg透皮十肽-4∶25ngMATP-siRNA1，得到实施例5的美白保湿护肤品组合物。

实施例6

与实施例1基本相同，区别仅仅在于三者的比例为1g溶媒∶0.5mg透皮十肽-4∶50ngMATP-siRNA1，得到实施例6的美白保湿护肤品组合物。

实施例7

与实施例1基本相同，区别仅仅在于将MATP-siRNA1换成烟酰胺，三者的比例为1g溶媒∶0.1mg透皮十肽-4∶2％烟酰胺，得到实施例7的美白保湿护肤品组合物。

实施例8

与实施例1基本相同，区别仅仅在于将MATP-siRNA1换成烟酰胺，三者的比例为1g溶媒∶0.1mg透皮十肽-4∶5％烟酰胺，得到实施例8的美白保湿护肤品组合物。

实施例9

与实施例1基本相同，区别仅仅在于将MATP-siRNA1换成烟酰胺，三者的比例为1g溶媒∶0.5mg透皮十肽-4∶2％烟酰胺，得到实施例9的美白保湿护肤品。

实施例10

与实施例1基本相同，区别仅仅在于将MATP-siRNA1换成烟酰胺，三者的比例为1g溶媒∶0.5mg透皮十肽-4∶5％烟酰胺，得到实施例10的美白保湿护肤品组合物。

实施例11

将制备溶媒所需的原料0.925克水、0.05克甘油、0.003克凝血酸、0.002克谷胱甘肽、0.001克丁二醇、0.001克牛磺酸、0.001克甲氧基水杨酸钾、0.001克甘油辛酸酯、0.002克辛酰羟肟酸、0.001克对羟基苯乙酮、0.001克肌肽、0.002克产碱杆菌多糖类、0.003克甘草酸二钾、0.005克透明质酸钠、0.002克苯氧乙醇加入均质乳化机的水相锅中以400转/分搅拌，20分钟后加入透皮十肽-4，MATP基因siRNA No.1和烟酰胺，四者的比例为1g溶媒∶0.1mg透皮十肽-4∶10ng MATP-siRNA1∶2％烟酰胺，再继续搅拌10分钟，得到实施例11的美白保湿护肤品组合物。

实施例12

与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒∶0.1mg透皮十肽-4∶10ng MATP-siRNA1∶5％烟酰胺，得到实施例12的美白保湿护肤品组合物。

实施例13

与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒∶0.1mg透皮十肽-4∶25ng MATP-siRNA1∶2％烟酰胺，得到实施例13的美白保湿护肽品组合物。

实施例14

与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒∶0.1mg透皮十肽-4∶25ng MATP-siRNA1∶5％烟酰胺，得到实施例14的美白保湿护肤品组合物。

实施例15

与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒∶0.1mg透皮十肽-4∶50ng MATP-siRNA1∶2％烟酰胺，得到实施例15的美白保湿护肤品组合物。

实施例16

与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒∶0.1mg透皮十肽-4∶50ng MATP-siRNA1∶5％烟酰胺，得到实施例16的美白保湿护肤品组合物。

实施例17

与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒∶0.5mg透皮十肽-4∶10ng MATP-siRNA1∶2％烟酰胺，得到实施例17的美白保湿护肤品组合物。

实施例18

与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒∶0.5mg透皮十肽-4∶10ng MATP-siRNA1 No.1∶5％烟酰胺，得到实施例18的美白保湿护肤品组合物。

实施例19

与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒∶0.5mg透皮十肽-4∶25ng MATP-siRNA1∶2％烟酰胺，得到实施例19的美白保湿护肤品组合物。

实施例20

与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒∶0.5mg透皮十肽-4∶25ng MATP-siRNA1∶5％烟酰胺，得到实施例20的美白保湿护肤品组合物。

实施例21

与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒∶0.5mg透皮十肽-4∶50ng MATP-siRNA1∶2％烟酰胺，得到实施例21的美白保湿护肤品组合物。

实施例22

与实施例11基本相同，区别仅仅在于：四者的比例为1g溶媒∶0.5mg透皮十肽-4∶50ng MATP-siRNA1∶5％烟酰胺，得到实施例22的美白保湿护肤品组合物。

实施例23

与实施例22基本相同，区别仅仅在于将MATP-siRNA1替换成MATP-siRNA2，得到实施例23的美白保湿护肤品组合物。

实施例24

与实施例22基本相同，区别仅仅在于将MATP-siRNA1替换成MATP-siRNA3，得到实施例24的美白保湿护肤品组合物。

实施例25

与实施例22基本相同，区别仅仅在于将MATP-siRNA1替换成MATP-siRNA4，得到实施例25的美白保湿护肤品组合物。

实施例26 小鼠皮肤的黑色素抑制实验

上述所示的实施例得到美白保湿护肤品1-25，仅含溶媒的对照组别为26。将130只成年雌性C57BL/6小鼠安置在环境控制的动物护理实验室中，使用标准的小鼠饮食。用剪刀仔细修剪腹部1cm×1cm区域的毛发(不使用任何有明显皮肤损伤迹象的小鼠)。选择小鼠并将其随机分为不同的组，每组5只。每天一次将组合物涂抹在腹部剔除毛发的区域。应用上述配方7天后，处死小鼠，将皮肤切成薄片以测量黑色素抑制活性。为了提取黑色素，在80℃下将皮肤组织块的细胞悬液与等体积的含有10％二甲基亚砜和1N NaOH的混合物一起摇动60分钟。在2,000rpm下离心10分钟后，使用SpectroQuest Reader在475nm处测定OD值，OD值越高，表明黑色素生成越多。

表1 各组别抑制黑色素的效果

根据上表所示的数据，在仅有护肤品溶媒的情况下，OD值最高，说明皮肤中含有的黑色素最多；而在使用本发明提供的护肤品后7天，小鼠皮肤中的黑色素明显降低，最少的降低近30％，最高降低81.25％。组合22即1g溶媒，0.5mg透皮肽，50ng MATP基因siRNANo.1，5％烟酰胺对黑色素的抑制效果最好。

实施例27 肌肤的保湿效果测试

皮肤角质层水合率试验：工作原理是以电容器为仪器探头，由于水是皮肤上介质常数最大的物质，当皮肤水分含量发生变化时，皮肤的电容值也发生变化，所以可以通过测定皮肤电容值，分析皮肤表面水分含量。常用的仪器是Corneometer CM825。

实验方法：在应试者左右前臂屈侧划出3×3cm²大小的正方形实验区域，以左臂作为保湿品的测试区域，均匀涂抹本发明实施例1-25制备的美白保湿护肤品1ml(仅含溶媒的对照组别为26)，右臂相应的对称区域为空白对照，然后用Corneometer CM825测试每个试验部位的水分含量，分别重复5次，得出平均值。用下列公式计算水合率。

水合率＝(测试值-空白值)/空白值×100％

表2 保湿效果测试结果

从上表所示，与溶媒组相比，本发明所提供的护肤品保湿时间长，效果好，实施例21和22的保湿效果最好。

综合抑制黑色素和保湿效果，实施例22即1g溶媒，0.5mg透皮肽，50ng MATP-siRNA1，5％烟酰胺最好。